- Aislar BACTERIAS AERBICAS por los mtodos de ESTRIADO, DISEMINACIN Y DIFUSIN - Reconocer los diversos parmetros que se toman en cuenta para describir una colonia bacteriana. - Relacionar la morfologa de la colonia con la capacidad tintorial.
MATERIALES: Muestra biolgica - Leche natural - Abono - Bebida fermentada Otros: - Asa de siembra - Alambre de nicrom en aro - Agua destilada - Plumn marcador - Encendedor - Mascarilla - Guantes - Leja - Pao - Gradilla
CULTIVO DE MICROORGANISMOS 1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Gracias a la aplicacin de los medios de cultivo, se ha llegado a conocer ampliamente el comportamiento cultural y fisiolgico de la variada flora microbiana que pulula en los ambientes permitindose la identificacin especfica. Para ello es necesario considerar la metodologa que conduzca a la exacta determinacin de la especie en el laboratorio.
a. Siembra y Aislamiento de microorganismos
Siembra: Acondicionamiento de un microorganismo en un medio de cultivo, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin, pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. Se siembra con dos finalidades: a) Para hacer un aislamiento y b) para hacer un trasplante.
Aislamiento: Permite la separacin del microorganismos a un estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, genere su progenie formando colonias separadas. Si se aslan colonias distintas, cada colonia tendr caracteres especiales. La morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
Trasplante: Separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura y por tanto trasplantes en medios especiales, se logran conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado la identificacin especfica. Los trasplantes pueden ser:
- De lquido a lquido - De lquido a slido - De slido a lquido - De slido a slido
ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA SIEMBRA
(1) Conocer la procedencia de la muestra (tierra, agua, plantas, secreciones, desecho industrial, un cultivo en particular) (2) El medio de cultivo estril y apropiado que condiciona el crecimiento del microorganismo que se quiere estudiar. (3) Los dispositivos de siembra: asas de siembra, pipetas graduadas, esptula de Drigalsky, mecheros, etc. (4) El cubculo de siembra apropiado para el cultivo en condiciones de asepsia. Deben ser instalados en lugares fuera de corrientes de aire, lmparas germicidas UV, mecheros, etc. (5) Equipo complementario: gradillas, lpiz graso, lminas desinfectantes, etc.
RECOMENDACIONES PARA COLECTAR ALGUNAS MUESTRAS A SEMBRARSE
(1) Muestras de Leche: Botellas de 100 mL de capacidad con tapa limpios. Tomar 50 a 100 mL. (2) Muestras de Agua: Almacenar en recipientes de vidrio blanco limpios con capacidad de 250 mL. Se recomienda colectar 100 a 200 mL para asegurar el estudio de los microorganismos. Si es agua turbia, recolectar 20 a 50 mL en frascos de menor capacidad. (3) Muestras de tierra: Si est abonada, basta 1 a 4 g en tubos de prueba de 25 x 120 mm. En caso de tierra virgen la recolecta se har en bolsas de polietileno de mayor capacidad. En general, toda muestra slida debe ser diluida de preferencia en solucin salina o en agua destilada estril antes de la siembra. Adems, la cantidad de inculo debe dosificarse en relacin con la densidad de la muestra, dispositivo de siembra y volumen de medio utilizado.
2. AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA PETRI
Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio slido. Se va descargando gradualmente el inculo para que en los ltimos planos del medio queden escasas clulas que en el ambiente nutricio se irn multiplicando logartmicamente hasta formar colonias puras. Los mtodos de siembra varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el inculo. Cualquiera que sea el mtodo ensayado se aprovecha al mximo la superficie del medio, logrndose aislar el mayor nmero de cepas microbianas.
a. Aislamiento por el Mtodo del Estriado Con el asa de siembra se distribuye el inculo por ESTRIAS en ZAG, con escasa separacin unas de otras (1-3) mm). La distribucin puede ser por estra simple (inculo descrito en un solo plano por todo el medio) y estra en tringulo, cuadrado o pentgono (estras en 3, 4 5 planos en el mismo medio respectivamente). El nmero de estras depende de la cantidad de inculo y los planos de siembra ensayados. Se evita romper el medio.
TECNICA N 1 1.- Con la mano derecha, cargar el asa en aro, previamente al rojo, con inculo de cultivo mixto que sostiene la mano izquierda; destapar el cultivo con el dedo meique y margen cubital de la mano derecha. Se debe flamear el tubo antes y despus de extrada la muestra. 2.- Tomar con la izquierda la placa Petri con agar, descansando la base sobre los dedos medio, anular y meique; el ndice acta de bisagra y con el pulgar, levantar la tapa lo suficiente para el paso del asa cargada. Esta operacin se realiza a la altura del mechero encendido. 3.- Descargar el inculo en un punto marginal de la superficie del medio y con el asa misma, describir la ESTRIAS hasta el margen opuesto de la placa, cuidando de no romper el medio (ESTRIADO SIMPLE). En caso de estriado por PLANOS, repetir los pasos 1, 2, 3 hasta la descarga del inculo, diseminar en el primer plano. Hacer 1/4 de giro de la placa y continuar con el estriado en el segundo plano. Volver a hacer de giro ms para diseminar en estras en el tercer plano, de igual modo en el cuarto plano. Puede hacerse el estriado en 5 planos y an en la parte central del medio, con un solo inculo. 4.- Dejar caer suavemente la tapa con el control de los dedos pulgar e ndice. 5.- Rotular datos sobre el dorso de la placa Petri sembrada as: nmero de grupo, tipo de siembra y fecha. 6.- Incubar a 37 C por 24 hrs. Colocar las placas en la estufa en posicin invertida. TECNICA N 2 1.- Levantar con la izquierda y a la altura de la llama el dorso o base de placa Petri que esta invertida sobre la mesa. Con la derecha cargar el asa y depositar el inculo sobre el medio. Describir las ESTRIAS simples o por planos, manteniendo casi vertical la placa, con la superficie del medio frente al operador. 2.- Regresar la base sembrada en su posicin normal en la mesa de trabajo. 3.- Poner datos e incubar en igual forma a la anterior.
b. Aislamiento por Diseminacin Se practica mediante la pipeta Pasteur estril para la toma del inculo. Esta, por la capilaridad, permite el ascenso del inculo a discrecin el cual es depositado en un margen del medio y esparcido sobre el medio de cultivo con una esptula de Drigalsky. La placa Petri del cultivo debe destaparse lo suficiente como para permitir la estrecha penetracin de la esptula de siembra; as se evita la contaminacin. Ver los pasos de la tcnica en la parte experimental.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Tomar el inculo del cultivo mixto con la pipeta Pasteur y depositar una gota sobre el medio de la placa Petri N 2, que descansa en posicin normal sobre la mesa. 2.- Devolver el sobrante al tubo de cultivo. 3.- Destapar con la izquierda la placa Petri, lo necesario para introducir la esptula de Drigalsky y diseminar la gota por la superficie del medio, no pasando dos veces por el mismo plano. 4.- Desechar la esptula en el frasco bactericida. 5.- Rotular: nmero de grupo, tipo de siembra y fecha. 6.- Incubar igual a los mtodos anteriores.
NOTA: En caso de cultivo muy turbio, el inculo debe ser muy pequeo. Si est diluido, inocular en el medio ms de una gota.
c.- Aislamiento por Difusin
Se practica de preferencia en ANALISIS CUANTITATIVOS BACTERIANOS. Por ejemplo, una muestra de agua en la que se desea conocer el nmero de microorganismos por mL. Es diluida primero al 1/10, 1/1000, etc. de acuerdo a la turbiedad. Se toman alcuotas (1ml) de cada dilucin y se depositan separadamente en placas Petri vacas y estriles. Sobre cada una se vierte agar fundido y enfriado a 45 C (10-15 mL). La mezcla se agita moderadamente con movimientos ondulantes; se espera a que el medio solidifique, se rotulan los datos y se incuban las placas en posicin invertida, a 37 C. A las 24 horas aparecern colonias aisladas en superficie y profundidad, a diferentes planos. Estas ltimas, de forma lenticular y de dimetros diversos. Los clculos matemticos de las cuentas es motivo de otra prctica. Una variedad del mtodo consiste en depositar los inculos en tubos de prueba conteniendo agar fundido. Se agita vigorosamente cada tubo entre las palmas de las manos y el medio se vierte sobre cada una de las placas estriles antes que solidifique. Otra modificacin: se toma de la muestra una cantidad conocida del inculo, se vierte en el primer tubo con el agar fundido, se agita para difusin uniforme, de ste se toma igual cantidad y se vierte en el segundo tubo, se agita, se toma igual cantidad de inculo y se vierte en el tercer tubo, se agita y con movimientos rpidos se vierten los 3 tubos sembrados sobre las respectivas placas estriles. Se obtienen as las diluciones seriadas y el nmero de colonias ser mayor en las ltimas diluciones. Las placas de cultivo para incubacin se colocan invertidas para evitar que el agua de condensacin de la cara interna de la tapa humedezca la superficie. Se asegura el crecimiento de colonias aisladas.
PROCEDIMIENTO.-
El profesor har la demostracin con una muestra de tierra a 3 diluciones: 10 -1 , 10 -2 y 10 -3 . Para los fines de la tcnica seguir cuidadosamente lo indicado por el instructor luego de la demostracin.
NOTA: Hacer esquemas de cada uno de los mtodos de aislamiento y anotar cualquier otra observacin no estipulada en la gua.
PRACTICA N 4 I. LECTURA: MORFOLOGIA DE COLONIAS
Ensayados los mtodos de aislamiento en la clase anterior, el alumno podr ahora observar el resultado de sus siembras sobre el gel (agar corriente), en placas Petri, en 24 48 horas de incubacin.
Si ha seguido las instrucciones, podr visualizar sobre algunos planos del medio, definidas masas microbianas separadas entre s: COLONIAS. Cada COLONIA, no viene a ser sino el resultado de la multiplicacin logartmica de una clula depositada en un punto del medio slido, que en condiciones ptimas de crecimiento forma su progenie con sus caractersticas distintivas de ESPECIES o GRUPOS BACTERIANOS.
La morfologa puede depender de varis factores: naturaleza del medio para el vigor del crecimiento, temperatura y tiempo de incubacin, modo de divisin celular y tipo de movimiento de post-fisin; en consecuencia, una variedad de bacteria tiende a formar constantemente el mismo tipo general de colonia cuando crece sobre el mismo medio y bajo iguales condiciones. De esta manera, por sus caracteres ayuda grandemente a la identificacin. Aunque la mayora de especies bacterianas forma colonias definidas, algunas dan un desarrollo difuso, sobre todo el medio, debido a su extrema motilidad. Ejm. Gnero PROTEUS. Tomando en cuenta la divisin celular y los movimientos de post-fisin, los caracteres de las colonias de definen as:
a) DESLIZAMIENTO: Cundo las clulas se separan fcilmente despus de la divisin, formando masas contorneadas, hmedas, de bordes lisos. As por Ejemplo La familia Enterobacteriaceae.
b) LAZOS Y PLIEGUES: Cuando las clulas se dividen en cadenas largas que se adhieren entre s, formando franjas o pliegues de paquetes de organismos (bacilos rectangulares), que dan a la colonia un aspecto de cabellera despeinada o rizoide con bordes irregulares. Por ejemplo Gnero Bacillus.
c) SALTOS: en caso de clulas cocobacilares o bacilares, unas veces se deslizan aisladamente o formando pequeos grupos; las colonias generalmente esfricas y de superficie lisa, terminan no obstante con bordes dentados o aserrados. Por ejemplo algunas especies del gnero Pasteurella.
Los principales caracteres tomados en cuenta para la descripcin de una colonia son: FORMA, TAMAO, BORDE, ELEVACION, TEXTURA DE LA SUPERFICIE, CONSISTENCIA, GRADO DE ADHERENCIA AL MEDIO, CROMOGENISIS.
Las variaciones de cada uno de los caracteres se sintetizan en el siguiente Cuadro Comparativo:
REQUISITOS PARA LA DESCRIPCIN DE COLONIAS ELEGIDAS
(1) Las colonias deben llegar a su mximo desarrollo, generalmente se obtienen en un tiempo de incubacin de 24 horas a 37 C, en la mayora de especies que estudiamos. (2) El medio sobre el que se desarrollan debe siempre conservar en el ltimo trazo de aislamiento su aspecto transparente. Facilita su ubicacin en superficie, mirando por el dorso de la placa. (3) Las colonias de eleccin deben ser las que han desarrollado en el ltimo trazo de siembra. Adems de presentar caracteres normales, garantiza el grado de pureza por carecer de competencias vecinas. (4) Se recomienda su ubicacin por trazos (crculos, cuadrados, etc.) con lpiz graso o plumn, sobre la base de la placa Petri. Se evita confusin con las que no son de inters para el estudio. En caso de describir ms de una, es mejor enumerarlas en el dorso mismo de la placa. (5) Proceder a la observacin macroscpica sobre la base de los caracteres del cuadro. Para mejor observacin de la textura, es mejor el auxilio de una lupa o microscopio estereoscopio. Para el estudio de la elevacin mirar la colonia de perfil, levantando moderadamente la tapa de la placa a la altura de la llama del mechero. (6) Ajustar las descripciones acompaadas de esquemas. Si son varias las descritas, guardar relacin de forma, tamao, aspecto y otros.
MATERIALES.-
1.- Tres cultivos mixtos en agar nutritivo sembrados por difusin, diseminacin y estriado a partir de agua de regado, leche y abono con diluciones al 1/100 y 1/ 1000 para demostracin.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Observar y comparar el desarrollo microbiano en las placas. Recordar que las placas Petri fueron inoculadas con diferentes muestras usando un mtodo distinto de aislamiento. 2.- En el ESTRIADO SIMPLE, ver desarrollo difuso indiferenciado sobre los primeros trazos; numerosas colonias aisladas bien definidas, sobre los ltimos trazos de siembra. 3.- Observar 5 colonias diferentes, si el aislamiento fue bien llevado. Cada una, corresponde a una especie bacteriana distinta. 4.- Con el plumn marcador limitar mediante un crculo o cuadrado sobre el dorso de la placa, la colonia elegida y enumerarla. 5.- Describir caracteres morfolgicos consultando con el CUADRO COMPARATIVO. En caso de duda, preguntar al profesor. Para mejor observacin de TEXTURA, mirar con lupa. Para ELEVACION, observar de perfil la colonia levantando discretamente la tapa de la placa Petri. 6.- En la MUESTRAS PROBLEMAS, ver colonias distintas o algunas idnticas. En muestras con escasos grmenes,las colonias crecern compartidas en la mayor parte de la superficie del medio. 7.- Describir algunas de las de MUESTRA PROBLEMA; las que se encuentren bien distanciadas unas de otras, siguiendo los pasos anteriores. 8.-Los cultivos en las placas Petri aislados por el mtodo de DIFUSIN, presentarn colonias en superficie en profundidad a varios planos. Las primeras con caractersticas consignadas en el CUADRO COMPARATIVO; las segundas, lenticulares, de varias dimensiones, opacas y transparentes:
11.- Representar esquemticamente el desarrollo de las colonias por cada muestra de agua de regado, leche y abono y presentar las caractersticas morfolgicas observadas de cada una de las colonias analizadas segn el cuadro comparativo mencionado arriba.
CUESTIONARIO 1.- Mencione otros mtodos utilizados en la caracterizacin de los aislamientos de microorganismos. Explique su fundamento.
PRACTICA 5 COLORACIN DIFERENCIAL DE GRAM. PREPARACIN Y FIJACIN OBJETIVOS - Diferenciar a los microorganismos por su capacidad tintrea. - Relacionar la diferencia en composicin de pared celular de acuerdo a la coloracin de GRAM.
COLORACION GENERALIDADES Debido a la naturaleza qumica de la clula bacteriana, su afinidad por los colorantes bsicos es manifiesta, si tomamos en cuenta su principal contenido de cidos nucleicos. Esta propiedad ha sido aprovechada para estudiar mejor los diferentes tipos morfolgicos y estructuras (cpsulas, esporas, flagelos, etc.) que ayudan a la identificacin de una especie o grupo en particular. Los colorantes de mayor aplicacin son los derivados del alquitrn de hulla (anilinas): Cristal Violeta, Violeta de Genciana, Fucsina Bsica, Safranina, Azul de Metileno y Verde de Malaquita. Actan mejor mediante la adicin de mordientes, porque aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmtica. Las coloraciones de rutina con un solo tinte no permiten observar con nitidez cada una de las estructuras mencionadas. De mayor aplicacin prctica son las especficas o diferenciales que requieren prolijidad para un resultado satisfactorio ya que intervienen dos o ms colorantes. Para mejor comprensin del mecanismo de coloracin en microorganismos, es necesario referirse a la accin de los tintes, principalmente los utilizados en microorganismos. Las imgenes producidas por absorcin en las preparaciones coloreadas son ms fciles de interpretar que las imgenes de difraccin dadas por las preparaciones frescas, sobre todo, teniendo en cuenta que los diferentes elementos celulares poseen casi el mismo ndice de refraccin, lo que hace su diferenciacin difcil. En general, las bacterias tienen afinidad por los colorantes derivados de la anilina o en especial por aquellos de carcter bsico. Estos colorantes llevan en su parte cromfora carga electro-positiva, lo que tendra una fuerte afinidad por los grupos electronegativos que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre los cuales se encuentran los cidos nucleicos y sus derivados. Para una breve tincin hay que tomar en cuenta la naturaleza de la bacteria; edad del cultivo, muestra y preferentemente una buena aplicacin de la tcnica.
COLORANTE.- Definicin.- Sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a otros cuerpos de cualquier naturaleza. Composicin Para que una sustancia sea colorante debe estar compuesta por: MOLECULA INCOLORA + CROMOFORO + AUXOCROMO = COLORANTE Donde: Cromgeno: Son las molculas que poseen potencialidad de coloracin; esta potencialidad es conferida por un radical llamado CROMOFORO. Cromforo: Son grupos de tomos no saturados susceptibles de dar coloracin a las molculas de las cuales forman parte; la fuerza de los cromforos vara con la naturaleza de sus tomos y de su estructura. Algunos de estos grupos dan reaccin bsica. Ejm.: Grupo AZO (-N=N-), grupo INDAMINICO (-N=), grupo AZINA (*). Otros dan reaccin cida, por ejm. Grupos Nitro: NO 2 . Auxocromo: Sustancias no saturadas, debido a esta insaturacin influyen en el color. Pueden ser: Simples: Cuando cada uno encierra un tomo no saturado. Ejm.: grupos -OH, - SO 3 H, NH 2 . Compuestos: Cuando cada uno encierra dos tomos no saturados. Ejm.: Grupos hidroxilaminados (-NHOH), grupos hidroxnicos (-NHNH 2 ), grupos Tiohidroxilaminados (-SNH 2 ).
En bacteriologa se emplean colorantes cidos y bsicos, siendo los bsicos de mayor importancia para el bacterilogo.
RECOMENDACIONES GENERALES PARA CUALQUIER COLORACION Cualesquiera de las tcnicas de coloracin bacteriana implican un cuidadoso procesamiento del material colorearse. La calidad de los tintes, fijadores, mordientes y decolorantes debe estar garantizada al igual que la preparacin.
ETAPAS A SEGUIR: (1) EXTENSION O FROTIS La lmina debe estar transparente, desengrasada y limpia. Si el cultivo es lquido, con el asa de siembra en aro esterilizada previamente al rojo, tomar 1-2 gotas y extender suavemente sobre el centro del portaobjetos. Si el cultivo es slido, primero colocar con el asa 1 gota de agua destilada estril sobre el portaobjetos y luego tomar el inculo, emulsionar y extender igual que en la anterior. (2) FIJACION Someter el frotis a la llama del mechero con calentamiento moderado o con alcohol de 70% u otro lquido fijador. (3) COLORACION Cubrir la extensin fijada con la solucin colorante ensayada. Evitar evaporacin por el tiempo que debe actuar. Se intensifica la coloracin con el uso de mordientes como el lugol en el caso de tincin GRAM, cido tnico para teir flagelos, etc. El tiempo vara de acuerdo a la tcnica. (4) DIFERENCIACION Con alcohol simplemente, alcohol acetona o cidos fuertes, como agentes decolorantes. El empleo de cada uno depende de la tcnica. Deben dejarse actuar hasta que el lquido quede incoloro, para desprender el exceso de colorante. (5) LAVADO Con agua corriente para sacar el exceso de diferenciador; en algunos casos se recomienda usar agua destilada. (6) DECOLORACION Para tincin de estructuras que se decoloran por la accin de los diferenciadores. Hacer actuar los colorantes de contraste, el tiempo vara segn la tcnica. (7) LAVADO FINAL A chorro continuo de agua corriente hasta que arrastre todo exceso de colorante. Es preferible para algunas tcnicas, el uso de agua destilada solamente. Evitar formacin de precipitados. (8) SECADO Preferible al ambiente, colocando el preparado en plano inclinado para el escurrimiento y con el frotis protegido de polvo o impurezas. Se puede acelerar el secado con el calor del mechero, evitando sobrecalentamientos. (9) OBSERVACION Observar al microscopio con lente de inmersin y aceite de cedro. Conviene primero enfocar con lente de menor aumento (10X).
II.COLORACION POR EL METODO GRAM Es uno de los principales mtodos de amplia utilidad para clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. Las primeras toman el Cristal Violeta tindose de azul violceo y las segundas, pierden el Cristal Violeta al ser lavadas con el diferenciador (alcohol acetona): es necesario imprimirle un colorante de contraste: fucsina o safranina, para ser observadas, tindose de rojo.
MECANISMO DE LA COLORACION GRAM Se ha estudiado intensamente desde su iniciador (el dans Christian Gram, 1884) hasta nuestros das, el mecanismo ntimo de la COLORACION GRAM, surgiendo varias teoras al respecto: La ms generalizada dice que el Cristal Violeta en mezcla con el Lugo (mordiente) forma en la clula el complejo CARBOHIDRATO-PROTEINA-RIBONUCLEATO DE MAGNESIO, y luego sta, al ser tratada con el alcohol acetona (diferenciador) no cede el colorante, quedando teida de violeta. En cambio las que ceden el colorante por el tratamiento con el colorante de contraste (fucsina o safranina) se tien de color rojo pudiendo ser observadas. Estudios recientes comparativos atribuyen el carcter de gram positividad a la estructura qumica de las paredes celulares; entre otras, principalmente, al contenido de lpidos. En las gram positivas la permeabilidad de las paredes resistentes puede decrecer por el efecto deshidratante del alcohol, mientras que en las gram negativas el alcohol extrae de sus paredes el gran contenido de lpidos aumentando la permeabilidad. De esta manera, fcilmente escapa el complejo cristal violeta-yodo o violeta de genciana- yodo. Es evidente entonces que la pared de las bacterias Gram positivas interpone una barrera que impide acceso al decolorante; en consecuencia, evita la prdida del complejo tinte. Si las Gram positivas teidas se tratan con lisozima se liberan protoplastos que retienen el colorante, mostrando que la clula misma y no la pared es el sitio de la reaccin Gram. Sin embargo, al actuar el decolorante, los protoplastos pierden el tinte y se hacen Gram Negativas. Otros experimentos como la rotura mecnica de la clula o el procesamiento con la enzima ribonucleasa, convirtiendo en Gram negativas las que inicialmente fueron Gram positivas, nos conduce al convencimiento que la integridad estructural fisiolgica de la pared celular juega un papel importante en el mecanismo de este mtodo de coloracin. Es evidente entonces que la causa de la coloracin Gram gravita en la diferencia de composicin qumica de la pared y protoplasma celular de las Gram (+) y Gram (-). Para una buena tincin hay que tomar en cuenta la naturaleza de la bacteria, edad del cultivo o muestra, el carcter cido o bsico del medio y preferentemente una buena aplicacin de la tcnica. Cualquier variacin puede alterar el resultado. Cuando el cultivo es viejo, las bacterias Gram (+) se tornan Gram (-). En cultivos demasiados jvenes, las clulas individuales pueden reaccionar con una u otra forma de tincin. En el caso de ciertas especies bacterianas, por ejemplo Neisserias saprofticas que son bacterias Gram (-) toman inicialmente en forma tan intensa la coloracin Gram, que a una discreta coloracin puede que aparezcan como Gram (+), prestndose a confusin en el diagnstico morfolgico. Aparte de la reaccin Gram, hay otras caractersticas diferenciales entre ambos grupos con propiedades fundamentales que guardan relacin con la Gram positividad (ver cuadro a continuacin).
MATERIAL.- 1.- Cultivos en placas Petri aisladas con los mtodos de Difusin, Diseminacin y Estriado a partir de muestras de agua de regado, leche y abono. 2.-Batera Gram: Cristal Violeta, Fucsina Bsica, Lugol, Alcohol-acetona. 3.-Lminas portaobjetos limpias, asa de siembra, lpiz graso. 4.-Microscopio y aceite de inmersin. Papel lente. Solucin desinfectante (leja). 5. Alcohol 70. 6. Guantes PROCEDIMIENTO.- 1.- Del cultivo tomar el inculo con el asa de siembra, siguiendo las indicaciones del instructor. Extender sobre la lmina conforme se indica en las recomendaciones generales. Flamear nuevamente el asa hasta quedar estril. Tomar el inculo de las colonias previamente caracterizadas morfolgicamente. 2.-Fijar la preparacin a la llama o al ambiente. En el primer caso por pasadas ligeras. Se controla sobre el dorso de la mano. Si el calentamiento es moderado, no habr calcinacin. 3.-Cubrir con la solucin Cristal Violeta por 1 minuto. 4.-Lavar ligeramente con agua corriente. 5.-Cubrir la preparacin con Lugol, por 1 minuto. 6.-Diferenciar con alcohol acetona hasta que ste no arrastre colorante. Es mejor regular la accin del alcohol con movimientos de balanceo con la preparacin antes de ser descartado. 7.-Lavar con agua caliente. 8.-Contrastar con el colorante Fucsina bsica o Safranina, por 10 segundos a 1 minuto. 9.-Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados. 10.-Secar al ambiente o con ayuda del mechero. 11.-Observar el microscopio con lente de inmersin y aceite de inmersin. 12.- Reconocer diversas tipos de morfologa celular: cocos aislados, en parejas, en racimos regulares e irregulares y en cadenas. Tambin bacilos rectangulares, aislados o en cadenas. Todos de color morado intenso, si la tcnica ha sido bien seguida. Son los GRAM POSITIVOS. Tambin cocos en granos de caf y por parejas. Son los GRAM NEGATIVOS. 13.- Dibujar sus observaciones. 14. Relacionar la morfologa de la colonia con morfologa bacteriana y tipo de tincin gram que la conforma.
CUESTIONARIO
1.- Haga un esquema de la pared celular de bacterias gram + y gram y mencione diferencias y semejanzas.
2.- Afecta la edad del cultivo a la coloracin de Gram?
3.- Por qu se utiliza el aceite de inmersin para observar bacterias en el microscopio?
Sesgos Cognitivos: Una Fascinante Mirada dentro de la Psicología Humana y los Métodos para Evitar la Disonancia Cognitiva, Mejorar sus Habilidades para Resolver Problemas y Tomar Mejores Decisiones