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Fisiologa Clnica Medicina USACH 2014: Protocolo 3

Prctico: permeabilidad de solutos a travs de la
membrana plasmtica
M. Albornoz, S. Cabrera, J. Klagges, M. Orellana. Segundo ao de Medicina, USACh, Chile.

Introduccin
El objetivo del prctico es provocar un acercamiento emprico a caractersticas de soluto-
concentracin que determinan fenmenos fsicos en las clulas. De los solutos mostrados en la
Tabla 1 todos difunden menos el Cloruro de Amonio, la Sacarosa y el Manitol.
Los anlisis se centran a los conceptos de osmolaridad de las soluciones y tonicidad del
medio. La osmolaridad es la presin osmtica generada por las molculas de soluto disueltas en
un litro de disolvente. La presin osmtica est determinada exclusivamente por el nmero de
molculas presentes en la solucin y no depende de factores como tamao, masa o naturaleza
qumica de las mismas. La tonicidad de una solucin depende del efecto de la solucin sobre el
volumen de la clula. Guarda relacin con la capacidad de las molculas en solucin de atravesar
la membrana plasmtica. Una solucin hipotnica determina que la clula se hinche y una
hipertnica que hace que se retraiga. El procedimiento prctico enfrenta membranas biolgicas
(eritrocitos) a diferentes medios, de tal forma que se puedan evaluar el flujo de soluto/agua desde
y hacia la clula.
Mtodos
5mL de cada juego soluto-concentracin expuesto en la Tabla 1 fueron puestos en un
tubo de ensayos. De cada uno de ellos fueron retirados 400L con una micropipeta P1000 y
almacenados en caso de ser necesaria la determinacin del hematocrito para evaluar la tonicidad
del medio al no observarse hemlisis.
Se desarroll el siguiente procedimiento secuencialmente desde la solucin 1 hasta la 14:
Con gotario se dej caer una gota de sangre sobre la solucin, agitndola con cuidado para
prevenir la lisis por traumatismo celular. En el instante en el que la sangre toc la solucin, se
activ un cronmetro para determinar el tiempo que tomaba en ocurrir la lisis. En las soluciones
en que no se observ lisis dentro de 20 minutos, se tom una muestra para medir el hematocrito
frente a un control.
La determinacin del hematocrito se llev acabo aadiendo 100L de sangre a cada una
de las soluciones que no mostraron cambios en sus propiedades pticas como medio refractante.
Luego se llenaron capilares de micro-hematocrito y se centrifugaron a 5*10
6
rpm durante 5
minutos. Con papel milimetrado se midi la longitud relativa del volumen de eritrocitos con
respecto al total de la muestra, con eso se determin el porcentaje correspondiente al hematocrito
dentro del capilar.

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Para definir la hemolisis de las soluciones se establecieron dos criterios: el primer criterio
visual es el tubo A1 (vase Tabla 1, muestra A1) con el cual se compararon el resto de las
muestras de las series. El segundo criterio a usar en conjunto, fue la capacidad del medio para
permitir la lectura de un texto, tal que sus letras se vieran completamente ntidas a travs del
tubo.
Debido a que las soluciones estn diluidas a su quinta parte, el hematocrito registrado se
multiplica 5 veces para obtener el hematocrito corregido.
Los datos de los ocho subgrupos fueron ordenados en plantillas Excel resumidas, aquellas
soluciones que no hemolizaron y que se les midi el hematocrito, fueron ingresadas al programa
GraphPad y analizadas mediante un One-way ANOVA Dunnet (sangre pura como control) y
Newman-Kleus, en busca de criterios de comparacin estadsticos para definir la tonicidad del
medio.

Series de diluciones de prueba
Serie Tubo Cantidad Solucin
Osmolaridad
(osmoles/L)
A 1 5 ml Agua destilada 0

2 5 ml NaCl 0,05 M 0,1
3 5 ml NaCl 0,15 M 0,3
4 5 ml NaCl 0,30 M 0,6
B 5 5 ml Urea 0,1 M 0,1

6 5 ml Urea 0,30 M 0,3
7 5 ml Urea 0,60 M 0,6
C 8 5 ml Etanol 0,30 M 0,3

9 5 ml Glicerol 0,30 M 0,3
10 5 ml Manitol 0,30 M 0,3
D 11 2,5 ml NaCl 0,30 M 0,6

2,5 ml Urea 0,60 M 0,6

12 2,5 ml NaCl 0,30 M 0,6

2,5 ml Glicerol 0,30 M 0,3
13 2,5 ml NaCl 0,30 M 0,6

2,5 ml NH4Cl 0,30 M 0,6
14 2,5 ml NaCl 0,30 M 0,6

2,5 ml Sacarosa 0,80 M 0,8
Tabla 1: Soluciones con su composicin, molaridad y osmolaridad. Se clasificaron en cuatro series
(A, B, C y D).

Resultados
El 50% de las soluciones hemoliz durante los primeros 20 minutos del experimento,
tiempo que se defini previamente como suficiente para la observacin. Del 50% de soluciones
restantes, el 60% corresponde a la serie D (vase Tabla 2, muestra 11-14) no demostr cambios
en su propiedad como medio refractante durante el tiempo de observacin.
De las soluciones no hemolizadas: NaCl 0.3M; NaCl 0.3M + Urea 0.6M y NaCl 0.3M +
NH4Cl 0.3M, no mostraron variacin significativa del hematocrito con respecto a la sangre,
mientras que el 60% restante mostr diferencia de hematocrito (vase Grfico 1).

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Tiempo de hemolisis para series de diluciones de pruebas

Tabla 2: Se muestran las diferentes soluciones y el tiempo de hemolisis en la sangre, de acuerdo a cada
subgrupo

Grfico 1: Grfico de barras donde estn dispuestas las soluciones que no lograron la hemlisis en el
tiempo de observacin. Con un (*) estn marcadas aquellas soluciones que obtuvieron un hematocrito
significativamente mayor (p<0.05) al de la sangre control.

Muestra
Osmolaridad
(osmoles/L)
Tiempo de hemlisis de cada sub-grupo(mins)
A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4
A1 0 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0.88 3,39 -
A2 0,1 0,03 0,016 0,05 0,03 0,25 0.37 0,46 4
A3 0,3 N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H
A4 0,6 N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H
B5 0,1 0,55 0,5 0,57 0,55 0,16 0,42 2,36 1
B6 0,3 0,41 0,15 0,44 0,42 0,25 0,78 0,1

B7 0,6 0,52 0,52 0,53 0,52 0,16 0,37 3,41 0,75
C8 0,3 0,68 0,56 0,65 0,66 0,33 0,32 2 -
C9 0,3 0,69 5,5 0,67 0,683 0,38 4,72 N.H 2,5
C10 0,3 N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H
D11 1,2 N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H
D12 0,9 N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H
D13 0,9 N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H
D14 1,4 N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H N.H
-: Dato no obtenido
N.H: No hemoliz a los 20 minutos

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Con el anlisis de los datos obtenidos se logr establecer la tonicidad de las soluciones.
Un 70% del total result ser hipotnica. El 100% de las series B y C lo fue. No se observ
ninguna disminucin significativa de volumen que permitiera clasificar alguna de las soluciones
como hipertnica.
Clasificacin de series de diluciones de prueba

Clasificacin
Tubos Solucin
Osmolaridad
(mosmol/L)
Segn osmolaridad Segn tonicidad
A1 Agua destilada 0,0
hipoosmolar hipotnica
A2 NaCl 0,05 M 0,1
hipoosmolar hipotnica
A3 NaCl 0,15 M 0,3
isoosmolar isotnica
A4 NaCl 0,30 M 0,6
hiperosmolar isotnica
B5 Urea 0,1 M 0,1
hipoosmolar hipotnica
B6 Urea 0,30 M 0,3
isoosmolar hipotnica
B7 Urea 0,60 M 0,6
hiperosmolar hipotnica
C8 Etanol 0,30 M 0,3
isoosmolar hipotnica
C9 Glicerol 0,30 M 0,3
isoosmolar hipotnica
C10 Manitol 0,30 M 0,3
isoosmolar hipotnica
D11 NaCl 0,30 M 0,6
hiperosmolar isotnica
Urea 0,60 M 0,6

D12 NaCl 0,30 M 0,6
hiperosmolar hipotnica
Glicerol 0,30 M 0,3

D13 NaCl 0,30 M 0,6
hiperosmolar isotnica
NH4Cl 0,30 M 0,6

D14 NaCl 0,30 M 0,6
hiperosmolar hipotnica
Sacarosa 0,80 M 0,8

Tabla 3: Se presenta la clasificacin de las soluciones segn la osmolaridad y la tonicidad en funcin de los
resultados previos
Discusin
En base a los resultados obtenidos el objetivo se cumpli debido a la observacin de un
cambio fsico en las clulas de acuerdo a los parmetros visuales para las soluciones donde
ocurri hemolisis, y el hematocrito para las que no hemolizaron. Sin embargo, los resultados
obtenidos no se condicen con la tonicidad que se esperara en base a los conocimientos de
permeabilidad de membrana y osmolaridad.

Se sabe que la membrana de los eritrocitos es permeable a todos los solutos expuestos,
excepto al cloruro de amonio, la sacarosa y el manitol, de acuerdo a la bibliografa revisada. Las
caractersticas de los diferentes solutos tales como el peso molecular, la carga elctrica, y el tipo
de transporte hacia la clula determinan la variacin de volumen celular. En aquellas soluciones
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con molculas de bajo peso molecular o que atraviesan por difusin facilitada se observa
hemlisis en poco tiempo. Este es el caso del agua destilada y la urea (Serie B). Para el resto de
soluciones de la Serie A (con NaCl en diferentes concentraciones), tal como se esperaba, se
registr lisis slo en la solucin hipoosmolar. Sin embargo, en la solucin isoosmolar A3, que no
debi presentar movimiento neto de agua, se evidenci un aumento de volumen, y la solucin
A4, que debi presentar un comportamiento hipertnico se comport como un medio isotnico.
Para la Serie C, los primeros dos solutos son permeables a la membrana plasmtica del
eritrocito, por lo que ingresan a la clula debido al gradiente de concentracin, provocando lisis.
El soluto de la solucin C10, el manitol, es un azcar de gran tamao incapaz de atravesar la
membrana, por lo que la solucin debi comportarse como una solucin isotnica, sin embargo,
hubo lisis.
Finalmente, las primera solucin de la Serie D se comport segn lo esperado
considerando que NaCl y urea presentan osmolaridades iguales y efectos opuestos en la clula.
El resto de las soluciones debieron comportarse como soluciones hipertnicas, principalmente
por la predominancia de la osmolaridad de NaCl frente a solutos que no atraviesan la membrana
(cloruro de amonio y sacarosa) o de muy baja osmolaridad (glicerol), pero presentaron
comportamientos diferentes.

Los resultados fuera de lo esperado se deben a diferentes fuentes de errores, empezando
por el uso de sangre no apta para transfusin y por lo tanto, con caractersticas biolgicas
alteradas. Prueba de esto es el hematocrito control, cuyo promedio fue aprox. 12% y el rango
normal est alrededor del 45%. Adems, la falta de material ptimo para el sellado del
microhematocrito y el consecuente reemplazo de ste por plasticina signific que al centrifugar
no se obtuvieran resultados concluyentes.
Aparte de los errores relacionados con el material, existen los errores relacionados con el
operador, tales como la poca experiencia en el manejo de material biolgico, baja precisin en el
cronometrado y la medicin del hematocrito y la lisis traumtica.

Bibliografa

Koeppen, B., & Staton, B. (2009). Berne y Levy. Fisiologa (Sexta ed.). Elsevier.