Av. Universitaria Km. 1.5, Tingo Mara, Per -Telfono: (51) 62-561280 - Fax: (51) 62-561156 Email: cipna@msn.com UNAS CIPNA Universidad Nacional Agraria de la Selva Centro de Investigacin de Productos National Agrarian University of the Jungle Naturales de la Amazona
Determinacin de Polifenoles Totales Mtodo: Espectrofotometra
I. Materiales - Espectrofotmetro UV/VIS - Cuvetas 1 ml - Tubos de vidrios - Micropipetas (1000 l, 200 l, 100 l) - Pipetas, tips.
II. Reactivos - (+)-Catequin. - Solucin de fenol de Folin Ciocalteu - Carbonato de sodio (NaCO 3 )
III. Procedimiento 1. Preparar las siguientes soluciones stocks: 20% NaCO 3 100 mL 1 mM (+)-Catequin en metanol 10 mL 2. Agregar a cada tubo 1.58 mL de agua destilada desionizada (ddH2O) y 20 l de muestra, control y estandares. Vortear ligeramente. Para los controles agregar 20 l de agua destilada desionizada. Para los estandares preparar de la solucin stock de 1 mM (+)-Catequin las siguientes concentraciones:
[Cat] ug/mL V met V cat V F
S0 0 1000 L 0 L 1000 L S1 1 999 1 S2 3 997 3 S3 10 990 10 S4 30 970 30 S5 100 900 100
Donde: V met : Volumen en L de metanol. V cat : Volumen en L de 1 mM (+)-Catequin (estndar). V F : Volumen final.
CIPNA-UNAS Science and Nature for the Benefit of Human Kind Av. Universitaria Km. 1.5, Tingo Mara, Per -Telfono: (51) 62-561280 - Fax: (51) 62-561156 Email: cipna@msn.com Las muestras, controles y estandares deben ser corridos en triplicados para mayor precisin y reproducibilidad en los resultados. 3. Luego agregar 100 l de la solucin de fenol Folin-Ciocalteu. Mezclar nuevamente. 4. Incubar por 1 min a temperatura de ambiente. 5. Para neutralizar la reaccin agregar 300 l de 20% de NaCO 3 . 6. Incubar por 2 horas a temperatura de ambiente, tiempo en el que hay una completa reaccin. 7. Para determinar la cantidad de compuestos fenlicos producidos durante la reaccin, agregar 1 mL de muestra, control o estandar en una cuveta de poliestireno (1 cm x 1 cm x 4.5 cm) y leer la absorbancia por espectrofotmetro a 700 nm. Precaucin: Debido a que algunos reactivos son txicos, corrosivos e irritantes se recomienda el uso de guantes. Todo desperdicio lquido o slido deben ser tratados como material txico y eliminados en envaces adecuados.
VI. Clculos Determinar el contenido de fenoles totales a partir de una curva estandar generada por las absorbancias obtenidas con el estandar (+)-Catequin a 700 nm.
V. Referencias 1. Amakura Y., Umino Y., Tsuji S., and Tonogai Y. Influence of jam processing on the radical scavenging activity and phenolic content in berries. J Agric Food Chem. 48:6292-7; 2000. 2. Sanoner P., Guyot S., Marnet N., Molle D., and Drilleau JP. Polyphenol profiles of French cider apple varieties (Malus domestica sp.). J Agric Food Chem. 47:4847-53; 1999. 3. Saucier, C. and Waterhouse, A. Synergetic Activity of Catechin and Other Antioxidants. J. Agric. Food Chem. 47:4491-4494; 1999.