Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC

Resolucin de Problemas en
HPLC:Troubleshooting HPLC:Troubleshooting
Tcnicas, Consejos , y Trucos
Agilent Technologies
Page 1
Pasos en la Resolucin de Problemas
Una vez que has detectado que hay un problema! Una vez que has detectado que hay un problema!
Cmo lo solucionas?
1
st
Fall el sistema o la calibracin de la muestra?
Hacer Blancos
2
d
R i l li i d l d 2
nd
Revisar el cumplimiento del mtodo
Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?
Son correctos los parmetros en el instrumento?
3
rd
Hgase ms preguntas!
Cundo funcion correctamente el sistema por ltima vez?
Se ha cambiado alguna cosa?
4
th
Revise TODOS los parmetros! 4 Revise TODOS los parmetros!
Lo obvio no es siempre la causa
Hubo ms de un cambio?
Page 2

Componentes del Sistema HPLC Componentes del Sistema HPLC

Bomba
Inyector /Automuestreador yecto / uto uest eado
Columna
Detector Detector
Sistema de datos/Integrador
Los problemas pueden estar relacionados con todos los p p
componentes del sistema
Page 3
Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas
Column Problem Percentage of Respondents Column Problem Percentage of Respondents
Alta presin, fritas obstruidas 24%
Pobre reproducibilidad (formas de
pico, retencin)
16%
Recuperacinde muestra
14%
Recuperacin de muestra
14%
Perdida de resolucin
13%
Inestabilidad
11%
Volumenes muertos
8.1%
Fugas, conexiones
4.8%
%
Rango de pH
2.0%
Bajo numero de platos
2.0%
Saturacin de la columna
2 0%
Saturacin de la columna
2.0%
Cost
1.7%
Miscellaneous
15%
Page 4
Tipos de problemas del Sistema y la Columna
A. Presin A. Presin
B. Forma del Pico B. Forma del Pico
C. Retencin C. Retencin
Page 5
Problemas de Presin
Sintomas de la columna Posibles causas
Alta - Frita obstruida Alta Frita obstruida
- Contaminacin de la
columna columna
- Obstruccin en el
empaquetamiento empaquetamiento
Baja presin - Fuga
- Flujo incorrecto
Page 6
Correccin de la sobrepresin
Determinacin de la causa y correccin de una presin alta
Muchos problemas de presin estn relacionados con obstrucciones en el sistema Muchos problemas de presin estn relacionados con obstrucciones en el sistema.
Comprobar la presin del sistema con y sin columna.
Si la presin con columna es alta: Si la presin con columna es alta:
Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)
Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)
Lavar la columna Lavar la columna
Eliminar la contaminacin en la column y limpiar el empaquetado bloqueado
Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular
Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampn Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampn
Page 7
Obstruccin del empaquetado
Tamao de
partcula
Area
(um
2
)
Diam intersticial
medio (um)
Porosidad de
la frita(um)
5.0 2.7 0.9 2.0
3.5 1.3 0.6 2.0
3 0 1 0 0 6 2 0 3.0 1.0 0.6 2.0
2.7 0.7 0.5 2.0
1.8 0 4 0.4 0 5 1.8 0.4 0.4 0.5
1.7 0.3 0.3 0.5
C id d l f il t d Cuidado con las fases mviles tamponadas
Los tampones contienen material insoluble filtrar
La solubilidad del tampn decrece con el aumento del % La solubilidad del tampn decrece con el aumento del %
de orgnico* - evitar 100%B con tampones salinos
*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)
Page 8
Solubilidad del tampn
La Tabla I presenta una estimacin de la concentration a aba p ese ta u a est ac de a co ce t ato
soluble del tampn menos soluble (fosfato potsico a pH 7.0)
en tres solventes orgnicos
Page 9
Solubilidad de 5 tampones en mezclas con
(a) metanol (b) acetonitrilo y (c) tetrahidrofurano (a) metanol, (b) acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano
metanol metanol
acetonitrilo
THF
El trazo representa acetato amnico a pH 5.0, representa fosfato amnico
a pH 3 0 --- representa fosfato potsico a pH 3 0 representa fosfato a pH 3.0, --- representa fosfato potsico a pH 3.0, representa fosfato
amnico a pH 7.0, y representa fosfato potsico a pH 7.0.
Page 10
Cambiar la frita puede no ser buena idea
Puede que no sea posible con columnas de nueva generacin Puede que no sea posible con columnas de nueva generacin
Puede daar columnas de alto rendimiento
Compression
Column
Inlet Frit
Ferrule
Wear gloves
Do not allow bed to dry
Column Body
y
Do not touch the column -
body heat will extrude packing
Do not overtighten
Female End Fitting
Male End Fittingg
Consejo: Prevenir es mucho mejor!
Page 11
El Truco: El Truco:
Tecnicas de Prevencin- La mejor eleccin!
Usar proteccin de la columna
- Filtros en linea
- Salva columnas
Filtrar las muestras
Fcil
Filtrar fases mviles tamponadas
Extraccin de la muestra(i.e. SPE)
No tan fcil
Lavado apropiado de la columna
Page 12
Limpieza de la columna
Limpiar con solventes ms fuertes que la fase
mvil
Opciones de Solventes de Fase Reversa
en orden de fuerza creciente
Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analticas
Fase Mvil sin sales de tampn p
100% Metanol
100% Acetonitrilo
75% Acetonitrilo:25% Isopropanol
Debe
revertirse para
Esto lleva tiempo,
amenudo se realiza 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol
100% Isopropanol
100% Cloruro de Metileno*
100% Hexano*
revertirse para
Re-Equilibrar
amenudo se realiza
Offline
100% Hexano
*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con
Isopropanol antes de volver a la fase mvil de fase reversa
Page 13
Isopropanol antes de volver a la fase mvil de fase reversa.
Li i d l l f l
Use al menos 50mL o 20 30 volumenes de columna para las columnas analticas
Limpieza de la columna fase normal
Use al menos 50mL o 2030 volumenes de columna para las columnas analticas
Opciones tpicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:
Solvent Composition
Methanol:Chloroform 50:50% Methanol:Chloroform 50:50%
Ethyl Acetate 100%

Page 14
Cules son los problemas ms comunes
de la forma de pico? de la forma de pico?
1. Picos dividos
2. Colas en los picos (simetra <1 )
3 Picos anchos (mala resolucin Rs<2) 3. Picos anchos (mala resolucin. Rs<2)
Muchos problemas de formas de pico son combinaciones- i e Muchos problemas de formas de pico son combinaciones i.e.
ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retencin.
Los Sntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el Los Sntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el
cromtograma.
C d d t bl d t lti l
Page 15
Cada uno de estos problemas pueden tener mltiples causas.
Picos dobles por perturbacion en el flujo
Perturbacin en el flujo por un volumen muerto
L t fl dif t i t d La muestra fluye por diferentes vias a travs de
la columna
Pobre empaquetamiento de las partculas p q p
El pH alto disuelva la Silice
Picos dobles o partidos
Normal Picos
dobles
Consejo: Un efecto similar se produce con una frita
parcialmente obstruida
Page 16
parcialmente obstruida
Picos divididos por efectos del solvente
de inyeccin de inyeccin
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 m Fase mvil: 82% H
2
O : 18% ACN
Volumen de inyeccin: 30 L Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida
A Solvente de inyeccin B Solvente de inyeccin
1
A. Solvente de inyeccin
100% Acetonitrilo
B. Solvente de inyeccin
Fase Mvil
1
2
2
0 10
Time (min)
0 10
Time (min)
Consejo: Inyectar un solvente ms fuerte que la fase mvil puede provocar problemas
en los picos tales como picos divididos o ensanchamiento
Truco: Mantener la concentracin de orgnico en el solvente de muestra <Fase mvil
Page 17
C l h i t Colas, ensanchamiento
y perdida de eficacia
Pueden ser causadas por:
Interacciones secundarias en
la Columna la Columna
Contaminacin en la Columna
E j i i t d l l Envejecimiento de la columna
Saturacin de la columna
Efectos extra columna
Page 18
Forma del pico: Colas en los picos
Simetra >1.2
Causas
Algunos picos con cola:
Interacciones secundarias Efectos de
Retencin
Interacciones con silanoles residuales
Normal
Cola
Interacciones con silanoles residuales.
Pico pequeo eluyendo en la cola de un pico
mayor.
Todos los picos con colas:
Efectos extra-columna.
Acumulacin de contaminacin en la
Normal
Colas
entrada de la columna.
Metales pesados.
Mala columna.
Normal
Colas
Page 19
Colas en los picos- Contaminacin en la
Columna
Consejo: Test Rpido para Determinar si la Columna est Sucia o est Daada
Truco: Revetir la columna y analizarSi hay mejora, una limpieza puede
ayudar-No hay mejora-Columna Daada y necesita ser reemplazada
Test QC direccin
Test QC direccin inversa
Test QC despues lavado
100% IPA 35C
ayudar No hay mejora Columna Daada y necesita ser reemplazada
3
3
3
Platos TF
1. 7629 2.08
2 12043 1 64
Platos TF
1. 7906 1.43
Platos TF
1. 7448 1.06
2 12237 1 21
correcta
Q
100% IPA, 35 C
2
2
2
2. 12043 1.64
3. 13727 1.69
4 13355 1.32
2. 12443 1.21
3. 17999 1.19
4 17098 1.25
2. 12237 1.21
3. 15366 1.11
4 19067 1.17
4
1
4
1
4 1
0.0 2.5 5.0
Time (min)
0.0 2.5 5.0
Time (min)
0.0 2.5 5.0
Time (min)
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5m Fase Mvil: 20% H
2
O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min
Page 20
Temperatura: R.T. Deteccin: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno
Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)
2000
1500
1000
m
A
U
500
0
0 5
10 15 20 25
Ti ( i )
Normal
Fronting
Simetra < 0.9
Tiempo(min)
Causas:
Saturacin de columna
Page 21
Colas en los picos/Ensanchamiento
Efectos de carga de muestra
Columnas: 4.6 x 150 mm, 5m Fase Mvil: 40% 25 mM Na
2
HPO
4
pH 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 mL/min
T t 40C M t 1 D i i 2 N t i tili 3 D i 4 I i i 5 A it i tili 6 T i i i Temperatura: 40C Muestra: 1. Desipramina 2. Nortriptilina 3. Doxepina 4. Imipramina 5. Amitriptilina 6. Trimipramina
Ensanchamiento
A.
C
Alta Carga
Factor de Cola
Platos de una C8
A.
C.
g
x10
C D
Factor de Cola
Eclipse XDB-C8
USP TF (5%) i
A B
B
1. 850 5941
2. 815 7842
3. 2776 6231
4. 2539 8359
A B
1. 1.60 1.70
2. 2.00 1.90
3. 1.56 1.56
4. 2.13 1.70
0 5 10
Time (min)
0 5 10
Time (min)
B.
D.
Baja Carga
5. 2735 10022
6. 5189 10725
5. 2.15 1.86
6. 1.25 1.25
0 5
Time (min) 0 5
Time (min)
Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada
Page 22
Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada
Forma de Picos: Picos Anchos
Todos los picos ensanchan:
Prdida de Eficacia de la columna.
Volumen muerto.
Gran Volumen de Inyeccin Gran Volumen de Inyeccin.
Algunos picos ensanchan:
Elucin tarda de una muestra previa
(Pico fantasma) (Pico fantasma).
Alto Peso Molecular.
Muestra - Proteina o Polmero.
Page 23
Dispersin Extra-Columna
Aumentando el Volumen Extra-Columna
n Use tubos cortos de pequeo dimetro interno entre el inyector y
la columna y entre la columna y el detector.
n Asegrese de que todas las conexiones de los tubos estn
hechas con los fittings adecuados.
n Use una celda de detector de bajo volumen.
n Inyecte pequeos volumenes de muestra.
Page 24
Consejo: Malas Conexiones en el HPLC
d C E h i t d Pi pueden Causar Ensanchamiento de Picos
El Sistema se ha optimizado y : El Sistema se ha optimizado y :
Todas las longitudes de los Tubos son Mnimas
S l di t d t b Se us el diametro ms pequeo de tubo
Una celda de flujo de volumen adecuado
Los Sntomas parecen mostrar que todava hay demasiado Los Sntomas parecen mostrar que todava hay demasiado
Volumen Extra-Columna
Q t l? Qu est mal?
ha hecho las conexiones adecuadamente?
Page 25
Conectores de Columna Usados en HPLC
Troubleshooting LC Fittings Part II J W Dolan and P Upchurch LC/GC Magazine 6:788 (1988)
Swagelok
Waters
Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988)
0.090
in.
0.130
in.
g
0.090
in.
0.170
in.
Parker
Rheodyne
in.
Valco Uptight
0.090
in.
0.080
in.
Page 26
Qu Ocurre si las conexiones no son correctas?
Incorrecto demasiado largo
La Frrula no asienta adecuadamente
Incorrecto demasiado corto
Si la distancia X es muy larga, habr fuga
Cmara de mezcla
X
X
Si la distancia X es demasiado corta, se
generar un volumen muerto o cmara de
mezcla
X
Page 27
Los cambio en Retencin puedes ser Qumicos o
Fsicos
P d t d Pueden estar causados por:
Envejecimiento de la columna j
Contaminacin de la columna
Equilibracin insuficiente Equilibracin insuficiente
Pobre combinacin columna/fase mvil
Cambio en la fase mvil Cambio en la fase mvil
Cambio en el flujo.
Diferentes volumenes de retraso del gradiente Diferentes volumenes de retraso del gradiente
Page 28
Envejecimiento de la fase mvil/Equilibracin j q
Causan Cambios en la Retencin/Selectividad
Columna 1 Tras lavado con
C l 1 Di i i t
1% H
3
PO
4
/Equilibracin
Columna 1 Dia siguiente
Columna 1 - Inicial
1
1
2
1
2
1
0 3 5 9 12 15
Time (min)
0 3 5 9 12 15
Time (min)
El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase
movil/ acondicionamiento de la columna o / aco dc o a e to de a cou a
La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto
quelante de metal)
resuelto por des-activacin de la
contaminacinactiva del metal
Page 29
contaminacin activa del metal
Los compuestos sensibles a los metales
d Q l pueden Quelarse
Pista: Busca un par solitario de Electrones en
:
C
O H
O
:
C
H
:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6
miembros con un Metal
C
O
O
H
H
M
+2
O
OH + M
+2
C
H
:
:
:
Salicilaldehido Complejo Anillo de 6-miembros
OH
:
:
M
+2
C O
OH C N
N: M
+2
:
:
:
8-hidroxiquinolina
Complejo Anillo de 5-
miembros
a-benzoinoxomina
Complejo Anillo de 5-
miembros
Page 30
miembros miembros
Un lavado Acido puede mejorar la forma de
i pico
Antes del lavado
id
Despus del lavado cido
50 100 L 1% H PO
OH
OH
OH HO OH HO
OH
OH
1. 2. 1. 2.
acido
50 100 mLs 1% H
3
PO
4
M
+2
-
-
Columnas: ZORBAX SB-Phenyl
4.6 x 150 mm
1
2
Fase Mvil: 75% 25 mM tampn
fosfato amnico / 25% CAN
Flujo: 1.0 mL/min.
Temperatura: RT
1
2
2
Temperatura: RT
Tamao muestra: 5 mL
2
Tf: 1.2
Tf: 3.7 Tf: 3.7
Se us una solucin del 1% H
3
PO
4
en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse
Page 31
un 0.5 % .
pH de la Fase Mvil y pH de tampones
Porqu son tan importantes en HPLC? Porqu son tan importantes en HPLC?
El pH afecta la Ionizacin
Superficie de la Silica de la Columna
Componentes de Inters de Muestra
Tampones
Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retencin Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retencin
Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables
Efectos en el tiempo de Vida de la Columna
pHs bajos liberan las cadenas alquilicas de la Fase estacionaria p s bajos be a as cade as aqu cas de a ase es ac o a a
pHs altos Disuelven la Silica
Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retencin y la reproducibilidad lote a lote
Page 32
Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retencin y la reproducibilidad lote a lote
Porqu preocuparse del pH?
pH pKa y cidos Dbiles pH, pKa y cidos Dbiles
RCOOH RCOO
-
+ H
+
K
a
=
[[RCOO
-
][H
+
]
[RCOOH]
RCOOH RCOO + H
K
a
= 6.4 x 10
-5
a
[RCOOH]
COOH COO
_
K
a
6.4 x 10
pK
a
= 4.2
+ H
+
A pH 4.2 la muestra contiene cido benzoico e in benzoato en proporcin
de 1:1. La forma de Pico puede ser pobre
A pH 5.2 el 91% de la muestra es in benzoato. La retencion RP disminuye.
A pH 3.2 el 91% de la muestra es cido benzoico. La retencion RP aumenta.
Page 33
Efecto del pH en la Forma de Pico
a o cerca del pK de la Muestra a o cerca del pK
a
de la Muestra
Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Mvil: 40% 5 mM KH
2
PO
4
: 60% ACN
/ Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: RT
pH 4 4 pH 3 0
CH
3
CHCOOH
pH 4.4 pH 3.0
CH
2
CH(CH
3
)
2
Ibuprofeno
pK
a
= 4.4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min) Time (min)
Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto
debe evitarse
Page 34
debe evitarse.
Porqu preocuparse del pH?
pH, pKa y Bases Dbiles pH, pKa y Bases Dbiles
[R
3
N][H
+
]
R
3
NH
+
R
3
N + H
+
K
a
=
[R
3
N][H ]
[R
3
NH
+
]
K = 1 x 10
-9
3 3
+ K
a
= 1 x 10
9
pK
a
= 9
CHOCHCHN
2 2
CH
3
CH

+
H
CH
3
CH

CHOCHCHN
2 2
+ H
+
CH
3

CH
3

A pH 9 la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadas

en relacin 1:1. La forma de pico puede ser pobre
A H 10 91% d l t dif hid i d t d A pH 10 91% de la muestra es difenhidramina desprotonada.
A pH 8 91% de la muestra es difenhidramina protonada.
Page 35
pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases
5
Columna: Nucleosil-C18
Fase Mvil: 45% ACN/55% tampn fostato
Muestra: Acidos Biliares
Columna: mBondapak-C18
Fase Mvil: 60% 25 mM tampn fostato
40% Metanol
1 cido Saliclico
SCD
1.5
5
40
6
1. cido Saliclico
2. Fenobarbital
3. Fenacetin
4. Nicotina
5. Metamfetamina
5
1.0
g

k

30
o
n
UDC
SOC
4
2 +
0.5
l
o
g
4
20
R
e
t
e
n
t
i
o
+
+
+
3
1
7,12 - OC
C
12-OC
J.C. 111(1975) 149
+
+
1
0.0
2
3
10 J.C. 268(1983) 1
-0.5
3 4 5 6 7 8 pH
A B C
2
3 5 7 9
ELUENT pH
10
La Retencin y la selectividad puede cambiar dramticamente cuando se cambia el pH
Page 36
La Retencin y la selectividad puede cambiar dramticamente cuando se cambia el pH.
Importancia del pH y los Tampones
Un Ejemplo Prctico Un Ejemplo Prctico
Por qu la Muestra impone las condiciones de uso
Qu pasa cuando el tampn se usa con efectividad
Q d i l t Qu pasa cuando se ignora el tampn o se usa
inadecuadamente
Page 37
Tampones ms usados en Fase Reversa HPLC
Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)
Phosphate 2.1 1.1-3.1 200
7.2 6.2-8.2
12.3 11.3-13.3
Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210
Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210
Citrate 3.1 2.1-4.1 230
4.7 3.7-5.7
5.4 4.4-6.4
Tris 8.3 7.3-9.3 205
Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200
Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200
* Volatile buffers for LC/MS applications
La capacidad de tamponamiento ptima se d a un pH igual al pKa del tampon. La mayora de
l i id d d d d i l l H d l f los tampones tienen una capacidad adecuada de tamponamiento para controlar el pH de la fase
movil solo en 1 unidades de su pKa
Page 38
Importancia del pH y Tampones - Un Ejemplo Prctico
Condiciones Isocrticas Optimizadas para Frmacos Cardacos Condiciones Isocrticas Optimizadas para Frmacos Cardacos
1
Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Mvil: 45%25 mMNaH
2
PO
4
pH 3 0 (1 1-3 1) Fase Mvil: 45% 25 mM NaH
2
PO
4
, pH 3.0 (1.1-3.1)
55% MeOH
Flujo: 2.0 mL/min.
Temperatura:35C
Deteccin: UV 254 nm
Muestra: Frmacos Cardacos
1. Diltiazem
2. Dipyridamol
3. Nifedipina
4 Lidoflazina
5
4
3
2
4. Lidoflazina
5. Flunarizina
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time (min)
Page 39
No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el
pH pH
Columna: StableBond SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Mvil: A: 20% H
2
O Fase Mvil: A: 20% H
2
O
B: 80% MeOH
Flujo: 1.0 mL/min.
Temperatura:35C
Deteccin UV:254 nm
Fuertes
Muestra: Frmacos Cardacos
Incluso a muy alto % MeOH La mayra de
Fuertes
interacciones
secundarias
d l t
y y
componentes fuertemente retenidos muestran
pobre forma de pico debido al IEX en la
superficie
de la muestra
(aminas) con
la superficie de
la columna
0 5 10 15 20 25
Time (min)
Los Tampones son crticos para una buena retencin y forma de pico en muchas separaciones
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Los Tampones son crticos para una buena retencin y forma de pico en muchas separaciones.
Qu pasa si trabajas fuera del rango del tampn?
2
Columna: StableBond SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Mvil: A: 30% 25 mM NaH
2
PO
4
, pH 4.8 no tamponado
B: 70% MeOH
Flujo: 1 0mL/min
Se aadi
t
1
Flujo: 1.0 mL/min.
Temperatura:35C
Deteccin UV:254 nm
Muestra: Frmacos Cardacos
1 Diltiazem
tampn,
pero no
controla el
1. Diltiazem
2. Dipyridamol
3. Nifedipina
4. Lidoflazina
5. Flunarizina
Forma de Pico Inadecuada
controla el
pH a 4.8
5
3
4
0 5 10 15 20 25
Time (min)
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No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la
Fase Mvil para el Mximo Tiempo de Vida Fase Mvil para el Mximo Tiempo de Vida
pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)
Fase Mvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA
(~ pH 11, disolucin de la slica)
Inicial Inicial
Despus de 30 inyecciones
Consejo: Usar las columnas diseadas para el pH elegido
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Consejo: Usar las columnas diseadas para el pH elegido
Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector
El Sistema est operando bien- los ajustes se hicieron mal! El Sistema est operando bien- los ajustes se hicieron mal!
Bajas Velocidades de Adquisicin Pueden Dificultar la Deteccin de Impurezas y
Reducir la Sensibilidad
0.1 seg
Tiempo de Respuesta
Agilent 1100 DAD
Agilent 1100 WPS with ADVR
Columna: Poroshell 300SB-C18
2 1x 75 mm 5 um
0.2 seg
1
er
pico = 1.2 seg
A 20 pts/seg = 24 pts
2.1 x 75 mm, 5 um
Fase Mvil:
A: 95% H
2
O, 5% CAN con 0.1% TFA
B: 5% H
2
O, 5% CAN con 0.1% TFA
Flujo: 2 mL/min
0.5 seg
1 0 seg
1
er
pico = 1.2 seg
Temperatura:70C
Detector: UV 215 nm
Embolada de Piston : 20
1.0 seg
2.0 seg
p g
A 5 pts/seg = 6 pts
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Time (min)
1.0
Muestra:
1. Neurotensina 3. Lisozima
2. RNasaA 4. Mioglobina
2.0 seg
Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor deteccin de picos
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Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor deteccin de picos.
Conclusiones
Los problemas en Columnas HPLC ms comunes son:
Alta Presin (Prevenir mejor que curar) ( j q )
Malas Formas de Pico
Cambio en la Retencin/Selectividad
A menudo estos problemas no estn asociados con la columna y pueden
ser causados por el instrumento o por problemas qumicos:
pH de la Fase Mvil pH de la Fase Mvil
Conexiones del Instrumento
Parmetros del Detector
Contaminacin por Metales
Comenzar con las pregunta correctas
Encontrar las resp esta Encontrar las respuesta
Las respuestas conducirn a soluciones
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