INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICA

INGENIERA DE FERMENTACIONES






PRODUCCIN DE CIDO CTRICO





Asesora: Dra. Cleotilde Jurez Ramrez



Alonso Mungua Hainik
Flores Ponce Ren
Pea Partida Jos Carlos
Vzquez Cruz Beln Guadalupe

9IM1

A 17 de mayo de 2013
NDICE
Pg (s).
1. Introduccin
2. Justificacin del proyecto
3. Localizacin de la planta
4. Seleccin y diseo del bioproceso
5. Condiciones de operacin del bioproceso
6. Simulacin del proceso
7. Anlisis de costos
8. Conclusiones
9. Bibliografa

1. INTRODUCCIN

2. JUSTIFICACIN DEL PROYECTO

3. LOCALIZACIN DE LA PLANTA
Para poder decidir dnde ubicar la planta en cuestin, se hizo un anlisis de tanto
proveedores de materias primas como de posibles clientes potenciales.

3.1 Anlisis de proveedores de materia prima

3.2 Anlisis de clientes potenciales
De acuerdo al INEGI, en Mxico la distribucin de las distintas industrias alimentarias del
pas es como se muestra en la siguiente imagen:

Donde las industrias panaderas, crnicas y lcteas ocupan un 67% del mercado nacional.
De estas, uno de los centros de congregacin ms importantes del pas es en el
Estado de Mxico, en particular en zonas aledaas a la capital (Toluca de Lerdo) y en el rea
metropolitana de la Ciudad de Mxico, pudiendo destacar a Unilever, Barcel, Alpura,
entre otras.

3.3 Seleccin del espacio fsico para ubicacin de la planta
Se opt por colocar la planta en una zona industrial cercana al Aeropuerto Internacional
Miguel Alemn (a 5.8Km), Toluca Park Doa Rosa de e-Group, colindante al sur con la
Av. Paseo Tollocan Carretera Mxico Toluca Km. 54, al noreste con Industria Sur y al oeste
con Emiliano Zapata.





Caractersticas geogrficas de la zona:
Coordenadas: 18592 19279N, 993143
994658O.

Altitud: 2638 M.S.N.M. con una presin
baromtrica de 558.5mmHg.

Clima: Templado a Semi-seco de altura, con una temperatura promedio anual de
13.5C, registrando mnimos promedio anuales de 5.8C hasta mximos promedio
anuales de 33.5C. Suelen presentarse heladas durante el invierno y parte de
primavera, entre los meses de diciembre y febrero, alcanzando temperaturas mnimas
de -3C promedio.

Precipitaciones: Bajas, de aproximadamente 747.5mm anuales, con estacin lluviosa
comprendiendo los meses de junio hasta septiembre, con lluvias irregulares en el mes
de mayo.

Humedad relativa: 66% promedio anual.

Tipo de suelo: Phaeozem (23.08%), Roca gnea extrusiva volcanoclstica (22.05%)
Andosol (18.5%), Vertisol (15.89%), Aluvial (11.23%), Lacustre (5.19%), Arenoso
(3.42%).

El tamao de la nave industrial ser de aproximadamente 1000m
2
, con dimensiones de 50 x
200m.

El costo aproximado del terreno y la nave industrial es de $2950,000 M.N. a 2011 (Century
21).


4. Seleccin y diseo del bioproceso

Antiguamente, la produccin de cido ctrico se realizaba por extraccin a partir de frutos
ctricos, especialmente del limn, cuyo contenido vara entre un 7 9%; Scheele fue capaz
de aislar este cido orgnico (utilizando jugo de limn) por primera vez en 1784 por
precipitacin con una sal de calcio. Sin embargo, no fue posible de obtener cristales con un
elevado grado de pureza sino hasta el primer cuarto del siglo XX, por medio de tcnicas de
purificacin.
A pesar de esto, la produccin industrial de cido ctrico a partir de jugo de frutas tiene
un rendimiento bajo, pues se necesitan de alrededor de 30 toneladas de limones
(aproximadamente 300,000 frutos) para producir 1 tonelada de cido ctrico, lo cual limitaba a
este proceso a slo aquellos pases con una alta produccin de ctricos, como Italia o
Espaa.

Hacia finales del siglo XX, Wehmer descubri que ciertos mohos (Penicillium glaucum) eran
capaces de formar cido ctrico, lo que signific el inicio de la tecnificacin e industrializacin
de los bioprocesos para la produccin de este compuesto, al tiempo que la extraccin de
ctricos perda importancia a nivel mundial. Wehmer patent la primera tcnica de produccin
de cido ctrico por medio de un biocatalizador.
Hoy en da, cerca de un 90% de la produccin de cido ctrico se lleva a cabo por el
metabolismo de carbohidratos como substratos. Los ms utilizados son las melazas
provenientes de la produccin de azcar, las cuales son consideradas productos de desecho
y, por ende, son accesibles a costos bajos. Para la produccin de 1 tonelada de cido ctrico
se necesitan de alrededor de 3 toneladas de melazas.

En general, el proceso de generacin y purificacin de cido ctrico no ha cambiado desde
sus orgenes y sigue siendo vigente, en esencia, en la actualidad; Messing y col. identificaron
en 1976 dos etapas principales en ste: el metabolismo de las materias primas y el
acondicionamiento de la solucin impura hasta obtener cristales con un alto grado de pureza.
En la siguiente figura se muestra el esquema general de proceso planteado por
Messing y col.






Originalmente, los bioprocesos por cultivo extendido en superficie eran los ms utilizados. En
estos, esporas de algn hongo eran asperjadas sobre la superficie de la materia prima,
buscando el crecimiento de una fina capa de micelio. Sin embargo, desde su invencin en los
aos 50s, el cultivo sumergido (el cual utiliza soluciones diluidas de melazas en tanques con
agitacin) se ha convertido en el tipo de bioproceso ms utilizado principalmente en Estados
Unidos y Europa, mientras que el cultivo extendido es utilizado en pases asiticos (como
Japn).

Para la eleccin del microorganismo, se busca aqul con altas productividades de
bioconversin de materia prima a cido ctrico. En 1913, Zahorsky patent una nueva cepa
de microorganismo capaz de producir cido ctrico, que se convertira en la ms utilizada,
incluso, en la actualidad: Aspergillus niger; este hongo tiene la peculiaridad de crecer bien a
valores de pH bajos, entre 2.5 y 3.5, lo cual previene contaminaciones por otros
microorganismos.
Otros de los microorganismos utilizados para llevar a cabo la produccin de este
compuesto incluyen a los gneros Hansenula, Arthrobacter, Corynebacterium, Penicillium y
Yarrowia, sin embargo estos no han mostrado tener buenos rendimientos; especies del
gnero Candida han sido recientemente estudiadas, sin embargo estos microorganismos no
son tan utilizados como Aspergillus niger, a pesar de sus buenos rendimientos, por la
generacin de otros cidos orgnicos (oxalactico e isoctrico).

Debido a que el proceso ya es ampliamente conocido, y por cuestiones de facilidad en
instalacin y adquisicin de equipo, se opt por elegir el bioproceso en cultivo sumergido por
lotes, utilizando melazas de betabel (remolacha) como fuente de carbono y al
microorganismo Aspergillus niger como biocatalizador. Se utiliz el siguiente diagrama de
flujo de proceso para llevar a cabo la produccin del metabolito:

En este diagrama se aprecian las tres etapas del bioproceso:
Upstream: Comprende el acondicionamiento de las materias primas, as como la
esterilizacin de stas, previo a la fermentacin.

Produccin: Incluye el proceso de inculo (no mostrado en el diagrama) y
fermentacin.

Downstream: Son todas las etapas de separacin y purificacin del metabolito de
inters, posteriores al proceso de fermentacin.

5. Condiciones de operacin del bioproceso

Para la operacin del bioproceso seleccionado en el apartado anterior, ciertas condiciones de
operacin y equipo son necesarias.

1. Upstream
Consta de dos procesos simultneos: el acondicionamiento y esterilizacin de la fuente de
carbono as como de la esterilizacin de nutrientes y oligoelementos. El mezclado de estos
dos se lleva a cabo directamente en los fermentadores.

Dilucin de las melazas
Una de las ventajas de la utilizacin de melazas como fuente de carbono, y en particular
las melazas de betabel, es su alto contenido en sacarosa (entre 44 54%), ya que
Aspergillus niger posee potentes invertasas extramiceliares capaces de degradar estos
compuestos rpidamente incluso a valores de pH bajos, a diferencia de otros
microorganismos que necesitan metabolizar azcares ms sencillos de manera rpida.
Por otro lado, el rendimiento final de cido ctrico se ve incrementado cuando la
concentracin inicial de azcares se incrementa, con valores que van desde un 14 22%
del medio de cultivo. Valores por debajo de un 2.5% no permiten la produccin de este
metabolito. Por ello es necesario diluir las melazas utilizadas (con un contenido inicial de
azcares cercano al 50%) hasta un 22% mximo. Esto se realiza en un tanque agitado
adicionando agua.
Se debe procurar mantener un pH en el medio con valores cercanos a la neutralidad o
ligeramente alcalinos (7 7.5), para favorecer el crecimiento inicial del microorganismo.

Filtracin
Una filtracin, por medio de un filtro de placas, se utiliza para remover carbohidratos y
fibra no soluble (rafinosa), as como algunos compuestos caramelizados presentes en las
melazas.



Intercambio inico
En las tecnologas de produccin de cido ctrico, la ausencia de iones hierro y
manganeso en la fuente de carbono es crucial ya que, a menos que la presencia de an
trazas de estos no sea controlada, no se podrn tener buenos rendimientos en la
produccin. Previo a este paso es recomendable una clarificacin de las melazas
utilizando cido sulfrico concentrado seguido de una neutralizacin.
Iones hierro en concentraciones superiores a las 1.5ppm afectan directamente la
morfologa celular del hongo, promoviendo el crecimiento de micelio filamentoso
improductivo.
Los iones manganeso, en concentraciones mayores a 200g/L, pueden afectar la
morfologa del hongo de pellets a crecimiento miceliar filamentoso. (Berovic et al., 2006).
Sin embargo, concentraciones menores a 10
7
M de este elemento reduce la produccin
de -glicana, sntesis de lpidos y composicin de membrana, as como afectar la sntesis
de ADN y ARN del hongo.
Otros elementos cuyas concentraciones no es conveniente se encuentren superiores a
0.3ppm son el cinc y el cobre.

Se propone utilizar una columna de intercambio catinico para eliminar estos iones
cargados positivamente. En algunos casos, la remocin de iones hierro se puede ver
favorecida por la adicin de EDTA, formando complejos de hexacianoferrato, ms afines
a ser retenidos por este tipo de cromatografa.

Formulacin del medio de cultivo
Las melazas son ricas en compuestos nitrogenados y rara vez es necesario suplementar
con fuentes de nitrgeno adicionales; sin embargo, de ser necesario, sales de amonio
(principalmente sulfatos o nitratos de amonio) pueden ser adicionadas para proveer al
microorganismo de nitrgeno necesario. La ventaja de la utilizacin de estas sales es el
descenso del pH del medio conforme son consumidas, ya que valores de pH bajos
favorecen el bioproceso y la formacin de cido ctrico.
Ya se ha mencionado con anterioridad la importancia de remocin de algunos
elementos traza; cuando estos se encuentran en concentraciones elevadas, existe la
posibilidad de un aumento en niveles de fosfatos en el microorganismo lo cual resulta en
crecimiento de biomasa excesivo y disminucin en la produccin del metabolito de
inters.

Por otra parte, el pH en el medio es importante por dos motivos. Primeramente, las
esporas del biocatalizador necesitan de valores de pH superiores a 5.0 para germinar y
segundo, se necesita de una disminucin progresiva del pH en el medio, a valores
inferiores a 2.0, para favorecer la produccin del metabolito una vez se ha crecido al
microorganismo, al tiempo que se evita la contaminacin del medio por otros
microorganismos indeseados.
Si durante la etapa de produccin el pH aumenta a valores mayores a 4.5, el
rendimiento disminuye hasta en un 80%.

Esterilizacin
Se esterilizan por separado la fuente de carbono diluida y los micronutrientes, utilizando
dos esterilizadores continuos.

2. Produccin
El bioproceso por cultivo sumergido puede llevarse a cabo tanto en columnas de burbujeo
como en reactores agitados mecnicamente, ambos en proceso por lotes, pero para fines
de este trabajo, biorreactores del segundo tipo fueron elegidos, ya que al trabajar con
Aspergillus niger se busca la formacin de estructuras compactas tipo pellets con
micelio corto (con dimetros menores a 0.5mm) las cuales favorecen hasta en un 85% la
produccin de cido ctrico (Papagianni, 1999).
Para lograr estas estructuras miceliares, ciclos de rompimiento son recomendados, los
cuales son proporcionados por la agitacin del medio, y esta se ve favorecida en mayor
medida por el efecto de una accin mecnica. Esta fragmentacin y crecimiento de
micelio nuevo favorece la produccin del metabolito, ya que los nutrientes son destinados
a produccin del metabolito y micelio joven en vez de produccin de vacuolas en la
biomasa vieja inactiva.

La aireacin es otro factor importante al momento de llevar a cabo el bioproceso. No se
recomiendan flujos muy altos de aire debido a que a tasas altas de aireacin, la presin
parcial de CO
2
en el medio disminuye considerablemente, y el CO
2
acta como un
substrato importante para la piruvato carboxilasa, la cual reabastece al oxalacetato para
sintetizar la citrato sintasa.
Por otro lado, concentraciones muy bajas de oxgeno en el medio causan daos
irreversibles en la produccin de cido ctrico. Aspergillus niger tiene la capacidad de
utilizar dos rutas respiratorias distintas para la produccin de este metabolito.
Para llevar a cabo el proceso productivo fue necesario inocular al biorreactor a partir de dos
tanques semilla en escalamiento (1% transferido a 10% en volumen de operacin del
biorreactor, los cuales no son mostrados en el diagrama de flujo del proceso); una
concentracin inicial de 10
4
10
5
esporas/mL en el biorreactor es la adecuada para llevar a
cabo el bioproceso.

La fermentacin ocurre a una temperaturas entre los 28 32C con valores de pH iniciales
cercanos a 5.8. La duracin aproximada de este bioproceso es de 5 das.

3. Downstream
La separacin y purificacin del metabolito ocurre en seis etapas:

Filtro rotatorio
La primera etapa comprende una separacin de micelio as como el contenido de cido
ctrico incluido dentro de ste (alrededor de un 15%). Una vez terminada la fermentacin, un
calentamiento a 70C por 15 minutos tiene lugar. Esto coagula las protenas miceliares
facilitando la posterior separacin en un filtro rotatorio a vaco. La torta (restos de micelio)
puede ser lavada y prensada para su posterior uso como alimento forrajero.

Tanque de precipitacin
Es el mtodo estndar de recuperacin de cido ctrico, donde el citrato triclcico insoluble
en solucin es precipitado por accin de volmenes iguales de hidrxido de calcio a una
concentracin de 180 250Kg/m
3
; el proceso ocurre a 90C o a temperaturas superiores,
con valores de pH ligeramente ms bajos que 7.0. Este proceso se lleva a cabo en 120 150
minutos; una vez transcurrido este tiempo se obtiene al compuesto citrato tetrahidrato
triclcico.

Tanque de acidificacin
El compuesto obtenido en el proceso anterior es separado por medio de un filtro rotatorio.
Posteriormente pasa a un tanque en el cual se pone en contacto con cido sulfrico
concentrado (60 70%), obteniendo cido ctrico y sulfato de calcio como subproducto.
Posteriormente, el sulfato de calcio es filtrado con un filtro rotatorio obteniendo una solucin
con 20 30% de cido ctrico.
Purificacin
Impurezas y coloracin de la solucin son removidas por medio de un filtro de carbono
activado, seguido de una cromatografa de intercambio inico para remover residuos de
sales e iones en la solucin.

Cristalizador
La solucin es concentrada en un cristalizador/evaporador a 40C (para evitar reacciones de
caramelizacin). Los cristales formados son separados por centrifugacin mientras que el
licor es recirculado a las columnas de purificacin.

Secado
El secado de los cristales de citrato monohidrato se lleva a cabo en secadores rotatorios, a
temperaturas de 37C para evitar la caramelizacin de stos.


6. Simulacin del bioproceso

7. ANLISIS DE COSTOS

8. Conclusiones


8. Bibliografa

Bibliogrficas
Berovic, M. & Legisa, M.; Citric acid production; Department of Chemical, Biochemical
and Ecology Engineering, University of Ljubljana; Ljubljana, Eslovenia, 2007; Pps. 303
343.

Berovic, M., Vodopivec, M. & Milicic, S.; The influence of manganese ions on
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fermentation; Chem Biochem Eng Q, Vol. 20, Issue 3; Eslovenia, 2006; Pps. 281
284.

Messing, W. & Reiner, S.; The technical production of citric acid on the basis of
molasses; Chem. Exp. Didakt. Vol. 2, Issue 9; Georg Thieme Verlag; Stuttgart,
Alemania, 1976; Pps. 309 316.

Papagianni, M; Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: Biochemical
aspects, membrane transport and modeling; Biotechnology Advances, Vol. 25;
Thessaloniki, Grecia, 2007; Pps. 244 263.

Sikander, A., Ikram-ul-Haq, Qadeer, M. & Javed, I.; Production of citric acid by
Aspergillus niger using cane molasses in a stirred fermentor; Electronic Journal of
Biotechnology, Vol. 5, No. 3; Valparaso, Chile, 2002; Pps. 258 271.

Soccol, C., Vandenberghe, L., Rodrigues, C. & Pandey, A.; New perspectives for citric
acid production and application; Food Technol. and Biotechnol. Vol. 44, No. 2; Curitiba,
Brasil, 2006; Pps. 141 149.

Electrnicas
Servicio Meteorolgico Nacional: smn.cna.gob.mx

e-Group Desarrollo Inmobiliario: http://www.e-group.com.mx/%C2%BFquienes-somos/

Century 21, Vilchis y Asociados: http://www.century21vilchis.com/es/nave-industrial-
en-renta-en-toluca