UNIVERSIDAD NACIONAL DE JUJUY - FACULTAD DE INGENIERIA -

TRABAJO PRCTICO N: 1
ESTERILIZACIN. USO DE ESTUFA Y AUTOCLAVE.
En la prctica microbiolgica es necesario tener todo el material experimental exento de microorganismos
vivos, de forma tal que al sembrar un microorganismo (m. o.) determinado en un cierto medio de
cultivo, las manifestaciones de vida que se evidencien podamos asignarlas con seguridad a dicho m.
o. y no a una mezcla con otros, puesto que los grmenes contaminantes pululan en todos los
ambientes y en todos los ob!etos y sustancias.
"ara destruir toda clase de m. o. se esterilizan los materiales a emplear.
#os principales mtodos de esterilizacin son los siguientes$
1. FISICOS:
%& 'alor$
(irecto$ combustin, flameado
a) 'alor )eco
*ndirecto$ aire caliente (estufa)
Ebullicin
+apor fluente
b) 'alor ,-medo
+apor saturado a presin (autoclave)
.indalizacin
/& 0iltracin
'& 1ayos 2ltravioleta
(& +ibraciones 2ltrasnicas
2. QUIMICOS
%ntispticos y desinfectantes.
1- MTODOS DE ESTERILIZACIN FSICOS
A- Calor
a) Calor Seco:
Combustin/Flameado (Directo)
)e utiliza para esterilizar agu!as histolgicas, ansas, etc., las que se colocan en la zona caliente de la
llama del mechero (cono azul) hasta ro!o vivo. "ara bistur3s, pinzas y todo otro instrumental que
puede ser da4ado por la combustin directa se aplica la tcnica de flamearlos tres a cuatro veces
sobre la llama del mechero pero sin llegar a calentar como en el primer caso. .ambin los morteros
pueden ser esterilizados por este mtodo, pero quemando alcohol en su interior.
Aire Caliente (Indirecto)
)e utiliza para esterilizar instrumental, ca!as de "etri, tubos de ensayo, pipetas, o en general,
materiales de vidrio, todos los cuales son envueltos previamente con papel, protegindolos de una
posterior contaminacin. )e lleva a cabo en estufas u hornos de esterilizacin.
b) Calor Hmedo:
Ebullicin$
'onsiste en hacer que sobre el material a esterilizar act-e agua hirviente, cuya eficiencia puede
elevarse por el agregado de algunas sales, como 5a6'78, 5a578, 96'78, etc. Este mtodo ofrece
seguridad relativa, pues algunas bacterias esporuladas resisten a la accin del agua hirviente.
+apor saturado a presin (autoclave)$
Este mtodo es el ideal para la esterilizacin de soluciones acuosas, pues es rpido y seguro. 'omo
dispositivo especial requiere el uso del autoclave, aparato que permite elevar la presin hasta 8&: atm
sobre la presin atmosfrica del lugar de funcionamiento, elevando as3 la temperatura de ebullicin del
agua (vapor).
+apor fluente (autoclave)$
Es una tcnica corrientemente usada para esterilizar medios de cultivo que no pueden someterse a una
temperatura mayor de ;<< =' sin perder alguna propiedad.
'alor discontinuo o tindalizacin$
Esta tcnica se emplea cuando se desea esterilizar sustancias que se descomponen o alteran a cierta
temperatura, como en el caso de ciertos az-cares o compuestos de naturaleza proteica, e!emplos$
sueros de leche, solucin de sacarosa, etc.
'olocando el material en recipientes adecuados, se calientan al ba4o >ar3a a una temperatura que
var3an entre ?? =' y ;<< =', durante una hora. )e de!a enfriar y se mantiene a la temperatura ambiente,
durante 6: horas, repitiendo el calentamiento al cabo de ese lapso y otra vez a las :@ horas.
'alentando a una temperatura menor a la de ebullicin del agua se hace necesario aumentar el n-mero
de calentamientos. (urante el primer calentamiento se destruyen las formas vegetativas, quedando con
vida las esporas, que germinan luego a temperatura ambiente. #as formas vegetativas por ellos
producidas son las que se destruyen en los posteriores calentamientos.
B- Filtracin :
%quellas soluciones que se descomponen o inactivan al someterse a las temperaturas del autoclave
(termolbil), se esterilizan en fr3o pasndolas a travs de filtros de poros peque4os que impiden el paso de
todas las bacterias y microorganismos de mayor tama4o.
#os l3quidos as3 filtrados quedan completamente estriles y no es necesario someterlos al calor o a la
accin de sustancias bactericidas. )e pueden emplear tanto el filtro )eitz (hecho de asbesto) como el filtro
de membrana de celulosa.
2- METODOS DE ESTERILIZACIN UMICOS:
.ambin conocido como desinfeccin, este mtodo se basa en el hecho de que la clula microbiana, como
toda clula viva, necesita para permanecer como tal, condiciones adecuadas. %lterando algunos de estos
factores se produce una perturbacin y, si la alteracin se prolonga o es intensa, llega a causar la muerte de
la clula. %provechando este hecho se han proporcionado los medios para eliminar los grmenes o para
inhibir su crecimiento, provocando ya sea una alteracin de la composicin qu3mica del protoplasma o
destruyendo su estado coloidal. #a tcnica consiste en someter el material a esterilizar, a lava!es con
soluciones desinfectantes o antispticas, eliminando luego los restos de stos mediante repetidos lavados
con agua destilada estril.
#os productos que pueden utilizarse con este fin son muy diversos, variando tambin su modo de actuar
con relacin a su actividad antisptica. El bicloruro de mercurio, alcohol, sulfato de cobre cido fnico, sales
de metales pesados, etc. act-an rompiendo el equilibrio coloidal. #a actividad de estos desinfectantes es
ms eficaz cuando son usados en soluciones acuosas, pues la hidratacin previa facilita la coagulacin de
las alb-minas, as3 por e!emplo, es me!or desinfectante el alcohol de A<= que el alcohol puro.
7tros como el yodo, cloro, agua oxigenada, permanganato de potasio, por su gran actividad qu3mica act-an
oxidando algunos componentes sensibles del protoplasma.
PREPARACIN DE LOS MATERIALES PARA ESTERILIZAR
El material de vidrio a esterilizar se lava previamente muy bien, se en!uaga con agua destilada y se de!a
escurrir para secarlo (o se seca en estufa).
"*"E.%)$ )e envuelven en tiras de papel apergaminado o papel de diario de : a ? cm de ancho y de largo
unos cent3metros ms que la longitud de la pipeta. El papel se coloca !unto con la pipeta en un ngulo de
:?= aproximadamente y se va enrollando el papel sobre la pipeta, no muy apretado. Existe tambin la
posibilidad de preparar paquetes con varias pipetas. Es muy importante marcar el volumen de las pipetas
sobre el paquete, se4alando la orientacin de las mismas.
E1#E5>BCE1E)$ )e tapa con tapones de algodn y se cubren stos con capuchones de papel que se
atan con piol3n.
.2/7) (E E5)%C7$ )e les coloca tapn de algodn, se agrupan de a ? D y se les hace un capuchn de
papel, como en el caso anterior.
'E")2#%) 7 '%F%) (E "E.1*$ )e envuelven con papel y se atan o no con piol3n.
ESTERILIZACIN CON AIRE CALIENTE: ESTUFA
)e usa para esterilizar vidrio o materiales slidos estables al calor, envueltos en papel o protegidos de otra
forma contra la posterior contaminacin, para lo cual se puede emplear una estufa especial o un horno de
cocina ordinario.
D!"#$%&#%'( ) *+(#%,(-.%!(/,:
#a estufa u horno de esterilizacin consta de una doble pared por donde circula aire caliente y una puerta
frontal. #a pared exterior est revestida con amianto, los ob!etos se colocan sobre un estante enre!ado.
El aire calentado por la llama de un quemador, como en los hornos de 9och y "asteur, o mediante una
resistencia elctrica como en las estufas de esterilizacin.
,7157 "%).E21 ,7157 (E 97',
U",:
'olocar el material en la estufa y esperar que la temperatura alcance y se mantenga en 101 C (esto
demora aproximadamente entre G< min. y ;6< min.). (esde entonces, cronometrar 21 .%(+/,". Esperar
que la estufa se enfr3e, una vez desconectada, para recin retirar el material esterilizado.
"ara esterilizar con calor en seco es necesario mantener altas temperaturas por per3odos de tiempo
mayores de los que requiere el autoclave. El ciclo de esterilizacin ordinario en un horno de aire seco es de
;A< = ', por G< minutos a ;@< minutos.
ESTERILIZACIN CON VAPOR: AUTOCLAVE
D!"#$%&#%'(:
"ara esterilizar en ambiente h-medo, se emplea el autoclaveH que es un aparato seme!ante a una gran olla
de presin, en la cual se logran temperaturas superiores a la temperatura de ebullicin del agua por medio
de un aumento de presin.
'onsta de un recipiente cil3ndrico dividido por una placa perforada en dos partes, la inferior es el reservorio
del agua y la superior es la cmara de vapor donde se coloca el material a esterilizar recubierto de papel.

.iene una tapa que se fi!a mediante bulones de tuerca mariposa, logrndose el cierre hermtico mediante la
interposicin de una arandela de caucho. %dems hay en la tapa un manmetro, una vlvula de seguridad y
otra de purga (espita). El sistema de calefaccin est colocado deba!o de la caldera.
En el autoclave se logra que la temperatura del vapor sea superior a la de ebullicin en el lugar de traba!o,
al aumentar la presin luego de la eliminacin del aire por la espita, la que se cierra cuando la atmsfera es
de vapor.
'om-nmente el autoclave funciona a una presin absoluta de 6 atm la que corresponde una temperatura
de ebullicin del agua de ;6<='. El tiempo de esterilizacin depende de la temperatura de esterilizacin y
del volumen a esterilizar. %s3, para vol-menes inferiores a ;<< ml, se puede destruir toda forma de vida
aplicando ;6<=' durante ;? minutos, o ;;?=' durante 6< minutos, o ;;< =' durante 8< minutos. #os medios
slidos o viscosos (papa, etc.) deber ser calentados a 121C 3+$-(/! 21 .%(+/,". )i el autoclave est muy
cargado o los vol-menes son mayores es necesario prolongar el tiempo de calentamiento.
Es importante recordar que$
a) #a temperatura de ebullicin de un l3quido (en este caso$ agua) depende de la presin absoluta a la
que est sometido.
b) #a presin absoluta dentro del autoclave est dada por la suma de la presin atmosfrica y la
sobrepresin (o presin manomtrica) aplicada, o sea la que el operador elige para traba!ar.
c) #a presin atmosfrica de un lugar depende la su altura sobre el nivel del mar (Is.n.m.J). (e modo
que, si estamos a nivel del mar (por e!emplo, /uenos %ires) con una presin atmosfrica de ; atm,
para lograr una temperatura de ;6<=' se deber3a aplicar, una sobrepresin de ; atm,, y as3 se
llegar3a a las 6 atm de presin absoluta, en tanto para )an )alvador de Fu!uy, a aproximadamente
;6?< m s.n.m., con un presin promedio de <,@? atm, la sobrepresin a aplicar ser mayor (;,;?
atm), y ser3a a-n mayor para localidades ms altas, tales como .ilcara, ,umahuaca, #a Kuiaca.
'umplido el tiempo de esterilizacin, se cierra el gas y se espera que la agu!a del manmetro llegue a cero,
recin se abre la espita y luego se quita la tapa. 5o debe abrirse antes la vlvula de purga, pues una brusca
descompresin produce una ebullicin en los l3quidos que los proyecta fuera de los recipientes. .ampoco
debe abrirse demasiado tarde porque el vapor de agua se condensa sobre los papeles y algodones, y
adems la !unta de caucho sometida al vac3o formado se deteriora rpidamente.
M-(!4,:
- )e coloca agua en el interior de la caldera hasta casi la altura de la bande!a o re!illa.
- )e coloca los medios y ob!etos a esterilizar.
- "osicionar la tapa y a!ustar los tornillos perfectamente, valindose de un llave si fuera necesario. El
a!uste.
- )e observa que la espita est abierta.
- )e conecta la fuente de calor (gas, electricidad).
- )e de!a salir aire y vapor por la espita ? a ;< minutos aproximadamente (depende del tama4o y de la
cantidad de material a esterilizar yLo volumen), purgado que se prolonga hasta que se establece una
corriente de vapor continua (comprobar burbu!eando en vaso con agua).
- ara com!robar la eliminacin del aire" se #ace burbu$ear el esca!e de %a!or en un %aso con a&ua"
obser%ando si #a' burbu$as de aire( se com!uta el tiem!o de esterili)acin desde *ue se alcan)a la
!resin deseada.
- )e cierra la espita.
- )e observa que el manmetro llegue a la presin deseada y se regula la fuente de calor para que se
mantenga en dicha presin.
- )e de!a el tiempo necesario (seg-n la presin fi!ada).
- .ranscurrido ese tiempo, se interrumpe la fuente de calor y se de!a enfriar hasta alcanzar
aproximadamente cero de presin manomtrica. 1ecin se igualan las presiones interna y externa
abriendo la espita.
- )e aflo!an los bulones gradualmente para evitar que salten los tapones.
- )e sacan los ob!etos y se verifica en qu estado se encuentran.
CONTROL DE LA ESTERILIZACIN:
a. P-$- !5 -+/,#5-6!: se colocan ampollas o tubos bien cerrados con una sustancia finamente pulverizada,
cuyo punto de fusin sea aproximadamente igual a la temperatura que se desea alcanzar en el autoclave.
)i se alcanza la temperatura de fusin de la misma quedar formada una masa homognea dentro del
recipiente. )i la temperatura de traba!o es ;6< =' se puede usar el cido benzoico que tiene un punto de
fusin de ;6; = '.
.ambin pueden usarse pinturas indicadoras tal como la compuesta por carbonato de plomo, azufre
precipitado y carbonato de litio (;<$;$8) sobre cartn u otro material. Esta mezcla vira al gris en 8<
segundos. .oma color negro si est expuesta ms de 8< minutos a ;;< =', y a ;6< =' en ? minutos.
b. P-$- 5- !"/+*-: en este caso tambin se puede aplicar tambin el principio del punto de fusin,
colocando en el interior de la estufa una sustancia que funda a los ;A< =', pero preferentemente se
proceder como sigue$
'olocar un poco de tierra en cada uno de dos tubos, uno de los cuales ser sometido a
esterilizacin con el material que vaya a estufa.
Esterilizar 8 tubos conteniendo un caldo nutritivo (equivale al alimento para los posibles
microorganismos presentes) de peptona en agua en el autoclave.


A: TAPA

B: BULONES DE TUERCAMARIPOSA

C: MANMETRO

D: VLVULADE SEGURIDAD

E: VLVULADE PURGA(ESPITA)

G : CALEFACC IN

H: CMARADE ESTERILIZACIN
%gregar el caldo de uno de los tubos a la tierra esterilizada, y el de otro a la tierra sin esterilizar. El
tercer tubo con caldo queda como testigo.
(e!ar los tres tubos resultantes en estufa o al ambiente a una temperatura de 6<='&8< ='.
7bservar si hubo o no crecimiento de m.o. luego de un cultivo de una semana. En presencia de
desarrollo microbiano el l3quido sobrenadante de la suspensin con tierra aparecer enturbiado,
pudiendo presentarse tambin un crecimiento de m.o. en la superficie del l3quido yLo sedimento en
el fondo del tubo (este crecimiento es ms dif3cil de distinguir por la presencia de tierra).