Produccin de cido ctrico por fermentacin en estado slido usando bagazo de caa de azcar

Resumen:
Se utiliz un mtodo de fermentacin en estado slido (FES) para producir cido ctrico por
Aspergillus niger DS1 utilizando bagazo de caa de azcar como transportador y sacarosa o
melaza medio basado como agente humectante. Inicialmente bagazo y salvado de trigo fueron
comparados como transportadores. El bagazo fue el medio transportador ms adecuado, ya que
no mostr aglomeracin despus de la humidificacin con el medio, resultando en l una mejor
transferencia de calor y de masa durante la fermentacin y un mayor rendimiento del producto.
Diferentes parmetros tales como contenido de humedad, tamao de partcula, el nivel de azcar
y la concentracin de metanol en el medio fueron optimizados y adems 75% del nivel de
humedad, 31,8 g de azcar / 100 g de slido seco, 4% (v / w) metanol, y partculas del tamao
entre 1,2 y 1,6 mm se encontraron para que el medio tambin fuera ptimo. La sacarosa y la
melaza purificada y no purificada del medio tambin se aprobaron como agentes humectantes
para la FES y en condiciones optimizadas, 20.2, 19.8 y 17.9 g de cido ctrico / 100 g de slido seco
con un rendimiento de 69,6, 64,5 y 62,4% (basado en azcar consumido) se obtuvo en sacarosa,
medio melaza purificada y no purificada respectivamente, despus de 9 das de fermentacin.
1. Introduccin: El cido ctrico es un producto microbiano valioso comercialmente, es producido
principalmente por fermentacin fngica sumergido en un medio de sacarosa o melaza
utilizando Aspergillus niger [1,2]. Laxminarayan et al. [3] y Chaudhary et al. [4] han utilizado
fermentacin en estado slido (FES) con el fin de aumentar la eficiencia de la produccin de
cido ctrico y en los ltimos aos ha habido un creciente inters en el uso del proceso de FES
como una alternativa en la fermentacin [5,6]. Esto gracias a que la FES tiene un menor
requerimiento de energa, un mayor rendimiento de producto con poco riesgo de
contaminacin bacteriana, disminuyendo la cantidad aguas residuales y las preocupaciones
ambientales con respecto a la disposicin de residuos slidos [7]. La biosntesis de cido ctrico
por A. niger es altamente sensible a la concentracin de iones metlicos (Fe , Mn , Zn , etc.) en
dilucion o en fase lquida de fermentacin [1,2]. La Inhibicin de la produccin de cido ctrico
se debe a la presencia de iones metlicos, ineficaz en la FEA [8,9] y Shankaranand y Lonsane
[10] han informado de que la adicin de estos iones metlicos o minerales a la melaza y al
medio de base de salvado de trigo aumento de la produccin de cido ctrico en un 1,4-1.9
veces en la FEA. El Bagazo de caa de azcar, el salvado de trigo y la melaza son producidos
abundantemente en la India. Este residuo agrcola, el bagazo se utiliza generalmente como un
combustible. Tambin se puede utilizar como transportador de la FES [11] , el presente trabajo
fue emprendido para optimizar las condiciones del proceso, incluyendo tamao de partcula,
contenido de humedad, nivel de azcar y concentracin de metanol en el medio para la
produccin de ctrico cido utilizando residuos agrcolas (bagazo y salvado de trigo) y melaza
por FES
2. Material y mtodos

2.1. Organismo: El cido ctrico produce la cepa de A. niger, fue aislado y desarrollado en este
laboratorio como se describe a continuacin y fue utilizado en este estudio. Se mantuvo en agar
de patata y dextrosa (PDA), se almaceno a 48C y se subcultivo cada 2 semanas.

Fig. 1 Efecto del transportador en la produccin de cido ctrico por FES.

2.2. Preparacin del medio:
El bagazo se sec en un horno, fue cortado en trozos pequeos, molido y tamizado para
recoger cuatro fracciones de diferentes tamaos de partculas, de menos de 0,64 mm, entre
0,64 y 1,2 mm, 1,2-1.6 y 1,6-2 mm. El Bagazo (3 g) de tamao de partcula deseado fue
tomado en un Erlenmeyer de 250 ml y humedecido con medio (15-20% sacarosa o melaza,
0.25%, NH4NO3, 0,1%, KH2PO4, 0,025%, 0,004% y MgSO4, CuSO4, pH 4,0) para ajustar el nivel
de humedad deseado. Los medios se esterilizaron a 121C durante 60 min para proporcionar
la adecuada coccin del sustrato e incrementando la susceptibilidad al ataque microbiano.
El medio de salvado de trigo se prepar de manera similar. La melaza de caa de azcar fue
purificada con un tratamiento con ferrocianuro potsico, se diluy con agua doblemente
destilada hasta la concentracin deseada y el pH se ajust a 4,5. Los iones de metales pesados
fueron luego precipitados por la adicin de 0,1% (w/v) de ferrocianuro potsico seguido de
calentamiento a 90C durante 20 min. Los metales pesados precipitados se separaron por
filtracin, el filtrado se hizo pasar a travs de carbn activado para obtener melaza purificada.

2.3. Aislamiento del organismo productor de cido ctrico: Se colocaron pedazos de limn en
suelo, en diferentes lugares y despus de unos das se evidencio el crecimiento de hongos en
cada pedazo de limn. Las esporas de cada pieza fueron transferidas por separado en placas
de PDA y se incubaron a 30C. Despus de 2 das se evidencio el crecimiento en cada placa.
Las suspensiones de esporas se preparan a partir de cada placa por separado, se diluyeron
adecuadamente a otras placas PDA y se incubaron a 30C durante 2 das. Las esporas de
colonias aisladas individuales fueron tomadas de cada placa, transferidas aspticamente a
sesgos de PDA y se incubaron a 30C durante 2 das. Se obtuvieron 400 aislamientos y fueron
almacenados a 4 C.

2.4. Apantallamiento del aislamiento: Los discos de papel de filtro fueron esterilizados en
placas de Petri y empapados con medio a base de sacarosa esterilizada que contiene solucin
de indicador universal de la gama de pH 1-10.5. Las Placas de Petri se inocularon con esporas
de diferentes aislamientos y se incubaron a 30C durante 3 das. Las cepas productoras de
acido fueron detectadas por la formacin de una zona color (rosa) alrededor de la colonia. El
dimetro de la zona fue tomado como criterio de una buena capacidad de produccin de cido
por parte del aislamiento. De estos productores de cido, las cepas productoras de cido
ctrico fueron identificadas mediante el cultivo en bagazo humedecido con medio a base de
sacarosa en matraces de 250 ml por 8 das. El material fermentado se extrajo con agua
destilada y el cido ctrico se estim en extractos. De stos aislamientos, se encontr que A.
niger DS 1 el mejor productor de cido ctrico, por lo que selecciona para el trabajo posterior.

2.5. Inoculo: Un mililitro suspensin de esporas de la concentracin 2 x10
7
esporas / ml se
utiliz como un inculo en cada experimento.

2.6. Fermentacin en estado slido: Cada matraz, se inocul con el medio que contiene 1
ml de suspensin de esporas seguido de la mezcla y la incubacin a 30 C, dentro de una
incubadora con humedad controlada. El metanol se aade al medio antes de la inoculacin.
Un matraz se cosech cada da para la estimacin de cido ctrico producido y el azcar
consumidos, hasta que todo el azcar se consumi. El muestreo se continu hasta que todo el
azcar del medio se haba consumido.

2.7. Mtodos de anlisis: El azcar se estim por el mtodo cido sulfrico fenol de Dubois et
al. [12] y el cido ctrico por el mtodo actico anhdrido y piridina de Marier y Boulet [13].

3. Resultados y discusin :
El presente trabajo consisti en la comparacin y seleccin del transportador adecuado
(bagazo/salvado de trigo) para la produccin de cido ctrico por FES. Los efectos de diferentes
parmetros, incluyendo el contenido de humedad, tamao de partcula, nivel de azcar y la
concentracin de metanol en el medio, fueron estudiados.


3.1. Comparacin y seleccin del transportador:
Inicialmente el bagazo y el salvado de trigo fueron utilizados como transportadores para la
produccin de cido ctrico por SSF a un nivel de humedad de 65% y 29,6 g de azcar / 100 g de
slido seco. Los datos de la produccin de cido ctrico se muestran en la figura 1. La produccin
de cido y el consumo de azcar fue mayor en medio bagazo que en medio de salvado de trigo. La
concentracin mxima de cido ctrico en el bagazo y en el salvado de trigo fue de 9,4 y 6,2 g /
100 g de seca slido, respectivamente despus de 9 das de fermentacin. Tambin se observ
que el salvado de trigo se aglomero a un nivel de humedad de 65%, mientras que el bagazo exista
en forma discreta a este nivel de humedad. Las aglomeraciones afectan de manera uniforme la
mezcla del sustrato y por lo tanto afecta el crecimiento, la transferencia de calor (calor
metablico, Transferencia de masa (O2 en tomar y la evolucin de CO2) y la formacin de
producto. Como resultado un medio de salvado de trigo produce menores rendimientos que un
medio de bagazo. El bagazo no mostr aglomeracin, incluso a un nivel de humedad 85%, dando
como resultado una buena mezcla de sustrato, mejorando la transferencia de calor y masa
Efecto del tamao de las partculas en la produccin de cido ctrico

Fig. 2 Efecto del tamao de las partculas en la produccin de cido ctrico en FES. Smbolos sp1, sp2, sp3, y SP4
representan las concentraciones de azcar mientras p1, p2, p3, y p4 representan las concentraciones de cido ctrico en
cuatro tamaos de partculas diferentes.
Tabla 1. Datos calculados sobre la produccin de cido ctrico en partculas de tamaos diferentes
despus de 9 das de fermentacin
S N Tamao de
Partcula (mm)
cido ctrico
(g/100g)
Consumo de
azcar (%)
Rendimiento (%)
1 M1(<0.64) 9.2 97.6 31.8
2 M2(0,64-1.2) 10.4 98.6 35.9
3 M3(1.2-1.6) 10.9 98.0 37.3
4 M4(1.6-2) 8.6 96.0 30.3

Efecto del contenido de humedad en la produccin de cido ctrico en SSF

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Fig. 3 Efecto del contenido de humedad en la produccin de cido ctrico en SSF. Smbolos SM1, SM2, SM3 y SM4
representan las concentraciones de azcar, mientras que m1, m2, m3, y m4 representan las concentraciones de cido
ctrico a niveles de humedad de 50, 60, 70, y 80% respectivamente.
Tabla 2. Datos calculados sobre la produccin de cido ctrico a diferente nivel de humedad
despus de 9 das de fermentacin
S N Contenido de
humedad (%)
cido ctrico
(g/100g)
Consumo de
azcar (%)
Rendimiento (%)
1 55 8.8 96.6 30.9
2 65 10.7 98.0 36.9
3 75 11.2 98.6 38.4
4 85 10.5 96.6 36.0

Y superior produccin de cido ctrico. El bagazo era, por lo tanto un transportador superior al
salvado de trigo y fue seleccionado para experimentos adicionales.
3.2. Efecto del tamao de partcula: El bagazo de cuatro tamaos diferentes de partculas se
utiliz para preparar cuatro tipos de medio a saber. M1 (partculas de B < 0.64), M2 (partculas
entre 0,64 y 1,2 mm), M3 (partculas entre 1,2 y 1,6 mm) (M4 partculas entre 1,6 y 2,0 mm). La
fermentacin se realiz a un nivel de humedad de 65% y un nivel de azcar de 29,6 g / 100 g de
slido seco, para la produccin de cido ctrico. Los resultados se muestran en la figura. 2 y
algunos datos calculados se dan en la Tabla 1. La concentracin mxima de cido ctrico en medio
M1, M2, M3 y M4 fue de 9,2, 10,4, 10,9 y 8,6 g / 100 g de seca slido, despus de 9 das de
fermentacin. La produccin mxima de cido ctrico se obtuvo a partir del medio M3. La tasa de
produccin de cido ctrico tambin fue mxima en el medio M3. La produccin ms baja de cido
ctrico se obtuvo de M4.
Efecto del nivel inicial de azcar en la produccin de cido ctrico en SSF
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Fig. 4 Efecto del nivel inicial de azcar en la produccin de cido ctrico en SSF. Smbolos M1, M2, M3 y M4 estn representando cuatro
diversos medios que contiene concentraciones iniciales de azcar en 26.5, 29.6, 31.8, y 35 g / l, mientras que CM1, CM2, CM3 y CM4
estn representando la produccin de cido ctrico en estos medios M1, M2, M3 y M4, respectivamente.
Tabla 3. Datos calculados sobre la produccin de cido ctrico a diferentes niveles de azcar
despus de 9 das de fermentacin
S N Azcar Inicial
(g/100g)
cido ctrico
(g/100g)
Consumo de
azcar (%)
Rendimiento (%)
1 M1(26.5) 9.4 98.5 36.1
2 M2(29.6) 11.2 98.0 37.9
3 M3(31.8) 12.1 97.5 38.8
4 M4(35.2) 11.7 90.8 36.5
La produccin de cido ctrico en el medio M2 era muy cercano a M3 mientras que en M1
produccin de cido ctrico fue menor. Esto se debe a que el medio que contiene partculas ms
grandes (M3) presenta una alta porosidad y por lo tanto resulta mejor transmisor de calor y masa,
lo que aumenta la produccin cido ctrico. Sin embargo, las grandes partculas del medio (M4)
redujeron la disponibilidad de sustrato para el microbio, resultando inferior la produccin de cido
ctrico. En el caso de las partculas ms pequeas del medio (M1), la transferencia de calor y de
masa transferencia era pobre resultando una produccin pobre de cido ctrico. El tamao de
partcula ptimo del medio fue M3 que fue seleccionada para estudios adicionales.
3.3. Efecto del contenido de humedad: Los experimentos se llevaron a cabo a cuatro niveles de
humedad diferentes 55, 65, 75 y 85%, un nivel de azcar 29,6 g / 100 g de slidos secos y un
tamao de partculas de 1,2-1.6 mm. La Fig. 3 muestra el efecto del contenido de humedad en la
produccin de cido ctrico por SSF. Algunos datos calculados se dan en la Tabla 2. La
concentracin mxima de cido ctrico: 8.8, 10.7, 11.2 y 10,5 g / 100 g de slido seco se obtuvo a
partir del medio que contiene 55, 65, 75 y 85% de humedad, respectivamente, despus de 9 das
de fermentacin. La produccin de cido ctrico y el consumo de azcar variaron
considerablemente con la humedad contenida en el medio. La produccin mxima de cido ctrico
se obtuvo a un nivel de humedad del 75%. La produccin de cido ctrico y el consumo de azcar
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fueron ms bajos a un nivel de humedad 55%. La tasa de consumo de azcar aumento
considerablemente con el nivel de humedad, hasta un 75%. El consumo de azcar fue similar al 75
y 85% niveles de humedad. Estos resultados indican que el ms alto nivel de humedad (85%),
probablemente aumento la disponibilidad de sustrato para el hongo pero reduce la porosidad del
medio y por lo tanto tambin la transferencia de calor y masa. Por lo tanto el aumento del
consumo de azcar, puede ser debido al aumento en la disponibilidad de sustrato y la reduccin
de cido ctrico puede ser debida a la mala transferencia de calor y masa, y a la escasa
disponibilidad de oxgeno. La baja humedad (55%) tambin reduce la disponibilidad del sustrato
tambin para el hongo que resulta en menor produccin de cido ctrico y consumo de azcar. El
mximo rendimiento 38,4% de cido ctrico se obtuvo a un nivel de humedad del 75%, el cual fue
ptimo y seleccionado para ms experimentos.
Efecto del metanol en la produccin de cido ctrico en SSF.

Fig. 5 Efecto del metanol en la produccin de cido ctrico en SSF. Smbolos s1, s2, s3, s4, s5 representan concentraciones de azcar a l
0, 2, 3, 4, y 5%metanol, respectivamente, en el medio mientras que C, M1, M2, M3, M4 representan las concentraciones de cido
ctrico en presencia de 0, 2, 3, 4 y 5% de metanol en el medio.

Tabla 4 .Datos calculados sobre la produccin de cido ctrico en diferentes concentraciones de
metanol despus de 9 das de fermentacin
S N Metanol conc.
(%)
cido ctrico
(g/100g)
Consumo de
azcar (%)
Rendimiento (%)
1 Control 12.2 97.8 39.2
2 2 14.2 95.9 46.5
3 3 19.2 94.1 64.2
4 4 20.6 93.1 69.6
5 5 14.4 86.2 52.6

3.4. Optimizacin del nivel de azcar en el medio: Cuatro medios diferentes M1, M2, M3 y M4
con niveles de azcar de 26,5, 29,6, 31,8 y 35,0 g / 100 g de slido seco, respectivamente, se
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utilizaron para la produccin de cido ctrico por SSF a un nivel de humedad del 75%. Los
resultados se muestran en la Fig. 4 y algunos datos calculados sobre la produccin de cido ctrico
se dan en la Tabla 3. En el medio M4 tanto la produccion de cido ctrico como el consumo azcar
se redujeron mientras que en M1 y M2 el consumo de azcar fue similar pero la produccin de
cido ctrico aument ligeramente en M2. La concentracin maxima de cido ctrico 12,1 g / 100 g
de slido seco se obtuvo en medio M3 con un rendimiento de 38,8% y un consumo de azcar de
97,5%. Por lo tanto se selecciono este nivel de azcar.