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UNESP Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita

Filho
Faculdade de Odontologia de Araraquara
CAROLINA DE ANDRADE LIMA CHAVES
Avaliao in vitro da citotoxicidade de monmeros,
plastificante e produtos de degradao liberados a partir de
resinas para reembasamento imediato.
Araraquara
2009
UNESP Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho
Faculdade de Odontologia de Araraquara
CAROLINA DE ANDRADE LIMA CHAVES
Avaliao in vitro da citotoxicidade de monmeros,
plastificante e produtos de degradao liberados a partir de
resinas para reembasamento imediato.
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Reabilitao Oral rea de prtese, da
Faculdade de odontologia de Araraquara, da
Universidade Estadual Paulista, para obteno do ttulo
de Mestre em Prtese.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Lcia Machado
Co-Orientadora: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos
Araraquara
2009
Chaves, Carolina de Andrade Lima
Avaliao in vitro da citotoxicidade de manmeros, plastificante e
produtos de degradao liberados a partir de resinas para
reembasamento imediato / Carolina de Andrade Lima Chaves .
Araraquara: [s.n.], 2009.
157 f. ; 30 cm.
Dissertao (Mestrado) Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Odontologia
Orientadora: Profa. Dra. Ana Lcia Machado
Co-orientadora: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos
1. Citotoxicidade imunolgica 2. Reembasadores de dentadura
3. Bases de dentadura I. Ttulo
Ficha catalogrfica elaborada pela Bibliotecria Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646
Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
1
CAROLINA DE ANDRADE LIMA CHAVES
AVALIAO IN VITRO DA CITOTOXICIDADE DE MONMEROS,
PLASTIFICANTE E PRODUTOS DE DEGRADAO LIBERADOS A PARTIR
DE RESINAS PARA REEMBASAMENTO IMEDIATO
COMISSO J ULGADORA
DISSERTAO PARA OBTENO DO GRAU DE MESTRE
Presidente e Orientador: Ana Lcia Machado
2 Examinador: Ana Cludia Pavarina
3 Examinador: Cludia Helena Lovato da Silva
Araraquara, 17 de Abril de 2009.
DADOS CURRICULARES
CAROLINA DE ANDRADE LIMA CHAVES
Nascimento: 11 de Agosto de 1982 Recife/PE.
Filiao: Tarcsio Cavalcanti Chaves e Abigail de Andrade Lima Chaves.
2000/2005: Curso de Graduao - Faculdade de Odontologia de Caruaru/ASCES.
2006: Participao no Programa de Aperfeioamento Continuado (PROAC)
Disciplinas de prtese total e fixa Departamento de Prtese e Materiais Dentrios-
Faculdade de Odontologia de So J os dos Campos/UNESP.
2007/2009: Ps-Graduao em Reabilitao Oral - rea de Concentrao em
Prtese Curso de Mestrado - Faculdade de Odontologia de Araraquara/UNESP.
Dedico este trabalho
Deus, por cuidar da minha vida com tanto carinho.
Aos meus pais Tarcsio e Abigail, por terem proporcionado o suporte
necessrio para que eu vena essa etapa da minha vida. Pelo amparo, dedicao,
apoio incondicional s minhas decises, pela minha formao pessoal e valores que
me foram passados: humildade, sinceridade, educao e amor a Deus e famlia. Foi
com o apoio e amor de vocs que hoje consigo conquistar este sonho!
A minha irm, Fabiana, e aos meus avs, Cleonice e Paulo, pela
preocupao, companheirismo, carinho, amor e incentivo.
Ao meu querido Raphael, pelo incentivo incondicional, apoio,
carinho, compreenso, pacincia e por sempre estar ao meu lado em todos os
momentos. Muito obrigada por tudo. Voc foi muito importante nesta etapa da minha
vida!
Agradecimentos especiais
A Profa. Dra. Ana Lcia Machado, por acreditar em mim, pela
confiana, incentivo e contribuio na minha formao profissional. A senhora um
exemplo de dedicao, competncia e seriedade a docncia. Fui privilegiada de poder
ser orientada por voc, eu no poderia ter tido mais sorte. Muito obrigada por tudo!
A Prof. Dra. Iracilda Zeppone Carlos, pela disponibilidade e
incentivo. Obrigada por me deixar fazer parte do seu laboratrio de pesquisa.
As professoras e amigas, Simone Xavier e Anamaria Pessoa Pereira
Leite, pela amizade, incentivo e, principalmente, por acreditar em mim. Obrigada!
A minha amiga de ps-graduao Cristiane, pela sua amizade,
companhia no laboratrio e troca de informaes. Estudamos muito para que nossos
trabalhos fossem concludos com xito, muito obrigada pela sua companhia!
Agradecimentos

coordenadoria do curso de Ps-Graduao em Reabilitao Oral,
muito obrigada por tornar possvel a realizao do meu trabalho.
A todos os Professores do Curso de Ps-Graduao em Reabilitao
Oral, em especial ao Prof. Dr. Luis Geraldo Vaz, Prof. Dr. Gelson Lus Adabo,
Prof. Dr. Carlos Alberto Cruz e Profa. Dra. Cnara Maria Camparis, pelos
conhecimentos, apoio e acolhida.
Aos professores da disciplina de prtese removvel Profa. Dra. Ana
Cludia Pavarina, Profa. Dra. Eunice Giampaolo e Prof. Dr. Carlos Eduardo
Vergani, pela amizade, convivncia e incentivo.
As amigas de infncia Dani Moroni, Amanda, Carol Fernandes,
Izabela, Renatinha Sarmento, Renata Da Fonte, Bia e Mariana; E as amigas da
faculdade Fabiana, Aline, Maria, Duda, Carol Cavalcanti, Rafaela, Juliana,
Maradulce e Willyanne muito obrigada pela convivncia e apoio por todos estes
anos. Sei que mesmo de longe, vocs torcem pela minha vitria. Obrigada por tudo!
Aos amigos do curso de ps-graduao Tatiane, Fernanda, Carlos,
Rodrigo, Antnio, Fabiane, ngela, Patrcia, Cristiane, Ana Lcia, Camila, Ana
Paula, Flvia Zardo e Flvia Medeiros, obrigada pela convivncia e amizade.
Aos amigos do laboratrio da Faculdade de Cincias
Farmacuticas, em especial a Djamile, Lvia, Dani e Lucas, obrigada pela
pacincia, amizade, companheirismo e ensinamentos.
A tcnica de laboratrio Marisa, pela pacincia e amizade. Muito
obrigada pela ajuda para a concluso do meu trabalho.
Aos funcionrios do Departamento de Materiais Odontolgicos e
Prtese, pela ajuda e amizade.
Aos funcionrios da Seo de Ps-Graduao Mara, Alexandre,
Flvia e Rosngela, obrigada pela gentileza e ateno.
CAPES, pela bolsa de estudos concedida ao curso de mestrado.
FAPESP, pelo auxlio pesquisa (processo 2007/06710-9).
___________________________________________Lista de abreviaturas e smbolos

Lista de abreviaturas e smbolos
x AB - cido benzico
x AM - cido metacrlico
x BA - n-butil acrilato
x BA - Banho em gua
x BBP - Butil benzil ftalato
x 1,4 BDMA - 1,4-Butanediol dimetacrilato
x BMA - Butil metacrilato
x BPA - Bisfenol A
x BPBG - n-butil ftalil n-butil glicolato
x Bis-GMA - Bisfenol A glicerolato dimetacrilato
x cm - Centmetro
x cpm - Contagem por minuto
x CQ - Canforoquinona
x DBP - Di-n-butil ftalato
x DBS - Ester di-n-butil
x DEHP - Di(2- etilhexil) ftalato
x DMA - n-dodecyl metacrilato
x DMSO Dimetilsulfxido
x DOA - Di(2-etilhexil) adipato
x DPPC - Mtodo de lipossomas de dipalmitoilfosfatidilcolina
x EHMA - 2-etil exil-metacrilato
x 2,3-EMA - cido 2,3-epoximetacrlico
x EMPA - 1,2-epoxi-2-cido metilpropinico
___________________________________________Lista de abreviaturas e smbolos

x EMPME - 2,3-epoxi-2-metil-cido propinico metil ster
x g Grama
x GMA - Glicidil metacrilato
x h - Horas
x 1,6 - HDMA - 1,6 - Hexanediol dimetacrilato
x HEMA - 2-Hidroxietilmetacrilato
x HMA - Hexil metacrilato
x HPLC- Cromatografia lquida de alta resoluo
x IBMA - Isobutil metacrilato
x K Kooliner
x LL - Light Liner
x L Lucitone 550
x M - Molar
x g - Micrograma
x mg - Miligramas
x l Microlitro
x m- Micrmetro
x mol - Micromol
x Ci Micro-query
x mL Mililitro
x mm Milmetro
x mM Milimolar
x mmol - Milimol
x min Minuto
x MBuP - Mono-n-butil ftalato
___________________________________________Lista de abreviaturas e smbolos

x MMA - Metil metacrilato
x MPa Mega-pascal
x nmol - Nanomol
x NT - New Truliner
x PB - Perxido de benzola
x PBN - n-tert-butil--fenilnitrone
x PBS - Soluo salina fosfatada \
x PEMA - Polietil metacrilato
x PMMA Polimetil metacrilato
x s - Segundos
x TEG - Trietileno glicol
x TEGDMA - Trietileno glicol dimetacrilato
x TMPT - Trimetilolpropano trimetacrilato
x TR Tokuso Rebase
x U - UfiGel Hard
x UDMA - Uretano dimetacrilato

SUMRIO
Resumo ....................................................................................................................13
Abstract....................................................................................................................15
1 INTRODUO ...................................................................................................17
2 REVISO DA LITERATURA ..........................................................................23
3 PROPOSIO.....................................................................................................95
4 MATERIAL E MTODO...................................................................................97
4.1 Materiais ...........................................................................................................97
4.1 Mtodos .............................................................................................................99
5 RESULTADO.......................................................................................................111
6 DISCUSSO.........................................................................................................121
7 CONCLUSO.......................................................................................................138
8 REFERNCIAS....................................................................................................140
9 APNDICES........................................................................................................152
_____________________________________________________________Resumo

















RESUMO

_____________________________________________________________Resumo

Resumo
Chaves CAL. Avaliao in vitro da citotoxicidade de monmeros, plastificante e
produtos de degradao liberados a partir de resinas para reembasamento imediato
[dissertao mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2009.
O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito citotxico dos
monmeros isobutil metacrilato (IBMA) e 1,6 Hexanediol dimetacrilato (1,6
HDMA), do plastificante di-n-butil ftalato (DBP), e dos produtos de degradao
cido metacrlico (AM) e cido benzico (AB) sobre clulas L929. Esses compostos
foram testados em faixas de concentraes liberadas, em um perodo de 30 dias, por
materiais reembasadores rgidos, previamente quantificadas em estudos anteriores. O
efeito citotxico foi verificado por meio dos testes de MTT e
3
H-timidina, aps as
clulas terem sido expostas s substncias testadas nas concentraes estabelecidas. A
classificao da citotoxicidade foi baseada na viabilidade celular em relao ao
controle (clulas expostas ao meio sem as substncias testadas). A atividade de
sntese de DNA foi inibida por todos os compostos. Os resultados do presente estudo
demonstraram que o teste de
3
H-timidina foi mais sensvel que o teste de MTT e que
os compostos avaliados mostraram diferentes nveis de citotoxicidade in vitro. A
atividade da desidrogenase mitocondrial diminuiu nas clulas tratadas com os
monmeros, o plastificante e o produto de degradao AM; porm, para o AB, a
maioria das concentraes testadas no apresentou efeito citotxico.
Palavras-chave: Citotoxicidade imunolgica; reembasadores de dentadura;
bases de dentadura.
___________________________________________________________Abstract





ABSTRACT


___________________________________________________________Abstract
Abstract
Chaves CAL. In vitro cytotoxicity of monomers, plasticizer and degradation by-
products released from hard chair side reline resin [dissertao mestrado].
Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2009.
The aim of this study was to evaluate the cytotoxic effect of the
monomers 1,6 hexanediol dimethacrylate (1,6 - HDMA) and isobutyl methacrylate
(IBMA), the plasticizer di-n-butyl phthalate (DBP), and the degradation by-products
methacrylic acid (MA) and benzoic acid (BA) on L929 cells. These compounds were
tested in the range of concentrations released in 30 days from hard chairside reline
resins that were quantified in previous investigations. Cytotoxic effects were assessed
by using MTT and
3
H - thymidine assays after the cells had been exposed to the test
compounds at the given concentrations. Cytotoxicity was rated based on cell viability
relative to controls (cells exposed to medium without test substances). The results
presented in this study demonstrated that the
3
H-thymidine assay was more sensitive
than the MTT assay, and all compounds tested showed varying degrees of cytotoxic
effect in vitro. DNA synthesis activity was inhibited by all compounds.
Mitochondrial dehydrogenase activity decreased in cells treated with monomers,
plasticizer and MA by-product, whereas no cytotoxic effect was observed on contact
with BA at the majority of concentrations tested.
Key-Word: Immunologic cytotoxicity; denture liner; denture base.
__________________________________________________________Introduo

16
16




INTRODUO



__________________________________________________________Introduo

17
17
1 INTRODUO
Devido ao processo de reabsoro ssea, que crnico, progressivo,
irreversvel e de origem multifatorial, o rebordo residual apresenta constante alterao
morfolgica. Assim, pacientes total ou parcialmente desdentados, reabilitados por
meio de prteses removveis, apresentam como um dos aspectos crticos do
tratamento a manuteno da adaptao entre a parte interna das bases e os tecidos de
suporte. Como mtodo alternativo ao reembasamento mediato, o mtodo imediato
permite a readaptao das prteses aos tecidos de suporte no prprio consultrio,
eliminando as fases de incluso e prensagem, sendo por esse motivo, mais rpido e de
fcil execuo
11
. Assim, o reembasamento imediato tem sido indicado, apresentando
resultados clnicos considerados favorveis
19
.
Diferindo das resinas acrlicas comumente utilizadas, que so
compostas de polmero e monmero contendo polimetilmetracrilato e metacrilato de
metila, para o reembasamento imediato tm sido utilizadas resinas autopolimerizveis
especialmente formuladas para essa finalidade. Esses materiais so fornecidos em
forma de p composto de polietil metacrilato (PEMA) e de um lquido que pode ser
base de butil metacrilato (BMA), isobutil metacrilato (IBMA) ou 1,6 - hexanediol
dimetacrilato (1,6 - HDMA)
2,62
.
Durante a reao de polimerizao, a converso das molculas de
monmero em polmero no completa, permanecendo certa quantidade de
monmero residual na resina polimerizada
55
, sendo esse contedo usualmente maior
__________________________________________________________Introduo

18
18
nas resinas ativadas quimicamente que naquelas ativadas pelo calor
64
. O monmero
residual apresenta ao plastificante e pode afetar as propriedades dos materiais
32,46
.
Em funo desses aspectos, um estudo inicial foi realizado para avaliar o contedo de
monmero residual em 4 resinas autopolimerizveis para reembasamento imediato e
1 resina termopolimerizvel para base de prtese
62
. Os resultados confirmaram a
presena de monmero residual em todos os materiais, com diferenas significativas
entre as resinas para reembasamento imediato avaliadas, tendo sido a quantidade de
monmero detectada em 3 delas significativamente maior que a da resina
termopolimerizvel.
O monmero residual tambm pode influir na biocompatibilidade dos
materiais polimricos
8,11,17,25-27,31,34,60
. Alm de serem citotxicos
8
, podem causar
irritao qumica local
64
, hipersensibilidade (alergia)
1,65
, inflamao na mucosa,
vesculas e ulceraes
1
, sensao de queimao
1
e reao alrgica sistmica
38
. Alm
do monmero residual, outros componentes das resinas acrlicas devem ser
considerados do ponto de vista da biocompatibilidade. Dentre esses componentes,
podemos destacar os plastificantes, que so includos na formulao para
proporcionar flexibilidade e melhorar as caractersticas de trabalho dos materiais.
Geralmente, so utilizados ftalatos e steres de cidos carboxlicos
aromticos
18,24,29,67
. Hashimoto et al.
18
, em 2000, em trabalho in vitro, avaliaram
materiais condicionadores de tecidos e concluram que os steres de ftalatos possuem
atividade estrognicas. Existe ainda a possibilidade de serem mutagnicos, agentes
__________________________________________________________Introduo

19
19
hepatotxicos e carcinognicos
67
. Outro aspecto que deve ser considerado que,
durante sua utilizao, os materiais polimricos esto sujeitos a influncias qumicas,
mecnicas e trmicas
32,39
, que podem resultar em sua degradao e conseqente
formao de vrios sub-produtos. Dentre esses produtos de degradao podemos citar
os cidos metacrlico (AM) e benzico (AB)
30,55
, que tm sido considerados
potencialmente txicos em diferentes nveis e tempos, cujos efeitos se prolongam por
vrios dias aps a polimerizao
33
. Esses produtos tambm podem atuar como
agentes sensibilizantes, podendo causar irritao ou reaes alrgicas tardias
1,17
.
Um fator importante a ser considerado que, para que os componentes
presentes na resina polimerizada, como monmero residual, plastificantes e produtos
de degradao, apresentem efeito txico necessrio que sejam liberados para o meio
a partir dos materiais e, dessa forma, entrem em contato com os tecidos da cavidade
bucal. Tem sido observado que somente parte do monmero residual presente em
materiais polimricos pode ser extrado ou liberado
61-63
. Com base nessas
informaes, um estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a possvel
liberao de monmeros residuais, plastificante (di-n-butil ftalato - DBP) e dois
produtos de degradao (AM e AB) a partir das resinas para reembasamento imediato
Kooliner (K), New Truliner (NT) e UfiGel Hard (U)
61
. Para isso, os materiais foram
imersos em saliva artificial e, aps perodos pr-determinados, coletas foram obtidas
e analisadas por meio de cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC). Foi
observado que o monmero IBMA foi liberado a partir das resinas K e NT e o
__________________________________________________________Introduo

20
20
monmero 1,6 - HDMA da resina U. Foi tambm observado a liberao de DBP a
partir da resina NT, que apresenta esse plastificante em sua composio
2
, e dos
produtos de degradao AM e AB a partir de todas as resinas avaliadas. Entretanto,
os possveis efeitos txicos dessas concentraes ainda no foram investigados. Outro
aspecto importante que, enquanto vrios autores avaliaram a citotoxicidade de
resinas acrlicas para base de prtese
25-28,34,50,60
, poucos avaliaram esse aspecto em
resinas para reembasamento imediato
8,11,31
. Alm disso, nesses estudos, embora
alguns materiais tenham sido relatados como citotxicos, os componentes
responsveis por essa citotoxicidade no foram identificados. Somente no trabalho de
Lai et al.
31
, em 2004, os testes de citotoxicidade foram realizados utilizando-se os
monmeros das resinas K e TR. Entretanto, as concentraes avaliadas foram
estabelecidas de maneira aleatria e no com base em resultados de liberao. Alm
disso, o efeito de outros componentes que podem ser liberados, como produtos de
degradao e plastificantes, no foi avaliado. Assim, a citotoxicidade das diferentes
concentraes de componentes liberados por resinas utilizadas para o reembasamento
imediato precisa ainda ser investigado em maiores detalhes.
A fim de minimizar os efeitos deletrios causados pela presena de
componentes residuais, e tornar a resina mais aceitvel biologicamente e com
melhores propriedades mecnicas, estudos tm avaliado diferentes tratamentos,
realizados aps a polimerizao
26,60,62
, com o objetivo de reduzir a quantidade desses
compostos. Tem sido observado que a imerso de resinas acrlicas polimerizadas em
__________________________________________________________Introduo

21
21
gua aquecida a 55q C por 10 min pode reduzir tanto o contedo de monmero
residual
61
como tambm a liberao desse composto e de outros componentes
61,63
. As
concentraes mximas de IBMA, 1,6 HDMA, DBP e AB liberadas de todas as
resinas foram significativamente reduzidas aps esse tratamento. Reduo nas
quantidades de AM liberadas tambm foi observada, com exceo da resina U
61,63
.
Da mesma forma como relatado anteriormente, os possveis efeitos citotxicos das
concentraes obtidas aps o tratamento de ps-polimerizao por imerso em gua
aquecida, tambm precisam ser analisados.
Tendo em vista o exposto, foi considerado oportuno realizar um
estudo para avaliar in vitro a citotoxicidade dos monmeros IBMA e 1,6 - HDMA, do
plastificante DBP e dos produtos de degradao AM e AB nas concentraes
mximas liberadas a partir de resinas para reembasamento imediato, submetidas ou
no a tratamento de ps-polimerizao
61,63
. Essa avaliao particularmente
relevante considerando-se que, para se analisar o efeito txico de biomateriais, tem
sido recomendado identificar e quantificar os compostos por eles liberados
28,31,60
.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 22


















REVISO DA LITERATURA





_______________________________________________________________ Reviso da literatura 23
2 REVISO DA LITERATURA
Quando respostas alrgicas s resinas acrlicas so observadas, os principais
agentes responsveis so os monmeros residuais, capazes de produzirem estomatites e queilites
angulares. Giunta et al.
16
, em 1979, relataram um caso clnico de eritema multiforme devido a
provisrio confeccionado com resina autopolimerizvel. Paciente do sexo feminino, 57 anos de
idade, fumante, sem relato de alergias anteriores e que no fazia uso de nenhum medicamento, foi
atendida para reabilitao prottica do arco superior. Os dentes anteriores foram preparados ao
nvel da gengiva marginal e um provisrio de resina acrlica autopolimerizvel (Cold-pak),
confeccionado pela tcnica indireta, foi cimentado com o material Temp-Bond. Aps dois dias, a
paciente relatou desconforto na gengiva marginal devido prtese temporria. No perodo de
uma semana, todos os dentes superiores foram preparados e a prtese temporria colocada at a
regio posterior. Um dia depois, a paciente apresentou dificuldade de fala e de deglutio, com
sensao de queimao na cavidade bucal. Na avaliao clnica, foi observada estomatite severa e
vermelhido generalizada. Existiam tambm leses vesculo-bolhosas com reas de coagulao e
necrose no assoalho bucal e na superfcie interna do lbio, alm de outras leses severas no
palato duro e mole. O diagnstico clnico foi de eritema multiforme, que tem como principal
fator etiolgico a reao alrgica resina. A prtese foi removida, imersa em gua aquecida sob
presso por 20min para remoo do monmero no polimerizado e cimentada com Temp-bond.
Medicamento para reduzir o edema e soluo para bochecho, para diminuir a dor, foram
prescritos. Os sintomas reduziram na primeira noite e, aps 4 dias, todos os sinais e sintomas
haviam desaparecido. Decorridos dois meses, foi realizado o teste de contato no qual nenhuma
reao foi observada para o cimento temporrio enquanto reaes moderada e severa foram
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 24
observadas para a resina acrlica e o monmero lquido, respectivamente, tendo sido comprovado
que o monmero residual havia sido o responsvel pela reao alrgica observada.
Desde a dcada de 30, quando as resinas acrlicas foram introduzidas no mercado,
existem vrios relatos de reaes a prteses confeccionadas com esses materiais. De acordo com
a reviso de literatura realizada por Weaver, Goebel
65
, em 1980, essas reaes frequentemente
incluem sintomas como ardncia na lngua e outras regies da cavidade bucal, vermelhido e
eroses na mucosa oral. As causas desses sintomas podem estar relacionadas com vrios fatores
como trauma devido prtese mal adaptada, irritao qumica local causada pela resina ou seus
constituintes, hipersensibilidade (alergia) resina acrlica ou aos seus componentes ou outras
doenas sistmicas e bucais no relacionadas com as resinas acrlicas. Existem relatos bem
documentados tanto de reaes de hipersensibilidade como irritao local causadas pelo
monmero metil metacrilato. As resinas autopolimerizveis contm concentraes maiores de
monmero residual e podem causar injria qumica local, sensibilizao, ou reao alrgica em
pacientes previamente sensibilizados. As resinas tambm contm aditivos que ainda no foram
completamente investigados e podem, em alguns casos, serem responsveis por reaes. Para
minimizar essas reaes, a utilizao de resinas temopolimerizveis adequadamente processadas
recomendada. Quando se utilizam prteses provisrias confeccionadas em resinas
autopolimerizveis, os mtodos indiretos devem ser preferidos aos mtodos diretos intra-orais
para prevenir o contato direto de altas concentraes de monmero com a mucosa oral. A injria
qumica direta mais provvel de ocorrer do que uma reao alrgica.
Danilewicz-Stysiak
12
, em 1980, realizou testes in vitro de citotoxicidade para dois
tipos de monmeros utilizados na odontologia: monmero com 99% de MMA e um lquido de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 25
resina acrlica para prteses dentrias (MP). O experimento foi realizado com fibroblastos de
embries de galinhas e os monmeros dissolvidos em meio de cultura nas seguintes
concentraes: 2 mg/ml; 1,5 mg/ml; 0,0075 mg/ml; 0,005 mg/ml; 0,0025 mg/ml; e 0,001 mg/ml.
Essas concentraes foram baseadas em estudo piloto que essas substncias foram letais s
clulas em concentraes entre 1 a 2 mg/ml, com o limite de toxicidade variando de 0,01 e 0,001
mg/ml. Durante o experimento, o meio de cultura das clulas foi substitudo a cada trs dias,
avaliando-se o crescimento celular por meio de microscpio ptico regularmente. Aps sete dias
de contato das clulas com os monmeros, a cultura foi fixada em lcool metlico e corada com
hematoxilina e eosina. O crescimento celular foi determinado de acordo com o coeficiente
mittico das clulas. Os resultados mostraram que, aps sete dias em contato com os monmeros,
esses coeficientes variaram de 35 a 124. Rpido crescimento celular foi observado nas culturas
com pequenas concentraes de monmeros, diminuindo com o aumento dessas concentraes,
no sendo observado crescimento celular nos meios contendo altas concentraes dos
monmeros. As modificaes na morfologia celular tambm foram correlacionadas com as
concentraes de monmeros s quais as clulas foram expostas, sendo observadas as seguintes
alteraes: distrbios nas estruturas da clula, degenerao progressiva do protoplasma e
destruio dos ncleos. Para o MP, a dose letal para as clulas foi de 1,5 mg/ml e para o MMA,
foi de 2 mg/ml. As doses mnimas de MP e MMA abaixo da qual no foram observadas
diferenas com relao ao controle (clulas cultivadas sem monmeros), foram de 0,0025 mg/ml
e 0,01 mg/ml, respectivamente. Foi concludo que o MMA tem efeito citotxico; porm, o MP,
que possui em sua composio outros componentes, foi mais citotxico do que o monmero
puro, indicando que os produtos adicionados ao monmero MMA tem potencial citotxico.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 26
Na literatura, existem relatos de reaes alrgicas ao monmero metil metacrilato.
Testes de contato com a pele demonstraram que alguns pacientes e profissionais da rea
odontolgica tambm eram hipersensveis ao formaldedo. Dessa forma, Ruyter
47
, em 1980,
realizou um estudo com o objetivo de avaliar a liberao e a origem do formaldedo em resinas
acrlicas para base de prteses. Foram selecionados 9 materiais, sendo 3 resinas
termopolimerizveis (Paladon 65, Swe Base e SR 3/60) e 6 resinas autopolimerizveis, sendo 3
fluidas (Palacast, Swe Flow e Ivocast) e 3 convencionais (Palapress, Swebond Compact e Quick
20). Corpos-de-prova (50 mm X 0,5 mm) foram confeccionados de acordo com as instrues dos
fabricantes e colocados em solues aquosas de dimedone, saturadas com ar ou argnio, para que
o formaldedo fosse liberado, sendo as solues analisadas por meio do mtodo HPLC. Tambm
foi analisado o contedo de MMA e agentes de ligao cruzada de cada resina e a formao de
formaldedo por meio da reao entre o oxignio e o monmero metil metacrilato. Os resultados
mostraram que, as trs resinas termopolimerizveis apresentaram menor liberao de formaldedo
quando comparadas com as outras 6 resinas. Em relao composio dos lquidos, as resinas
autopolimerizveis apresentaram diferentes tipos de agentes de ligao cruzada, sendo o 1,4-
butanediol dimetacrilato encontrado em 2 resinas (1 convencional e 1 fluida). As demais resinas
autopolimerizveis foram divididas em duas categorias: uma com baixo teor e outra com alto teor
do agente de ligao cruzada etileno glicol dimetacrilato. Aps 4 semanas a 37C, a reao entre
MMA e oxignio formou uma mistura contendo monmero MMA, metil piruvato, formaldedo e
copolmero oxignio-metilmetacrilato. O formaldedo pode ser formado como produto da: 1)
oxidao durante o perodo da reao de polimerizao; 2) quebra do co-polmero oxignio-metil
metacrilato; 3) oxidao do monmero metil metacrilato residual presente na resina polimerizada.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 27
Em 1981, Hensten-Pettersen, Wictorin
20
, realizaram estudo para verificar a
citotoxicidade de duas resinas acrlicas para base de prtese termopolimerizveis (SR 3/60 e
Dura-Flow), duas fluidas autopolimerizveis (Swe-Flow e Palacast) e duas autopolimerizveis
convencionais (Quick 20 Pink e Quick 20 Clear) correlacionando a influncia da citotoxicidade
com diferentes formas de armazenamento. Corpos-de-prova em formato de discos (40 mm X 4
mm) foram confeccionados, de acordo com as recomendaes dos fabricantes e de forma
assptica. Para a resina termopolimerizvel, A SR 3/60 foram utilizados dois processos de
polimerizao: (1) 73 C por 30min, sendo a temperatura aumentada at 100C e mantida por
30min; (2) 73 C por 9h. Apenas o primeiro ciclo foi utilizado para a resina Dura-Flow. Para
todas as resinas autopolimerizveis, foram utilizados dois mtodos de polimerizao: (1) 21 C
por 1h; (2) 45 C com presso com 2 Kpa por 30min. Discos de vidro com as mesmas dimenses
foram utilizados como controle. Os corpos-de-prova foram, ento, submetidos a duas condies
prvias ao teste: armazenamento em gua destilada por 1 a 4 dias; colocao em atmosfera
umidificada por 2 semanas. Para o teste de citotoxicidade, os corpos-de-prova (controle e
experimentais) foram colocados no fundo de placas de Petri. Clulas do epitlio oral humano
(NCTC 2544), foram adicionadas, na proporo de 0,6 X 10
6
em meio Eagle, e as placas
incubadas a 37 C com CO
2,
por perodos de at 4 dias ou 2-3 semanas. Aps os perodos de
incubao, os corpos-de-prova foram lavados com soluo salina, transferidos para outra placa de
petri com soluo de tripsina. Depois de 5min de incubao a 37 C, as clulas foram suspensas e
contadas como o auxlio do aparelho Celloscope 101. Os resultados mostraram que as clulas ao
redor dos corpos-de-prova possuam morfologia normal no tendo sido observada zona de
inibio do crescimento celular em nenhuma das culturas. Para as resinas Swe-Flow
(autopolimerizvel fluida), Quick 20 Pink e Quik 20 Clear (autopolimerizveis convencionais), o
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 28
crescimento celular foi de 40 a 60% em comparao com o grupo controle. A resina Palacast
apresentou menor crescimento celular e a SR3/6, taxas intermedirias. No houve diferena na
citotoxicidade quanto aos tipos de polimerizao utilizados. Em relao ao armazenamento, no
houve diferenas significativas no crescimento celular para as resinas SR 3/60 e Swe-Flow,
enquanto a resina Quick 20 apresentou diminuio na citotoxidade com o tempo. De acordo com
os resultados obtidos, a classificao das resinas em funo do mtodo de polimerizao no est
diretamente relacionada com o potencial citotxico das substncias por elas liberadas.
Muitos testes biolgicos requerem a mensurao da sobrevivncia e/ou
proliferao celular, que pode ser realizada por diferentes mtodos como contagem de clulas
mortas coradas ou no, mensurao de protenas marcadas com
51
Cr aps lise celular, marcao e
mensurao da incorporao de nucleotdeos radioativos (
3
H - timidina ou [
125
I]
iododeoxiuridina) durante a proliferao celular. Dessa forma, Mosmann
44
, em 1983, realizou um
estudo para verificar um novo mtodo de mensurao de clulas viveis que fosse rpido e capaz
de avaliar grande nmero de amostras. Para isso, o autor utilizou espectrofotmetro (leitor de
ELISA), que mensura grande nmero de amostras com alto grau de preciso, e investigou a
possibilidade de usar uma reao de alterao de cor como medida do nmero de clulas viveis.
Idealmente, um mtodo colorimtrico para se avaliar clulas viveis deveria utilizar um substrato
incolor que seja modificado em um produto colorido por clulas viveis mas no por clulas
mortas ou pelo meio de cultura. Os sais de tetrazlio foram considerados pelo autor como
adequados para esse propsito, tendo em vista que eles medem a atividade da enzima
desidrogenase. O anel tetrazlio quebrado na mitocndria ativa e, assim, a reao ocorre
somente em clulas viveis. Experimentos iniciais foram realizados com vrios sais de tetrazlio,
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 29
tendo sido o reagente mais promissor o MTT [3-(4,5-dimetiazol-2il-2,5-brometo de
difeniltetrazlio)], um substrato de cor amarelo claro que produziu o formazan azul escuro
quando incubado com clulas viveis. O mtodo desenvolvido foi considerado verstil e
quantitativo, e um avano sobre as tcnicas tradicionais usualmente utilizadas nos testes de
proliferao e citotoxicidade. Para testar o mtodo proposto, diferentes linhagens de clulas
foram utilizadas. Os resultados mostraram que a absorbncia diretamente proporcional ao
nmero de clulas vivas, que possuem uma atividade mitocondrial que gera um sinal forte,
sugerindo que a quantidade de cristais de formazam formados por cada clula depende do nvel
de metabolismo de energia. Alm disso, o mtodo capaz de detectar pequenos nmeros de
clulas viveis (200 clulas/orifcio). A principal vantagem do mtodo colorimtrico a rapidez
com que as amostras podem ser processadas. O substrato no interfere com a mensurao do
produto e, nas condies estabelecidas pelo autor, os componentes do meio tambm no
interferem. Isso permite que a leitura seja realizada sem a necessidade de fases de remoo ou
lavagem, o que aumenta a rapidez do teste e auxilia a minimizar a variabilidade entre amostras.
As leituras podem ser realizadas logo aps a colocao do cido isopropanol, para dissolver os
cristais de colorao azul escura, e a cor estvel por algumas horas a temperatura ambiente.
Uma ressalva feita pelo autor foi que, enquanto o mtodo colorimtrico mensura o nmero e a
atividade celular no fim do teste, o ensaio por incorporao de
3
H - timidina mede o nmero de
clulas que sintetizaram DNA durante as ltimas horas do teste. Assim, esse mtodo pode
potencialmente diferir daqueles que utilizam a incorporao de nucleotdeos radiativos. Esse fato
deve ser considerado para aplicaes especficas, ou seja, fazer a distino entre os aspectos que
sero avaliados: morte, viabilidade ou proliferao celular.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 30
Tem sido relatado que o monmero metil metacrilato pode causar reao de
hipersensibilidade na mucosa oral e pele, quando sua polimerizao no foi completa e ele
liberado na cavidade oral. Ali et al.
1
, em 1986, realizaram estudo com pacientes que
apresentavam sensao de ardncia bucal e eram usurios de prtese total. Foram utilizados
exames hematolgicos e de urina, para verificar eventuais problemas sistmicos; questionrio de
avaliao psicolgica; teste de contato com a pele para verificar sensibilidade ao metil
metacrilato ou outros componentes das resinas acrlicas; cromatografia gs/lquida de alta
resoluo para anlise de monmeros residuais; avaliao quanto presena de infeco por
Candida albicans. Foram selecionados 22 pacientes que relataram ardncia bucal e 22 pacientes
usurios de prteses, sem alteraes bucais ou sistmicas (controle). Os resultados mostraram que
todos os 22 pacientes que apresentaram a sensao de ardncia relataram que coincidiu com a
colocao das prteses. Alm da ardncia na regio dos tecidos superiores em contato com as
prteses, 15 pacientes relataram essa sensao em outros locais como lngua, mucosa labial e
tecido da faringe. Falhas de estabilidade, ajuste ou ocluso foram encontradas em 12 (55%) dos
pacientes. No foram encontradas evidncias de infeco por Candida em nenhum dos 44
pacientes. Nos exames hematolgicos, 2 pacientes apresentaram anemia e, nos de urina, 1
paciente apresentou glicosria. No teste psicolgico, 11 (50%) dos pacientes do grupo
experimental apresentaram alterao, enquanto no grupo controle, alteraes foram observadas
em 4 pacientes. Foi observado que, dos 22 pacientes do grupo experimental, 16 (73%) das
prteses apresentaram nveis de monmero residual maiores que 0,3%. Cinco pacientes
apresentaram reao positiva de alergia no teste de contato. Uma nova polimerizao das
prteses, a imerso em gua quente ou a substituio por prteses novas, diminuram os sintomas
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 31
em 4 pacientes. Nenhum dos pacientes do grupo controle apresentou resultado positivo para o
teste de alergia por contato.
Para que ocorra a sensibilizao dos pacientes, o monmero residual precisa ser
liberado da prtese para a saliva, por meio da qual ele conduzido at a mucosa oral ou, aps a
deglutio, at o trato gastro-intestinal. Em funo desses aspectos, Baker et al.
5
, em 1988,
realizaram o primeiro estudo in vivo para detectar a presena de MMA na saliva, no sangue e na
urina de 6 voluntrios dentados saudveis que utilizaram aparelhos removveis. Os aparelhos
foram confeccionados com a resina autopolimerizvel Orthoresin (poli metilmetacrilato -
PMMA), polimerizada durante 10min a 50C e presso de 204 kPa, ou com a resina
termopolimerizvel Lucitone 199, tambm a base de PMMA, processada com ciclos de 1, 3, 5 ou
7h a 70 C. A liberao do monmero foi detectada at o perodo de uma semana de utilizao
dos aparelhos. A quantidade total de monmero liberado de aparelho confeccionado em resina
autopolimerizvel na primeira hora foi de 6,2 a 29,5 g/mL. Nenhum monmero foi detectado na
saliva dos pacientes que utilizaram aparelhos confeccionados com a resina termopolimerizvel
processada com ciclos de 3h ou mais, enquanto para aqueles processados por perodo de 1h a 70
C, houve liberao de 6,3 g/mL. A concentrao de monmero residual na resina polimerizada
foi maior na regio superficial do que na parte interna. Alm disso, a quantidade de monmero
obtido a partir da saliva presente na superfcie interna de um dos aparelhos confeccionados com a
resina autopolimerizvel foi de 180 g/mL, superior ao valor de 40 g/mL observado na amostra
total de saliva obtida do mesmo paciente. Essa alta concentrao local de monmero
provavelmente poderia causar sensibilizao ou desencadear resposta alrgica na mucosa da
regio do palato, esclarecendo porque, em casos de estomatite alrgica, a inflamao
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 32
frequentemente restrita a rea recoberta pela prtese. No exame do sangue e urina dos pacientes,
no foi detectado MMA, provavelmente por ter se apresentado em pequenas concentraes. Os
autores realizaram alguns experimentos para avaliar as possveis causas de reduo da
concentrao de MMA na saliva. Foram testadas as hipteses de oxidao, evaporao ou
hidrlise do monmero em cido metacrlico, tendo sido esta ltima considerada a mais provvel.
Segundo os autores, as bases das prteses so constantemente banhadas pela saliva e enzimas
oxidativas tambm poderiam estar envolvidas na degradao do MMA, que ocorreu de forma
mais rpida na saliva que em gua. A maior parte do MMA foi liberada nas primeiras 24h aps a
colocao dos aparelhos confeccionados com a resina autopolimerizvel e nenhuma liberao foi
detectada quando os aparelhos foram imersos em gua por 24h previamente a sua colocao nos
pacientes, sendo esse procedimento recomendado pelos autores.
Para investigar o mecanismo de interao do eugenol com a membrana de
odontoblastos comparando-o com aqueles do fenol e trietileno glicol dimetacrilato (TEGDMA),
Fujisawa et al.
15
, em 1988, empregaram o mtodo de lipossomas de dipalmitoilfosfatidilcolina
(DPPC) e espectroscopia de ressonncia magntica nuclear. Nenhum sinal devido ao eugenol no
DPPC/eugenol lipossoma foi observado, indicando que a maior parte foi incorporado na dupla
camada de lipdios e no se difundiu para o meio externo aquoso. Foi observado, ainda, que o
efeito solubilizante do eugenol foi maior que o do fenol e que o efeito do eugenol na membrana
depende da concentrao utilizada. O sinal do TEGDMA no DPPC/TEGDMA lipossoma foi
dividido em dois picos: um pico menor (TEGDMA livre) e um pico maior (membrana-vinculado
TEGDMA). A quantidade de TEGDMA que foi incorporado na membrana foi menor que a do
eugenol, sugerindo que os grupos etileno glicol do TEGDMA atuaram nos DPPC lipossomas
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 33
como surfactantes e solubilizaram a camada lipdica. Dessa forma, os autores sugerem que, em
geral, os monmeros metacrilatos so incorporados na superfcie da dupla camada das
biomembranas e a membrana lipdica solubilizada.
Nos testes de biocompatibilidade in vitro, todavia, diferentes tcnicas tm sido
propostas para assegurar contato adequado dos materiais avaliados com as clulas, envolvendo
tanto o contato direto como o indireto. Wennberg
66
, em 1988, sugeriu o mtodo de filtro
Millipore que consiste em um ensaio de citotoxicidade baseado em contato indireto
clulas/materiais onde as clulas crescem em um lado do filtro e o material testado colocado do
lado oposto. Para a realizao do teste, filtros de Millipore em forma de discos (47 mm de
dimetro), com poros de 0,45 m, foram colocados em placas de petri. Clulas epiteliais humanas
(HeLa) ou fibroblastos de hamsters (L929) foram preparadas em suspenso, colocadas para
cobrir o filtro e a placa incubada por 24h a 37C em atmosfera umedecida com 5 % de CO
2.
Para
estabelecer o contato material/clula, foi preparado 5 ml de Bacto-agar (3%), com a mesma
quantidade de meio Eagle, colocado em uma nova placa de petri. O filtro Millipore com as
clulas aderidas foi lavado com soluo salina fosfatada (PBS), pr-aquecida a 37 C, e colocado
sobre o gar solidificado. Do lado contrrio ao das clulas, amostras dos materiais testados foram
colocadas e o disco incubado por 2h. Aps esse perodo de contato clula/material, o filtro com
as clulas aderidas foi removido, lavado com PBS, colocado em glutaraldedo para a fixao das
clulas, imerso em hematoxilina e eosina sendo, posteriormente, cortado em tamanhos
apropriados e imerso em xilol. Os filtros com as clulas aderidas tambm foram incubados por 3h
para demonstrao citoqumica da succinato-desidrogenase e, logo aps, examinados
macroscopicamente. Os resultados mostraram que filtros de Millipore, com poros de 0,45 m,
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 34
so suficientes para fixar as clulas e compatveis com a maior parte dos materiais, com exceo
dos cimentos de policarboxilato, que aderem ao filtro podendo causar danos. O mtodo tambm
permitiu avaliar a atividade enzimtica como um indicador do metabolismo celular, utilizando a
succinato-desidrogenase, que forma um precipitado com colorao somente onde h atividade
enzimtica, ou seja, dentro das clulas vivas. Assim, o autor concluiu que o presente teste pode
ser utilizado para citotoxicidade independente do estado fsico do material a ser testado, sendo
uma tcnica simples, rpida e de reproduo fcil, baseada na atividade enzimtica.
Na cavidade bucal, as prteses so continuamente lavadas por saliva e cobertas
por placa que podem apresentar baixo pH, em funo da fermentao e dieta, expondo, dessa
forma, as prteses a condies cidas. Assim, Koda et al.
30
, em 1990, realizaram um estudo com
o objetivo de avaliar a associao de liberao de produtos por resinas acrlicas e o meio cido.
Para isso, foi analisada, quantitativamente, a liberao de cido benzico, cido metacrlico,
metacrilato de metila e acrilato de metila a partir de resinas acrlicas imersas em saliva artificial
com diferentes pHs (de cido a neutro), por meio do HPLC. Foram utilizadas trs resinas
acrlicas com diferentes tipos de polimerizao: autopolimerizvel (Rebaron n 3),
termopolimerizvel (Acron n 8) e polimerizada por microondas (Acron MC n 8). Corpos-de-
prova em forma de disco (8 mm de dimetro e 2 mm de espessura) foram confeccionados,
colocados em frascos tampados contendo saliva artificial apresentando diferentes pH (4, 5, 6 e
6,8) e incubados a 37 C. Os resultados mostraram que o cido benzico, o metacrilato de metila
e o cido metacrlico foram liberados por todas as resinas. Houve maior liberao de substncias
qumicas pela resina autopolimerizvel quando comparada com os outros dois mtodos de
polimerizao e a quantidade de metacrilato de metila, cido benzico e cido metacrlico
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 35
aumentou com o tempo de imerso. Com relao ao pH, a concentrao de metacrilato de metila
foi maior nas solues com pH mais baixo (4,0). Em pH mais alto (6,8), a concentrao de
metacrilato de metila diminuiu enquanto a de cido metacrlico aumentou, provavelmente devido
hidrlise do metacrilato de metila. Nenhuma relao entre o pH e as concentraes de cido
benzico liberadas foi observada. As variaes de pH da saliva podem modificar as aes
adversas das resinas acrlicas autopolimerizveis por alterar as propores das concentraes
relativas entre o metacrilato de metila e o cido metacrlico. Os resultados tambm sugerem que
as aes txicas das resinas autopolimerizveis podem ser atribudas, potencialmente, ao
metacrilato de metila sob condies mais cidas e ao cido metacrlico em condies de menor
acidez.
Condicionadores teciduais so produtos compostos por polietil metacrilato ou
polmeros similares, steres plastificantes, que podem ser citotxicos, e lcool como solvente.
Okita, Hensten-Pettersen
45
, em 1991, utilizaram o mtodo de gar overlay para testar a
citotoxicidade dos reembasadores teciduais temporrios Coe Comfort (CC), GC Soft Liner (GC),
Kerr FITT (KF) e Visco-gel (VG). Os corpos-de-prova de cada material, foram preparados
assepticamente com dimetro de 12 mm e espessura de 2 mm, polimerizados a temperatura de 37
C por 30min. Aps esse perodo, os corpos-de-prova foram armazenados em meio de cultura por
1h, 24h, 8 dias e 15 dias a 37 C. Corpos-de-prova dos materiais logo aps a manipulao
tambm foram avaliados. Para o teste de citotoxicidade, fibroblastos de hamster L929 (6,1 X 10
5

clulas) foram colocadas em placas de petri e, aps 2 dias, o meio de cultura foi removido e 5 ml
de meio de cultura contendo 1% de agarose foi adicionado. Quando esse material solidificou, as
clulas foram coradas com vermelho neutro por 15min a 37 C. Os corpos-de-prova foram, ento,
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 36
colocados sobre a superfcie do gar. Polietileno e polivinilcloreto foram utilizados como
controles negativo e positivo, respectivamente. Aps 24h de incubao a 37 C em atmosfera de
4% CO
2
, a cultura foi examinada em microscpico avaliando-se a zona de inibio e o ndice de
lise celular e a soma dos ndices de reao (IR). Os resultados mostraram que o controle negativo
no causou nenhuma alterao nas clulas, e o controle positivo induziu a morte celular. Os testes
realizados com corpos-de-prova logo aps a manipulao e aqueles com corpos-de-prova
armazenados pelos perodos de 1 e 24h, demonstraram que todos os materiais testados foram
citotxicos. O ndice IR revelou que os materiais CC e KF foram mais citotxicos que GC e VG.
Para os perodos de 24h, 8 e 15 dias, os condicionadores de tecidos CC e KF continuaram sendo
mais citotxicos que os outros materiais (GC e VG). Um dos fatores que foram relacionados com
a citotoxicidade observada foi a presena de plastificantes, usualmente steres ftalatos, na
composio dos materiais.
Tem sido observado que o PB, embora no mutagnico, produz danos ao DNA
celular, sendo um promotor de tumor, e que essa ao seria mediada por radicais livres derivados
desse composto. Estudos prvios viram que o metabolismo do PB em queratincitos ocorre via
clivagem inicial da ligao do perxido, gerando radicais benzoiloxil que, por sua vez,
fragmentam-se em radicais fenil e dixido de carbono ou tomos de hidrognio e cido benzico
(AB). AB o produto mais estvel do PB produzido pelos queratincitos. Dessa forma, Swauger
et al.
56
, em 1991, estudaram o efeito do PB e seus produtos de degradao em induzir ciso do
DNA celular. O PB produziu danos no DNA de forma dose-dependente, com faixa de
concentrao superior de 0,1-1mM, necessitando da presena de cobre. Em contraste, AB no
produziu danos no DNA celular, tanto na presena como na ausncia de cobre. A incluso de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 37
alguns produtos como o n-tert-butil--fenilnitrone (PBN), 3,5-dibromo-4-nitro benzesulfonato e
nitroso-benzeno reduziram significantemente o grau de leses no DNA causado atravs da
ativao do PB pelo cobre. Esses resultados demonstraram que os radicais livres so os
responsveis pelos danos ao DNA observados. As anlises em espectroscopia de ressonncia
eletrnica paramagntica sugeriram que o principal radical da decomposio do PB capturado
pelo PBN foi o radical benzoiloxil. Essas informaes sugerem que as ligaes do PB podem ser
clivadas na presena de cobre, resultando na formao do radical benzoiloxil o qual pode
produzir danos ao DNA celular.
Foram introduzidas no mercado, resinas acrlicas fotopolimerizveis para base de
prteses. Logo aps, fabricantes sugeriram o uso de selantes resinosos para proporcionar a essas
resinas lisura superficial a fim de reduzir o acmulo de placa bacteriana, alm de promover maior
dureza e resistncia abraso. Para testar a biocompatibilidade desses materiais, Lefebvre et al.
36
,
em 1992, realizaram teste de citotoxicidade para dois selantes (Palaseal e Extoral) utilizados com
trs resinas fotopolimerizveis (Triad, Astron LC Hard e Extoral) e uma polimerizada em banho
de gua quente como controle (Lucitone 199). Foram confeccionados, em condies asspticas, 3
corpos-de-prova em forma de disco (1 cm X 1 mm), para cada material, sendo as resinas
fotopolimerizveis processadas de duas formas: (1) sem barreira de ar; (2) com barreira de ar
(removida, posteriormente, com escova estril e gua, e lavada em gua destilada por 30s ). Os
corpos-de-prova foram divididos em trs grupos: um sem selante, e os outros dois grupos, cada
um com um dos selantes selecionados, polimerizados de acordo com instrues dos fabricantes.
Para o teste de citotoxicidade, foram utilizadas clulas epiteliais de hamsters e a sntese de
protenas foi monitorada por meio da incorporao do radioistopo
35
S-metionina. Os resultados
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 38
mostraram que o selante Extoral apresentou menor inibio de produo de protenas em
comparao ao grupo sem aplicao de selante. Para o Palaseal, a resposta foi oposta, resultando
em maior citotoxicidade que a resina sem este selante. Os resultados indicaram que o selante
Extoral protege as clulas do efeito txico dos componentes das resinas, enquanto o selante
Palaseal aumenta esse efeito. Com relao aos corpos-de-prova com barreira de ar, apesar de o
Palaseal ter tornado as resinas menos citotxicas nessa condio experimental, o Extoral
apresentou melhores resultados de citotoxicidade em todas as resinas testadas. Assim, foi
observado que o uso de um selante bem selecionado pode reduzir a citotoxicidade das resinas
para base de prteses.
O monmero metil metacrilato residual presente nas bases das prteses de resina
acrlica pode ser liberado e entrar em contato com a mucosa oral, principalmente na regio dos
tecidos de suporte. Existem vrios relatos de reao alrgica ou de irritao da mucosa causadas
por prteses confeccionadas com esses materiais. Assim, Sadamori et al.
48
, em 1992, realizaram
estudo com o objetivo de verificar o contedo de monmero residual em bases de prteses e
estimar sua reduo durante longos perodos de utilizao. Para a realizao do experimento,
foram utilizadas 24 prteses totais superiores, das quais foram retiradas pequenas pores da
regio posterior (0,2 mg, aproximadamente). As amostras foram colocadas em tubos contendo
metil etil cetona e armazenadas por 96h a 4C. Em seguida, 25 l de p-xilol foram adicionados
aos tubos e levados para a centrifugao. O extrato foi analisado pelo mtodo HPLC. Os
resultados mostraram que a taxa de monmero residual variou de 0,12% a 4,22%. Alm disso, o
contedo de monmero residual foi usualmente menor nas prteses em utilizao por perodos
longos que naquelas em utilizao por perodo curto de tempo. Isso sugere que, apesar de existir
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 39
liberao de monmero residual por muitos anos, o contedo de monmero residual das resinas
acrlicas para base de prteses diminui com o aumento do tempo de utilizao, e a maior
liberao ocorre nos primeiros 5 anos.
As resinas fotopolimerizveis para prteses podem ser classificadas de acordo
com o modo de polimerizao em polimerizada apenas por luz visvel (PVL), ou com luz visvel
e quimicamente polimerizada (dual). Essas resinas possuem um tratamento superficial para
impedir o contato com o oxignio da atmosfera e favorecer a maior converso dos monmeros
presentes. Dessa forma, Barron et al.
6
, em 1993, realizaram estudo para comparar a
biocompatibilidade, atravs da anlise in vitro da sntese de DNA e RNA em clulas do epitlio
oral de hamsters, de uma resina PLV (Triad) e de duas resinas de polimerizao dual (Astron
LCH e Extoral), com uma resina polimerizada em banho de gua quente (Lucitone 199). Para
cada resina, foram preparados trs corpos-de-prova (10 mm de dimetro X 1 mm de espessura)
variando o tempo de polimerizao (5 ou 10 min ). Trs tratamentos foram avaliados: sem
aplicao da barreira de ar, com aplicao da barreira de ar aps a polimerizao e aplicao de
barreira de ar aps a polimerizao, seguida da escovao do corpo-de-prova com escova e gua
estreis. Para o teste de citotoxicidade, clulas do epitlio oral de hamsters (4,5 X 10
5
) foram
colocadas em orifcios de placas de cultura de clulas contendo os discos de resina. Aps 24h de
incubao a 37 C com 5 % de CO
2
, cada cultura foi examinada utilizando microscpio de
contraste de fase. Para a verificao da sntese de DNA e RNA, aps as 24h de incubao inicial,
o meio de cultura foi substitudo por meio de cultura contendo 15 Ci/mL de
3
H-Uridine, para
marcar o RNA e 4 Ci/mL de
3
H-Timidina para marcar DNA e incubada por mais 24h. Os
resultados mostraram que, aps 24hs de exposio aos corpos-de-prova, as clulas em contato
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 40
com as resinas para reembasamento (PVL ou dual) no apresentaram caractersticas normais.
Contudo, as que estavam em contato com a resina polimerizada em banho de gua quente
apresentaram normalidade. Todas as resinas para reembasamento, nas diferentes condies
experimentais, apresentaram inibio da sntese dos nucleotdeos em comparao ao grupo
controle. O aumento do tempo de polimerizao diminuiu a citotoxicidade das resinas Astron
LCH e Triad. A utilizao da barreira de ar pode aumentar o grau de citotoxicidade em algumas
delas (Astron LCH e Extoral). As resinas PLV e dual apresentaram-se mais txicas que a resina
polimerizada em gua quente (Lucitone 199) e, dos dois nucleotdeos analisados, o DNA foi mais
sensvel no teste de citotoxicidade. Os autores tambm relataram que os efeitos citotxicos
poderiam estar relacionados com a presena de constituintes no polimerizados nas resinas ou
com sub-produtos da polimerizao.
Algumas resinas para base de prtese e materiais reembasadores resilientes
possuem plastificantes em suas composies. At 1992, entretanto, no existiam relatos na
literatura sobre a liberao desses plastificantes na cavidade oral. Desta forma, Lygre at al.
40
, em
1993, realizaram estudo com o objetivo de quantificar plastificantes presentes na saliva de
indivduos usurios de prteses removveis. Foram selecionados 4 homens e 7 mulheres que
utilizavam prtese, com mdia de idade de 67,8 anos. Novas prteses foram confeccionadas
utilizando a resina termopolimerizvel (Vertex 5RS) de acordo com as instrues do fabricante.
Para identificar as substncias liberadas na saliva pelas prteses, corpos-de-prova (26 x 26 x 3
mm) foram confeccionados sob as mesmas condies das prteses, e colocados em recipientes de
vidro contendo 80 ml de etanol, cobertos com folha de alumnio e levados para agitao por 20h
a 37 C. Em seguida, as amostras foram analisadas pela espectrometria de massa associada
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 41
cromatografia a gs, para identificao dos diferentes produtos liberados a partir de cada amostra.
Foram coletadas amostras de saliva dos pacientes com a prtese antiga e aps uma semana de
utilizao das prteses novas. Como grupo controle, foram coletadas amostras de saliva de 11
indivduos que no usavam prtese, com mdia de idade de 22,9 anos. Os resultados mostraram
que dibutil ftalato e fenil benzoato foram encontrados na saliva dos pacientes com prteses
novas, porm no foram detectados nas amostras de saliva do grupo controle ou durante a
utilizao das prteses antigas. Dessa forma, foi concludo que os aditivos dos polmeros para
base de prteses (plastificantes) so liberados na saliva de indivduos que utilizam prteses
recentemente confeccionadas em condies clnicas normais.
Algumas substncias liberadas pelas resinas para base de prteses so
responsveis por reaes adversas nos tecidos orais, entre as quais o formaldedo. Assim,
Tsuchiya et al.
59
, em 1993, realizaram experimento para quantificar o formaldedo liberado por
resinas para base de prtese, com diferentes tipos de polimerizao. Foram selecionadas uma
resina autopolimerizvel (Rebaron n 3), uma termopolimerizvel (Acron n 8) e uma
polimerizada por meio de microondas (Acron MC n 8). Corpos-de-prova em forma de disco (8,5
mm X 2 mm) foram confeccionados, colocados em frascos de vidro com gua destilada que
foram mantidos sob leve agitao em banho de gua a 37 C. Alquotas de 50 a 70 l foram
coletadas em diferentes intervalos de tempo e analisadas pelo mtodo de injeo em fluxo com
detector de fluorescncia. Para avaliar a influncia do tempo na quantidade de substncias
liberadas, 10 discos de resina autopolimerizvel foram colocados em frascos contendo saliva
artificial e incubados a 37 C; 5 destes corpos-de-prova, tiveram a camada superficial de inibio
removidas com lixa de carberto de silcio. A cada dia, a quantidade de formaldedo e de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 42
metacrilato de metila liberada foi determinada pela anlise da injeo em fluxo e por
cromatografia lquida de alta resoluo. Os frascos contendo os discos de resina
autopolimerizvel eram lavados e novas alquotas de saliva artificial eram colocadas aps cada
anlise. Os resultados indicaram que a quantidade acumulada de formaldedo liberado a partir da
resina autopolimerizvel foi maior nas amostras coletadas aps 10 dias de imerso em saliva
artificial do que naquelas coletadas nos intervalos de 1 e 5 dias. Alm disso, os discos de resina
autopolimerizvel que tiveram a camada de inibio removida liberaram menor quantidade de
formaldedo quando comparadas aos discos no desgastados. Os discos de resina
termopolimerizvel e os polimerizados por microondas liberaram menor quantidade de
formaldedo quando comparados com os de resina autopolimerizvel. Os corpos-de-prova
imersos na saliva artificial, para determinar a influncia do tempo na liberao de produtos pela
resina acrlica autopolimerizvel, mostraram que quanto maior o tempo transcorrido, menor a
quantidade de produtos liberados. A liberao de metacrilato de metila tambm seguiu padro
similar. A provvel causa da formao do formaldedo liberado neste estudo seria a oxidao do
monmero residual metacrilato de metila.
Lefebvre et al.
34
, em 1994, realizaram estudo com o objetivo de verificar a
citotoxicidade de produtos liberados por 4 resinas para bases de prteses fotopolimerizveis
(Triad, Triad High Flow, Astron LC Hard e Extoral) e uma resina termopolimerizvel (Lucitone
199), em diferentes tempos. Foram confeccionados, em condies asspticas e de acordo com
instrues dos fabricantes, 3 discos para cada material nas seguintes dimenses: 1 cm de
dimetro e 1 mm de espessura. Para o preparo dos eluatos, as amostras foram colocadas em
frascos contento meio de cultura por 24h , em uma mesa giratria. Os discos foram transferidos
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 43
para meios de cultura recm preparados diariamente durante 10 dias e os eluatos obtidos foram
armazenados por dois perodos antes dos testes de citotoxicidade: 24h e 30 dias a 4 C. Para a
relizao desses testes, clulas epiteliais de hamster, suspensas em 50 l de meio de cultura
contendo as substncias liberadas e 50 l de meio de cultura fresco foram colocadas em placas de
cultura e incubadas por 24h ou 48h. Orifcios contendo somente clulas e meio de cultura sem os
eluatos foram utilizados como controle. Para a anlise da citotoxicidade, foram utilizados os
testes MTT, que verifica a produo de enzima desidrogenase mitocondrial, e a monitorizao da
sntese de RNA por meio da incorporao de radioistopo. Os resultados mostraram que os
componentes liberados pelas resinas acrlicas termo ou fotopolimerizveis podem causar efeito
txico s clulas epiteliais orais. As diferenas nos padres de toxicidade observadas nos vrios
perodos de imerso em que os eluatos foram obtidos (de 1 10 dias), principalmente aps 24h
de incubao das clulas com esses eluatos, podem estar relacionadas com o grau de
polimerizao e quantidade de carga e densidade dos materiais. Diferenas nesses aspectos
poderiam influenciar a quantidade de componentes liberados e a velocidade de liberao. Os
diferentes nveis de toxicidade observados tambm sugerem que a liberao de componentes
txicos das resinas pode continuar por vrios dias aps a polimerizao. Para os eluatos que
foram armazenados durante 30 dias antes dos testes, que foram avaliados pelo teste de MTT com
perodos de 4, 24 e 48h de incubao, foi observado um aumento significativo na atividade
enzimtica aps 4h. Essa atividade diminuiu ou desapareceu nos testes de MTT de 24 a 48h, e os
eluatos obtidos no segundo dia de imerso dos discos, quando incubados com as clulas por 48h,
proporcionaram resultados semelhantes ao controle. Segundo os autores, os resultados obtidos
sugerem que a imerso das prteses em gua por 24h antes da colocao nos pacientes pode
minimizar a exposio dos tecidos a substncias citotxicas.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 44
No incio da dcada de 80, foram desenvolvidas as resinas para base de prtese
fotopolimerizveis. Embora essas resinas no contenham MMA, elas possuem bis-GMA que
tambm pode ser txico. Dessa forma, Lefebvre, Schuster
33
, em 1994, apresentaram uma reviso
dos estudos por eles realizados para avaliar a citotoxicidade de trs resinas mais comumente
utilizadas (Triad, fotopolimerizvel; Extoral e Astron, de polimerizao dual). Nesses estudos
tem sido utilizados corpos-de-prova em forma de discos (1 cm X 1 mm) e clulas do epitlio oral
de hamster. Trs tipos de corpos-de-prova foram avaliados: 1-polimerizados sem o agente
inibidor de oxignio; 2- aplicao do agente inibidor de oxignio, que foi mantido na superfcie
da resina aps a polimerizao; 3-fotopolimerizado com o agente inibidor de oxignio, que foi
removido da superfcie da resina aps a polimerizao, utilizando-se escova estril e gua. Como
controle, foi utilizada a resina acrlica Lucitone 199, termopolimerizvel de alto impacto. Aps
perodo de incubao, foram realizados diferentes testes: efeito sobre as protenas celulares,
sntese de RNA e DNA, que foram mensurados com a utilizao dos radioativos metionina,
uridina, e timidina, respectivamente. Os resultados mostraram que, dos testes utilizados a sntese
de protena e de DNA apresentaram maior resposta aos efeitos txicos das resinas que a sntese
de RNA. Provavelmente as etapas associadas com o metabolismo de protena e de DNA devem
ser menos diversificadas que aquelas envolvidas na sntese de RNA, sendo, portanto, mais
sensveis. Do ponto de vista clnico, a resposta do DNA tem implicaes mais srias, resultando
em substituio mais lenta das clulas basais e, consequentemente, numa mucosa mais fina. Em
geral, as resinas fotopolimerizveis foram mais citotxicas que a termopolimerizvel Lucitone
199 e as resinas de polimerizao dual foram menos citotxicas que as polimerizadas apenas por
luz, sendo a Extoral a que menos inibiu o crescimento celular. A aplicao do inibidor de
oxignio da resina Extoral no afetou a toxicidade. Entretanto, para as resinas Triad e Astron a
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 45
utilizao do agente inibidor aumentou significativamente os efeitos txicos. Com o objetivo de
proporcionar superfcies lisas que auxiliem a reduzir a formao de placa e aumentar a resistncia
do material abraso e ao de agentes de limpeza, os fabricantes tm recomendado a
utilizao de selantes (Palaseal e Extoral) que so aplicados aps a polimerizao. Esses selantes
tambm poderiam reduzir a toxicidade dos materiais. Assim, a aplicao desses selantes nas
resinas Triad, Extoral e Astron foi avaliada em relao toxicidade. Quando comparados s
resinas sem selante, o Palaseal resultou em maior inibio da sntese de protenas enquanto a
aplicao do Extoral diminuiu a toxicidade das resinas. Os autores avaliaram, tambm, o tipo e a
biocompatibilidade dos produtos liberados pelas resinas. Foram realizados testes de liberao e
extrao das resinas aps perodos de 24, 48 e 72h de imerso em gua, metanol ou acetonitrila.
Vrias substncias foram detectadas, tendo sido observado que as resinas liberaram componentes
similares. Em outros estudos, foram avaliados a toxicidade dos produtos liberados pelas resinas
imediatamente aps a obteno dos eluatos ou aps eles terem sido armazenados por 30 dias 4q
C. Os eluatos foram obtidos em diferentes perodos de imerso dos discos das resinas em meio de
cultura. Os resultados indicaram que mais de uma substncia txica liberada pelas resinas
recm polimerizadas, porm os nveis parecem ser sub-txicos aps vrios dias de
armazenamento.
As respostas teciduais s resinas acrlicas para bases de prteses so usualmente
atribudas ao monmero MMA, porm o formaldeido liberado desses materiais tambm pode
causar danos aos tecidos. Assim, Tsuchiya et al.
55
, em 1994, realizaram estudo para verificar a
liberao de monmero metil metacrilato e formaldedo de resinas acrlicas a base de metil
metacrilato, assim como a citotoxicidade desses componentes e testar um mtodo simples para
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 46
diminuir a liberao. Foram avaliadas trs tipos de resinas (Rebaron n 3 - autopolimerizvel,
Acron n 8 - termopolimerizvel e Acron MC n 8 - polimerizada por meio de microondas).
Corpos-de-prova (8,5 mm X 2 mm) foram confeccionados e divididos em dois grupos: imerso
em saliva humana ou saliva artificial, ambos incubados a 37q C. Discos de resina
autopolimerizvel tambm foram inseridos na cavidade oral de indivduos saudveis e a saliva
coletada. Para quantificar o formaldedo liberado, foi utilizada a anlise de injeo em fluxo. A
quantidade de metacrilato de metila foi analisada pela cromatografia lquida de alta resoluo.
Para anlise da citotoxicidade, solues de formaldedo (2,0 100,00 nmol/ml) e MMA (0,2 10
mol/ml) foram dissolvidos no meio de cultura contendo clulas L na concentrao de 6,0 x 10
6

clulas/ml, e colocados em uma placa para cultura de clulas e incubadas 37 C, com atmosfera
de CO
2
, por 2, 3 e 5 dias. Aps estes perodos, as clulas foram suspensas em soluo salina e
contadas em nmero de clulas por cm
2
, utilizando um hemacitmetro. Amostras de resinas
acrlicas autopolimerizveis foram imersas em gua a temperatura ambiente, 20 ou 50 C e, aps
60min, foi realizada anlise da quantidade de substncias liberadas. Os resultados mostraram que
houve liberao de formaldedo e de metacrilato de metila em todos os meios de imerso, a
liberao diminuiu com o tempo e o contedo liberado in vitro foi maior do que o in vivo. Houve
maior liberao de produtos pelas resinas autopolimerizveis do que pelas resinas polimerizadas
por calor e microondas, tendo sido os valores observados, no primeiro dia de imerso, de 41,9
2,1 nmol/ml/dia para o formaldedo e de 0,97 0,06 mol/ml para o metil metacrilato. A
liberao foi maior no perodo de um dia e menor no perodo de um ms. O formaldedo e o
metacrilato de metila foram txicos s clulas, porm, o formaldedo mostrou-se citotxico em
menores concentraes. Concentraes de metil metacrilato de 1,0 a 5,0 mol/ml reduziram o
nmero de clulas a 50% e 70% em relao ao valor obtido no controle, porm nenhum efeito
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 47
txico foi observado com concentraes menores que 0,5 mol/ml. A imerso dos discos de
resina acrlica autopolimerizvel em gua a 50 C reduziu a quantidade de subprodutos liberados.
Assim, os autores sugeriram a imerso das prteses de resina acrlica em gua a 50 C, por pelo
menos 60min , antes da instalao, para diminuir seu potencial citotxico, principalmente para as
resinas autopolimerizveis utilizadas para a confeco ou o reembasamento de prteses.
Schmalz
49
, em 1994, realizou uma reviso da literatura para verificar as vantagens
e limitaes do uso de culturas celulares para testes de citotoxicidade. Foi verificado que existem
vrios mtodos de testes in vitro que consistem basicamente de trs componentes: a) o sistema
biolgico; b) o contato do material com as clulas e o aspecto biolgico final a ser avaliado; c) os
sistemas utilizados para atingir o objetivo. Os sistemas biolgicos utilizados podem ser cultura de
rgos, de clulas e organelas celulares, sendo a mais utilizada para materiais odontolgicos a
cultura de clulas tanto de linhagem permanente (que podem ser comercializadas) como de
cultura primria (colhidas de indivduos e mantidas em laboratrio). Estudo utilizando o teste
gar-overlay indicou que, independente do tipo de clulas utilizadas (linhagem permanente ou
primria) os principais efeitos observados foram similares. As clulas de linhagem permanente
so bem definidas e geralmente disponveis, enquanto as de linhagens primrias, apesar de
simular melhor as condies clnicas, no so definidas sendo disponveis somente em
determinados laboratrios, devendo ser utilizadas para estudos especficos. O contato dos
materiais com as clulas pode ser feito de forma direta, indireta ou atravs de eluatos. E, os
resultados podem ser analisados considerando-se a morfologia celular ou atravs de diferentes
aspectos biolgicos tais como: efeito na membrana celular, atividade celular e taxa de
proliferao. Um dos mtodos empregados para anlise da viabilidade celular a utilizao do
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 48
corante azul de tripan, no qual as clulas mortas so coradas e as viveis no. Os testes de
atividade celular baseiam-se na taxa de metabolismo de certas substncias, por meio da qual a
atividade de uma enzima ou outras substncias pode ser mensurada. Um dos mtodos que tem
sido utilizado a incorporao do radioistopo
14
C-timidina que permite avaliar a sntese de
DNA. Os testes de genotoxicidade podem ser realizados com bactrias ou clulas humanas e o
contato material/clulas pode ser de forma indireta ou por eluato. As vantagens dos mtodos de
toxicidade in vitro consistem na possibilidade de controle das condies experimentais, baixo
custo, realizao rpida e sem envolver aspectos ticos. E, como limitao, pode ser verificada a
falta de simulao das condies in vivo e a dificuldade de extrapolar os dados obtidos para os
pacientes. Os resultados obtidos em estudos de toxicidade in vitro podem somente ser
interpretados dentro de uma srie de materiais de uma mesma categoria (anlise relativa de
toxicidade) e a comparao direta e extrapolao dos resultados obtidos em cultura de clulas
para os pacientes no possvel. Estudos in vivo com animais demonstram os fenmenos que
ocorrem, mas no os mecanismos que os induziram. Os estudos in vitro so capazes de elucidar
esses mecanismos, porque diferentes aspectos do complexo sistema in vivo podem ser
investigados, separadamente, em experimentos in vitro.
Estudos in vitro utilizando estrognio de mamferos revelaram que os dois steres
ftalatos, butil benzil ftalato (BBP) e DBP, so estrognicos. Esses steres ftalatos so comumente
utilizados na fabricao de vrios produtos plsticos. A presena desses steres no meio ambiente
e a tendncia para acmulo em gordura animal, por serem lipoflicos, so bem conhecidos.
Assim, Jobling et al.
24
, em 1995, testaram a capacidade estrognica de 20 compostos,
considerados como possveis contaminantes do meio ambiente, e relataram que alguns deles
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 49
podem interagir com o receptor estradiol. Os compostos DBP e BBP foram estrognicos in vitro
em concentraes entre 10
-6
a 10
-4
M. Houve reduo na ligao do estrgeno 17E aos receptores
celulares, quando as clulas foram cultivadas na presena desses compostos. Esses resultados no
podem, entretanto, serem utilizados para predizer a atividade estrognica in vivo. Considerando-
se que todos os ftalatos so lipolfilicos, eles apresentam a tendncia de se acumular nas clulas
adiposas e podem ser absorvidos pela pele humana. Entretanto, uma vez ingeridos, podem ser
metabolizados e eliminados.
Componentes txicos podem se difundir em ambientes aquosos e atingir stios
distantes das reas de contato da mucosa com a resina. Esse fator, agrava-se em pacientes que
apresentam a mucosa infectada, inflamada, lacerada ou frgil como resultado de problemas
nutricionais ou utilizao de medicamentos. Dessa forma, grandes reas da mucosa podem ser
expostas a esses componentes txicos durante um prolongado perodo de tempo. Alm disso,
sabe-se que a cavidade oral est sujeita a constante variao de pH devido ingesto de
alimentos e lquidos. Com base nessas informaes, Lefebvre et al.
35
, em 1995, realizaram um
estudo com o objetivo de verificar o efeito de diferentes pHs sobre a citotoxicidade de uma resina
termopolimerizvel para base de prtese (Lucitone 199) e duas para reembasamento sendo uma
polimerizvel por luz visvel (Triad) e outra com polimerizao dual (Extoral). Corpos-de-prova
em forma de discos (1 cm X 1 mm) foram confeccionados em condies asspticas. Para as
resinas fotopolimerizada e dual, os corpos-de-prova foram produzidos de duas formas: (1) sem
agente inibidor de oxignio; (2) com agente inibidor de oxignio (removida com escova estril e
gua, e lavada em gua destilada por 30s ). As preparaes dos eluatos foram feitas utilizando-se
o tampo Michaelis barbital (pH 4,0, 5,0 e 6,8) colocado em contato com amostras das resinas e
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 50
trocado, diariamente, durante 5 dias. Meio de cultura foi, ento, adicionado para obter pH dentro
da variao fisiolgica (7,2, 7,6, 7,7). Para o teste de citotoxicidade foram utilizadas clulas
epiteliais de hamster e a viabilidade celular foi avaliada pelo RNA, por meio da incorporao do
3
H-Uridina e mensurao em contador de cintilao. Os resultados mostraram que apenas os
eluatos obtidos at o terceiro dia de imerso das amostras de todas as resinas, apresentaram
diferenas estatisticamente significantes entre alguns pHs. O eluato da resina Lucitone 199, em
pH 4,0, produziu inibio significativa na sntese de RNA no primeiro dia e aumento no segundo
dia. Para o pH 5,0, o eluato do primeiro dia resultou em aumento em relao ao controle,
enquanto no pH 6,8 no apresentou diferena comparado com o controle. A resina Triad, no
primeiro dia apresentou inibio da sntese de RNA para todos os pHs e, na anlise dos outros
dias, pode-se sugerir que, para esta resina, o pH 5,0 mais citotxico que os pHs 4,0 e 6,8. A
resina Extoral apresentou maior citotoxicidade para os dois primeiros dias, em todos os pHs. Os
componentes txicos so liberados em diferentes quantidades e velocidades, e a quantidade
liberada pode ser afetada pelo pH. No houve diferenas significativas entre os eluatos obtidos a
partir dos corpos-de-prova produzidos sem agente inibidor de oxignio e com esse agente,
removido aps a polimerizao. O aumento observado em algumas condies experimentais foi
relacionado com o fato das clulas no se apresentarem seriamente comprometidas e
compensarem os danos por meio do aumento de vrias respostas na sua sntese, como a sntese de
RNA.
Biomateriais polimricos esto sujeitos a influncias mecnicas e qumicas e
podem apresentar degradao e liberao de componentes. Para avaliar a toxicologia dos
biomateriais, recomendvel identificar e quantificar os componentes liberados. Dessa forma,
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 51
Lygre et al.
39
, em 1995, realizaram um estudo com o objetivo de separar, identificar e quantificar
os componentes orgnicos liberados in vitro de algumas resinas para base de prtese base de
PMMA. Corpos-de-prova (50 mm X 0,5 mm) de cada resina foram confeccionados de acordo
com as instrues dos fabricantes. A resina termopolimerizvel Vertex 5RS foi submetida a dois
tipos de processamento, ambos sob compresso: 1) temperatura de 100 C por 65min; 2)
temperatura de 80 C por 45min. A resina autopolimerizvel Palpress Vario foi processada a
temperatura de 55 C por 15min e a Swebond Compact a 40 C por 10min, ambas sob
compresso de 0,2 MPa. Depois da confeco, os corpos-de-prova foram colocados em soluo
de Ringer por 7 dias ou em etanol por 20h para a liberao dos produtos. A identificao e
quantificao dos produtos liberados pelas resinas para base de prtese foram realizadas atravs
de cromatografia a gs, espectrometria de massa e cromatografia lquida. Quando imersas em
soluo de Ringer, todas as resinas liberaram quantidades similares de dibutil ftalato, enquanto as
substncias bifenil, diciclohexil ftalato, e fenil benzoato foram detectados, porm em quantidades
abaixo dos limites de quantificao. A liberao em etanol revelou que as quantidades liberadas
de dibutil ftalato de todas as resinas tambm foram similares. Entretanto, houve diferena
significativa entre as resinas para as demais substncias. A resina Swebond Compact liberou
maiores quantidades de diciclohexil ftalato e de bifenil e menores quantidades de fenil salicilato
em relao s demais resinas. Para o fenil benzoato, a maior liberao foi observada para a resina
Palpress Vario. Quanto maior a temperatura de processamento utilizada, menor foi a quantidade
de produtos liberados. Os autores ressaltaram que a liberao de substncias das resinas a base de
polimetacrilato de metila, tais como o monmero metacrilato de metila, cido metacrlico, cido
benzico, dibutil ftalato, fenil benzoato, bifenil e formaldedo tem sido relatada na literatura. Os
componentes responsveis pelo efeito citotxico, todavia, ainda no foram identificados.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 52
Schuster et al.
50
, em 1995, realizaram um estudo com o objetivo de analisar o
efeito das substncias liberadas pelas resinas para bases de prteses no metabolismo de lipdeos
de clulas epiteliais orais de hamsters. Foram selecionadas resinas acrlicas para base de prtese
de diferentes polimerizaes e composies: Lucitone 199 (resina acrlica termopolimerizvel de
alto impacto), Triad (resina acrlica fotopolimerizvel, base de uretano dimetacrilato) e Triad
Dualine (polimerizao dual, livre de monmero metil metacrilato) e Extoral (polimerizao
dual, composta por poli-metil metacrilato e polietil metacrilato). Foram confeccionados corpos-
de-prova, em condies asspticas, na forma de discos (1 cm X 1 mm), de acordo com instrues
dos fabricantes. Clulas epiteliais orais de hamster foram cultivadas em meio de cultura acrescido
de 5% de soro fetal bovino, 100 U/ml de penicilina e 100 l/ml de estreptomicina, incubadas a
37 C com 5% de CO
2
. Para a obteno do eluato (meio de cultura contendo as substncias
liberadas), primeiramente os corpos-de-prova foram mantidos em meio de cultura acrescido de
antibiticos e sem soro fetal bovino por 24 ou 48h a 37 C. Aps esse perodo, o meio contendo
as substncias liberadas pelos corpos-de-prova foi colocado em placas contendo meio de cultura
fresco acrescido de soro fetal bovino e clulas epiteliais orais de hamster, alm do radioistopo
14
C-acetato. As placas foram incubadas por 24h para que os lipdeos celulares fossem marcados
e, posteriormente, realizadas as mensuraes em um espectrmetro. Para o grupo controle, foram
utilizadas clulas propagadas em meio de cultura suplementado sem discos de resina. As
respostas celulares mais acentuadas foram observadas com o eluato obtido da resina Extoral. Os
resultados demonstraram que os componentes liberados pelas resinas para bases de prteses
podem afetar o metabolismo de lipdeos e possibilitarem alteraes nas membranas celulares.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 53
Arima et al.
2
, em 1996, realizaram estudo para analisar a composio e a estrutura
de seis materiais reembasadores rgidos autopolimerizveis (Rebaron, Tokuso Rebase, Mild,
Metabase, Kooliner e New Tru Liner). O p de cada material foi analisado em relao aos
seguintes aspectos: composio qumica, temperatura de transio vtrea, peso molecular e
distribuio de partculas. A composio qumica dos lquidos de cada material tambm foi
analisada. Os mtodos utilizados foram espectroscopia infravermelha, HPLC, anlise de
partculas a laser, cromatografia a gs e espectroscopia de massa, espectroscopia de ressonncia
magntica e calorimetria diferencial de varredura. Para a composio do p, foi observado que o
material Rebaron apresenta PMMA. A temperatura de transio vtrea desse material (69,1 qC)
sugere que o p tambm contm plastificante. O p da resina Metabase contm PEMA e
P(MMA/EMA), enquanto o p dos outros 4 materiais avaliados contm PEMA. Os valores de
temperatura de transio vtrea variaram de 68,4 qC (resina Mild) a 97,1 qC (resina Metabase). O
peso molecular variou de 1,6 x 10
5
2,2 x 10
5
, o que sugeriu que no p desses materiais so
utilizados polmeros com distribuio estreita de peso molecular. A anlise das partculas
demonstrou que, para as resinas Rebaron, Mild, Kooliner, Metabase e New Tru Liner, o tamanho
variou de 50 100 m, enquanto para o material Tokuso Rebase os valores foram entre 20-50
m. Os resultados das anlises dos lquidos demonstraram que a resina Rebaron contm MMA e
ster di-n-butil (DBS), a resina Mild contm 2-etil exil-metacrilato (EHMA), 2-hidroxi etil
metacrilato (HEMA), trimetilolpropano trimetacrilato (TMPT) e 1,4-butanediol dimetacrilato
(1,4 - BDMA). Para a resina Metabase, foi observado que o lquido apresenta MMA, EHMA e
1,6 - HDMA. Os lquidos das resinas Kooliner e New Tru Liner possuem IBMA e, o New
TruLiner, tambm apresenta o DBP. A anlise do material Tokuso Rebase revelou a presena de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 54
dois monmeros: o 1,6 - HDMA e outro no determinado, que pelos espectros de ressonncia
magntica obtidos parece ser o -metacriloil oxietil proprionato.
Linha celular de queratincitos humanos, RHEK-1, foi utilizada para avaliar a
citotoxicidade do PB e seu produto de degradao AB, por Babich et al.
4
, em 1996. A
citotoxicidade foi avaliada pelo teste colorimtrico de vermelho neutro, onde foi analisado o
valor de IC 50 (concentrao inibitria de 50% das clulas), em mM, aps 24h de contato dos
compostos com as clulas. Os valores IC 50 foram 0,11 para PB e 29,5 mM para o AB.
Citotoxicidade irreversvel foi observada aps 1h de contato com concentraes de PB maiores
ou igual a 0,15 mM. Danos na membrana plasmtica celular, como liberao de desidrogenase
ltica, foram evidentes quando as clulas foram expostas ao PB em concentrao de 0,05 mM por
4h. A membrana intracelular tambm foi afetada com extensa vacuolizao, inicialmente
perinuclear e, posteriormente, comprometendo todo o citoplasma. A gerao de radicais livres
pelo PB foi sugerida, pelos seguintes fatores: a quantidade intracelular de glutatione foi baixa nas
clulas expostas ao PB; as clulas pr-tratadas com clorodintitrobenzeno, agente que reduz a
quantidade de glutatione, foram hipersensveis para os efeitos do PB; a peroxidao de lipdeos
pelo PB foi induzida na presena de Fe2+; e as clulas previamente mantidas em meio contendo
vitamina E e um antioxidante, foram mais resistentes ao PB, apresentaram menor peroxidao de
lipdeos na presena de PB + Fe2+ e no desenvolveram extensa vacuolizao intracelular
quando comparadas com as clulas no tratadas com vitamina E.
Materiais reembasadores rgidos autopolimerizveis so freqentemente utilizados para
promover melhora na estabilidade de prteses removveis. Em 1996, Bohnenkamp
7
, descreveu
um caso clnico de paciente com 56 anos, sexo masculino, que apresentou sinais e sintomas aps
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 55
a realizao de reembasamento imediato. O paciente relatou dificuldade no uso da prtese
mandibular 24 horas aps o procedimento ter sido realizado, devido dor causada pela presena
de ulceraes na cavidade bucal. O paciente apresentava-se febril e, no exame extra-oral, foi
detectado linfodenopatia bilateral na palpao. No exame intra-oral, foram observadas ulceraes
e edema em toda a rea edntula em contato com a prtese. O diagnstico diferencial inicial
incluiu estomatite por contato alrgico ou estomatite traumtica causada pela exposio ao
material reembasador autopolimerizvel. A histria mdica e odontolgica do paciente foi
avaliada no tendo sido relatada alergia, especialmente a resinas acrlicas para base de prtese. O
paciente informou que, para o reembasamento na prtese maxilar, apenas um procedimento foi
necessrio. Para o reembasamento da prtese mandibular, entretanto, foram realizados 3
procedimentos a fim de se conseguir uma boa adaptao da prtese. A gerao de calor e a
irritao qumica so as causas mais comuns de estomatite na mucosa dos pacientes. O
tratamento incluiu a utilizao de um analgsico, e aconselhamento ao paciente para utilizar a
prtese apenas durante a alimentao. Aps 10 dias, no foram mais observadas lceras no tecido
mole e o rebordo residual apresentava-se normal aps 2 semanas. Os autores concluram que a
aplicao repetida de resinas acrlicas autopolimerizveis para reembasamento pode resultar em
estomatite traumtica. Por essa razo, o reembasamento imediato deve ser cuidadosamente
monitorado durante a polimerizao. A estomatite traumtica causada por materiais
reembasadores rgidos pode ser diferenciada de outras doenas pela histria prvia do paciente.
No ano seguinte, Sheridan et al.
53
, em 1997, realizaram estudo para comparar a
citotoxicidade de resinas polimerizadas por calor (Lucitone 199), ativada quimicamente
(Lucitone de ativao qumica) e por energia de microondas (Acron MC), atravs da viabilidade
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 56
celular de fibroblastos gengivais humanos quando expostos aos eluatos obtidos com essas
resinas, em perodos de 24, 42, 72 e 96h. Foram confeccionados 30 corpos-de-prova (12 mm X 1
mm) das resinas polimerizadas por microondas e calor, em condies asspticas. Vinte desses
corpos foram selecionados, aleatoriamente, para serem utilizados neste estudo. Removidos os
excessos de cada disco, realizou-se a limpeza com gua destilada em ultrasom por 20min e luz
ultravioleta, pelo mesmo perodo. Alguns discos no expostos a esse tratamento foram
submetidos ao teste de citotoxicidade para demonstrar que a luz ultravioleta no interfere na
polimerizao das resinas. Os eluatos foram, ento, preparados utilizando-se 5 discos para cada
um dos tempos previamente determinados. Aps esses perodos, os eluatos foram congelados a -
20 C at a exposio aos fibroblastos humanos. Para o ensaio de citotoxicidade, clulas foram
colocadas em uma placa de 96 orifcios em concentrao de 3 x 10
4
por orifcio, e incubadas por
um perodo de 24h em 200 ml de alpha - meio essencial mnimo, suplementado com 100 mg/ml
de penicilina G, 50 mg/ml de sulfato de gentamicina e 0,1% de soro fetal bovino. Aps essa fase,
o meio foi descartado e 200 ml de cada eluato armazenado foram adicionados. Meio de cultura
sem eluato foi utilizado como controle negativo. Alm disso, para permitir a obteno de uma
curva padro, clulas em diferentes concentraes (5 x 10
3
, 1 X 10
4
, 5 x 10
4
, 1 x 10
5
) foram
tambm plaqueadas, com meio de cultura suplementado. A viabilidade celular foi avaliada por
meio do teste de MTS, que composto de um tetrazlio (MTS) e um agente acoplador de
eltrons, o fenazine metossulfato (PMS). Os testes mostraram que todas as resinas, em todos os
tempos, tiveram efeito significativo sobre os fibroblastos gengivais humanos. A resina Lucitone
quimicamente ativada apresentou maior inibio na viabilidade celular quando comparada com as
resinas Lucitone 199 e Acron MC. Os autores concluram que todas as resinas testadas liberaram
componentes txicos, tendo sido o eluato da resina quimicamente ativada mais txico quando
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 57
comparado com aos das resinas ativadas por calor e microondas. Contudo, a resina polimerizada
por microondas apresentou citotoxicidade significativamente maior que a resina
termopolimerizvel, no perodo de 96h.
Existem poucos estudos que relacionam a estrutura dos monmeros utilizados nos
produtos odontolgicos com a citotoxicidade. Dessa forma, Yoshii
68
, em 1997, realizou estudo
com o objetivo de analisar a toxicidade de acrilatos e metacrilatos, usando testes de
citotoxicidade, e correlacionar a estrutura dos materiais testados com a citotoxicidade. Foram
selecionados 16 monoacrilatos e monometacrilatos que possuem grupamento ster alqulico
(Metil acrilato MAA; Etil acrilato - EAA; n-Propil acrilato nPAA; n-Butil acrilato - nBAA; i-
Butil acrilato - iBAA; Lauril acrilato - LAA; Metil metacrilato MMA; Etil metacrilato EMA;
n-Propil metacrilato nPMA; n-Butil metacrilato nBMA; i-Butil metacrilato iBMA; Lauril
metacrilato LMA) e ster alqulico com um grupo hidroxila (2-Hidroxil etil acrilato -HEAA; 2-
Hidroxi etil metacrilato HEMA; 2-Hidroxipropil acrilato - HPAA; 2-Hydroxipropil metacrilato
- HPMA), 10 monometacrilatos com grupos funcionais (2-Metoxietil metacrilato - ME; 2-
Etoxietil metacrilato - EE; 2- Butoxi etil metacrilato - BE; 2-Fenoxietil metacrilato - PE; Benzil
metacrilato BZ; 4- metacriloiloxietil trimeritico acido anidratado - 4 META; 2-Etilbutil
metacrilato EB; tetrahidrofurfuril metacrilato THF; Glicidil metacrilato - G; dimetilamoetil
metacrilato DMC; Cloreto de metila - sal) e 13 dimetacrilatos (Monoetileno glicol dimetacrilato
- 1G; Dietileno glicol dimetacrilato - 2G; Trietileno glicol dimetacrilato 3G; Tetraetileno glicol
dimetacrilato - 4G; Nonaetileno glicol dimetacrilato - 9G; Tetradecaetileneglicol dimetacrilato -
14G; Tricosaetilenoglicol dimetacrilato - 23G; 2,2-Bis [4-(2-hidroxi-3-metacriloiloxi-
propiloxi)fenil-]propano - Bis-GMA; Uretano dimetacrilato - UDMA; 1,6 - Hexanediol
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 58
dimetacrilato - HD; 2-Hidroxi-1,3-dimetilacriloxi propano - HP; 1,3 - Butileno glicol
dimetacrilato - BG; Neopentiglicol dimetacrilato NPG). Os monmeros hidroflicos foram
dissolvidos direto no meio de cultura, com L-Glutamima (0,292 g/L). Monmeros hidrofbicos
(LAA, LMA, BE, PE, BZ, EB, bisGMA, UDMA, BG, NPG), entretanto, foram dissolvidos em
tetraborato de polioxietileno sorbitano, com proporo de monmero e surfactante de 3:1. Foi
utilizado o teste de MTT, com clulas HeLa S3, para avaliar a citotoxicidade. Curvas de dose-
resposta foram confeccionadas para determinar a quantidade de cada monmero que diminuui a
produo de formazan, mensurada pelo teste MTT, em 50% (valor - IC
50
). O logaritmo do
coeficiente de partio de cada monmero entre n-octanol e gua (log P), tambm foi calculado.
Os monoacrilatos e monometacrilatos com grupamento ster alqulico exibiram efeito dose-
dependente e a citotoxicidade indicada pelo IC
50
dos monoacrilatos foi LAA > iBAA, nBAA,
nPAA > MAA > EAA. Para os 6 monometacrilatos, a ordem observada foi LMA > iBMA,
nBMA > nPMA > EMA > MMA. Os resultados do IC
50
sugerem que quanto mais longa a cadeia
alqulica, maior a citotoxicidade em ambos, acrilatos e metacrilatos. Foi observada correlao
entre o IC
50
e o logP para os acrilatos (r
2
= 0,950) e metacrilatos (r
2
= 0,718). Para os acrilatos e
metacrilatos com ster alqulico correspondentes, os valores de IC
50
para os acrilatos sempre
foram menores que os dos metacrilatos. Os efeitos citotxicos de 4 monmeros com o grupo
hidroxila mostraram a mesma tendncia observada naqueles com steres alqulicos, com os
acrilatos apresentando maior citotoxicidade que os metacrilatos, tendo sido observada a seguinte
ordem de citotoxicidade HEAA > HPAA > HEMA, HPMA. Todos os monmeros com grupo
hidroxila mostraram menores valores de citotoxicidade quando comparados aos monmeros
correspondentes com steres alqulicos sem grupo hidroxila. Nos 4 metilmetacrilatos com
substituintes aos steres, a citotoxicidade foi a seguinte: PE > BE > EE > ME. Correlao foi
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 59
observada entre o IC
50
e o logP em 4 etil metacrilatos com substituintes aos steres (r
2
= 0,980).
Entretanto, para os monometacrilatos com outros grupos funcionais, os valores de IC
50

apresentaram grande variao de 0,33 a 88,77 mmol/L e nenhuma relao entre o IC
50
e o logP
foi encontrada (r
2
= 0,392). A ordem de citotoxicidade foi seguinte: EB, G, BZ > 4 META,
THF > DMC. Para os 7 dimetacrilatos avaliados, que apresentavam diferentes comprimentos da
cadeia de oxietileno, foi observado que aqueles que possuam 14 cadeias de oxietileno ou menos
apresentaram valores similares de IC
50
variando de 1,06 a 1,97 mmol/L. Por outro lado, aqueles
que apresentavam 23 cadeias de oxietileno os valores de IC
50
foram muito maiores (10,28
mmol/L). A citotoxicidade desses monmeros apresentou a seguinte ordem: 1G, 2G, 3G, 4G, 9G,
14G > 23G. Para os outros 6 dimetacrilatos avaliados, o bis-GMA mostrou maior citotoxicidade,
vindo a seguir o UDMA > NPG > HP, BG > HD. Todos os acrilatos foram mais txicos que os
metacrilatos. Para os acrilatos e metacrilatos com substituintes ao alqulico, o efeito citotxico
aumentou com o aumento no comprimento da cadeia do substituinte ester e correlao inversa
entre IC
50
e logP foi encontrada. Os efeitos citotxicos dos acrilatos e metacrilatos com
substituintes ao alqulico foram afetados pelos seus valores de logP. O logP de um monmero
relaciona-se diretamente com sua lipofilicidade. Assim, a citotoxicidade desses monmeros
afetada por sua lipofilicidade, sugerindo que os efeitos citotxicos so causados por meio da
incorporao desses monmeros na superfcie da camada lipdica das biomembranas ou pela
solubilizao dos lipdios dessas membranas pelos monmeros. Neste estudo, entretanto, foi
observado que para os monometacrilatos com outros grupos funcionais, no houve correlao
entre o IC
50
e o logP, sugerindo que outros fatores como carga eltrica foram dominantes. O
monmero DMC apresentou o menor efeito citotxico (IC
50
de 88,77 mmol/L) devido a sua
carga positiva quando em soluo. O grupo hidroxila aumentou a citotoxicidade dos acrilatos e
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 60
metacrilatos. Dimetacrilatos com 14 cadeias de oxietileno ou menos apresentaram a mesma
citotoxicidade, enquanto dimetacrilatos com 23 cadeias de oxietileno tiveram menor
citotoxicidade.
Independentemente do mtodo utilizado para iniciar a polimerizao das resinas
para base de prteses, a converso dos monmeros em polmeros no completa e algum
monmero residual permanece nos polmeros. Acredita-se que a sensibilidade dos tecidos orais
as resinas para base de prtese depende da quantidade de monmero residual. Dessa forma,
Vallittu et al.
64
, em 1998, realizaram um estudo para avaliar o efeito da temperatura e do tempo
de polimerizao no contedo de metacrilato de metila residual em duas resinas
autopolimerizveis, cuja reao de polimerizao iniciada pelo cido barbitrico (Palapress
Vario e ProBase Cold) e duas termopolimerizveis, iniciada pela ativao do perxido de
benzola (Lucitone 199 e ProBase Hot). Corpos-de-prova, na forma de discos (30 mm x 2 mm)
foram confeccionados. Para as resinas autopolimerizveis o tempo de polimerizao foi constante
(15min) e a temperatura variou de 30q a 60q C. Para as resinas termopolimerizveis foram
utilizados vrios ciclos, incluindo 70 qC por 540min, 70 qC durante 90min, seguido de
aquecimento a 100q C por 7 diferentes perodos de tempo (variando de 30 a 1.440min) e
polimerizao a 100q C por 11 diferentes perodos (entre 15 a 1.440min). Depois de
polimerizados, os corpos-de-prova foram armazenados a 23 1 C com umidade relativa de 50
5% por um perodo de 3 dias, sendo posteriormente desgastados e polidos at atingirem espessura
de 1 0.1 mm. A mensurao da quantidade de metacrilato de metila residual foi realizada por
meio de cromatografia a gs. Os resultados mostraram que para as resinas autopolimerizveis
quanto maior a temperatura, menor a quantidade de monmero residual liberado. E, para as
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 61
termoativadas, as que foram polimerizadas a 100 C, apresentaram reduo na quantidade de
monmero residual com o aumento do tempo de polimerizao. De forma geral, as resinas
autopolimerizveis apresentaram nveis de monmero residual maiores que as
termopolimerizveis. Quando submetidas a diferentes ciclos de polimerizao, as resinas
termopolimerizveis apresentaram grande quantidade de metacrilato de metila residual na
temperatura de 70 C por 540min. Esses resultados foram associados com o fato de que, nas
resinas termopolimerizveis, ocorre elevao da temperatura que pode atingir a temperatura de
transio vtrea da matriz polimrica, proporcionando movimentos das cadeias moleculares,
facilitando a polimerizao do monmero. Assim, ciclos de aquecimento com temperaturas
abaixo de 100 C, resultaram em polmeros com contedos de metacrilato de metila mais altos do
que aqueles obtidos com perodos de polimerizao a 100 C mais longos.
Tendo em vista a liberao de monmeros residuais e outros produtos a partir de
resinas acrlicas para base de prtese, Kedjarune et al.
28
, em 1999, avaliaram a concentrao de
MMA residual, assim como sua citotoxicidade, de trs resinas autopolimerizveis (Takilon,
Tokuso e Meliodent) e trs termopolimerizveis (Rodex, Trevalon e Meliodent). Para a
realizao do estudo, foram confeccionados 15 corpos-de-prova (8 mm X 35 mm X 3 mm) de
cada material, seguindo-se as instrues dos fabricantes. Dez corpos-de-prova foram utilizados
para determinar a concentrao de monmero residual, imediatamente aps a confeco. Os
outros 5 foram colocados em tubos contendo saliva para anlise da liberao do MMA, verificada
pelo mtodo da cromatografia a gs, aps perodos de imerso de 24 e 48h. Para o teste de
citotoxicidade, foram utilizados fibroblastos humanos, obtidos de tecido gengival. Essas clulas
foram colocadas em orifcios de placas, contendo meio de cultura. Aps 24h, o meio de cultura
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 62
foi substitudo por novo meio contendo as diferentes concentraes de metil metacrilato e a
viabilidade celular foi analisada atravs do teste de citotoxicidade MTT. Os resultados
demonstraram que a liberao de monmero no depende apenas do tipo de polimerizao, mais
tambm da proporo p/lquido utilizada e do mtodo de processamento. Quanto maior a
quantidade de lquido, maior a quantidade de monmero residual. Assim como, quanto maior o
tempo de polimerizao, menor a quantidade de monmero residual. As resinas que apresentaram
baixa quantidade de monmero residual, tambm apresentaram baixa liberao de MMA.
Contudo, resinas que apresentaram alta concentrao de monmero residual, no necessariamente
apresentaram grande liberao de MMA. O teste MTT demonstrou que o MMA, em todas as
concentraes liberadas a partir das resinas avaliadas, apresentou efeitos citotxicos. Em geral,
maior citotoxicidade foi observada para as maiores quantidades liberadas.
Tang et al.
57
, em 1999, realizaram experimento para avaliar a citotoxicidade de
resinas utilizando diferentes mtodos de exposio das clulas aos materiais por meio dos testes
MTT e
3
H - timidina. Foram utilizados um cimento sseo quimicamente polimerizvel (CMW 1)
base de MMA e 5 materiais fotopolimerizveis, sendo um selante de fissura (Concise) e dois
materiais restauradores (Z100 e Silus Plus) base de Bis-GMA/TEGDMA, uma resina
ortodntica para colagem de brackets (Transbond XT) contendo Bis-GMA e dimetacrilato e um
adesivo dentinrio (Scothbond Multipurpose) base de Bis-GMA e HEMA. As clulas utilizadas
foram fibroblastos gengivais humanos e os testes foram realizados em placas com 24 orifcios,
tendo sido colocados 20.000 clulas em 2 ml de meio por orifcio. Vinte e quatro horas aps, as
amostras obtidas das resinas foram introduzidas no meio de cultura e as clulas avaliadas quanto
aos efeitos citotxicos. Corpos-de-prova (2 x 8 mm) de cada material foram confeccionados e
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 63
mantidos intactos ou submetidos remoo da camada superficial de inibio pelo oxignio com
gaze estril contendo acetona 99%. Os corpos-de-prova intactos foram avaliados em 4 diferentes
experimentos: 1- corpos-de-prova colocados sobre as clulas; 2- clulas colocadas sobre os
corpos-de-prova; 3- corpos-de-prova colocados sobre uma membrana com microporos acima das
clulas (contato indireto clulas materiais); desse modo, as clulas entram em contato com as
substncias liberadas pelas resinas no meio de cultura; 4- eluatos obtidos a partir dos corpos-de-
prova colocados no meio de cultura contendo as clulas. Os extratos foram obtidos pela imerso
dos corpos-de-prova no meio de cultura durante 30min sob agitao em banho de gua a 37q C.
Os corpos-de-prova em que a camada superficial de inibio pelo oxignio foi removida foram
testados somente na condio experimental 3. Os testes MTT e
3
H - timidina foram realizados
nos perodos de 1, 3 e 6 dias aps exposio das clulas s condies experimentais. Os
resultados demonstraram a existncia de diversos padres de toxicidade material-dependente
entre as resinas testadas. Um resultado observado em todos os procedimentos foi a citotoxicidade
tardia de todas as resinas, demonstrado pelo teste de MTT. O cimento sseo base de MMA
apresentou menor toxicidade nos dois testes (MTT e
3
H - timidina) quando comparado com os
materiais base de Bis-GMA. As condies experimentais com diferentes tipos de contato entre
as clulas e as resinas influenciaram significativamente os testes de citotoxicidade. O teste
3
H -
Timidina foi mais sensvel toxicidade das resinas que o MTT, que, por outro lado, um mtodo
que produziu resultados mais reprodutveis e pode trazer mais informaes sobre a natureza da
toxicidade. A remoo da camada superficial das resinas reduziu significativamente, mas no
eliminou completamente, a toxicidade das resinas.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 64
Apesar de j terem sido relatados diferentes graus de citotoxicidade das resinas
acrlicas para base de prtese, base de PMMA, os mecanismos de morte celular ainda no
foram elucidados. Dois modos de morte celular tm sido descritos: apoptose e necrose, sendo que
a apoptose um modo ativo e fisiolgico de morte celular, com integridade das organelas
celulares e da membrana plasmtica e ocorre na ausncia de resposta inflamatria. J a necrose
um processo passivo que ocorre aps a exposio da clula injria, caracterizado por aumento
de volume das mitocndrias, ruptura da membrana plasmtica e liberao dos constituintes
citoplasmticos, havendo, tambm, reao inflamatria no tecido. Dessa forma, Cimpan et al.
9
,
em 2000, realizaram estudo com o objetivo de identificar e quantificar os modelos de morte
celular induzida por substncias liberadas por trs resinas acrlicas termopolimerizveis (Vertex
RS - VRS; Superacryl S; Superacryl New - SN) e quatro autopolimerizveis (Vertex SC -
VSC; Quick SR 3/60 type 10 - Q; Duracryl D; Duracryl New - DN). Corpos-de-prova (50
mm X 0,5 mm) foram confeccionados e armazenados por 24 ou 48h a 37 C em meio de cultura
para obteno dos extratos. As mdias entre massa do corpo-de-prova e volume do meio
utilizadas foram de 0,1 g/ml, 0,2 g/ml, 0,4 g/ml e 0,8 g/ml. Para o contato extrato/clulas, 7,5
x10
5
clulas U-937 (clulas de linfoma humano) foram colocadas em placas com o meio de
cultura contendo as substncias liberadas pelos corpos-de-prova e incubadas por 24 e 48h. Como
controle negativo, foi utilizado cultura de clulas expostas ao meio de cultura e incubadas nas
mesmas condies que as dos extratos. Aps perodos de armazenamento, trs testes foram
utilizados para a anlise da citotoxicidade: quantificao de DNA, microscopia ptica e eletrnica
de transmisso e teste para quantificar a morte celular por apoptose ou necrose (teste Anexina V-
FITC). Os resultados mostraram que os eluatos das resinas induziram a morte celular de maneira
dependente da concentrao e do tempo e de forma geral, as substncias liberadas pelos corpos-
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 65
de-prova induziram, de maneira significativa, a morte celular em relao ao grupo controle. Na
concentrao do extrato de 0,1 g/ml, as resinas autopolimerizveis Duracryl e Duracryl New
induziram porcentagens de morte celular, por apoptose ou necrose, maiores que as resinas
termopolimerizveis. Nas concentraes de 0,2 g/ml e 0,4 g/ml no foi observada diferena
estatisticamente significativa entre as resinas. Na concentrao de 0,8 g/ml, a morte por necrose
superou a morte por apoptose das clulas em contato com os extratos das resinas Duracryl e
Duracryl New. As substncias liberadas por todas as resinas diminuram a viabilidade das clulas
em todos os intervalos de tempo utilizados, tendo sido observada maior morte celular quando em
contato com extratos obtidos em 48h do que com aqueles obtidos em 24h, apesar de outros
autores terem relatado maior ciototoxicidade das resinas para base de prtese para os eluatos
obtidos no perodo de 24h. Segundo os autores, essas diferenas nos resultados podem ter
ocorrido devido a diferena na composio das resinas testadas, diferentes tipos de clulas e de
ensaios empregados em cada estudo. Os autores consideraram importante a identificao do
padro de morte celular na avaliao da citotoxicidade. Se o material causa apoptose, os tecidos
que esto em contato com a prtese tero maiores condies de se adaptar as modificaes
induzidas por ela. Por outro lado, se o material causar necrose, o fenmeno inflamatrio
resultante pode induzir reaes teciduais mais severas. Os efeitos citotxicos observados neste
estudo foram atribudos a possvel peroxidao dos lipdeos celulares, que pode ser causado pelo
PB presente na composio das resinas, ou por alterar os mecanismos de fosforilao.
A atividade estrognica de compostos utilizados na odontologia foi estudada por
Hashimoto et al.
18
, 2000, por meio de ensaio de gene e competio pelo receptor estrognio. Dez
compostos foram testados: bisfenol A - BPA; Bis-GMA; TEGDMA; MMA e HEMA; DBP,
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 66
BBP; n-butil ftalil n-butil glicolato - BPBG, di(2- etilhexil) ftalato - DEHP, di(2-etilhexil) adipato
DOA. Esses compostos foram diludos com dimetil sulfxido (DMSO) em faixas de
concentrao entre 5 x 10
-7
5 x 10
-3
M. Como controle positivo foi utilizado o 17-estradiol
(E2). BPA e BBP mostraram atividades estrognicas nos dois testes, enquanto os demais
compostos no apresentaram atividade nas concentraes testadas. Informaes adicionais,
associadas com experimentos in vivo e epidemiolgico so necessrios. Essas investigaes
podem promover informaes sobre a validade dos mtodos utilizados neste estudo para testar a
atividade estrognica de compostos.
Os metacrilatos so considerados como causa de dermatite alrgica de contato em
profissionais da rea odontolgica, assim como de estomatite alrgica de contato e outras reaes
adversas da mucosa oral pelo uso de prteses. Entretanto, reaes alrgicas sistmicas so raras.
Lunder, Rogl-Butina
38
, em 2000, relataram um caso clnico de paciente do sexo feminino, 49
anos, que se apresentou com urticria durante uma semana. No questionrio sobre a sade,
relatou problemas respiratrios (asma) e alergia a salicilato, e episdios curtos de urticria nos
ltimos anos, facilmente solucionados com o uso de anti-histamnico. Dessa forma, foram
administrados anti-histamnicos via oral e os sintomas melhoraram gradativamente. A causa,
entretanto, no foi diagnosticada. A paciente associou a urticria ao uso da prtese dentria, que
havia sido instalada dois meses antes. Ao retirar a prtese por alguns dias o sintoma desapareceu,
reincidindo com o uso da mesma. A paciente no apresentava alteraes aparentes na mucosa e
no relatou sensao de ardncia ou queimao na cavidade bucal. Teste de contato foi realizado
e o resultado demonstrou que a paciente apresentou reao positiva para o metil metacrilato e
para o lquido da resina K30, utilizada na confeco da prtese. A paciente foi, ento, orientada
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 67
para no utilizar a prtese e, como conseqncia, o sintoma no foi mais relatado. Aps duas
semanas, a prtese foi substituda por outra, confeccionada com um material que no continha
metil metacrilato e a paciente no apresentou mais leses.
No mesmo ano, Cimpan et al.
10
, em 2000, realizaram um estudo com o objetivo de
determinar a capacidade de alguns polmeros para base de prtese, base de PEMA de afetar a
clonogenicidade e induzir a morte celular por necrose e/ou apoptose de fibroblastos de linhagem
L929. Foram confeccionados corpos-de-prova (50 mm x 0,5 mm), em condies asspticas com
as resinas termopolimerizveis (Vertex RS, Superacryl e Superacryl New) e autopolimerizveis
(Vertex SC, Quick SR 3/60, Duracryl e Duracryl New). Imediatamente aps a confeco, os
corpos-de-prova foram colocados em placas, com meio de cultura e incubados por 24 ou 48h a
37 C para a obteno dos extratos. As mdias entre massa de corpo-de-prova e volume de meio
de cultura foram de 0,2 g/ml, 0,4 g/ml e 0,8 g/ml. Como grupo controle negativo foi utilizado
meio de cultura, incubado sob as mesmas condies, porm sem amostras de resinas. Os efeitos
das substncias testadas foram avaliados por meio de diferentes mtodos. Para o mtodo de
contagem de colnias, as clulas L 929 foram propagadas sobre os discos de resina imersos em
meio de cultura ou em contato com os extratos previamente obtidos, tendo sido incubadas por 10
dias. As colnias foram, ento, fixadas, coradas e contadas. Testes similares, porm com tempo
de incubao menor (24 e 48h), tambm foram realizados e as clulas coradas com iodeto de
propdio para marcao do DNA. Esses testes foram realizados para avaliar se as resinas afetam a
clonogenicidade das clulas (colnias) e induzem a morte celular por apoptose (marcao do
DNA) e se esses efeitos so causados por contato direto com os materiais ou por meio das
substncias por eles liberadas. Para a realizao do teste com Annexina V-FITC, as clulas L 929
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 68
foram propagadas em placas de 24 orifcios em contato com os extratos obtidos, incubadas por 24
e 48h , marcadas com Anexina V-FITC e iodeto de propdio, para verificar a reduo do DNA
das clulas mortas por apoptose. As clulas foram, ento, analisadas em microscpio confocal a
laser. As clulas aderidas nos corpos-de-prova e as que cresceram em contato com os extratos
obtidos foram fixadas para anlise em microscopia eletrnica. Por meio da contagem de colnia,
os resultados mostraram que quanto maior a mdia entre a massa do corpo-de-prova e o volume
do meio, maior foi a citotoxicidade do material testado, tendo sido as resinas autopolimerizveis
mais txicas dos que as termopolimerizveis. Alm disso, observou-se que o contato direto entre
as clulas e os discos de resina provoca maior reduo do nmero de colnias. Na mdia de 0,8
g/ml, observou-se maior nmero de morte celular por apoptose ou por necrose em relao s
outras propores utilizadas. Para todas as resinas acrlicas testadas e em todas as propores
utilizadas foi verificado maior nmero de morte celular por apoptose em relao aos outros
padres (necrose secundria e necrose), fato confirmado pelas anlises microscpicas. A
porcentagem de clulas necrticas aumentou com o aumento da proporo massa do corpo-de-
prova e o volume do meio, tendo sido maior nas concentraes de 0,4 g/mL e 0,8 g/mL. Esses
resultados sugerem que reaes mais severas dos tecidos podem ocorrer em concentraes mais
altas. Em todos os testes realizados, os efeitos citotxicos foram mais acentuados quando do
contato direto das clulas L929 com as resinas. Uma possvel explicao seria que o efeito txico
das substncias liberadas mais forte quando as clulas so expostas a essas substncias durante
sua liberao. O potencial citotxico dos eluatos pode diminuir com o tempo devido
degradao progressiva ou reaes das substncias liberadas com outros componentes qumicos
presentes no meio de cultura. Os efeitos txicos observados, segundo os autores, podem estar
relacionados com a liberao de perxido de benzoila e metil metacrilato que podem causar
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 69
peroxidao dos lipdeos celulares e bloqueio do transporte de eltrons. Tem sido observado que
existe mais monmero residual nas resinas autopolimerizaveis e que a induo da polimerizao
por calor aumenta a quebra do perxido de benzoila. Esses aspectos podem diminuir a liberao
desses componentes a partir de resinas termopolimerizveis e podem ajudar a explicar porque,
em geral, as resinas autopolimerizveis apresentaram efeitos citotxicos mais acentuados.
Entretanto, os autores enfatizaram que, somente as condies de polimerizao, no so
suficientes para explicar os resultados, considerando-se que uma das resinas atuopolimerizveis
(Vertex SC) apresentou menor efeito txico que a resina termpolimerizvel Superacryl. Alm
disso, apesar da resina Vertex RS ter sido polimerizada por tempo muito mais curto que as
resinas Superacryl e Superacryl New, apresentou menor potencial de induo de morte celular.
Assim, para determinar as causas dessas diferenas, a composio qumica e os componentes que
so liberados de cada material devem ser identificados e o potencial citotxico de cada
componente deve ser analisado.
Silikas, Watts
54
, em 2000, objetivaram analisar a composio de primers e agentes
de unio para dentina, e investigar a relao entre o tempo de reteno desses compostos em
anlises de HPLC e o valor do coeficiente de partio (Log P). Os valores de log P foram obtidos
de forma computacional, atravs de um software. Os resultados dos agentes de unio dentina
foram analisados e os monmeros identificados. Os valores de Log P foram calculados e
relacionados com os tempos de reteno dos monmeros atravs da seguinte equao: log P =
2.436R(t) - 3.636 e, o valor obtido de (r) foi igual a 0,9095. Assim, os autores sugeriram que
esses valores podem ser utilizados como uma ferramenta de previso em anlises futuras.
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 70
Lefebvre et al.
37
, em 2001, realizaram estudo do efeito da incorporao de um
agente anti-microbiano (Microban) em um reembasador macio (PermaSoft) sobre a aderncia de
Candida albicans na parte externa e interna do material, bem como na citotoxicidade. Os ftalatos
presentes nos materiais rembasadores podem ter efeitos citotxicos sobre clulas de mamferos.
Considerando que esse aspecto poderia interferir com os resultados de toxicidade do Microban,
corpos-de-prova foram confeccionados e imersos em saliva artificial estril por 5 dias para
permitir a liberao dos ftalatos e assegurar condies de longo prazo mais clinicamente
relevantes. Para o teste de citotoxicidade, foram cultivados fibroblastos de rato Balc/c em meio
de cultura suplementado com soro fetal bovino e antibiticos e a cultura foi mantida a 37 C em
atmosfera de 5% de CO
2
e 95% de ar. As clulas foram colocadas em placa de cultura de 24
orifcios, e corpos-de-prova (5 mm x 1 mm) sem o agente antimicrobiano (n=6) e com o produto
Microban (n=6) foram colocados em contato com as clulas e incubados por um perodo de 48h.
Os controles consistiram de orifcios contendo somente clulas e orifcios contendo clulas e
discos de Teflon de mesmo tamanho que os do material Permasoft. Aps o perodo de incubao,
foi realizado o teste de MTT que reflete a funo mitocondrial e a produo celular de energia.
Para analisar o crescimento de Candida albicans na parte externa e interna do material, foram
colocados corpos-de-prova com e sem o agente antimicrobiano em meio de cultura de gar
saboraud contendo o microorganismo. Aps perodo de 24h, os discos foram lavados e
centrifugados para liberar as clulas aderidas. As suspenses obtidas foram diludas e plaqueadas
em cultura de gar saboraud e incubadas por mais 24 e 48h. Aps estes perodos, as colnias
formadas foram contadas. Os resultados mostraram que a adio do agente antimicrobiano ao
PermaSoft no alterou a citotoxicidade do material e no reduziu a aderncia de Candida
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 71
albicans na superfcie (parte externa) do material. Com relao parte interna, nenhum
microorganismo foi encontrado no material, com ou sem o agente antimicrobiano.
No mesmo ano, Mainwaring et al.
41
, em 2001, analisaram possveis leses no
epitlio olfatrio de ratos causadas por metacrilato de metila. Ratos F344 foram expostos a 200
ppm de metacrilato de metila por 6h e desenvolveram uma leso no epitlio oral olfatrio que foi
caracterizada por degenerao e atrofia. A severidade da leso foi marcadamente reduzida pelo
pr-tratamento dos ratos com uma dose intraperitoneal de p-nitrofenil fosfato, um inibidor da
enzima carboxilesterase. Esse resultado demonstrou que a leso foi causada pelo metabolismo do
metil metacrilato em cido metacrlico, que um metablito irritante e corrosivo. Esse
metabolismo mediado pela carboxilesterase. A distribuio dessas enzimas no tecido nasal foi
investigada e o metabolismo do metacrilato de metila para cido metacrlico foi comparado em
ratos, hamsters e tecido nasal humano in vitro. Anlise histo-citoqumica mostrou que as
carboxilesterases apresentaram-se fortemente localizadas em clulas e na regio das glndulas
olfatrias do rato, mas geralmente foram mais distribudas no epitlio olfativo humano. Coerente
com isso, a atividade enzimtica, nas trs espcimes, foi maior no tecido olfatrio quando
comparado com o respiratrio. Esses resultados sugeriram que as clulas nasais humanas so
significantemente menos sensveis toxicidade do metil metacrilato, quando comparadas com as
clulas de ratos.
Diversos tipos de materiais polimricos tm sido introduzidos no mercado como
materiais para o reembasamento de bases de prteses. Os materiais atualmente disponveis
contm uma variedade de monmeros metacrilatos e polmeros, em substituio ao MMA e
PMMA com o objetivo de controlar o tempo e a temperatura de reao, diminuindo a irritao na
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 72
mucosa oral. Vrios estudos in vitro foram realizados para averiguar as propriedades desses
materiais, contudo, existem poucos relatos de estudos clnicos. Tendo em visto o exposto,
Matsumura et al.
42
, em 2001, realizaram um estudo clnico com o objetivo de avaliar o
comportamento de um material reembasador quimicamente polimerizvel logo aps sua
polimerizao e aps um ano de utilizao clnica. Foram selecionados 50 pacientes, que tiveram
suas prteses reembasadas com o material reembasador autopolimerizvel Tokuso Rebase que
contm PEMA no p e -metacriloil oxietil proprionato (39,8%) e 1,6-HDMA (60,2%) no
lquido. Aps o rembasamento, as prteses foram imersas em um agente para aumentar a dureza
de superfcie (Tokuso Resin Hardener-II) a 45 C durante 5min sendo, posteriormente, realizado
o polimento do material. Foi realizado ento, por dois examinadores, separadamente, 2
avaliaes, sendo a primeira logo aps o reembasamento da prtese e a segunda um ano depois.
As avaliaes abordaram os seguintes aspectos: (1) manchamento da superfcie da base da
prtese e do material reembasador; (2) alterao de cor dos dois materiais; (3) falha na unio
entre os dois materiais ou fratura; (4) adaptao; (5) irritao da mucosa oral. Os resultados
mostraram que, na avaliao aps um ano houve manchamento e alterao de cor em 5 prteses,
falha na unio do material reembasador e a resina de base em 3 casos e falta de adaptao em 2
prteses. Segundo os autores, um fator que pode afetar a estabilidade de cor a baixa converso
do monmero. Assim, mtodos para melhorar essa converso como tratamentos ps-
polimerizao, utilizao de agentes para aumentar a dureza de superfcie ou inibir a ao do
oxignio so importantes para a aplicao clnica ideal desses materiais reembasadores. Irritao
do tecido oral foi verificada em apenas um caso, na primeira avaliao, logo aps a colocao do
material. Os autores consideraram que esse resultado poderia estar vinculado ao fato do
componente do lquido do material Tokuso ser menos voltil que o MMA e do aumento de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 73
temperatura durante a polimerizao ser menor que aquele observado em outras resinas
quimicamente polimerizadas.
Testes de citotoxicidade tm sido largamente utilizados para avaliar as substncias
liberadas a partir de materiais para base de prtese. Contudo, existem poucos estudos
comparando diferentes linhagens de clulas em relao a esses materiais. Dessa forma, Huang et
al.
21
, em 2001, avaliaram, in vitro, a citotoxicidade de trs materiais para base de prtese
(polimerizado por calor - Lucitone 199; autopolimerizvel - Rebase; fotopolimerizvel - Triad), e
compararam as respostas de duas linhagens de clulas (epitlio oral humano de linhagem KB
ATCC CCL-17 e fibroblastos primrios derivados da mucosa oral obtidos de tecido de bipsia de
terceiro molar). Foram confeccionados trs discos (2 mm x 7 mm x 35 mm), de forma assptica,
para cada material a ser testado, que foram imediatamente colocados em tubos contendo meio de
cultura sem soro fetal bovino por 1, 3 e 5 dias. Os eluatos foram testados aps o cultivo das
clulas por 24h em meio de cultura, suplementado com soro fetal bovino e antibitico, a
temperatura de 37 C em atmosfera umidificada com 5% de CO
2
e 95% de ar. Para o teste de
MTT, as clulas foram plaqueadas na concentrao de 1 x 10
4
clulas/orifcio em placas de 96
orifcios. Aps incubao, 50 L de soluo de MTT (1 mg/mL em soluo tamponada salina)
foram adicionados e as placas incubadas por mais 4h a 37 C. Para cada orifcio, 150 L de
dimetil sulfxido foram acrescentados. Os resultados do teste MTT foram mensurados no
espectrofotmetro a 570 e 650 nm. Foram realizadas 5 duplicatas para cada teste. Os resultados
mostraram que os eluatos foram txicos para todos os tempos e nas duas linhagens de clulas. A
ordem de citotoxicidade das resinas foi: autopolimerizvel > polimerizvel por calor >
fotopolimerizvel, e a linhagem KB mostrou-se ligeiramente mais sensvel ao teste que a de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 74
fibroblastos orais humanos. Dessa forma, os autores concluram que as duas linhagens de clulas
podem ser utilizadas para testes in vitro, para se avaliar a citotoxicidade de resinas acrlicas para
base de prtese.
Kim et al.
29
, em 2002, examinaram o efeito do DBP e seu metablito mono-n-butil
ftalato (MBuP) na citotoxicidade e diferenciao celular em cultura de clulas embrionrias de
ratos. As clulas foram extradas de ratos, com gestao de 12,5 dias, e expostas ao DBP ou
MBuP por 96h, para verificar a citotoxicidade e inibio da diferenciao celular. Para os dois
testes, foram encontrados efeitos concentrao-dependente. Entretanto, MBuP apresentou efeito
citotxico em concentraes maiores que o DBP. Os valores de IC50 do DBP (avaliados pelo
ensaio colorimtrico de vermelho neutro) e diferenciao celular (mensurado pelo mtodo
colorimtrico azul de alcian) foram 25,54 /ml (91,75 M) e 21,21 /ml (76,20 M),
respectivamente. Os valores de IC50 do MBuP para citotoxicidade e diferenciao celular foram
307,24 /ml (1,38 mM) e 142,61 /ml (0,64 mM), respectivamente. Para determinar se radicais
livres estariam relacionados com a induo da citotoxicidade e inibio da diferenciao do DBP
nessas clulas, DBP foi co-administrado com vrios antioxidantes, incluindo catalase e acetato de
vitamina E. Essas substncias diminuram o efeito citotxico e a inibio da diferenciao por
DBP nas clulas testadas. Entretanto, esses compostos no mostraram efeito de proteo contra o
MBuP. Os resultados indicaram que DBP e MBuP induziram efeitos citotxicos nas clulas
embrionrias de ratos e sugeriram que esse efeito pode ser exercido atravs de estresse oxidativo
e pode estar relacionado com a relativa alta polaridade do MBuP em relao ao DBP.
Clulas de linhagem contnuas como 3T3 e fibroblastos de hamster L929 so
freqentemente utilizados em testes de citotoxicidade de materiais odontolgicos por causa de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 75
sua reprodutibilidade e respostas biolgicas. Clulas de linhagem primria, apesar de
representarem uma situao clnica mais prxima, apresentam desvantagens prticas, como:
tempo para isolar a clula dos tecidos e necessidade de laboratrio no momento da coleta,
apresentam poucas clulas quando cultivadas e, a desvantagem mais importante, que elas
apresentam tempo de vida curto. A sensibilidade de diferentes linhagens celulares, entretanto,
frente aos compsitos dentais, ainda no havia sido investigada. Assim, Thonemann et al.
58
, em
2002, realizaram estudo para comparar a resposta de trs linhagens de clulas (primrias de
papila bovina, imortalizadas derivadas desta linhagem primria, transformada com antgeno-T e
E6/F7 oncogem e L929 de hamster de linhagem imortalizada) a monmeros utilizados em
materiais odontolgicos. Para a realizao do experimento, foram cultivadas clulas primrias de
papila bovina (CCP) que, posteriormente, foram transformadas em clulas tCPC B e tCPC E.
Essas clulas e as L929 foram cultivadas em meio de cultura contendo soro fetal bovino e
antibiticos at a primeira passagem e, posteriormente, incubadas em meio de cultura com 10%
de dimetil sulfxido em nitrognio lquido at serem utilizadas. Os compostos testados foram:
BisGMA, UDMA, TEGDMA, 1,6 - HDMA (monmeros bifuncionais); BPA, glicidil metacrilato
- GMA (precursores); MMA, HEMA (monmeros monofuncionais) e canforoquinona - CQ
(fotoiniciador). Todos os compostos foram diludos em 1 mol/l com dimetil sulfxido e, para o
teste de MTT, foram realizadas diluies seriadas contendo no mximo 1% de dimetil sulfxido
em cada concentrao. Os resultados de citotoxicidade mostraram que os monmeros
bifuncionais foram mais citotxicos que os monofuncionais metacrilatos. Dentre as clulas
avaliadas, a sensibilidade aumentou na seguinte ordem: CCP=tCPC B < tCPC E < L929. Dessa
forma, as clulas de linhagem imortalizada L929 mostraram-se mais sensveis que as das
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 76
linhagens primria e transformada de papila dental bovina, quando utilizadas em testes de
biocompatibilidade de monmeros dentais.
Jorge et al.
25
, em 2003, realizaram uma reviso da literatura de artigos publicados
entre os anos 1973 e 2000, no banco de dados Medline, sobre a citotoxicidade de resinas acrlicas
para base de prteses comparando diferentes tipos de reinas, mtodos e ciclos de polimerizao,
alm de fatores que podem influenciar na citotoxicidade. Dois fatores que podem influenciar na
citotoxicidade desses materiais foram relatados: a proporo p/lquido e o armazenamento das
amostras de resina em gua, sendo este ltimo recomendado por 24h antes de instalar a prtese
no paciente, por ser este o perodo de maior citotoxicidade em todas as resinas. E, quanto ao ciclo
de polimerizao utilizado, os estudos relatam que a quantidade de monmero residual, bem
como a citotoxicidade, pode ser diminuda com o ciclo de 7h a 70 C seguido de 1h a 100 C. Por
outro lado, o ciclo de 7h a 60 C e 5min a 90 C, caracteriza-se por ser o ciclo de maior liberao
de monmero residual. Com relao aos mtodos de polimerizao, as resinas autopolimerizveis
so mais citotxicas do que as termopolimerizveis, que so mais citotxicas do que as
polimerizadas por meio de microondas.
O PB, um agente etiolgico de tumor, pode liberar radicais livres que induzem
peroxidao de lipdeos e danos nas membranas celulares em concentraes txicas. Entretanto, o
efeito no metabolismo de lipdeos em concentraes no txicas foi investigado por Datar et al.
13
,
2004. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do PB e seu produto final de degradao, AB, no
metabolismo de lipdeos. Duas linhagens celulares, clulas da mucosa oral de hamster (MOH) e
moncitos humanos (THP-1), foram utilizadas para determinar o efeito do PB, AB e PB
combinado com FeCl
2
no metabolismo de lipdeos. As clulas foram expostas ao PB e
14
C
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 77
acetato por 24h e os lipdeos extrados e separados com o uso de cromatografia. O metabolismo
de alguns lipdeos neutros como o triglicerdeo foi alterado nas duas linhagens celulares em
contato com o PB. O colesterol foi reduzido nas clulas THP-1 e o fosfolipdeo
fosfatidiletanolamina (FE) foi reduzido nas clulas MOH. O AB, produto final do PB, no
apresentou nenhum efeito sobre o metabolismo celular. Concentraes subtxicas do PB
induziram alteraes nos lipdeos neutros como os triglicerdeos e colesterol. O metabolismo dos
principais fosfolipdeos, exceto FE, manteve-se inalterado. Assim, os autores concluram que os
efeitos foram relacionados com o PB e seus produtos de degradao e variaram com o tipo
celular.
Lai et al.
31
, em 2004, avaliaram a citotoxicidade dos lquidos de trs resinas
autopolimerizveis (Alike, Kooliner e Tokuso Rebase) e dos principais componentes desses
lquidos (MMA, IBMA e 1,6 - HDMA). As concentraes desses monmeros presentes nos
lquidos das trs resinas foram determinadas utilizando-se HPLC. Para o teste de citotoxicidade,
foram obtidos fibroblastos gengivais (FG) humanos primrios e clulas de ligamento periodontal
(LP). Os lquidos das resinas e seus principais componentes foram dissolvidos em DMSO e
diludos em meio de cultura, sendo o DMSO utilizado na soluo em concentrao mxima <
0,5%. As clulas foram expostas a diferentes concentraes dos lquidos das trs resinas e dos
seus principais componentes a 37 C por 24h. O grupo controle foi submetido a apenas DMEM
ou DMEM contendo 0,5% de DMSO. O ensaio de MTT, que mensura a atividade metablica
celular, foi realizado e a viabilidade celular avaliada. Alm disso, os padres de morte celular
foram analisados usando a tcnica da Anexina V - FITC (isotiocianato de fluorescena/ iodeto de
propdeo). As anlises em HPLC mostraram que no lquido do material Alike

o monmero
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 78
encontrado em maior quantidade foi o MMA (91,3%). O lquido do material Kooliner apresentou
94,5% de IBMA, enquanto para o lquido do Tokuso Rebase, a concentrao do agente de ligao
cruzada 1,6 - HDMA obtida foi de 65,8%. No teste de MTT, todos os monmeros foram
citotxicos, sendo o lquido do Tokuso Rebase o que apresentou maior citotoxicidade, tanto nas
FG quanto nas LP. Aproximadamente 50% da viabilidade celular foi afetada quando 1,2% de
MMA, 0,15% de IBMA ou 0,025% de 1,6 - HDMA foram utilizados. Os autores relataram que o
maior tempo de reteno do 1,6 - HDMA, durante as anlises em HPLC, pode ser indicativo que
esse monmero apresenta um coeficiente de partio octanol-gua (log P) mais alto. Esse log P
diretamente relacionado com a lipofilicidade, sugerindo que o mecanismo de ao dos
monmeros mediado pela membrana e relativamente no especfico. A maior parte das
clulas morreu por necrose celular e somente uma pequena parte por apoptose. Com base nos
resultados, os autores recomendam que o reembasamento imediato, no qual os materiais
polimerizam in situ, deve ser utilizado com cuidado.
Sofou et al.
55
, 2005, atravs do mtodo de HPLC, analisaram a liberao de trs
compostos no-ftalatos (cido metacrlico, metil metacrilato e n-butil metacrilato) e quatro
ftalatos (dialil ftalato, butoxi carbonil metil butil ftalato, dibutil ftalato e dioctil ftalato), em trs
resinas acrlicas para base de prtese termopolimerizveis (Triplex, Paladon 65 e Type 15).
Corpos-de-prova foram confeccionados para cada um dos materiais avaliados e armazenados em
trs diferentes condies experimentais: gua destilada, saliva artificial e uma mistura de
etanol/gua. Os lquidos provenientes das amostras, de todas as resinas avaliadas, foram
analisados pelo HPLC, em trs diferentes experimentos, para cada uma das condies
experimentais em cada um dos parmetros a serem verificados (tempo e temperatura). Os
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 79
resultados obtidos no presente estudo sugeriram que amplo espectro de monmeros residuais foi
liberado pelas trs resinas testadas. Os compostos no-ftalatos foram liberados em grandes
concentraes. Os ftalatos examinados exibiram diferentes graus de liberao proporcional ao
tempo de armazenagem, marca do material e tipo do experimento. Pde-se observar que,
quantidades significativas de compostos ftalatos e no-ftalatos foram liberadas pelas resinas
testadas. O principal componente detectado foi o metil metacrilato, e o nvel liberado foi tempo-
dependente, diminuindo at o perodo de 5 dias, quando as resinas foram armazenadas em gua
destilada a temperatura ambiente.
Os monmeros podem ser liberados por materiais restauradores, difundir para a polpa ou
gengiva e atingir a saliva e a circulao sangunea. Alm disso, o potencial genotxico de alguns
compostos utilizados na odontologia tem sido claramente documentado. Assim, Schwengberg et
al.
51
, em 2005, realizaram estudo utilizando teste de fluorescncia modificado com clulas
embrionrias de rato (R.E.Tox) para avaliar o potencial embriotxico dos seguintes compostos:
BisGMA, UDMA, HEMA e TEGDMA, assim como de seus metablitos intermedirios, 2,3-
epoxi-2-metil-cido propinico metil ster (EMPME), 1,2-epoxi-2-cido metilpropinico
(EMPA) e AM. Clulas embrionrias de ratos (ER), transfectadas com vetor contendo o gene
para a protena de fluorescncia verde, sob o controle do promotor da alfa-miosina cardaca,
foram diferenciadas na presena de diferentes concentraes dos compostos testados por 12 dias.
A fluorescncia foi mensurada utilizando o espectrofotmetro TECAN e valores foram expressos
em porcentagem em relao aos valores controle. Para distinguir entre efeito citotxico e
embriotxico, todos os compostos tambm foram testados pelo teste de MTT. Os compostos
HEMA, TEGDMA e EMPME no influenciaram o processo de diferenciao das clulas ER em
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 80
micitos cardacos. Nenhum efeito citotxico foi observado em nenhuma das concentraes
testadas. A exposio ao BisGMA resultou em inibio de 50% da viabilidade celular e uma
intensa inibio da diferenciao celular em 10
-5
M. Efeitos embriotxicos foram verificados nas
concentraes 10
-6
e 10
-5
M. EMPA induziu diminuio na diferenciao das clulas ER na
concentrao 10
-5
M sem efeitos citotxicos. Nenhum efeito embriotxico foi induzido em baixas
concentraes. Exposio ao UDMA resultou em leve diminuio da diferenciao celular em 10
-
5
M. A exposio das clulas ao AM resultou em aumento da diferenciao cardaca em at 150%
em 10
-5
M. Nenhum efeito citotxico foi observado nas clulas aps exposio ao AM no teste
MTT. Os autores concluram que, o BisGMA induziu efeito embriotxico/teratognico
significante em ampla faixa de concentraes. Dessa forma, ateno especial deve ser dada a este
composto, o qual deveria ser melhor investigado em experimentos in vivo.
Para avaliar a possibilidade de existir correlao entre citotoxicidade e a mobilizao de
Ca
2+
por (metil) acrilatos, Atsumi et al.
3
, em 2006, investigaram a viabilidade celular e a
alterao na quantidade de Ca
2+

em clulas de carcinoma de glndulas salivares (CGS) e
fibroblastos gengivais humanos (FGH), tratadas, separadamente, com 9 monmeros (metil)
acrilatos utilizados na odontologia. Foram avaliados monmeros com diferentes graus de
hidrofobicidade: cido acrlico (AA), AM, HEMA, MMA, n-butil acrilato (BA), IBMA, n-hexil
metacrilato (HMA) e n-dodecyl metacrilato (DMA). A viabilidade celular foi mensurada pelo
teste de MTT, e a alterao no Ca
2+
avaliada com clulas carregadas com indo-1/AM, um
indicador fluorescente do clcio intracelular. Para ambas as clulas CGS e FGH, a citotoxicidade
dos monmeros foi aproximadamente proporcional sua hidrofobicidade (log P). Nenhum
aumento no de Ca
2+
foi associado aos monmeros hidroflicos. A elevao de Ca
2+
por
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 81
monmeros hidrofbicos ocorreu de forma dose/hidrofbica dependente. A alterao de Ca
2+
nas
clulas CGS ocorreu em dois picos: um pico inicial acentuado seguido de um tardio mais amplo;
com as clulas FGH, entretanto, apenas um nico pico foi observado, possivelmente dependente
da qualidade de membrana celular. O pr-tratamento com n-butanol ou com metil metacrilato
aumentou a elevao de Ca
2+
induzida pelo butil metacrilato, sugerindo que essa elevao possa
ser relacionada com a hidrofobicidade dos monmeros e o tipo celular. Com os monmeros
hidroflicos, AA, AM e HEMA, a viabilidade celular dos dois tipos de clulas avaliadas no foi
significativamente diferente daquela observada para o grupo controle (sem adio de
monmeros). Por outro lado, os monmeros hidrofbicos foram classificados em 3 sub-grupos:
1) DMA e HMA, que so altamente hidrofbicos (lop P maior que 3,5), causaram acentuada
diminuio na viabilidade celular nas concentraes entre 1 a 10 M. 2) BMA, IBMA e BA, que
contm o butil substituinte, so moderamente hidrofbicos (log P: 1,8 a 2,3) e reduziram a
viabilidade celular nas concentraes entre 10 a 100 M. 3) MMA que causou pequena reduo
na viabilidade celular na concentrao de 1 mM.
Nos materiais reembasadores rgidos autopolimerizveis, que permitem realizar o
reembasamento das prteses diretamente na cavidade bucal do paciente, a converso de
monmero em polmero pode no ser completa. O monmero residual e outros componentes
podem ser liberados na cavidade oral, resultando em reaes teciduais. Assim, mtodos de ps-
polimerizao vm sendo sugeridos para promover maior converso de monmeros em
polmeros, com menor liberao de substncias na cavidade oral. Dessa forma, Campanha et al.
8
,
em 2006, realizaram um estudo para comparar a citotoxicidade de seis materiais reembasadores
(TR, U, D, K, NT e Light Liner - LL), tendo sido este ltimo material avaliado com e sem o
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 82
agente inibidor de oxignio (LLABC). Os corpos-de-prova (10 mm X 1 mm) de cada material
foram divididos em trs grupos (n=3): G1 - sem tratamento de ps-polimerizao; G2 - com
tratamento por irradiao com energia de microondas; G3 - com tratamento por imerso em gua
aquecida (55 C por 10min). Os eluatos foram preparados colocando-se 3 discos em cada tubo
estril, contendo meio de cultura, suplementado com soro fetal bovino e antibitico, e incubados
por 37 C por 24h. Meio de cultura sem disco foi incubado para servir como controle negativo.
Clulas L 929 foram colocadas nos orifcios de uma placa de cultura, incubadas por 24h (37 C
em atmosfera de 5% de CO
2
), quando, ento, o meio foi substitudo por meio contendo eluato, na
proporo de 1:1, ou meio controle, e as clulas foram incubadas por mais 24h. Aps esse
perodo, a citotoxicidade foi avaliada por meio da viabilidade celular (MTT) e da incorporao do
radioistopo
3
H - timidina. Houve inibio significante da resposta celular para os eluatos obtidos
dos materiais U e D no grupo 1. Alm disso, houve inibio significante da sntese de DNA em
clulas expostas aos eluatos do grupo 3 para as resinas TR, D, NT e LLABC e aos eluatos do
grupo 2 para os materiais K, D, NT, LL e LLABC. No teste de MTT, a citotoxicidade foi
dependente do tipo de resina e os eluatos dos materiais NT, LL e LLABC produziram diminuio
significativa na viabilidade celular comparado com o grupo controle. Para o ensaio com
3
H -
timidina, os tratamentos de ps-polimerizao diminuram a citotoxidade do material U e no
influenciaram o material D. Alm disso, o tratamento ps-polimerizao com microondas
aumentou a toxicidade dos materiais K, NT, LL e LLABC e o tratamento com imerso em gua
aquecida aumentou a toxicidade das resinas TR, NT e LLABC. Esses resultados no eram
esperados, tendo em vista que os tratamentos utilizados podem reduzir a quantidade de
monmero residual. Assim, os resultados foram atribudos a possvel liberao de outras
substncias como aditivos e produtos da reao de polimerizao, assim como formaldedo que
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 83
pode ser formado na camada superficial durante os tratamentos ps-polimerizao. Um outro
aspecto observado foi que, as resinas que proporcionaram menor atividade metablica, nem
sempre resultaram em baixa incorporao do radioistopo demonstrando que a resposta das
clulas L929 difere quando avaliada pelo teste MTT ou
3
H-Timidina.
Dahl et al.
11
, em 2006, realizaram um estudo in vitro com o objetivo de verificar a
biocompatibilidade de 11 materiais reembasadores para base de prtese, sendo um
autopolimerizvel (Tokuso Rebase), cinco com polimerizao dual (Astron LC Soft, Astron LC
Hard, Bosworth Lightliner Soft, Bosworth Lightliner Hard, Triad DuaLine) e cinco
fotopolimerizveis (Lightdon U, Lightdon U + Plaquit, Triad Hi-Flow Reline Material, Triad
Resiline Reline Material, Triad VLC Reline Material). Esses materiais foram avaliados atravs do
teste de filtro Millipore, teste de viabilidade celular (MTT) e teste em membrana corion-alantide
de ovo embrionado de galinha (HET-CAM). Para os testes MTT e HET-CAM, foram preparadas
amostras dos materiais a partir das quais foram obtidos os extratos. No teste MTT, a
citotoxicidade dos materiais foi determinada pela comparao entre a viabilidade celular
(fibroblastos de hamster L 929) obtida com os extratos em relao ao controle (meio de cultura
sem extrato). A citotoxicidade no teste HET-CAM foi avaliada pelo grau de irritao da
membrana corion-alantide. Para o teste de filtro Millipore, filtros foram colocados na parte
inferior dos orifcios da placa de cultura, sendo ento cobertos com clulas L929 em suspenso.
Os filtros foram colocados em meio de gar com a parte correspondente s clulas voltadas para
baixo. A seguir, sobre os filtros foram colocadas as amostras dos materiais polimerizados, em
forma circular (5 mm de dimetro), e as placas foram incubadas por 24h. Para os produtos que
apresentaram citotoxicidade nas primeiras 24h foi realizado novo teste utilizando 2h de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 84
incubao. A citotoxicidade dos materiais foi avaliada com base em um sistema de pontuao,
que levou em conta a intensidade da colorao da rea de contato entre a amostra e o filtro
contendo as clulas e o dimetro ou extenso da rea afetada. Os resultados mostraram que, no
teste de filtro Millipore, 5 dos 11 materiais testados foram ligeiramente ou moderadamente
citotxicos, enquanto Lightdon U, quando utilizado com o verniz Plaquit, foi severamente
citotxico. Alm disso, todos os materiais apresentaram maior citotoxicidade aps 24h de
incubao, quando comparados ao perodo de 2h. No ensaio de MTT, apenas os materiais Triad
Hi-Flow e Astron LC Hard no apresentaram citotoxicidade. Para o teste HET-CAM nenhum dos
materiais testados apresentou irritao da membrana corion-alantide, com ressalva aos agentes
de unio e o verniz fornecido com os reembasadores Tokuso Rebase e Lightdon U, que no
podem entrar em contato com a mucosa do paciente.
Em estudo prvio, foi demonstrado que o cido metacrlico (AM) um
intermedirio metablito de monmeros dentais no polimerizados, liberados por materiais
restauradores dentrios. Dessa forma, Seiss et al.
52
, em 2007, realizaram estudo para identificar a
possibilidade do intermedirio cido 2,3-epoximetacrlico (2,3-EMA), dos monmeros
odontolgicos, ser metabolizado a partir do cido metacrlico em microssomas hepticos
humanos. A maioria dos compostos epxidos so considerados substncias altamente citotxicas.
A formao e hidrlise foi estudada em sistemas definidos contendo apenas AM e microssomas
hepticos humanos 37 C. A hidrlise foi inibida pelo xido de cicloexeno, um inibidor
competitivo da epxido hidrolase. O produto de reao 2,3-EMA foi analisado pela
cromatografia gasosa/espectrometria de massa. Aps 5, 30, e 60min, as amostras foram retiradas
e analisadas. Os resultados mostraram que, para a reao do AM em 2,3-EMA a taxa mdia de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 85
converso foi de, aproximadamente, 5%, dentro de 1h. Foi verificado que sem a presena do
xido de cicloexeno, a taxa constante de hidrlise enzimtica, no pH 7,4, foi aproximadamente
10 vezes maior que aquela observada na presena do xido de cicloexeno, indicando
instabilidade e, assim, a alta reatividade do 2,3-EMA. A formao do intermedirio do 2,3-EMA
a partir do AM no foi observada quando microssomas hepticos inativados pelo calor foram
utilizados (controle). Neste estudo pode ser demonstrado que o 2,3-EMA um produto do
metabolismo de materiais dentrios em sistemas biolgicos. Dessa forma, maior toxicidade pode
ocorrer em materiais restauradores odontolgicos que so capazes de liberar monmeros que
podem ser metabolizados para AM.
A reao de polimerizao qumica, para as resinas acrlicas, no resulta em total
converso de monmeros em polmeros e, durante o uso desses materiais, ocorre degradao
devido a estresses mecnicos, qumicos e trmicos, resultando na formao de diferentes
produtos, tais como o AM e o AB que so potencialmente irritantes, quando em contato com a
mucosa dos pacientes. Assim, para se avaliar a citotoxicidade das resinas acrlicas,
recomendvel identificar e quantificar a liberao desses componentes. Para isso, Urban
61
, em
2007, realizou um estudo para verificar e quantificar, atravs da anlise por HPLC, os produtos
AM e AB liberados pelos materiais reembasadores e avaliar o efeito de tratamento de ps-
polimerizao em banho de gua aquecida sobre a liberao desses componentes. Foram
selecionados materiais com diferentes composies, com e sem agente de ligao cruzada (K,
NT, U, T). Foram confeccionados 12 discos (50 mm X 2 mm) de cada material que foram, ento,
divididos em dois grupos (n=6): grupo C- corpos-de-prova sem tratamento (controle); e grupo
WB, submetidos a tratamento de ps-polimerizao em banho de gua aquecida (55 C por 10
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 86
min). Em seguida, cada corpo-de-prova foi imerso separadamente em um recipiente plstico, com
20 mL de saliva artificial, e armazenados em condies de 37 C por um perodo de 30 dias.
Alquotas foram retiradas da soluo de imerso nos perodos de 1, 3, 5, e 24h e em 3, 7, 14, e, 30
dias e analisadas imediatamente pelo teste de HPLC e os produtos liberados foram quantificados.
O material U apresentou maior liberao de AM na primeira hora, que diminuiu aps 3 horas de
imerso. Apenas para o material U, o tratamento de ps-polimerizao diminuiu a liberao de
AM quando comparado ao controle. Para todos os corpos-de-prova do grupo controle, a
concentrao de AB diminuiu progressivamente com o tempo. O tratamento de ps-
polimerizao diminuiu a liberao de AB para todos os materiais quando comparado com os
controles.
Em 2007, Jorge et al.
26
realizaram testes de citotoxicidade celular in vitro de duas
resinas acrlicas para base de prtese, com diferentes ciclos de polimerizao e dois tipos de
tratamento ps-polimerizao. Para a realizao do teste, foram utilizadas as resinas para base de
prtese QC-20, polimerizada em ciclo normal e em ciclo reverso, e a Lucitone 550, polimerizada
em ciclo longo e curto. Para cada condio experimental foram confeccionados 3 corpos-de-
prova (10 mm X 1 mm) de cada material que foram divididos nos seguintes grupos: 1- ps-
polimerizao em microondas por 3min a 500 W; 2- ps-polimerizao em banho de gua a 55
C por 60min; 3- sem ps-polimerizao. Eluatos foram obtidos a partir de cada corpo-de-prova,
que foram colocados em vidro estril, contendo 9 ml de meio de cultura complementado com
gentamicina e soro fetal bovino, e incubados a 37 C por 24h. Aps a obteno dos eluatos, foi
realizado o teste de citotoxicidade atravs da anlise de sntese de DNA em clulas de
fibroblastos de hamster (L929) pelo ensaio de
3
H - timidina. Os materiais foram classificados de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 87
acordo com a porcentagem de reduo da viabilidade celular em relao ao grupo controle (sem
eluato). Foi verificado que a resina Lucitone 550 quando polimerizada pelo ciclo longo
apresentou maior citotoxicidade (moderamente citotxica) que quando processada utilizando o
ciclo curto (no-citotxica). Alm disso, o tratamento de ps-polimerizao em gua aquecida
reduziu a citotoxicidade dessa resina, resultando em nvel de reduo na viabilidade celular
menor que 25% (no citotxica). A resina QC-20 polimerizada pelo ciclo normal e submetida a
tratamento por irradiao em microondas por 3min a 500W apresentou toxicidade considerada
moderada (reduo entre 50 a 75% da viabilidade celular em relao ao controle).
Moharamzadeh et al.
43
, em 2007, avaliaram e compararam os efeitos biolgicos de
trs monmeros (TEGDMA; UDMA e bis-GMA) em trs linhagens de fibroblastos gengivais
humanos (FGH) e em queratincitos (HaCaT) humanos imortalizados. As anlises foram
realizadas utilizando ensaios de citotoxicidade e liberao de IL-1, enzima correlacionada com
processos inflamatrios como gengivite e periodontite. Para a realizao dos ensaios, as clulas
FGH e HaCaT foram cultivadas nas mesmas condies, diferindo apenas no tempo de incubao
com a tripsina/EDTA, para a separao das clulas. Os monmeros foram diludos em DMSO,
em concentrao mxima de 0,5%, e meio de cultura, com sete diferentes concentraes,
variando de 10
-2
a 10 mM. Para o teste de citotoxicidade, as clulas foram cultivadas em placa de
48 orifcios por 24h e colocadas em contato com as diferentes concentraes de monmeros por
mais 24h. Aps esse perodo, foi acrescentado a cada orifcio da placa 1 ml de soluo com 10%
de Azul Alamar e meio de Eagle modificado por Dulbeccos (DMEM). Aps 5h, as amostras
foram transferidas para placa de 96 orifcios para a leitura da intensidade de fluorescncia em um
leitor de fluorescncia. O sobrenadante das clulas foi armazenado anteriormente ao teste de
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 88
citotoxicidade para a mensurao do IL-1. Essa anlise foi realizada em 24 e 72h, por meio do
ensaio imuno adsorvente ligada enzima ELISA. Os resultados demonstraram que todos os
monmeros apresentaram efeitos txicos sobre as clulas FGHs e HaCaT e, em concentraes
elevadas, inibiram a reduo qumica de Alamar Blue. Houve diferenas nas respostas celulares
quando avaliadas as trs linhagens de clulas. Nenhum dos monmeros induziu a liberao de IL-
1 nos sobrenadantes das clulas FGHs e HaCaT.
Urban et al.
62
, em 2007, realizaram estudo para avaliar a quantidade de monmero
residual (MR) em quatro materiais reembasadores autopolimerizveis (D, K, TR e U) e uma
resina para base de prtese termopolimerizvel (Lucitone 550-L), polimerizada por dois ciclos
(curto-LC e longo-LL). O efeito de dois tratamentos de ps-polimerizao no contedo de MR
tambm foi investigado. Foram confeccionados 18 corpos-de-prova circulares (50 mm X 3 mm)
para cada material. Aps a polimerizao, 0,5 mm foram removidos da superfcie de cada corpo-
de-prova, sobre refrigerao, utilizando-se de lixas em granulaes crescentes (80, 600 e 1200).
Em seguida, os corpos-de-prova foram divididos em trs grupos: G1 (no tratados - controle); G2
(submetidos a tratamento de ps-polimerizao em microondas, com diferentes tempos e
potncias; G3 (submetidos a tratamento de ps-polimerizao em banho de gua aquecida a 55
C, sendo o tempo de imerso de 60min para a resina L e de 10min para os materiais
reembasadores). Amostras de 100 mg foram obtidas de cada corpo-de-prova e colocadas,
individualmente, em tubos de vidro contendo 2 ml de metanol. Os tubos foram agitados durante
2h e, aps este perodo, o extrato foi centrifugado em 10.000 r.p.m. por 15min. Alquotas de
100L da soluo de cada tubo foram injetadas no sistema de HPLC, para avaliar a quantidade de
MR dos materiais. Os resultados mostraram que, para o grupo controle, houve diferenas
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 89
estatisticamente significantes entre os materiais e a quantidade de MR apresentou a seguinte
ordem K>D>U>LL>TR>LS. Os valores de MR das resinas TR e LS, aps imerso em gua
aquecida ou irradiao com microondas, no apresentaram diferenas estatisticamente
significantes. TR e LS tambm apresentaram os menores valores de MR em todos os grupos
avaliados. As resinas K e D apresentaram as maiores mdias de MR em todos os grupos. A
imerso em gua aquecida reduziu significantemente a quantidade de MR em todos os materiais
testados, enquanto a irradiao por microondas reduziu apenas para os materiais K, U e TR. Para
os materiais K, D e TR, a reduo de MR obtida com a imerso em gua aquecida foi
significativamente maior que a irradiao por microondas.
O monmero TEGDMA comumente utilizado em resinas odontolgicas.
Polmeros dentrios polimerizados por luz possuem a converso de monmeros em polmeros
incompleta, liberando compostos no polimerizados na cavidade oral. Alm dos monmeros,
compostos adicionais podem ser liberados devido degradao das resinas por ao mecnica e
enzimtica da saliva. Produtos de degradao associados ao TEGDMA incluem trietileno glicol
(TEG), AM, 2,3-EMA e formaldedo. Dessa forma, Emmler et al.
14
, em 2008, avaliaram a
citotoxicidade do TEGDMA e seus metablitos atravs da mensurao da atividade da enzima
mitocondrial desidrogenase verificada pela formao do formazan, produto da clivagem do sal
tetrazlico XTT, pela atividade das clulas A549. Os valores de IC50 (expressos em mmol/L)
foram calculados tendo sido obtidos os seguintes valores: 2,3-EMA - 1,65 (1,28-2,13); TEGDMA
- 1,83 (1,46-2,30); AM 4,91 (4,22-5,71) e formaldedo 5,48 (4,56-6,58). Para o TEG no foi
encontrado efeito citotxico at a concentrao de 10mM. O composto epxido 2,3-EMA induziu
efeitos citotxicos comparveis aos do monmero TEGDMA. Dessa forma, foi concludo que a
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 90
formao de intermedirios txicos pode contribuir para o efeito citotxico do monmero
TEGDMA em clulas pulmonares humanas.
indispensvel anlise da resposta biolgica in vitro dos materiais
odontolgicos. Imazato et al.
22
, em 2009, realizaram estudo para avaliar a hiptese de que eluatos
de materiais odontolgicos contendo monmeros no polimerizados podem causar efeito
inibitrio sobre osteoblastos. Foi estudada a liberao de monmeros em resina composta
(Clearfil AP-X-Bis-GMA/TEGDMA), cimento resinoso (Superbond C&BMMA) e ionmero de
vidro modificado (Fuji Ionomer Type II- HEMA). De acordo com as concentraes liberadas,
osteoblastos (clulas MC3T3-E1) foram cultivados na presena de TEGDMA, MMA, ou HEMA.
Foram analisadas a proliferao celular, por meio de microscopia eletrnica de varredura (MEV)
e teste de atividade mitocondrial (MTT), a atividade da fosfatase alcalina (ALP), a expresso de
marcadores osteoblsticos e a formao de tecido mineralizado. Para a mensurao da liberao
de monmero residual, foram confeccionados trs corpos-de-prova (10 mm X 2 mm) para cada
material sendo aqueles relativos aos materiais Fuji Ionomer Type II e Clearfil AP-X,
polimerizados por 40s, e os do material Superbond C&B, polimerizado por 30min a 25 C. Cada
corpo-de-prova foi colocado em 0,5 mL de gua destilada e a liberao dos monmeros foi
mensurada atravs da HPLC, nos perodos de 12, 24 e 72h. Foi realizada a cultura das clulas
MC3T3-E1 em meio essencial mnimo-, suplementado com soro fetal bovino e antibitico, em
umidade de 5% de CO
2.
As clulas foram, ento, colocadas e cultivadas em uma placa de 48
orifcios, com densidade de 5,0 X 10
4
por orifcio, por 24h. Aps este perodo, o meio foi
removido e colocado um novo meio com os monmeros diludos em concentraes determinadas
de acordo com os valores obtidos em HPLC, sendo 100, 50 ou 10 g/mL para o TEGDMA, 10, 5
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 91
e 1 g/mL para o MMA e 400, 200, 100 e 50 g/mL para o HEMA e incubados pelos perodos
de 3, 7 e 14 dias. A partir do terceiro dia, foi utilizado meio de cultura sem monmeros. Aps
esses perodos, os meios foram preparados para ser observada a morfologia celular em MEV.
Para o teste de MTT, semelhante ao procedimento anterior, aps cada perodo de incubao, foi
colocado 50 g/mL de MTT em soluo de 5 mg/mL e a atividade mitocondrial mensurada por
absorbncia a 570 nm. Os resultados das anlises em HPLC mostraram que liberao de
TEGDMA foi detectada para Clearfil AP-X aps 12-72h de imerso. Superbond C & B mostrou
liberao de MMA aps 12, 24 e 72h. Liberao de HEMA foi observada para o Ionmero Fuji II
LC. Pela anlise em MEV foi observado que houve proliferao normal das clulas at o perodo
de 3 dias para os monmeros TEGDMA e MMA. Para o HEMA, houve inibio no crescimento
celular aps 3 dias na presena de 400 g/mL e a densidade e morfologia foram alteradas com
200 g/mL ou mais aps 14 dias. A atividade ALP foi diminuda para o TEGDMA e MMA em
todas as concentraes no 3
o
dia e, para o HEMA, a atividade foi inibida com 100 g/mL ou
superior, com grande supresso na concentrao de 200 g/mL ou superior. O experimento de
RT-PCR demonstrou expresso de RNA no tipo I colgeno e osteonectina similares as do grupo
controle para os perodos de 7 a 28 dias. Em presena de 200 a 400 g/mL de HEMA a
calcificao foi inibida e no houve formao de tecido mineralizado aps 28 dias.
Tratamento de ps-polimerizao por imerso em gua tem-se mostrado efetivo na
reduo de monmeros residuais em resinas acrlicas. Essa reduo pode contribuir para a
diminuio da liberao de substncias por materiais polimerizados e, conseqentemente,
aumentar a biocompatibilidade e melhorar as propriedades mecnicas. Dessa forma, Urban et
al.
63
, em 2009, atravs do mtodo de HPLC, quantificaram a liberao de monmero residual e
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 92
plastificante em 4 materiais reembasadores rgidos (K, NT, U e T). Foi avaliado tambm o efeito
de tratamento de ps-polimerizao na quantidade e liberao de compostos, no grau de
converso dos materiais, na resistncia flexo e na microdureza. Para a anlise da liberao de
produtos, foram confeccionados 12 corpos-de-prova para cada material, que foram divididos em
2 grupos. Os corpos-de-prova do grupo controle (C), imediatamente aps sua confeco foram
imersos em saliva artificial temperatura de 37 1 C. Os corpos-de-prova do grupo BA foram
imersos em gua 55 C por 10min e, posteriormente, colocados em saliva nas mesmas
condies experimentais do grupo controle. Alquotas de 200 L de cada soluo foram retirados
nos perodos de 1, 3, 5, e 24h e tambm em 3, 7, 14 e 30 dias e analisadas por meio de HPLC.
Para todas as condies analisadas os seguintes compostos foram quantificados: IBMA (K e NT);
1,6 HDMA (U e T); e DBP (NT). As quantidades dessas substncias foram calculadas com
base em curvas de calibrao e expressas em g/mL. O grau de converso de todos os materiais
foi avaliado atravs do uso da espectroscopia Raman. A resistncia flexo foi avaliada
utilizando-se do mtodo de flexo em trs pontos. Aps esse teste, um fragmento de cada corpo-
de-prova foi selecionado para avaliao da microdureza Vickers. Os resultados mostraram que
NT mostrou maior liberao de IBMA quando comparado com a resina K, e U mostrou maior
liberao de 1,6 - HDMA quando comparada com a T. O tratamento de ps- polimerizao
resultou em diminuio significativa na liberao do monmero IBMA pelos materiais K e N.
Contudo, para o monmero 1,6 - HDMA houve reduo significativa somente na primeira hora,
em relao ao controle. Para o plastificante DBP liberado pela resina NT, ocorreu aumento
significativo de liberao de 1 a 3h, seguido de reduo com o aumento do tempo de imerso.
Aps tratamento de ps-polimerizao, houve reduo da quantidade liberada desse composto e,
com 24h, no foi mais identificado. O tratamento BA aumentou o grau de converso das resinas
_______________________________________________________________ Reviso da literatura 93
K e T; no foram encontradas diferenas significantes para os outros materiais. O tratamento BA
aumentou os valores de resistncia flexo apenas do material K e as mdias de microdureza
para os materiais NT, K e T. Os autores concluram que o tratamento de ps-polimerizao
provou ser um mtodo efetivo para reduzir a quantidade e a liberao de monmero residual e
plastificante, alm de promover melhora nas propriedades mecnicas para alguns dos materiais
reembasadores testados.
_____________________________________________________________Proposio 94



















PROPOSIO




_____________________________________________________________Proposio 94

3 Proposio
O objetivo do presente estudo foi avaliar, por meio dos testes
quantitativos de incorporao de
3
H - timidina no DNA e atividade celular pela
reduo do sal 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazlico, a
citoxicidade das seguintes substncias: monmeros IBMA e 1,6 - HDMA;
plastificante DBP; produtos de degradao, AM e AB. Esses compostos foram
analisados em faixas de concentraes que abrangem os valores mximos liberados a
partir de resinas para reembasamento imediato, em diferentes perodos de imerso em
saliva artificial, quantificados em estudos anteriores.

_____________________________________________Material e Mtodo 96

















MATERIAL E MTODO
_____________________________________________Material e Mtodo 97
4 MATERIAL E MTODO
Material
- Materiais, instrumentos e aparelhos utilizados para obteno das solues,
cultura, manuteno e quantificao das clulas e testes de citotoxicidade
x cido benzico, MerckKGaA, Darmstadt, GER
x cido metacrlico, Acros Organics, FairLawn, NJ , USA
x lcool isoproplico, Vetec Qumica Fina LTDA, Duque de Caxias, RJ , BR
x lcool 70%, Vetec Qumica Fina LTDA, Duque de Caxias, RJ , BR
x Aparelho espectrofotmetro, Labsystems Multiskan Ascent, Thermo
Labsystems, Vantaa, FIN
x Aparelho Filtermate Harvester, Unifilter 96 GF/C-Packard Instrument
Company, Meriden, CT, USA
x Azul de tripan, Vetec Qumica Fina LTDA, Duque de Caxias, RJ , BR
x Balana de preciso Gehaka, Ind. e Com. Eletro - Eletrnica Gehaka Ltda,
So Paulo, SP, BR
x Cmara hermocitomtrica de Neubauer, Boeco, Hamburg, GER
x Capela de fluxo laminar, Veco do Brasil, Indstria e Comrcio de
Equipamentos Ltda, Campinas, SP, BR
x Centrfuga, Fanem Ltda, So Paulo, SP, BR
x Contador de cintilao, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA
x Dimetilsulfxido (DMSO), Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA
x Di-n-butil ftalato, Acros Organics, FairLawn, NJ ,USA
x Estufa para cultura de clulas, Forma Scientific, Marietta, OH ,USA
_____________________________________________Material e Mtodo 98
x Fibroblastos de hamster (clulas L929), Instituto Adolfo Lutz, So Paulo,
SP, BR
x Frasco para cultura de clulas, Costar, Corning Incorporated, Corning,
NY, USA
x 1,6-Hexanediol dimetacrilato, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
x Isobutil metacrilato, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
x Kit para anlise colorimtrica MTT, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO,
USA
x Lquido de cintilao Microscint 20, Packard Instrument Company,
Meriden, CT, USA
x Meio de cultura Eagle, Instituto Adolfo Lutz, So Paulo, SP, BR
x Micropipetas, Digipet, Manostat Corp., NY, USA
x Microscpio ptico, Nikon-modelo YS 100, Tokyo, J P
x Pipetador automtico, Boeco, Hamburg, GER
x Pipetas graduadas de 10 ml, Costar, Corning Incroporated, Corning, NY,
USA
x Placa para contador de cintilao com 96 orifcios, Packard Intrument
Company, Meriden, CT, USA
x Placa para cultura de clulas com 96 orifcios, Costar, Corning
Incorporated, NY, USA
x Radioistopo
3
H - timidina, Amesham Pharmacia Biotech do Brasil Ltda,
So Paulo, SP, BR
x Soro fetal bovino, Instituto Adolfo Lutz, So Paulo, SP, BR
_____________________________________________Material e Mtodo 99
x Sulfato de gentamicina, Indstria Qumica e Farmacutica, Schering-
Plough S/A, Rio de J aneiro, RJ , BR
x Tripsina, Instituto Adolfo Lutz, So Paulo, SP, BR
x Tubos de ensaio, Costar, Corning Incorporated, NY, USA
Mtodo
Neste estudo foi avaliada a citoxicidade das seguintes substncias:
monmeros IBMA e 1,6-HDMA; plastificante DBP; produtos de degradao,
AM e AB. Essas substncias foram verificadas em faixas de concentraes
(Tabela 1), em que os valores mximos e mnimos abrangem os maiores valores
que foram liberados por resinas para reembasamento imediato em estudos
anteriores
60,62
. Nesses estudos, amostras das resinas para reembasamento
imediato K, NT e U, submetidas ou no a um tratamento de ps-polimerizao
por meio de imerso em gua aquecida a 55q C por 10 min, foram imersas em
saliva artificial a 37 C, e as quantidades liberadas foram quantificadas por
perodos de at 30 dias. A citotoxicidade foi avaliada por meio de dois mtodos:
incorporao do radioistopo H - timidina e a reduo do sal tetrazlio MTT
(brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil- tetrazlio).
_____________________________________________Material e Mtodo 100
Tabela 1- Substncias e concentraes avaliadas
Substncias Concentraes (Pg/mL).
Mxima Mnima
IBMA 200 0,78
1,6 - HDMA 10 0,31
DBP 40 0,31
AM 50 0,78
AB 50 0,39
Cultura e manuteno das clulas
Fibroblastos de hamsters (clulas L 929) foram propagados em
meio de cultura Eagle, suplementado com 7,5% de soro fetal bovino e 80 g/ml
de gentamicina. O cultivo das clulas foi realizado em frascos para cultura de
clulas com tampa contendo um filtro que permite a passagem de CO
2
. Esses
frascos foram incubados em estufa para clulas com 5% de CO
2,
a 37 C e
ambiente com umidade controlada.
Para a manuteno da cultura, as clulas foram repicadas para
novos frascos a cada perodo de 3 dias de incubao, at a realizao dos testes de
citotoxicidade. Para isso, 2 ml de tripsina foram incorporados ao meio de cultura
com o objetivo de desprender as clulas do frasco. Dessa suspenso de clulas,
cada 1 ml foi colocado em novo frasco e 9 ml de meio de cultura suplementado
foram adicionados com o auxlio de pipeta graduada e pipetador automtico. Cada
_____________________________________________Material e Mtodo 101
frasco foi, ento, tampado e levado estufa para a formao de nova confluncia
de clulas.
Quantificao das clulas
Para a realizao dos testes de citotoxicidade, uma suspenso de
1,0 x 10
5
clulas/ml de meio de cultura foi preparada. As clulas foram
removidas do frasco com a utilizao de tripsina e, em seguida, a suspenso foi
colocada em um tubo de 15 ml e levada para a centrfuga, por 5 min a 1.500 rpm,
com o objetivo de precipitar as clulas no fundo do tubo. Posteriormente, dentro
da capela de fluxo laminar, o sobrenadante foi desprezado e 1 ml de meio de
cultura Eagle suplementado foi acrescentado e homogeneizado s clulas. A
seguir, 10 l foram retirados e adicionados a 90 l de corante azul de tripan.
Dessa soluo, 10 l foram removidos e introduzidos na cmara hemocitomtrica
de Neubauer e as clulas viveis foram contadas com a utilizao de microscpio
ptico com aumento de 40 x. A suspenso foi ajustada a uma concentrao de 1,0
x 10
5
clulas/ml de meio de cultura para posterior utilizao no teste de
citotoxicidade, variando-se o volume da suspenso. Para a realizao dos testes
de citotoxicidade, 100 l da suspenso contendo 1,0 x 10
5
clulas/ml, ou seja, 1,0
x 10
4
clulas/ml, foram colocados em cada um dos compartimentos de uma placa
com 96 orifcios e incubada em estufa com 5% de CO
2,
a 37 C por 24hs.
_____________________________________________Material e Mtodo 102
Obteno das solues
Para obteno das concentraes a serem testadas, foi utilizado o
procedimento de diluio seriada em meio de cultura. Inicialmente, foram
preparadas as solues-me de cada uma das substncias, nas concentraes
mximas avaliadas (Tabela 1). Para se determinar o volume necessrio de cada
substncia para a obteno das solues-me (V1) foi empregada a frmula A:
Frmula A:
C1 x V1 =C2 x V2
na qual, C1 corresponde densidade das substncias fornecidas
pelos respectivos fabricantes; C2 representa a concentrao mxima a ser
avaliada; V2 o volume final da soluo-me, pr-estabelecido com base na
quantidade de meio de cultura necessrio para a realizao dos testes de
citotoxicidade.
O volume V1 calculado com a aplicao dessa frmula,
corresponde a 100% do volume da substncia necessrio para a obteno da
concentrao mxima da soluo-me. Entretanto, os monmeros IBMA e 1,6 -
HDMA, o plastificante DBP e o produto de degradao AM apresentam baixa
solubilidade. Em funo disso, para a obteno da soluo-me desses compostos,
Concentrao mxima
Volume final da soluo me
Densidade: Fornecida pelo fabricante
Volume da substncia necessrio para
obteno da soluo me
_____________________________________________Material e Mtodo 103
em meio de cultura, foi necessria a diluio prvia em dimetilsulfxido (DMSO).
Esse diluente deve estar presente em at 0,5% da concentrao final da substncia
a ser avaliada
21,31,43
. Assim, a partir do valor V1, foi determinado o volume de
DMSO (V2) permitido para cada substncia, por meio do seguinte clculo:
V1___________100 %
V2___________0,5 %
V2 =V1 x 0,5%
100%
Dessa forma, para a substncia IBMA, em que a concentrao
mxima avaliada foi de 200 Pg/ml (C2), a densidade fornecida pelo fabricante
de 0,886 g/ml (C1) e o volume final necessrio para a realizao dos experimentos
de citotoxicidade foi de 10 ml (V2), o valor de V1 foi calculado por meio da
frmula A:
0,886g/ml x V1 =200Pg/ml x 10 ml
0,886g/mlV1 =200x10
-6
g/ml x 10 ml
V1 =0,0022573 ml
V1 =2.257,3 l
Obtido o valor V1, foi, ento, calculado o volume de DMSO (V2)
para essa soluo-me:
_____________________________________________Material e Mtodo 104
2.257,3
V2
V2 =11,3 Pl

Assim, o volume de IBMA utilizado na soluo-me de
concentrao mxima foi equivalente a:
2.257,3Pl - 11,3 Pl =2.246 Pl
O IBMA e o DMSO, nos volumes calculados, foram colocados em
um tubo de ensaio, a soluo foi homogeneizada e 7.743,7 ml de meio de cultura
Eagle foram adicionados, para uma soluo final de 10 ml, obtendo-se a
concentrao mxima. A partir dessa soluo-me foi feita diluies seriadas
(Figura 1) at obteno da concentrao mnima (0,78 Pg/ml).
Seguindo-se os mesmos procedimentos descritos para o IBMA, as
solues-me das substncias 1,6 - HDMA (10 Pg/ml), DBP (40 Pg/ml) e AM (50
Pg/ml) foram obtidas e serialmente diludas em meio de cultura Eagle at as
concentraes mnimas desejadas (1,6 - HDMA - 0,31 Pg/ml; DBP - 0,31 Pg/ml;
AM - 0,78 Pg/ml).
Considerando-se que o AB solvel, no foi necessria sua
diluio prvia em DMSO. Dessa forma, para a obteno da soluo-me, na
concentrao mxima (50 Pg/ml), foi calculado apenas o valor de V1, realizando-
se a diluio seriada at a concentrao mnima avaliada (0,39 Pg/ml).
0,5%
100%
_____________________________________________Material e Mtodo 105
FIGURA 1- Diluio seriada
Teste de citotoxicidade
3
H - Timidina
Neste teste a citotoxicidade das substncias foi analisada pela
quantificao da incorporao do radioistopo H - timidina, que indica o nmero
de clulas viveis pela sntese de DNA. Aps o perodo de incubao de 24 horas,
o meio de cultura de cada orifcio da placa foi substitudo por 20 l de meio de
cultura Eagle contendo 0,25 Ci de H timidina, juntamente com 50 l de meio
de cultura novo e 50 l das solues a serem testadas (IBMA, 1,6 - HDMA, DBP,
AM e AB), nas concentraes obtidas pela diluio seriada. Para cada condio
experimental, foram destinados cinco compartimentos de placa. Para as
substncias IBMA, 1,6 - HDMA, DBP e AM, cinco orifcios da placa receberam
apenas a soluo de H timidina e 100 l de meio de cultura Eagle novo com
_____________________________________________Material e Mtodo 106
DMSO, em concentrao mxima de 0,5%, servindo, dessa forma, como controle.
Para controle do AB, as clulas receberam a soluo de H timidina e 120 l de
meio de cultura Eagle novo. Aps o perodo de 24 horas em estufa com 5% de
CO
2
temperatura de 37 C, em cada orifcio da placa foram colocados 50 l de
tripsina, sendo esta armazenada por 5 minutos na estufa a 37 C para que as
clulas se desprendessem do fundo do compartimento e ficassem em suspenso.
Em seguida, a placa foi levada ao aparelho Filtermate Harvester (Figura 2), onde o
sobrenadante foi descartado e as clulas marcadas com o material radioativo
foram aspiradas, ficando retidas em filtros de outra placa de 96 orifcios branca.
Aps um perodo de 24 horas, a placa foi vedada com um selador opaco na sua
parte inferior e, ento, 30 l de lquido de cintilao foram colocados em cada
orifcio. Posteriormente, um selador transparente foi colocado na parte superior da
placa, levada para anlise da sntese de DNA em um contador de cintilao
(Figura 3). Atravs da vibrao do lquido de cintilao, a qual ocorre devido
sntese de DNA, que o contador de cintilao realizou a leitura. Os resultados
foram expressos em uma contagem por minuto (cpm)
FIGURA 2 - Aparelho Filtermate Harvester FIGURA - 3. Contador de cintilao
_____________________________________________Material e Mtodo 107
MTT
O mtodo de MTT tem como princpio a reduo do sal MTT 3-
(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo tetrazlio, pela desidrogenase
mitocondrial das clulas vivas, para um produto de reao formazan. Aps as
clulas L929 terem sido incubadas por perodo de 24 horas, o meio de cultura foi
descartado e 50 l de meio novo juntamente com 50 l das solues a serem
testadas, nas concentraes obtidas pela diluio seriada, foram colocados em
cada orifcio da placa. Em seguida, as placas foram incubadas por 24 horas em
estufa com 5% de CO
2
, a 37 C. Para cada condio experimental, foram
destinados seis compartimentos da placa. Para as substncias IBMA, 1,6 -
HDMA, DBP e AM, seis orifcios da placa contendo apenas 100l de meio de
cultura Eagle novo com DMSO, em concentrao mxima de 0,5 %, foram
utilizados como controle. No caso do produto de degradao AB, orifcios
contendo somente clulas e 100 l de meio de cultura novo foram utilizados como
controle. Aps o perodo de incubao de 24 horas, o meio foi removido e 100 l
da soluo do sal de tetrazlio MTT (5 mg de MTT, 1 ml de salina fosfatada
tamponada estril e 4 ml de meio de cultura) foram adicionados a cada orifcio da
placa, a qual permaneceu incubada por um perodo de 4 horas a 37 C para a
formao dos cristais de formazan, decorrentes da atividade mitocondrial. Em
seguida, o meio de cultura com a soluo de MTT foi removido e 100 l de
soluo de isopropanol acidificado em HCl a 0,04 N foram colocados em cada
orifcio para solubilizar os cristais de formazan formados. Posteriormente, a
anlise da atividade mitocondrial foi realizada em espectrofotmetro Multiskan
_____________________________________________Material e Mtodo 108
(Figura 4) com comprimentos de onda de 540 nm e 620nm. Os valores de
absorbncia foram calculados pelas diferenas entre os valores mensurados em
cada comprimento de onda, obtendo-se a atividade mitocondrial.
FIGURA 4 - Espectrofotmetro
importante salientar que todos os procedimentos foram
realizados em reas asspticas, dentro da capela de fluxo laminar previamente
desinfetada com lcool 70%, com o operador utilizando roupa de proteo, luvas,
culos, mscara descartvel, instrumental e materiais esterilizados em autoclave.
Metodologia estatstica
O estudo da citotoxicidade dos monmeros IBMA e 1,6 - HDMA,
do plastificante DBP e dos produtos de degradao, AM e AB, em diversas
concentraes, foi realizado pela avaliao da viabilidade celular em relao ao
controle, em porcentagem.
_____________________________________________Material e Mtodo 109
Em ambos os mtodos de citotoxicidade empregados no presente
estudo (
3
H - timidina e MTT), a porcentagem de viabilidade foi analisada
observando-se os grficos aos quais foram adicionados intervalos de confiana de
95% para as mdias de porcentagem de viabilidade em cada concentrao
estudada. Os intervalos de confiana de 95% permitem avaliar a preciso sobre a
mdia de viabilidade celular. Quanto maior a sobreposio desses intervalos,
menor a evidncia de diferena entre as mdias de porcentagem de viabilidade nas
diversas concentraes avaliadas.
Nos grficos de porcentagem de viabilidade celular em relao ao
controle foi utilizada uma escala horizontal logartmica decimal de modo a
facilitar a visualizao e interpretao dos resultados; porm, os valores indicados
nessa escala so as concentraes originais. Alm disso, linhas de grade
horizontais foram colocadas para dividir a escala vertical em faixas de
comprimento de 30%. Essas faixas permitem confrontar as mdias de viabilidade
celular obtidas com a classificao de efeito citotxico estabelecido pela ISO
10993-5
23
:
x no-citotxico: viabilidade celular acima de 90% em relao ao controle;
x discretamente citotxico: viabilidade celular entre 60 e 90% em relao ao
controle;
x moderadamente citotxico: viabilidade celular entre 30 e 60% em relao
ao controle;
x intensamente citotxico: viabilidade celular igual ou abaixo de 30% em
relao ao controle.
___________________________________________________Resultados


110




















RESULTADO



___________________________________________________Resultados


111
5 RESULTADO
Os valores obtidos durante os testes de citotoxicidade das
substncias avaliadas nas diversas concentraes, por meio dos mtodos
3
H -
timidina (cintilao por minuto cpm) e MTT (absorbncia), esto apresentados
nas Tabelas 1 a 5 dos Apndices A e B, respectivamente.
Nas Tabelas 2 a 6 esto apresentados as mdias e os desvios padro
de viabilidade celular em relao ao controle (%) obtidas nos testes
3
H - timidina
e MTT nas diversas concentraes avaliadas de IBMA, 1,6 HDMA, DBP, AM e
AB, respectivamente.

Tabela 2 - Mdias e desvios padro de viabilidade celular (%) nas concentraes
de IBMA para os mtodos
3
H - timidina e MTT
Mtodo Concentrao de IBMA (g/mL)
0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 100 200
3
H Mdia 108,0 106,6 91,4 106,8 102,5 53,9 43,8 4,0 3,9
DP 27,7 32,6 9,3 14,9 34,7 8,4 16,4 6,7 3,9
MTT Mdia 101,7 84,5 62,7 7,6 9,4 8,0 7,7 8,2 6,6
DP 12,5 12,8 7,8 2,3 2,1 1,2 1,0 1,2 1,6





___________________________________________________Resultados


112
Tabela 3 - Mdias e desvios padro de viabilidade celular (%) nas concentraes
de 1,6 - HDMA para os mtodos
3
H - timidina e MTT
Mtodo Concentrao de 1,6 - HDMA (g/mL)
0,31 0,62 1,25 2,5 5 10
3
H Mdia 4,5 1,3 1,5 1,7 1,7 1,4
DP 3,1 0,5 0,5 1,6 1,2 0,7
MTT Mdia 74,2 24,3 10,9 11,5 11,4 11,4
DP 18,8 5,1 2,1 1,9 2,6 3,3

Tabela 4 - Mdias e desvios padro de viabilidade celular (%) nas concentraes
de DBP para os mtodos
3
H - timidina e MTT
Mtodo Concentrao de DBP (g/mL)
0,31 0,62 1,25 2,5 5 10 20 40
3
H Mdia 60,0 32,6 21,9 11,8 2,6 6,1 1,5 1,5
DP 15,0 10,5 4,2 3,9 0,8 3,5 0,3 0,4
MTT Mdia 82,5 23,9 26,2 19,5 19,7 22,3 28,8 28,3
DP 4,8 3,1 5,1 3,1 2,4 5,4 8,1 5,1





___________________________________________________Resultados


113
Tabela 5 - Mdias e desvios padro de viabilidade celular (%) nas concentraes
de AM para os mtodos
3
H - timidina e MTT
Mtodo Concentrao de AM (g/mL)
0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50
3
H Mdia 3,0 0,5 0,6 0,6 0,5 0,4 0,4
DP 0,6 0,1 0,0 0,2 0,2 0,1 0,1
MTT Mdia 37,5 34,1 33,6 47,8 43,9 46,8 39,6
DP 10,2 3,8 3,6 9,4 10,0 2,9 8,7

Tabela 6 - Mdias e desvios padro de viabilidade celular (%) nas concentraes
de AB para os mtodos
3
H - timidina e MTT.
Mtodo Concentrao de AB (g/mL)
0,39 0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50
3
H Mdia 45,8 34,2 39,6 42,3 43,7 39,1 28,6 32,0
DP 10,5 3,2 9,8 10,4 9,3 5,7 8,3 4,9
MTT Mdia 123,4 73,1 102,7 94,1 93,4 92,5 94,6 96,3
DP 17,0 14,9 14,9 19,1 16,5 18,8 14,3 16,3

As Figuras 5 a 9 apresentam os grficos com as porcentagens de
viabilidade celular em relao ao controle, para os dois mtodos de citotoxicidade
empregados:
3
H - timidina e MTT. O modelo que descreve o comportamento da
porcentagem de viabilidade celular em funo do logaritmo da concentrao das
substncias avaliadas sabidamente de uma sigmide, tanto por resultados
___________________________________________________Resultados


114
apresentados na literatura como por alguns grficos obtidos no presente trabalho.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a citotoxicidade das substncias IBMA,
1,6 - HDMA, DBP, AM e AB na faixa de concentraes observadas em pesquisa
anterior
61,63
. Por meio de anlise em HPLC, foi avaliada, quantitativamente, a
liberao dessas substncias a partir de diferentes resinas autopolimerizveis para
reembasamento imediato quando imersas em saliva artificial a 37 C por perodos
de at 30 dias. Dessa forma, devido s faixas de concentraes estabelecidas para
o objetivo deste trabalho, no foi possvel definir uma expresso matemtica da
sigmide obtida. Em ambos os mtodos de citotoxicidade empregados no presente
estudo (
3
H - timidina e MTT), a porcentagem de viabilidade foi, ento, analisada
por meio de grficos, aos quais foram adicionados intervalos de confiana de 95%
para as mdias de porcentagem de viabilidade em cada concentrao estudada. Os
intervalos de confiana de 95% permitem avaliar a preciso sobre a mdia de
viabilidade celular. Quanto maior a sobreposio desses intervalos, menor a
evidncia de diferena entre as mdias de porcentagem de viabilidade nas diversas
concentraes avaliadas. Com o objetivo de facilitar a visualizao e interpretao
dos resultados, foi utilizada uma escala horizontal logartmica decimal.
Entretanto, os valores indicados nessa escala so as concentraes originais
avaliadas. As linhas de grade horizontais dividem a escala vertical em faixas de
comprimento de 30% e permitem analisar as mdias de viabilidade celular
obtidas, em relao ao controle, e relacion-las com a classificao de
citotoxicidade da ISO 10993-5
23
, que estabelece: no citotxico > 90% de
viabilidade celular, discretamente citotxico = 60-90% de viabilidade celular,
___________________________________________________Resultados


115
moderadamente citotxico = 30-60% de viabilidade celular e intensamente
citotxico 30% de viabilidade celular.
0
30
60
90
120
150
0.1 1 10 100 1000
%


v
i
a
b
i
l
i
d
a
d
e
IBMA (Pg/mL)
3H
MTT

FIGURA 5 - Mdias amostrais e intervalos de confiana de 95% para as mdias
populacionais (barras verticais) de viabilidade celular (%) nas
concentraes de IBMA para os mtodos
3
H - timidina e MTT.

Na Figura 5 encontra-se o grfico referente s concentraes
testadas do monmero IBMA. No teste
3
H - timidina, as concentraes de 200
3,12 Pg/mL foram intensamente citotxicas, a de 1,56 moderadamente citotxica,
enquanto a concentrao 0,78Pg/mL foi ligeiramente citotxica. No teste MTT,
entretanto, as concentraes entre 200 a 1,56 Pg/mL foram intensamente
citotxicas e a de 0,78 Pg/mL foi no citotxica.

___________________________________________________Resultados


116
0
30
60
90
120
0,1 1 10 100
%

v
i
a
b
i
l
i
d
a
d
e
1,6 - HDMA (Pg/mL)
3H
MTT

FIGURA 6 - Mdias amostrais e intervalos de confiana de 95% para as mdias
populacionais (barras verticais) de viabilidade celular (%) nas
concentraes de 1,6 - HDMA para os mtodos
3
H - timidina e
MTT.

A Figura 6 representa as concentraes avaliadas para o monmero
1,6 - HDMA. No teste
3
H - timidina, todas as concentraes foram intensamente
citotxicas, o que tambm foi observado no ensaio de MTT, com exceo da
concentrao de 0,31 g/mL que se apresentou discretamente citotxica.


___________________________________________________Resultados


117
0
30
60
90
120
0.1 1 10 100
%

v
i
a
b
i
l
i
d
a
d
e
DBP (Pg/mL)
3H
MTT

FIGURA 7 - Mdias amostrais e intervalos de confiana de 95% para as mdias
populacionais (barras verticais) de viabilidade celular (%) nas
concentraes de DBP para os mtodos
3
H - timidina e MTT.

Na Figura 7, observa-se o grfico da substncia DBP referente s
concentraes estudadas. Para o teste do
3
H - timidina, as concentraes entre 40
1,25 Pg/mL foram intensamente citotxicas, enquanto as concentraes de 0,62 e
0,31 Pg/mL foram moderadamente citotxicas. Para o teste MTT, todas as
concentraes apresentaram-se intensamente citotxicas, com exceo da
concentrao de 0,31 Pg/mL que se mostrou discretamente citotxica.

___________________________________________________Resultados


118
0
30
60
90
120
0.1 1 10 100
%

v
i
a
b
i
l
i
d
a
d
e
AM (Pg/mL)
3H
MTT

FIGURA 8 - Mdias amostrais e intervalos de confiana de 95% para as mdias
populacionais (barras verticais) de viabilidade celular (%) nas
concentraes de AM para os mtodos
3
H - timidina e MTT.
O grfico referente s concentraes estudadas do produto de
degradao AM encontra-se na Figura 8. No teste do
3
H - timidina, todas as
concentraes foram intensamente citotxicas. No ensaio de MTT, contudo, todas
as concentraes apresentaram-se moderadamente citotxicas.
___________________________________________________Resultados


119
0
30
60
90
120
150
0.1 1 10 100
%

v
i
a
b
i
l
i
d
a
d
e
AB (Pg/mL)
3H
MTT
FIGURA 9 - Mdias amostrais e intervalos de confiana de 95% para as mdias
populacionais (barras verticais) de viabilidade celular (%) nas
concentraes de AB para os mtodos
3
H - timidina e MTT.

Na Figura 9 visualiza-se o grfico relativo ao produto de
degradao AB, nas concentraes testadas. Para o teste de
3
H timidina, todas as
concentraes apresentaram-se moderadamente citotxicas. Enquanto no teste de
MTT, todas as concentraes apresentaram-se no-citotxicas, com exceo da
concentrao de 0,78 Pg/mL que foi discretamente citotxica.
_______________________________________________________ Discusso

120






DISCUSSO


_______________________________________________________ Discusso

121
6 DISCUSSO
Desde a introduo das resinas acrlicas em 1930, reaes alrgicas e
de irritao qumica local a esses materiais tm sido relatadas na literatura
1,16,65
. O
principal sintoma mencionado a queimao ou ardncia na cavidade bucal
16
,
envolvendo palato
1
, lngua, mucosa labial e tecido da faringe
1,65
. Os principais sinais
observados so inflamao na mucosa, vesculas e ulceraes
1,16,65
. Alteraes
sistmicas, como urticria, devido ao uso de prteses confeccionadas com resinas
acrlicas base de metil metacrilato (MMA), tambm foram relatadas
38
. Testes de
contato em pacientes que apresentaram sensibilidade comprovaram reao alrgica s
resinas acrlicas e aos seus componentes
1,16
.
As reaes adversas causadas pelas resinas acrlicas para base de
prtese tm sido correlacionadas a substncias que so liberadas por esses materiais,
entre as quais o monmero residual
1,7,12,16,20,25,26,28,30,35,43,48,50,59,60,64,65
. Na reao de
polimerizao das resinas acrlicas, a converso de monmero em polmero no
completa e, dessa forma, certa quantidade de monmero residual permanece no
material polimerizado. Um aspecto que tem sido observado que as resinas ativadas
quimicamente usualmente contm maior quantidade de monmero residual que as
termopolimerizveis
28,64
.
Estudos in vitro tm demonstrado que o monmero residual presente
nas resinas acrlicas para base de prtese pode ser liberado em meios aquosos
28,30,
59,60
. Resinas autopolimerizveis, termopolimerizveis e polimerizadas por irradiao

_______________________________________________________ Discusso

122
em microondas, quando imersas em saliva artificial ou humana liberaram MMA em
todos os meios de imerso
30,59,60
. Estudos in vivo tambm comprovaram a liberao
de monmero residual por resinas acrlicas
5,60
. Os resultados desses estudos in vitro e
in vivo mostraram que, em geral, as resinas quimicamente ativadas liberam
quantidades maiores de monmero residual
5,28,30,59,60
e esse tipo de resina tem sido
freqentemente associada com reaes adversas
16,65
. Kedjarune et al.
28
, em 1999,
observaram que as resinas com baixa quantidade de monmero residual, tambm
apresentaram baixa liberao de MMA. Contudo, resinas com alta concentrao de
monmero residual, no necessariamente, resultaram em maior liberao de MMA.
Assim, a liberao pode variar dependendo do material, demonstrando a necessidade
de se avaliar as diferentes resinas acrlicas comercialmente disponveis.
Alm das resinas para base de prtese, compostas por MMA, outras
resinas autopolimerizveis tm sido desenvolvidas para a realizao do
reembasamento imediato
2,8,31,42,61,62
. Essas resinas tambm contm monmero
residual aps sua reao e em quantidades maiores que resinas para base de prtese
termopolimerizvel
62
. Semelhante ao que ocorre com as resinas acrlicas para base de
prtese, nos materiais reembasadores tambm pode ocorrer a liberao de monmero
no reagido. Urban
61
, em 2007, realizou estudo com o objetivo de quantificar a
liberao em saliva artificial de monmeros residuais de materiais reembasadores
rgidos, em diferentes intervalos de tempo e verificaram que houve liberao de
monmero para todos os materiais. Esses resultados demonstram que, da mesma
_______________________________________________________ Discusso

123
forma que o MMA, a liberao de outros monmeros a partir das resinas para
reembasamento imediato, pode desencadear reaes adversas e estar relacionada com
os efeitos txicos verificados com esses materiais in vitro
8
e in vivo
42
. Estudos tm
avaliado outros monmeros utilizados na composio de diversos polmeros
odontolgicos e verificaram que eles tambm podem ser txicos. Entre os
monmeros avaliados podemos citar o TEGDMA, o uretano dimetacrilato (UDMA) e
o bisfenol A glicerolato dimetacrilato (Bis-GMA)
43,58
, HEMA
58
, monoacrilatos e
monometacrilatos que apresentam grupamento ster alqulico, monometacrilatos com
grupos funcionais e dimetacrilatos
68
.
Alm do monmero residual, as resinas acrlicas podem liberar outros
tipos de substncias, entre as quais o formaldedo
47,59,60
, alm do AM e AB,
formados, provavelmente, pela degradao do MMA e do perxido de benzola,
respectivamente
30
. Os estudos de Lygre et al.
39-40
, in vitro(1995) e in vivo(1993)
demonstraram a liberao de outras substncias como os plastificantes dibutil ftalato,
bifenil, diciclohexil ftalato e fenil benzoato. Um aspecto importante observado nos
estudos mencionados que as resinas autopolimerizveis liberam maior quantidade
de formaldedo
47,59,60
, AM e AB
30
, quando comparadas com as resinas termoativadas
ou polimerizadas por microondas.
Em funo dos aspectos mencionados, a biocompatibilidade das
resinas acrlicas para base de prtese
7,9,10,20,21,25,26,28,30-35,50,53,60
e para reembasamento
imediato tem sido avaliada
8,11,31
. Tm-se observado que as substncias liberadas pelas
_______________________________________________________ Discusso

124
resinas acrlicas para base de prtese termopolimerizveis ou fotopolimerizveis
podem causar efeito txico s clulas epiteliais orais
34
, afetar o metabolismo de
lipdeos e resultar em alteraes nas membranas celulares
50
. Estudos tm indicado
que a ativao qumica pode resultar em resinas que apresentam potencial txico
maior que aquelas polimerizadas pelo calor (em banho de gua aquecida ou
irradiao com microondas) ou por luz
7,9,10,21
. Alm disso, enquanto vrios estudos
tm avaliado a citotoxicidade das resinas para base de prtese, existe pouca
informao em relao s resinas indicadas para o reembasamento imediato,
sobretudo as autopolimerizveis. Nos poucos estudos realizados, foi verificado que
esses materiais tambm podem apresentar efeitos citotxicos. Dahl et al.
11
, em 2006,
avaliaram a biocompatibilidade de 11 materiais reembasadores para base de prtese e
observaram que apenas dois (um fotopolimerizvel e um com polimerizao dual)
no apresentaram citotoxicidade. Campanha et al.
8
, em 2006, compararam a
citotoxicidade de cinco materiais reembasadores para base de prtese
autopolimerizveis e um fotopolimerizvel. Houve inibio significante da sntese de
DNA para os eluatos obtidos de dois materiais autopolimerizveis. Quando
analisados pela atividade metablica celular, um material autopolimerizvel e a resina
fotopolimerizvel produziram diminuio significativa na viabilidade celular
comparados com o grupo controle. Testes de biocompatibilidade dos lquidos de
diferentes materiais reembasadores tambm revelaram que eles so citotxicos,
devendo ser utilizados com cautela
31
.
_______________________________________________________ Discusso

125
Tendo em vista os efeitos txicos das resinas acrlicas, tratamentos de
ps-polimerizao tm sido sugeridos com a finalidade de reduzir a quantidade de
monmeros residuais, melhorando a biocompatibilidade dos materiais. Os estudos de
Urban et al.
61,62,63
, em 2007, 2007 e 2009, quantificaram e comprovaram que os
tratamentos de ps-polimerizao diminuram tanto o contedo de monmero
residual que permanece na resina polimerizada, como tambm a liberao desse
monmero e de produtos de degradao por resinas para base de prtese e materiais
reembasadores autopolimerizveis. Resultados semelhantes foram obtidos por Jorge
et al.
26
, em 2007, que verificaram que o tratamento por imerso em gua aquecida
reduziu a citotoxicidade da resina termopolimerizvel. Por outro lado, Campanha et
al.
8
, em 2006, observaram que tratamentos de ps-polimerizao no influenciaram o
grau de citotoxicidade de materiais reembasadores, quando avaliados pelo teste de
MTT. Esses tratamentos diminuram a citotoxidade de um dos materiais, quando
analisado pelo teste de
3
H-Timidina. Alm desses tratamentos, outros procedimentos
como imerso em gua
5,33,45,50,59,61
por 24 horas antes da colocao da prtese no
paciente tem sido recomendado. Tsuchiya et al.
59
, em 1994, sugeriram a imerso das
prteses de resina acrlica em gua a 50 C, por pelo menos 60 minutos, antes da
instalao, para diminuir seu potencial citotxico, principalmente para as resinas
autopolimerizveis utilizadas para a confeco ou o reembasamento de prteses.
Uma metodologia usualmente empregada nos estudos de toxicidade de
resinas acrlicas envolve a confeco de corpos-de-prova e obteno de eluatos que
so colocados em contato com as clulas. Aps perodos de incubao, o efeito
_______________________________________________________ Discusso

126
citotxico avaliado
7-11,20,21,26,33-35,50,53
. Apesar de fornecer informaes importantes
sobre a toxicidade dos materiais, essa metodologia no permite identificar quais as
substncias foram responsveis pelos efeitos observados. Outros estudos realizam os
testes de citotoxicidade utilizando monmeros empregados na formulao de resinas,
diludos no meio de cultura para se obter as concentraes a serem testadas
11,12,28,
31,43,58,22,68
. Entretanto, usualmente, os estudos tm utilizado concentraes arbitrrias
que podem no refletir as quantidades de monmeros efetivamente liberados pelos
materiais. Poucos estudos tm utilizado concentraes com base em anlise prvia
das quantidades liberadas por resinas acrlicas para base de prtese
28,60
. Em relao s
resinas para reembasamento, as informaes so ainda mais restritas. Somente os
estudos de Urban
61,63
, em 2007 e 2009, determinaram a quantidade de compostos
liberados por diferentes materiais reembasadores rgidos. Corpos-de-prova de cada
material reembasador foram fabricados e armazenados em saliva artificial por 37 C.
Em diferentes intervalos (1, 3, 5 e 24h, e tambm em 3, 7, 14 e 30 dias) alquotas das
solues foram retiradas e analisadas. Os seguintes compostos foram quantificados:
IBMA (K e NT), 1,6 - HDMA (U), DBP (NT) e produtos de degradao AM e AB
(K, NT e U). O efeito de um tratamento de ps-polimerizao (imerso dos corpos-
de-prova em gua a 55 C por 10 min) na liberao de componentes residuais tambm
foi avaliado. Entretanto, os possveis efeitos txicos dessas concentraes ainda no
haviam sido investigados. Assim, no presente estudo, os testes de citotoxicidade das
substncias avaliadas foram realizados utilizando-se faixas de concentraes
_______________________________________________________ Discusso

127
abrangendo os valores mximos liberados pelas 4 resinas reembasadoras nos diversos
perodos e condies experimentais avaliadas.
Vrios mtodos tm sido empregados para avaliar a
biocompatibilidade dos materiais odontolgicos, dentre eles, estudos em animais e
em cultura de clulas. Testes de materiais em cultura de clulas so relativamente
simples, facilmente reproduzveis e de custo acessvel e, por estes motivos, tem sido
freqentemente utilizados. Experimentos em animais possuem muitas variveis
difceis de serem controladas e custo elevado, quando comparado com testes de
cultura celular
25,33,49
. A avaliao in vitro da citotoxicidade (danos celulares) ou
genotoxicidade (danos em DNA ou aberraes cromossmicas) dos materiais tem
sido realizada por meio de diferentes ensaios. Os testes de genotoxicidade podem ser
realizados com bactrias ou clulas humanas e o contato material/clulas pode ser de
forma indireta ou direta
49
. Para anlise da atividade celular, os testes empregados
baseiam-se na mensurao da taxa de metabolismo de determinadas substncias
como, por exemplo, atividade de uma enzima como no teste MTT
8,11,21,22,28,31,37,44,45,53,57,58,68
ou incorporao do radioistopo
3
H - timidina
7,8,26,34,57
. O
teste MTT reflete a respirao mitocondrial
8,11,22,26,31,44,57,58,68
e baseado na
mensurao da enzima deidrogenase mitocondrial, sendo realizado pela converso do
sal tetrazlio em azul formazan, facilmente detectado pelo espectrofotmetro. Dessa
forma, quanto maior a atividade mitocondrial, maior o nmero de clulas
viveis
35,34,44
. um teste simples, sem necessidade de radioistopo, com poucas
etapas e reduzido tempo laboratorial. Assim, este mtodo colorimtrico tem sido
_______________________________________________________ Discusso

128
largamente utilizado para estimar a citotoxicidade de polmeros dentais in
vitro
8,11,22,26,31,44,57,58,68
. O teste
3
H-timidina mensura a incorporao da timidina
marcada na nova sntese de DNA que serve de referncia para mensurar a
proliferao celular
6,8,26,44,57
e uma baixa incorporao demonstra toxicidade. um
teste facilmente realizado no laboratrio; contudo, requer rea assptica, lquido de
cintilao, equipamento especial de alto custo e a utilizao de radioistopo, com
formao de descarte radioativo
6,33
. Alguns autores
8,49,57,26
, entretanto, afirmam de
acordo com os seus resultados, que, entre os testes utilizados nesses experimentos, o
mais sensvel o de incorporao de DNA (
3
H - timidina). Tang et al.
57
, em 1999,
atribuiu a diferena entre os dois mtodos ao fato de que o teste de
3
H timidina
reflete a habilidade das clulas em sintetizar DNA na populao de clulas que esto
se dividindo, enquanto o teste de reduo do MTT reflete a atividade enzimtica que
pode ocorrer na ausncia de proliferao. Assim, a proliferao celular pode ser mais
sensvel que as clulas que no esto dividindo. Dessa forma, segundo Mosmman
44
,
em 1983, o idealizador do mtodo colormetro (MTT), para a seleo do teste a ser
aplicado deve ser considerado qual aspecto especfico ser analisado, fazendo a
distino entre morte, viabilidade e proliferao celular. Segundo Tang et al.
57
, em
1999, embora o teste
3
H-Timidina tenha sido mais sensvel toxicidade das resinas
avaliadas que o MTT, este ltimo mtodo obteve resultados mais reprodutveis e
pode trazer mais informaes sobre a natureza da toxicidade. Alm disso, a utilizao
de mais de um mtodo para avaliar os efeitos citotxicos de polmeros odontolgicos
pode fornecer informaes complementares importantes sobre processos celulares
_______________________________________________________ Discusso

129
diferentes (sobrevivncia e proliferao). Assim, no presente estudo, a citotoxicidade
dos compostos testados foi avaliada pelo teste de
3
H timidina e tambm pela
reduo do sal 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazlico (MTT).
Similar aos resultados de outros estudos, os valores de viabilidade celular mensurados
pelo teste de
3
H timidina foram, em geral, mais baixos que aqueles obtidos com o
ensaio do MTT.
Para a realizao dos testes mencionados, diferentes linhagens
celulares tm sido utilizadas
6,8-11,20,21,26,28,31,35,34,33,37,43,50,53,57,58,66
. Clulas de linhagem
contnua, como fibroblastos de hamster L929, tm sido freqentemente utilizadas por
causa de sua reprodutibilidade e respostas biolgicas. Clulas de linhagem primria,
apesar de representarem situao clnica mais prxima, apresentam desvantagens
prticas, como: tempo para isolar a clula e necessidade de laboratrio no momento
da obteno do tecido, poucas clulas quando cultivadas e tempo de vida limitado
58
.
Thonemann et al.
58
, em 2002, realizaram testes para verificar a sensibilidade de uma
linhagem primria, uma transformada e clulas L929 frente a monmeros utilizados
em produtos odontolgicos e observaram que esta ltima foi mais sensvel. Com base
nessas informaes, as clulas L929 foram selecionadas para avaliar a citotoxidade
dos compostos testados no presente estudo.
Os resultados demonstraram que o mnomero IBMA exibiu um efeito
dose dependente. Para os dois testes de citotoxicidade, a sobrevivncia celular
aproximou-se de zero na maior parte das concentraes avaliadas, e o composto foi
_______________________________________________________ Discusso

130
classificado como intensamente citotxico. Os resultados tambm demonstraram que
o IBMA em concentraes de 1,56 Pg/mL foi moderadamente citotxico, enquanto
em concentraes abaixo de 0,78 g/mL foi considerado discretamente e no
citotxico. Yoshii
68
, em 1999, observou correlao entre o efeito citotxico de
monometacrilatos e seus valores de logaritmo de coeficiente de partio octanol/gua
(log P), que est diretamente relacionado com a lipofilicidade dos monmeros.
Fujisawa et al.
15
, em 1988, tambm hipotetizaram que os efeitos citotxicos dos
monmeros metacrilatos ocorrem devido a alteraes das membranas celulares,
incluindo a migrao de pequenos metacrilatos, solveis em lipdios, na dupla
camada lipdica e a solubilizao dessa camada. A correlao entre os valores de log
P e os tempos de reteno dos monmeros em cromatogramas obtidos por meio de
HPLC tem sido demonstrada
54
. O log P (2,13)
3
e o tempo de reteno (8 min)
62
do
monmero IBMA so maiores que os do monmero MMA (log P 0,73; tempo de
reteno 4,5 min)
3,62
, comumente utilizado em resinas para base de prtese. O
monmero IBMA, quando testado em concentraes semelhantes do MMA, resultou
em baixa viabilidade celular
31
. Assim, podemos supor que a lipofilicidade um fator
importante para a ao citotxica do monmero IBMA sobre as clulas L929
observada no presente estudo.
Os testes de MTT e
3
H-Timidina demonstraram que o monmero 1,6
HDMA foi intensamente citotxico para as clulas L929, com exceo da
concentrao de 0,31 g/mL, que induziu discreta citotoxicidade no teste de MTT.
_______________________________________________________ Discusso

131
Esses resultados esto de acordo com os relatados por Lai et al.
31
, em 2004, que
observaram que o monmero 1,6 HDMA causou efeito citotxico intenso em
fibroblastos gengivais humanos e clulas de ligamento periodontal. Em outro estudo
que determinou a correlao da citotoxicidade com a estrutura molecular de
monmeros, Yoshii
68
, em 1997, analisou o efeito de seis dimetacrilatos, entre eles o
1,6 HDMA, na viabilidade celular relativa de clulas HeLa S3. Eles observaram
que esses dimetacrilatos apresentaram grande variao nos valores de IC 50, entre
0,03 e 3,61 mmol/L. Essa variao foi correlacionada com as diferentes estruturas
moleculares localizadas entre os grupos metacrilatos, que podem ter um papel
importante no efeito citotxico de dimetacrilatos. Similar ao que foi considerado para
o monmero IBMA, o log P (3,31)
68
e o tempo de reteno (17 min)
62
do monmero
1,6 HDMA tambm podem ter contribudo para sua intensa citotoxicidade sobre as
clulas L929.
O plastificante DBP foi intensamente citotxico e reduziu a atividade
mitocondrial das clulas L929 e a sntese de DNA em, aproximadamente, 70 a 100%.
A nica exceo foi menor concentrao (0,31 g/mL), que induziu discreta
citotoxicidade quando mensurada pelo teste de MTT e
3
H - timidina. Vrios estudos
avaliaram a atividade do potencial estrognico dos ftalatos
18,24
; entretanto, existem
poucos estudos sobre sua citotoxicidade. Kim et al.
29
, em 2002, verificaram a
citotoxicidade do DBP e seu produto metablico mono-n-butil ftalato (MBuP) em
cultura de clulas embrionrias de ratos, e observaram que o DBP foi mais citotxico
_______________________________________________________ Discusso

132
que o MBuP. Esses resultados foram correlacionados com a polaridade relativamente
alta do MBuP em relao ao DBP. A alta polaridade do MBuP pode ter reduzido sua
penetrao nas clulas e interao com os locais especficos de ao. A alta
citotoxicidade do DBP observada no presente estudo sugere que baixa polaridade
pode aumentar o efeito txico. Tem sido relatado, tambm, que os fatalatos so
lipoflicos
24
. Como discutido para os monmeros IBMA e 1,6 HDMA, a
lipofilicidade tambm parece ser um fator importante na citotoxicidade dos
plastificantes.
Para todas as concentraes, o produto de degradao AM reduziu a
proliferao das clulas L929 em aproximadamente 100% enquanto a atividade
mitocondrial foi reduzida entre 40 a 70%. O AM tem sido identificado como o
principal produto de degradao de diferentes monmeros, como o TEGMA, 2-
hidroxietilmetacrilato (HEMA) e o MMA, que so comumente utilizados em vrios
materiais odontolgicos e polmeros de alto peso molecular
14,30,41,51
. Tem sido
relatado que leses no epitlio oral nasal de ratos foram causadas pelo metabolismo
do MMA em AM, um metablito irritante e corrosivo
41
. Estudos com cultura celular
tm demonstrado diferentes resultados. Exposio de clulas embrionrias de
camundongos resultou em efeitos embriotxicos, porm nenhum efeito citotxico foi
observado com o teste de MTT
51
. O AM na concentrao de 105 g/ml no
apresentou nenhuma citotoxicidade em fibroblastos de pele humana, enquanto na
concentrao de 470 g/ml a inibio do crescimento avaliado pela contagem de
_______________________________________________________ Discusso

133
clulas foi baixa. Por outro lado, semelhante ao observado no presente estudo,
Emmler et al.
14
, em 2008, observou que o AM induziu perda de viabilidade celular
em clulas pulmonares humanas expostas a esse produto. Por causa da estrutura
allica, o AM pode formar molculas altamente reativas (epxidos) que podem
contribuir para os efeitos citotxicos observados
14,52
. Um desses epxidos, o 2,3
epxi metacrlico cido (2,3 EMA), pode sofrer novas reaes com macromolculas
como o DNA e o RNA
52
.
Tem sido observado que o perxido de benzola (PB) 250 vezes mais
citotxico para as clulas RHEK-1 que o AB
4
. Estudos tm demonstrado que a
toxicidade do PB est relacionada com a gerao de metablitos (radicais livres),
como benzoiloxi e radicais fenil
13,56
. Por outro lado, o AB, que o produto de
degradao final e mais estvel do PB
4,13,56
, no causou nenhuma alterao
significante na sntese de lipdios
13
e no produziu danos no DNA
56
. No presente
estudo, entretanto, foi observado que a incorporao do
3
H - timidina foi reduzida,
indicando que o AB influencia a proliferao celular. Os resultados do teste de MTT
indicaram que o AB foi citotxico em poucas concentraes testadas. Esses
resultados esto em concordncia com aqueles obtidos por Datar et al.
13
, em 2004,
que observaram que o AB no afetou a viabilidade celular quando avaliado por um
mtodo colorimtrico.
Em geral, a sntese de DNA foi mais afetada pelos compostos testados
que a atividade mitocondrial das clulas L929. Tem sido afirmado que a capacidade
_______________________________________________________ Discusso

134
das clulas de se recuperarem de injrias aos mecanismos de sntese de DNA
menor, o que pode resultar em diminuio na taxa de reproduo celular e, como
conseqncia, em mucosa mais delgada
6,34
. Isso particularmente importante no caso
da tcnica de reembasamento imediato, na qual o material reembasador mantm
contato direto com o tecido da cavidade oral.
O resultado do presente estudo demonstrou que as concentraes
mximas dos produtos de degradao AM e AB liberadas pelos materiais
reembasadores NT, K e U, verificado em estudo anterior
61
, foram altamente
citotxicas (
3
H timidina), mesmo aps 7 a 30 dias de imerso em saliva artificial
61
.
Quando os materiais reembasadores foram submetidos a tratamento de ps-
polimerizao, por meio da imerso em gua a 55 C por 10 min, reduo
significativa na liberao de AB foi observada
61
. Apesar dessa reduo, as
quantidades de AB liberadas a partir das resinas para reembasamento, mesmo aps 14
a 30 dias de imerso, foram moderadamente citotxicas. Para o AM, os valores
mximos liberados dos materiais reembasadores, no perodo de 30 dias de imerso,
apresentaram-se intensamente citotxicos para as clulas L929.
A concentrao mxima liberada de DBP pela resina para
reembasamento NT, nas primeiras 5 horas aps polimerizao, verificada no estudo
de Urban et al., em 2009
63
, foi intensamente citotxica. Com o aumento do tempo de
imerso, por at 24 horas, a concentrao mxima liberada pelos corpos-de-prova da
resina NT foi levemente citotxica. Por outro lado, os valores mximos de liberao a
_______________________________________________________ Discusso

135
partir de corpos-de-prova da resina NT submetidos ao tratamento de ps-
polimerizao
63
, nas primeiras 5 horas, apresentaram-se na mesma faixa de
concentrao que foi discretamente citotxica.
Foi observado tambm que as quantidades do monmero 1,6 - HDMA
liberadas pelo reembasador U em saliva artificial at 7 dias de imerso quantificada
por Urban et al., em 2009
63
, foram altamente citotxicas. Resultados similares foram
obtidos com as concentraes mximas liberadas pelos corpos-de-prova da resina U
submetidos ao tratamento de ps-polimerizao. Para o monmero IBMA, os valores
liberados a partir das resinas K e NT at o perodo de 3 dias de imerso em saliva
artificial, observado no mesmo estudo de Urban et al., em 2009
63
, foram intensamente
citotxicos. Quando esses materiais foram submetidos ao tratamento de ps-
polimerizao, no houve liberao de IBMA aps 24 horas (K) e 3 dias de imerso
(NT)
63
; porm, as concentraes mximas liberadas at o perodo de 24 horas, ainda
apresentaram intenso efeito citotxico sobre as clulas L929.
Os resultados deste estudo demonstraram que todos os componentes
avaliados podem ter sido responsveis pelo efeito citotxico de resinas para
reembasamento previamente observado in vitro
8
. Em geral, todos os compostos
demonstraram vrios nveis de citotoxicidade, principalmente na proliferao celular.
Alm disso, com exceo do DBP, as quantidades mximas liberadas de monmeros
e produtos de degradao pelas resinas reembasadoras aps tratamento de ps-
polimerizao por imerso em gua aquecida, ainda apresentaram efeitos txicos
_______________________________________________________ Discusso

136
sobre as clulas L929. Deve ser enfatizado, entretanto, que a implicao clnica de
resultados obtidos em cultura celular deve ser realizada com cautela. A camada de
mucina e queratina pode tornar a mucosa oral mais resistente s substncias txicas
que as culturas celulares. Apesar disso, a identificao dos compostos responsveis
pelo efeito txico pode contribuir para o desenvolvimento de materiais
reembasadores mais biocompatveis.

_________________________________________________________ Concluso
















CONCLUSO



_________________________________________________________ Concluso

7 CONCLUSO
De acordo com os resultados do presente estudo, pode-se concluir que:
1. O monmero IBMA apresentou-se intensamente citotxico, com exceo da menor
concentrao avaliada (0,78 g/mL) que se apresentou discretamente (
3
H timidina)
e no-citotxica (MTT).
2. Para todas as concentraes avaliadas, o monmero 1,6 HDMA foi classificado
como intensamente citotxico; a nica exceo foi a concentrao de 0,31 g/mL que
foi discretamente citotxica no teste MTT.
3. Nos dois testes de citotoxicidade empregados, o plastificante DBP foi intensamente
citotxico, com exceo da menor concentrao avaliada (0,31 g/mL) que se
apresentou moderamente citotxica (
3
H timidina) e discretamente citotxica
(MTT).
4. No teste de
3
H timidina, os produtos de degradao AM e AB, em todas as
concentraes avaliadas, foram classificados como intensamente e moderadamente
citotxico, respectivamente. Para o teste MTT, todas as concentraes avaliadas
foram classificadas como moderadamente citotxicas para o AM e no-citotxicas
para a maioria das concentraes do AB.
5. O teste da incorporao de
3
H timidina foi mais sensvel do que o teste MTT na
deteco dos efeitos citotxicos dos compostos testados.

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_________________________________________________ Apndice A

151




APNDICES


_________________________________________________ Apndice A

152
9 APNDICE
APNDICE A
Resultados do teste de
3
H - timidina, contagem de clulas viveis, em
cintilao por minuto (cpm).
Tabela 1 A - Resultados do DBP
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
40 20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 DMSO
1 110 84 315 211 640 1343 1743 4944 6477
2 76 90 105 15726 543 1509 1477 2913 6726
3 63 71 75 139 656 921 1561 3626 5131
4 79 113 398 103 518 1143 2965 3129 4914
5 121 84 589 142 1074 1453 1742 2838 19307
Resposta 89,8 88,4 351,8 148,8 686,2 1273,8 1897,6 3490,0 5812,0
Dp 24,5 15,4 200,6 45,1 224,9 241,8 607,8 869,0 921,6
IC(95%) 30,5 19,1 319,1 71,8 279,2 300,2 754,7 1079,1 1466,4

Tabela 2 A - Resultados do IBMA

Repeties Concentraes (g/mL) Controle
200 100 50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 DMSO
1 402 452 523 783 752 974 982 1445 5343 4070
2 844 281 238 297 1509 1199 927 2890 4307 5924
3 680 346 717 233 284 1051 1351 2316 5678 8470
4 428 503 338 274 291 291 2144 2932 5504 8845
5 474 346 399 273 611 611 710 3192 5483 7705
Resposta 565,6 385,6 443,0 372,0 689,4 825,2 1222,8 2555,0 5263,0 7002,8
Dp 190,2 89,8 184,7 230,9 501,2 368,8 564,2 698,1 547,5 1987,7
IC(95%) 236,1 111,5 229,3 286,7 622,3 457,9 700,6 866,8 679,8 2468,1
_________________________________________________ Apndice A

153
Tabela 3 A - Resultados do 1,6 HDMA
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 DMSO
1 27 22 49 46 32 343 3904
2 39 42 80 62 40 135 3406
3 46 33 69 33 28 86 3869
4 40 72 29 43 61 150 3114
5 94 129 62 82 62 82 3211
Resposta 49,2 59,6 57,8 53,2 44,6 159,2 3500,8
Dp 26,0 43,0 19,6 19,2 16,0 107,0 367,7
IC(95%) 32,3 53,4 24,4 23,8 19,9 132,8 456,5
Tabela 4 A - Resultados do AM
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 DMSO
1 19 21 26 20 33 21 161 3690
2 25 20 24 29 40 37 174 6339
3 24 25 32 38 37 42 159 7303
4 37 28 36 37 35 33 232 8054
5 26 35 55 52 37 28 234 5612
Resposta 26,2 25,8 34,6 35,2 36,4 32,2 192,0 6346,5
Dp 6,6 6,1 12,4 11,9 2,6 8,1 37,9 1905,0
IC(95%) 8,2 7,5 15,3 14,7 3,2 10,1 47,0 3031,3
_________________________________________________ Apndice A

154
Tabela 5 A - Resultados do AB
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 L929
1 1596 1548 1902 2154 1519 1469 2299 1787 5214
2 1914 2101 2680 2064 2756 2192 2151 2495 4685
3 1684 2332 2663 2497 2957 2428 2057 3039 7866
4 2059 1466 2330 2952 2369 2763 1846 2941 5582
5 2321 1104 2119 3391 3049 2977 1876 3426 6537
Resposta 1914,8 1710,2 2338,8 2611,6 2530,0 2365,8 2045,8 2737,6 5976,8
Dp 291,8 498,2 339,4 558,1 622,7 585,2 189,8 626,2 1253,9
IC(95%) 362,4 618,6 421,4 692,9 773,1 726,6 235,6 777,6 1557,0
APNDICE B
Resultados do teste de MTT, pelos valores de absorbncia calculados pelas
diferenas entre os valores obtidos nos comprimentos de onda 540 e 620 nm,
obtendo-se a atividade mitocondrial das clulas vivas.
Tabela 1 B - Resultados do DBP
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
40 20 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 DMSO
1 0,012 0,010 0,008 0,007 0,009 0,009 0,008 0,030 0,035
2 0,008 0,013 0,010 0,008 0,006 0,008 0,008 0,030 0,038
3 0,008 0,012 0,006 0,006 0,006 0,009 0,009 0,027 0,036
4 0,008 0,020 0,008 0,006 0,006 0,008 0,009 0,037 0,037
5 0,011 0,006 0,019 0,006 0,007 0,008 0,009 0,028 0,034
6 0,011 0,008 0,006 0,006 0,006 0,012 0,006 0,027 0,026
Resposta 0,0097 0,0116 0,0076 0,0068 0,0067 0,0090 0,0082 0,0283 0,0343
Dp 0,0018 0,0048 0,0018 0,0008 0,0010 0,0017 0,0011 0,0016 0,0044
IC(95%) 0,0019 0,0051 0,0023 0,0009 0,0011 0,0018 0,0011 0,0020 0,0047
_________________________________________________ Apndice A

155
Tabela 2 B - Resultados do IBMA
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
200 100 50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 DMSO
1 0,014 0,024 0,022 0,019 0,029 0,024 0,029 0,021 0,320 0,143
2 0,023 0,019 0,017 0,018 0,013 0,019 0,030 0,095 0,423 0,241
3 0,024 0,021 0,014 0,016 0,018 0,016 0,018 0,130 0,514 0,489
4 0,022 0,013 0,015 0,014 0,023 0,014 0,018 0,086 0,613 0,511
5 0,015 0,020 0,017 0,020 0,015 0,015 0,015 0,018 0,603 0,497
6 0,025 0,015 0,014 0,016 0,018 0,014 0,022 0,150 0,469 0,411
Resposta 0,020 0,019 0,017 0,017 0,019 0,017 0,022 0,083 0,490 0,382
Dp 0,005 0,004 0,003 0,002 0,006 0,004 0,006 0,055 0,111 0,154
IC(95%) 0,005 0,004 0,003 0,002 0,006 0,004 0,006 0,057 0,117 0,162
Tabela 3 B - Resultados do 1,6 HDMA
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 DMSO
1 0,013 0,010 0,009 0,008 0,022 0,0186 0,056
2 0,008 0,008 0,008 0,007 0,018 0,070 0,062
3 0,006 0,011 0,011 0,007 0,021 0,048 0,068
4 0,008 0,008 0,008 0,008 0,0564 0,071 0,080
5 0,007 0,008 0,010 0,011 0,016 0,040 0,071
6 0,0170 0,005 0,007 0,008 0,013 0,049 0,112
Resposta 0,009 0,009 0,009 0,008 0,018 0,056 0,075
Dp 0,002 0,002 0,001 0,002 0,004 0,014 0,020
IC(95%) 0,003 0,002 0,001 0,002 0,005 0,017 0,021
_________________________________________________ Apndice A

156
Tabela 4 B - Resultados do AM
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
50 25 12,5 6,25 3,12 1,5 0,78 DMSO
1 0,010 0,012 0,011 0,011 0,009 0,007 0,013 0,008
2 0,007 0,011 0,015 0,013 0,008 0,008 0,0339 0,006
3 0,009 0,011 0,009 0,009 0,007 0,009 0,009 0,007
4 0,009 0,011 0,008 0,009 0,007 0,009 0,006 0,039
5 0,013 0,010 0,011 0,012 0,009 0,008 0,009 0,044
6 0,008 0,012 0,010 0,015 0,009 0,008 0,010 0,040
Resposta 0,010 0,011 0,011 0,012 0,008 0,008 0,009 0,024
Dp 0,002 0,001 0,002 0,002 0,001 0,001 0,002 0,019
IC(95%) 0,002 0,001 0,003 0,002 0,001 0,001 0,003 0,020
Tabela 5 B - Resultados do AB
Repeties Concentraes (g/mL) Controle
50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 DMSO
1 0,113 0,114 0,119 0,127 0,125 0,125 0,0044 0,115 0,103
2 0,108 0,105 0,108 0,113 0,112 0,105 0,0424 0,123 0,105
3 0,106 0,102 0,098 0,099 0,111 0,120 0,090 0,110 0,118
4 0,085 0,084 0,080 0,086 0,085 0,085 0,067 0,153 0,103
5 0,078 0,081 0,069 0,081 0,069 0,101 0,092 0,150 0,102
6 0,123 0,117 0,115 0,090 0,097 0,120 0,061 0,135 0,107
Resposta 0,102 0,100 0,098 0,099 0,100 0,109 0,078 0,131 0,106
Dp 0,017 0,015 0,020 0,017 0,020 0,015 0,016 0,018 0,006
IC(95%) 0,018 0,016 0,021 0,018 0,021 0,016 0,025 0,019 0,006

Autorizo a reproduo deste trabalho.
(Direitos de publicao reservado ao autor)
Araraquara, 17 de Abril de 2009.
CAROLINA DE ANDRADE LIMA CHAVES