LA INHIBICIN DEL ACACETIN TPA- INDUCE MMP-2 Y u-PA de las expresiones sobre el cncer

pulmonar humano, a travs de la inactivacin del JNK siganlins pathway y reduce las
actividades del NF-kNB y AP-1.
YAOU FONG, KUN-HUNG SHEN, TAI-AN CHIANG, AND YUAN-WEI SHIH

Resumen:

RESUMEN: El Acacetin (5,7-dihidroxi-4?-Metoxiflavona), es un compuesto flavonoide, el cual
tiene antiperoxidantes y efectos antiinflamatorios. El efecto de acacetin el 12-O-
tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)-inducedMMPs y u-PA expresiones en clulas
cancergenas de pulmn humano las A549 clulas se investig. En primer lugar, el resultado
demostr acacetin podra inhibir e Inducida por TPA de las capacidades de la adhesin,
invasin, migracin y por el ensayo de adhesin clula-matriz y la cmara de ensayo de
Boyden. Los datos tambin mostraron acacetin podra inhibir la fosforilacin de c-Jun N-
terminal quinasa 1 y 2 (JNK1 / 2) que participan en las expresiones de protenas abajo de la
regulacin y las transcripciones de la matriz metaloproteinasa-2 (MMP-2) y de tipo uroquinasa
del plasmingeno (u-PA) inducida por TPA. A continuacin, acacetin tambin inhibi
fuertemente estimulada por TPA los niveles nucleares del factor nuclear kappa B (NF-kB), c-Fos
y c-Jun. Adems, una inhibicin dependiente de la dosis en la unin habilidades de NF-kB y
activador de la protena-1 (AP-1) por tratamiento, se observ acacetin. Adems, el tratamiento
de inhibidor especfico de JNK (SP600125) a las clulas A549 podra inhibir TPA inducida por
MMP-2 y expresiones u-PA junto con una inhibicin de la invasin celular y la migracin.
Tomados en conjunto, estos resultados sugieren la antimetastsica efectos de acacetin sobre
las inducida por TPA clulas A549 puede ser mediante la reduccin de MMP-2 y las
expresiones de u-PA a travs de la inhibicin fosforilacin de JNK y la reduccin de NF-kB y AP-
1 vinculante actividades. Palabras clave: acacetin, invasin, JNK, la migracin, MMP-2, u-PA
Introduccin:
El cncer pulmonar es una de las principales causas de cncer relacionado a hombres y
mujeres (Greenlee y otros 2001) y el adenocarcinoma pulmonar cuenta con aproximadamente
entre 75% y 85% de todos los tipos de cncer pulmonar existentes (Shivapurkar y otros 2003).
El adenocarcinoma pulmonar comnmente desarrolla resistencia a la radiacin y a la
quimioterapia, y normalmente presenta sntomas demasiado tarde para la intervencin
mdica. La mayora de los pacientes presentan un avance del (37%) o metasttico (38%) de la
enfermedad en el diagnstico, y un gran porcentaje de esos diagnsticos con una etapa
temprana de la enfermedad normalmente presentan una reaparicin del metasttico. Acerca
del 2/3 de esas reapariciones son en diferentes rganos como el cerebro, el pulmn y hueso
como resultado de clulas cancergenas (Jemaly otros 2005). Un efectivo tratamiento del
qumico preventivo para la metstesis tendr un importante impacto en las tasas de
mortalidad por al cncer pulmonar.
Los flavonoides han sido extendidos en frutas, vegetales, semillas y hiervas medicinales. Todas
ellas deberan de ser un tipo de fenoles polifnoles los cuales tienen el esqueleto de un
difenilpropano (C
6
C
3
C
6
), incluyendo flavonoides monomricos , flavanol, flavones y flavonoles.
Estudios anteriores han sido estudiados con intensidad debido al rol que cumplen en la salud
humana, incluyendo la prevencin del cncer. Acacetin (5,7-dihidroxi-4-metanoxyflavonoide)
(Figura 1A), es un componente del flavonoide ha sido reportado por poseer antiperoxidasas,
anti inflamatorias y antiplasmodial (Kraft y otros 2003, Pan y otros 2006, Yin y otros 2008).
Estudios recienten tambin han demostrado acacetin y efectos de antiproliferacin del hgado,
prstata, pulmn, estmago y el cncer de mamas (Hsu y otros 2004, 2004b; Pan y otros
2005; Shim y otros 2007).
A pesar de todo, varios estudios sobre la bioactividad del acacetn han sido llevados a cabo, en
estudios respecto al preciso impacto y relacionado al mecanismo molecular en el cual el
acacetin acta en las expresiones matrices del metaloproteinasas (MMPs), u-PA y la invacin y
migracin de las clulas A549 todava son indefinidas.
El tumor de metastesis en una de las principales causas de muerte en los pacientes con cncer
(Weiss 1990). La metstasis consiste en una compleja cascada de independientes pasos, como
la intravasacin por tumores, circulacin de la linfa y los vasos sanguneos, disminuye la
distancia del lecho vascular, extravacin, proliferacin las colonias secundarias de clulas, y la
induccin de los inhibidores (Huang y otros 2004). La degradacin de la matriz extracelular
(ECM) el cual ejerce barreras bioqumicas y mecnicas al movimiento de las clulas ha sido
mpstrado como un importante proceso biolgico en la metstasis de las clulas cancergenas.
Como las clulas cancergenas se han convertido en metsticas y como clulas endoteliales se
han convertido en frmacos, ellos han desarrollado una afinidad y avidez a cambiar por los
ECM, incluyendo la membrana basal. Un exceso de la degradacin del ECM es uno de las
caractersticas de la invasin y migracin del tumor. (Huang y otros2005). La metastesis es uno
de los mltiples procesos invueltos en otras expresiones de las enzimas proteolticas, como las
MMPs y u-PA. MMP-2 y MMp-9 (tambin conocidas como tipo IV colagenasas y gelatinasas)
pueden ser degradadas en su mayora por los componentes que forman la membrana basal
ECM (Bernhard y otros 1994). En adicin, u-PA puede iniciar una activacin en la cascada de las
enzimas hbilitadas para la degradacin del ECM por clular cancergenas, permitiendo su
acceso la vasculatura del tejido, invasin y migracin a los principales rganos y el desarrollo
del tumor de metstasis (Itoh y Nagase 2002; Duffy y Duggan 2004).
As como las MMPs, las protenas cinasas activadas por mitgeno (MAPK) estn asociadas al
incremento dispersin/ movilidad, invacin, proliferacin, supervivencia, y morphogenesis
(Chan-Hui y Weaver 1998; Trusolino y Comoglio 2001). Tres de los ms importantes mamferos
MAP quinasas, incluyen seales extracelulares, reguladas por las kinasas 1 y 2 (ERK ), c-Jun N-
terminal/strees activadas por la protena kinasa (JNK/SAPK), y p38 MAPK. Los diferentes
miembros de la MAP kinasa son activados en respuesta a diferentes estmulos de las clilas
extracelulares y tiene distintos objetivos , eso sirve para diferenciar las diferentes respuesta
celulares. ERK , p38 MAPK, y JNK/SAPK juegan un rol centran en la regulacin de las
expresiones del MMPs y u-PA (Chen y otros 2005; Kwon y otros 2008; Lee y otros 2008). El
promotor del MMP-2 , MMP-9; y u-PA es altamente conservado y muestra altos contenido de
mltiples elementos funcionales, incluyendo NF-kB y AP-1 elementos (Nagase y Woessner
1999; Westermarck y Kahari 1999; Silva 2004).
Adems, estimuladores como el cytokines y 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA),
controla las expresiones del MMPs o u-PA mediante la modulacin de la activacin del factor e
transcripcin como el NF-kB y AP-1 adems ERK, p38 MAPK, JNK, y PI3K/Akt vas de
sealizacin (Ibaez-Tallon y otros 1999; Jang y otros 2007). Desde la regin promotora de
MMPs y u-PA tiene NF-kB y AP-1 en ambas partes laterales /Aguirre Ghiso y otros 1999;
Westermarck y Kahari 1999). Por lo tanto, MMPs, u-PA y sus regiones promotoras han sido
consideradas como promesas objetivas para las drogas anti-cancergenas y agentes qumicas
preventivos. Adems, las clulas A549 (un alto metastatic human adenocarcinoma clular)
fueron investigadas para la exploracin de mecanismos moleculares y vas de sealizacin para
la involucracin del TPA en la invasin y migracin del cncer in vitro.
Materiales y Mtodos
Agentes y anticuerpos
Acacetin (pureza > 97%), DMSO, TPA, Tris-HCl, EDTA, SDS, fenilmetilsufato fluoridem, (.)
(BSA), gelatina, casena, plasminogen, leupeptin,Nonidet P-40, acid deoxycholic, sodium
orthovanadate y SP600125 son purchased para Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., U.S.A); la
protena assay kit fue obtenida por el laboratorio Bio-Rad (Hercules, Calif., U.S.A). Dulbeccos
solucin buffer fosfato (PBS), tripsin-EDTA, y EDTA, and powderedDulbeccos modified Eagles
medium (DMEM) were purchased from Gibco/BRL (Gaithersburg, Md., U.S.A.). Matrigel was
from BD Biosciences (Bedford, Mass., U.S.A.). Antibody against Akt, ERK1/2, JNK/SAPK, and
p38 MAPK, proteins, and phosphorylated proteins were purchased from Cell Signaling Tech.
(Beverly, Mass., U.S.A.). PI3K, MMP-2, MMP-9, u-PA, NF-B (p65), c-Fos, c-Jun, -actin, and C23
antibodies were from BD Transduction Laboratories (San Diego, Calif., U.S.A.). The enhanced
chemiluminescence (ECL) kit was purchased from Amersham Life Science (Amersham, U.K.).



Cultura celular y tratamiento del acetn
A549, aes un adenocarcinoma aque pertenece a la lnea de las clulas del pulmn
humano fue obtenido por BCRC ( Coleccin de Bioresort y Centro de Investigacin en
HsinChu, Taiwn). Las clulas fueron cultivadas en suplemento DMEM con 10% con
suero de cabra, 2 nM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de
antibitico mezclado con streptomices y 1 nM de piruvato de sodio. Todas las clulas
cultivadas fueron mantenidas a 37C con una humedad atmosfrica de 5%, CO
2
a 95%
en el aire. Los cultivos medios fueron renovados cada 2 a 3 das. Clulas adherentes
fueron desechadas por incubacin con trypsin. Para el tratamiento del acetn. El lmite
de la solucin de acacetin fue disuelta con dimetil sulfato (DMSO) u esterilizada por
filtracin con 0.2 um de discos fuiltrantes. Una apropiada cantidad del lmite de la
solucin (1mg/mL de DMSO) de acetin donde fue adherida a dentro de un cultivo
medio para poder aaiindicar las concentraciones (Concentraciones finales del DMSO
afueron menores de .2%) y luego dfueron incubadasa con claulas que indican los
diferentes periodos.
Anlisis de la viabilidad de las clulas (ensayo MTT)
Para evaluar la citotoxicidad del acacetin y MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-
etrazolium bromide] ensayo.

Figura 1 Efectos acacetin sobre la viabilidad de las clulas A549. (A) Estructura qumica del acacetin.
(B)Clular (4 x 10
4
clulas/mL) donde se trataron con varias concentraciones (0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 30,
40, y 50 uM) de acacetin por 24-48 horas. La viabilidad de las clulas fue determinada por el ensayo de
MTT. La supervivencia del nmero de clukas fue directamente proporcional a la formacin, donde la
unidad espectrofotomtrica fue de 563 nm. Los valores representados significan SD de 3
experimentos independientes.
*
P < 0.05,
**
P < 0.01,
***
P < 0.001 comparado con el control (dosis 0).

Fue interpretado para determinar la viabilidad de las clulas (Mosmann 1983). En pocas
palabras, las clulas fueron plantadas a una densidad de 4 x 10
4
clulas/mL en 24 placas por
24 horas. Luego, las clulas fueron tratadas con acacetin a varias concentraciones 0, 1, 2.5, 5,
10, 20, 30, 40, y 50 uM) por varios periodos de tiempo (24 y 48 horas). Cada concentracin fue
repetida 3 veces. Despus de la exposicin de cada periodo, el cultivo fue removido con un
lavado de clulas con PBS. Luego, el cultivo fue cambiado e incubado con una solucin de MTT
(5mg/mL)/ por unas 4 horas. El cultivo fue removido, y el formazn fueron disueltas en
isopropano y medido por espectofotometra a 563 nm. El porcentaje de clulas viables que fue
estiamdo mediante la comparacin con una medida del control de clulas.
Ensayo de la adhesin de la matriz celular.

Clulas (2 x 10
5
cl/mL) fueron sembradas dentro de la cultura y estumuladas con 80nM TPA
por 12 horas y luego fueron incubadas en diferentes concentraciones de acacetin (0, 1, 2.5, y 5
uM) por 24 horas. Posteriormente, las clulas fueron sembradas a una densidad de 5 x 10
4

cl/mL en unas 24 placas y cubiertas con 150 uL del tipo 1 de colgeno (10ug/mL); luego
fueron cultivadas por 30 minutos. Luego las clulas que no se adhirieron fueron removidas con
PBS y adheridas a clulas que fueron arregladas con etanol. Despus fueron manchadas el
critas con 0.1% de violeta, las clulas arregladas fueron disueltas con 0.2% triton-100, y
medidas por la espectrofotometra a 550 nm.

Boyden, cmara de invasin y ensayo de migracin.

La capacidad de las clulas A549 para pasar a travs de filtros revestidos con Matrigel (BD
biosciences) se midi por el ensayo de la cmara de invasin de Boyden (Ochi y otros 1993). El
Matrigel se diluyo con 200ug/mL con agua fra destilada y aplicada a la parte superior del poro
de 8 um policarbonato. Brevemente, las clulas A549 fueron tratados con la presencia o
ausencia de las drogas (TPA y acacetin).
Despus de 48 h, las clulas fueron separadas con tripsina y se re suspendieron en suero libre
cultivo. El cultivo que contiene 10% de suero de bovino fetal fue aplicado a la cmara inferior
como quimio atrayente, y luego las clulas se sembraron en la cmara superior a una densidad
de 1 105 clulas / pocillo en 50 uL del suero. La cmara se incub durante 8 horas a 37 C. Al
final de la incubacin, las clulas de la superficie superior de la membrana fueron retiradas
cuidadosamente con un hisopo de algodn. Las clulas que invaden a travs del matrigel a la
superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol y se tieron con 5% de solucin de
Giemsa. Las clulas invasoras en la superficie inferior del filtro de membrana eran contadas
con un microscopio. Los datos se presentan como el nmero clulas de cultivo unidas a la
superficie inferior por campos de seleccin al azar. Cada experimento se llev a cabo por
triplicado. Para medir la capacidad de las clulas A549 sobre la migracin, las clulas fueron
sembradas en una cmara de Boyden con 8 m del poro filtros de policarbonato que no fueron
recubiertas con matrigel. La migracin de las clulas fue tratada con la presencia o ausencia de
las drogas (TPA y acacetin). El ensayo de migracin se midi como se describe en el ensayo de
invasin.

El anlisis de MMP-2, MMP-9, y u-PA actividades (ensayo Zimografa)

Las actividades de MMP-2 y MMP 9-se analizaron por zimografa de gelatina como se ha
descrito previamente (Chu y otros, 2004). Brevemente, las condiciones del cultivo fueron
acondicionado de clulas cultivadas en ausencia de suero durante 24 h en las cuales se
recogieron. Las muestras se mezclaron con tampn de carga y electroforesis a 8% SDS-gel de
poliacrilamida que contiene 0,1% gelatina. Se realiz la electroforesis a 140 y 110 V durante
3h. Los geles se lavaron dos veces en tampn de lavado Zimografa (2,5% Triton X-100 en H2O
doblemente destilada) a temperatura ambiente para eliminar SDS, seguido de incubacin a
37C durante 12-16 h en la reaccin del tampn de Zimografa (40mMTris-HCl [pH 8],
10mMCaCl2, 0,02% NaN3), tieron con azul de Coomassie R-250 (0,125% azul Comassie
R-250, 0,1% negro amino, metanol 50%, 10% de cido actico) durante 1 h y se desti con
una solucin de colorante (20% de metanol, 10% de cido actico, 70% de agua doblemente
destilada). No se encontraron manchas en las bandas los cuales representan los niveles de la
forma latente de MMP-2 y MMP 9-se cuantificaron por el densmetro de medida mediante un
anlisis de imagen digital sistema.

La visualizacin de la actividad de u-PA se realiz por casein plasminogen zymography. En
pocas palabras, casena 2% y 20 mg / ml de plasmingeno se aadieron a 8% SDS-PAGE gel. Las
muestras con un total protena de aproximadamente 20 g se carg entonces en los geles. La u-
PA actividad de las clulas tratadas o sin tratar con acacetin como medida se describe en la
seccin de zimografa de gelatina.

Aislamiento de ARN total, transcriptasa inversa y reaccin en cadena de la polimerasa (RT-
PCR) y la electroforesis de ADN

ARN total fue aislado desde clulas humanas de la prstata utilizado para la total extraccin
del ARN total sistema de Midiprep (Viogene BioTek Corp., Taiwan). El ARN total (2 g) fue
transcrito a 20 uL de ADNc con 1 dNTPs mu l (2,5 mM), 1LOligo dT (10 pmol / l), y 1 RTase uL
(200 U), 1 uL
El inhibidor de RNasa, y 5 x tampn de reaccin. Los cebadores apropiados (sentido de MMP-
2, 5-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3 nt 1337-1356; antisentido de MMP-2, 5?-
GGCATCCAGGTTATCGGGGA-3, nt 2026? - 2007; sentido de MMP-9, 5?-
AGGCCTCTACAGAGTCTTTG-3 nt 1201 - 1220; antisentido de MMP-9, 5-
CAGTCCAACAAGAAAGGACG-3, NT 1700-1683; sentido de u-PA, 5-TTGCGGCCATCTACAGGAG-3,
Nt 654 -672; antisentido de u-PA-5 ACTGGGGATCGTTATACATC-3, Nt 1205-1124; sentido de
GADPH, 5-CGGAGTCAACGGATTGGTGTT-3, nt 94-126; antisentido de 5-
AGCCTTCTCCATGGTTGGTGAAGAC-3, nt 399-375) se utilizaron para amplificaciones por PCR.
PCR se realiz con Platinum Taq polimerasa (Invitrogen) bajo las siguientes condiciones: 30
ciclos de 94 C durante 1 min, 59 C (MMP-2 y u-PA-) o 60 C (MMP-9 y GAPDH) durante 1
min, 72 C durante 1 min seguido por 10 min a 72 C.