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Rle du laboratoire de
microbiologie:
prlvements, examen biologique
2
Plan
1. Gnralits
2. Diagnostic direct
2.1 Prlvements des produits pathologiques
2.2 Etude des produits biologiques
2.2.1 Bactriologie classique
2.2.2 Recherche dantignes solubles
2.2.3 Mthodes molculaires
3. Diagnostic indirect: srodiagnostic
3
Maladies infectieuses
1
ire
cause de mortalit dans le monde (17
millions/an)
Etat pathologique transmissible induit par un
agent infectieux:
Organisme vivant: champignons, parasites, bactries
Parasite molculaire: virus, prions
Rsultats dun conflit hte-agent infectieux
aboutissant des lsions chez lhte infect.
4
Dfinitions
Bactries saprophytes :
Se nourrissent de matires organiques en dcomposition
Bactries de lenvironnement
Bactries commensales :
Vivent aux dpens dun autre organisme sans lui causer de dommage
Flore rsidente
Effet barrire
Bactries pathognes
Pouvoir pathogne : capacit induire des troubles morbides chez lhte
(typhode, cholra, tuberculose)
Li la virulence et la susceptibilit individuelle
Flore normale : pneumocoque, mningocoque
Ou non : salmonelle, tuberculose
5
Flores bactriennes humaines
Flore cutane:
10
6
bactries
Bactries gram
positif
(staphylocoques,
corynbactries)
Flore oro-
pharynge:
10
9
bactries
Anarobies,
streptocoques,
Haemophilus,
Neisseria
Flore digestive:
10
14
bactries
Anarobies,
entrobactries,
entrocoques
6
Diagnostic dune maladie
bactrienne
1. Clinique
Signes gnraux
Signes spcifiques
2. Examens complmentaires
Radiologiques
Biologiques
3. Diagnostic de ltiologie de la maladie bactrienne
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Diagnostic de ltiologie de la
maladie bactrienne
1. DIAGNOSTIC DIRECT ou bactriologique:
- Dtecter la bactrie ou ses constituants (protines,
polyosides, acides nucliques)
- Isoler en culture et identifier le genre et lespce de
cette bactrie
2. DIAGNOSTIC INDIRECT ou srologique:
- Dtection dune rponse immunitaire spcifique de la
bactrie suspecte
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Plan
1. Gnralits
2. Diagnostic direct
2.1 Prlvements des produits pathologiques
2.2 Etude des produits biologiques
2.2.1 Bactriologie classique
2.2.2 Recherche dantignes solubles
2.2.3 Mthodes molculaires
3. Diagnostic indirect: srodiagnostic
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Prlvements des produits
pathologiques
Guids par la symptomatologie et lexamen clinique
O ? :
dans les organes cibles (LCR, abcs profonds, panchements...)
dans le sang au cours de la dissmination
la porte d'entre cutano-muqueuse toujours recherche
Quand ?
le plus tt possible, avant l'antibiothrapie
Comment ?
Strilement
Transport rapide au laboratoire
10
Prlvements cutano-muqueux
Prlvements des produits
pathologiques
11
Urines (ECBU)
Toilette soigneuse de la rgion vulvaire ou du gland
Recueil du 2
ime
jet dans un pot strile
Acheminement rapide au laboratoire ou conservation
4C
Prlvements des produits
pathologiques
12
Prlvements pulmonaires
Crachats (ECBC)
Le matin au rveil, aprs rinage bucco-dentaire
Effort de toux (les crachats salivaires sont liminer)
LBA (Lavage Broncho-Alvolaire)
PDP (Prlvement Distal Protg)
Prlvements des produits
pathologiques
13
Selles (coproculture)
Il faut distinguer
Coproculture standard la recherche de Salmonella,
Shigella,Yersinia, Campylobacter
Coproculture la recherche de BMR
Coproculture la recherche de Clostridium difficile
Ecouvillonnage rectal si pas de selles
Prlvements des produits
pathologiques
14
Pus ou liquides dpanchements
Foyers infectieux ouverts (contamination par la flore
commensale) ou infections fermes
Seringue strile ou couvillon
Si recherche danarobies: milieux spcifiques
(Portagerm ou flacon dhmoculture anarobie)
Prlvements des produits
pathologiques
15
LCR (Liquide Cphalo-Rachidien)
Urgence absolue en cas de suspicion de mningite
Transport urgent +++
Prlvements des produits
pathologiques
16
Hmocultures
Une hmoculture = un flacon arobie + un flacon
anarobie
Prlvement veineux strile
Indications
Hyperthermie >38,5 C
Hypothermie <36,5C
Frissons
Prlvements rpts (3 en gnral)
Prlvements des produits
pathologiques
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Plan
1. Gnralits
2. Diagnostic direct
2.1 Prlvements des produits pathologiques
2.2 Etude des produits biologiques
2.2.1 Bactriologie classique
2.2.2 Recherche dantignes solubles
2.2.3 Mthodes molculaires
3. Diagnostic indirect: srodiagnostic
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Etude des produits biologiques
Bactriologie classique
Examen macroscopique
Examen microscopique
Mise en culture
Identification
antibiogramme
Recherche dantignes solubles
Mthodes molculaires
19
Examen macroscopique
20
Examen microscopique: examen
direct
Examen cytologique
quantitatif ou semi-quantitatif (leucocytes, hmaties)
qualitatif (type de cellules, MGG)
Examen bactriologique
tat frais (mobilit)
coloration
Information au clinicien
Choix des milieux de culture
21
Diffrentes techniques de coloration
des bactries
Coloration universelle : coloration au bleu de
mthylne
22
Coloration de Gram
Information rapide et mdicalement importante, car
pouvoir pathogne et sensibilit aux antibiotiques trs
diffrents
4 groupes:
Bactries Gram positif (bleu)
Bactries Gram ngatif (rose)
Bactries sans paroi (non colorables)
Bactries non colorables par la mthode de Gram (mycobactries,
trponmes)
23
Composition de la paroi en fonction
des espces ou du groupe bactrien
24
Cocci Gram positif
25
Bacilles Gram positif
26
Cocci Gram ngatif
27
Bacilles Gram ngatif
28
Colorations particulires
(bactries non colorables par la mthode de Gram)
Mycobactries
Non colorables par la
mthode de Gram
Treponema pallidum
Agent de la syphilis
Non cultivable
Ziehl-Neelsen
29
Conclusion J0
Arguments diagnostiques de forte
prsomption
Mise en route d'une thrapeutique adapte
Culture et isolement de l'agent causal
essentiels : identification et sensibilit aux
antibiotiques
30
Cultures des produits biologiques
Diffrents milieux de culture
Milieux solides/liquides
Milieux plus ou moins enrichis
Diffrents types de culture
Qualitative identification
Quantitative numration bactrienne (Urines,
prlvements pulmonaires)
31
Diffrentes conditions dincubation (anarobiose,
ajout de CO
2
,)
Diffrents dlais dincubation (24h 48h en
gnral)
Choix fonction des renseignements
cliniques, du type de prlvement et de
lexamen direct
32
Type respiratoire : culture en arobiose et/ou en
anarobiose
Aspect des colonies
Prsence d'une hmolyse (alpha, bta)
Tests dorientation : tat frais, Gram, oxydase,
catalase, srogroupage
Analyse qualitative des bactries
isoles
33
Prlvements uni- ou pauci-microbiens
Analyse qualitative des bactries
isoles
34
Prlvements plurimicrobiens
Analyse qualitative des bactries
isoles
35
Conclusion 24h ou 48h
(bactries usuelles)
Identification prsomptive
Staphylocoque Streptocoque Bacille Gram - Anarobie
- coagulase ngative
- dor
- -hmolytique
- -hmolytique
groupage
- non hmolytique
- entrobactrie
- oxydase +
pyocyanique
- type
Haemophilus sp.
-
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Identification dfinitive
Proprits biochimiques (mtabolisme
respiratoire, glucidique, enzymatique): galeries
adaptes
Constituants antigniques (agglutination)
+/- biologie molculaire
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Interprtation
Prlvements monomicrobiens:
provenant de sites normalement striles (sang, urine, LCR,
tissus...)
dinterprtation assez facile
Examen direct capital, rapide, trs informatif
Prlvements polymicrobiens:
du revtement cutano-muqueux avec flore commensale
(gorge, selles, vagin, peau)
diagnostic plus difficile: reprer une bactrie pathogne au
milieu de bactries commensales souvent trs abondantes
Examen direct peu contributif
38
Antibiogramme
Dtermination de la sensibilit des bactries aux
antibiotiques
Fonction de lespce bactrienne et de lacquisition de
mcanismes de rsistance aux ATB
Adaptation du
traitement antibiotique
39
Recherche dantignes solubles
Avantages : prcocit, simplicit, rapidit, diagnostic
tardif
Sensibilit variable
Urines : pneumocoque, Legionella pneumophila
LCR
Selles : toxines de Clostridium difficile
Inconvnient : pas disolement de la bactrie
40
Exemple : antignurie
Legionella pneumophila type 1
41
Nouvelles techniques de diagnostic
par biologie molculaire
La bactriologie traditionnelle peut tre prise
en dfaut:
Culture impossible (traitement antibiotique pralable,
Treponema)
Culture trop complexe (Chlamydia trachomatis)
Culture trop lente par rapport lurgence
(Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitidis, )
On utilise alors lamplification gnique par PCR
(Polymerase Chain Reaction) de squences
bacteriennes.
42
Arbre phylogntique
extraction Taq pol
PCR
(20 - 60 cycles)
Bactrie
Biopsie tissulaire
lectrophorse
M.W.
1 2
ADN
Banque
de donnes
squenage
43
Diffrents types de PCR:
PCR universelle: dtection et identification des
microorganismes dans les prlvements
biologiques ou aprs isolement (ARN 16S)
PCR spcifique:
dtection et identification dune espce bactrienne
partir de prlvements biologiques ou aprs
isolement (gne spcifique despce)
Epidmiologie: dtection de gnes de rsistance ou
de virulence
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Plan
1. Gnralits
2. Diagnostic direct
2.1 Prlvements des produits pathologiques
2.2 Etude des produits biologiques
2.2.1 Bactriologie classique
2.2.2 Recherche dantignes solubles
2.2.3 Mthodes molculaires
3. Diagnostic indirect: srodiagnostic
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Serodiagnostic
Indications:
Infection due une bactrie croissance difficile ou
impossible
Infection dcapite par les antibiotiques
Diagnostic rtrospectif dune infection rcente
tudes pidmiologiques : sroprvalence
Principe: les bactries expriment des antignes
(Ag), qui induisent une rponse immunitaire
spcifique (apparition danticorps)
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Cintique de production des Ac
IgM
IgG
semaines mois annes
Titre des
anticorps
temps
Exposition
lagent
infectieux
Rponse diffre
(8-10 j)
Ac spcifiques
IgG/IgM
Rexposition
lagent
infectieux
Ascension
immdiate
Ac spcifiques IgG
Taux rsiduel bas
Taux rsiduel lev
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Interprtation dun srodiagnostic
Le srodiagnostic est un diagnostic de suspicion
En faveur dune infection en volution (souvent une
primo-infection)
Sroconversion : Apparition danticorps spcifiques(le 1er
srum est ngatif et le 2me srum est positif)
Ascension des titres danticorps: 1er srum est
faiblement positif et le 2me srum est fortement positif
Dtection dIgM spcifiques : primo-infection
Limites : possibilit de ractions antigniques croises
frquentes avec dautres bactries
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Principales srologies bactriennes
Bactries responsables dinfections pulmonaires
Chlamydia pneumoniae
Legionella pneumophila
Mycoplasma pneumoniae
Bactries responsables dinfections gnitales
Chlamydia trachomatis
Treponema pallidum
Bactries responsables de maladies dissmines difficiles
cultiver
Brucellose
Maladie de Lyme
49
Conclusion : diagnostic
dune maladie bactrienne
Faisceau darguments clinico-biologiques
Examen direct parfois suffisant
Diagnostic indirect parfois seul recours en
routine