Universidad Complutense de Madrid

Facultad de Ciencias Qumicas

Departamento de Ingeniera Qumica
*530986438X
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
5
1
Desarrollo de Modelos Cinticos para
Bioprocesos:
Aplicacin a
la Produccin
de Xantano
MEMORIA
que para optar al
GRADO de DOCTOR
presenta:
Almudena Len Martn
Madrid, 1 999
4
A la memoria de mi padre, siempre conmigo
A mi madre
La Tesis doctoral que presenta Dfla. Alniudena Alcn Martn,
titulada: Desarrollo de Modelos Cinticos para Bioprocesos:
Aplicacin a la Produccin de Xantano, es un completo estudio de
los diferentes modelos cinticos que pueden ser aplicados a un
proceso de inters industrial, como es la produccin de xantano y, en
nuestra opinin, reune los requisitos necesarios de originalidad y
seriedad cientfica para ser defmida como Tesis Doctoral. El trabajo
ha sido realizado en los laboratorios de Ingeniera Qumica de la
Fsacultad de C.C. Qumicas, bajo nuestra direccin y ha sido
subvencionado por diversas instituciones pblicas.
Profesor Dr. Flix Garca-Ochoa Soria
Dra. Victoria E. Santos Mazorra
El presente trabajo de Investigacin ha sido realizado en el
Departamento de Ingeniera Qumica de la Facultad de Ciencias
Qumicas de la Universidad Complutense de Madrid, bajo la
Direccin del Profesor Dr. D. FELIX GARCIA-OCHOA
SORIA y de la Dra. Dita. VICTORIA E. SANTOS MAZORRA,
a los que quiero expresar mi agradecimiento por su enseanza,
confianza y apoyo durante todo el tiempo que me ha llevado la
realizacin del trabajo plasmado en esta Memoria.
AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer la ayuda directa o indirecta en el desarrollo de esta Tesis
Doctoral a una serie de personas cuya inestimable ayuda me ha hecho ms fcil y
grat~ficante mi trabajo durante estos aos:
En primer lugar, mi agradecimiento especial al Prof Felix Garca-Ochoa,
tanto por la aportacin cientWca como por su estmulo, y enorme paciencia. Deseo
agradecerle el gran esfuerzo realizado, especialmente en la ltima etapa de este
trabajo y por todo lo que he aprendido de l en estos ltimos meses.
A Vickv, por su enseanza y amistad, por los buenos y malos momentos.
Al Centro de Citometra de Flujo de la Facultad de Farmacia, especialmente a
Alberto Alvarez, quien siempre estuvo dispuesto a echarme una mano y a darme
consejo en lo que necesit.
Al Centro de Microscopia Electrnica Luis Bru, de la Universidad Complutense
de Madrid, especialmente a Agustn, por su ayuda buenos consejos para observar y
fotografiar a mis bichitos
Al Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, especialmente a la Dra.
Pilar Castilln y a la Dra. Carmen Acebal por poner a mi alcance la utilizacin del
espectrofluormetro, necesario para la realizacin de este trabajo.
Al Profesor D. Pedro Lus y Luis, por su categora cient{flea y humana, por sus
buenos consejos y nimos desde el princz~io de esta Tesis Doctoral.
A la Dra. Aurora Santos y al Dr. Jose Antonio Casas por estar siempre
dispuestos a echarme una mano yfacilitar mi trabajo.
A Jos Timn, siempre dispuesto a arreglar lo que dbamos por perdido y
supona perder o retrasar el trabajo.
A Inma, por su amabilidady ayuda prestada en todo momento
Quiero agradecer el apoyo, y siempre prcticos consejos, de mi compaero
Miguel Ladero, con quien he compartido durante los aos de realizacin de esta Tesis
trabajoy amistad
A mi compaero Emilio Gmez, por su inestimable ayuda profesional y apoyo
personal durante la realizacin de este trabajo.
A Jose Carlos y a David, con quienes he compartido estos dos ltimos aos de
tesis, gracias por su sincera amistad y la ayuda que me han brindado. Gracias por el
buen humor y las risas de cada da.
Al resto de compaeros de laboratorio Virginia, David, Alex y Pedro por su
inters y aportacin directa o indirecta en este trabajo.
A mis amigas del otro lado del Atlntico , Liliana, Vernicay Miriam, con las
que compart trabajo, consejos, y sin duda, amistad.
Quiero agradecer tambin a mis alumnos de la Academia, especialmente a
Khjad a, Besmay Monia, quienes me han dado grandes nimos para terminar.
Por supuesto no puedo olvidarme de mis amigos con quienes he compartido
momentos felices y otros no tan felices. Gracias a todos por los nimos, por las
llamadas, por las visitas y por el gran apoyo que me habis dado, especialmente en los
ltimos meses. Mi ms carioso agradecimiento a Sangee y a NPJos, y por supuesto a
Eva, Samaria, Bea, Rav, Gisella, Juan Ma, Pepe, Alberto, Raquel,...
A migran amigo Fernando de la Paz, por su sincera amistad y su apoyo.
A Rodrigo, por su amistad, fuerza y cario para la redaccin de la mayor
parte de esta Memoria.
Quiero reservar las ltimas lneas para agradecer a mi familia su cario y
grandes dosis de paciencia. A mis hermanos por su ayuda y buen humor, por estar
siempre ah cuando ha sido necesario. Tambin a Maria, Gema, Aurora yAlberto por
sus nimos constantes y gran apoyo.
A mi madre por sus mimos, paciencia y gran impulso, para continuar gracias
por todo.
Y, por supuesto, a mi padre, que fue el que ms me anim para empezar con
esta Tesis, casi con ms ilusin que yo. Gracias por tu sacrcio, por tu enseanza y
por tu cario.
INDICE
Pgina
1.- INTRODUCCIN 1
1.1.- OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO 10
1.2.- MODELOS CINETICOS 12
1.2.1.-Modelos Cinticos No Estructurados, No Segregados 12
1.2.1.1.- Modelos No Estructurados del Crecimiento 13
1.2.1.2.- Modelos de Consumo de Sustratos y Formacin de 18
Productos.
t.2.1.3.- Influencia de las Variables en los Parmetros /9
1.2.2.- Modelos Metablicos 2 4
1.2.3.- Modelos Estructurados o de Clula 3 0
1.2.3.1.- Modelos Compartimentados 3 0
1.2.3.2.- Modelos de Clula 3 5
1.2.4.- Modelos Qumicamente Estructurados 3 8
1.2.5.- Modelos Segregados 3 9
1.2.6.- In2eniera Metablica 43
1.3.- GOMA DEXANTANO 47
1.3.1.- Xanthomonas campestris 56
1 .3.2.- Produccin de Xantano 59
1.3.3.- Transporte de Oxgeno 67
1.3.4.- Aislamiento y Purificacin 74
1.3.5.- Propiedades del Xantano 78
2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 85
2.1.- EQUIPOS 85
2.2.- MATERIALES EMPLEADOS 1 0 1
2.2.1.-Microorganismo 101
2.2.2.- Reactivos Utilizados 103
2.2.3.- Composicin de los Medios Empleados /06
2.2.4.- Composicin de las Disoluciones Tampn y Preparaciones para
anlisis /07
i
Pgina
2.3.- REALIZACIN DE UN EXPERIMENTO /08
2.4.-MEDIDA DE COMPONENTES EXTRACELULARES 110
2.4.1.-Anlisis de Biomasa lO
2.4.2.- Medida de la Concentracin de Sustrato Carbonado /1/
2.4.3.- Medida de la Concentarcin de Sustrato Nitrogenado /13
2.4.4.- Anlisis de Xantano 114
2.5~ ANLISIS DE COMPONENTES INTRACELULARES lId
2.5.1.- Anlisis de Componentes Intracelulares por
Espectrofotometra de Absorcin /18
2.5.1.1.- Anlisis de Protenas /18
2.5.1.2.- Anlisis de cidos Nucleicos /21
2.5.2.- Tcnicas dc Fluorescencia /25
2.6.- MTODOS MATEMTICOS 13 5
2.6.1.- Tcnicas de Estimacin de Parmetros 13 5
2.6.2.- Simulacin con los Modelos Cinticos 13 7
3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES 141
4.- MODELO CINETICO NO ESTRUCTURADO 153
4.1.- FORMULACIN DEL MODELO 159
4.2.-AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES 161
4.3.- DISCUSIN 181
4.3.1.- Estudio de la Variacin del Valor de los Parmetros con las
Variables 181
4.3.1.1.- Influencia de la Temperatura 181
4.3.1.2.- Influencia dc la Cocentracin de Amonio Inicial 189
4.3.2.- Simulacin con el Modelo Cintico No Estructurado 191
4.3.2.1.-Influencia de la Biomasa Inicial 193
4.3.2.2.- Influencia de la Concentracin de Azcar Inicial /97
4.3.2.3.- Influencia de la Agitacin 199
4.3.3.- Validez del Modelo Cintico No Estructurado 201
Pizina
5.- MODELO CINTICO METABLICO 203
5.1.- FORMULACIN DEL MODELO 2/2
5.2.-AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES 2/6
5.3.- DISCUSIN 23 1
5.3.1.- Variacin del Valor de los Parmetros con las Variables 23 1
5.3.1.1.- Influencia de la Temperatura 23 1
5.3.1.2.- Influencia del Amonio Inicial 23 7
5.3.2.- Simulacin con el Modelo Cintico Metablico 23 9
5.3.2.1.-Influencia de la Biomasa Inicial 241
5.3.2.2.- Influencia de la Concentracin de Azcar Inical 244
5.3.2.3.- Influencia de la Agitacin y el Caudal del Aire 246
5.3.3.- Validez del Modelo Cintico Metablico 249
6.- MODELO CINTICO DE CLULA 251
6.1.- ETAPAS EN EL PLANTEAMIENTO DEL MODELO 254
6.2.-MODELO CINETICO DEL CRECIMIENTO DE Xanthomonas
campestris 261
6.2.1.- Determinacin de las Especies Qumicas y Formulacin del
Esquema de Reaccin 261
6.2.2.- Propuesta de las Ecuaciones Cinticas 281
6.2.3.- Obtencin de Parmetros por Ajuste en Mltiple Respuesta 3 06
6.2.4.- Discriminacin de Modelos Cinticos 3 50
6.2.4.1.- Criterios Estadsticos 3 50
6.2.4.2.- Discriminacin por Criterios Fsicos: Variacin de los
Parmetros con las Variables 3 53
6.2.5.- Mejora de las Deficiencias del Modelo Cintico de Clula 3 66
7.- MODELO CINTICO QUMICAMENTE ESTRUCTURADO 3 77
7.1.- PLANTEAMIENTO DEL MODELO 3 81
7.2.-APLICACIN DEL MODELO CON DATOS
EXPERIMENTALES 3 83
7.2.1.- Mejora del Modelo Qumicamente Estructurado 3 93
iii
P2ina
7.3.- SIMULACIN CON EL MODELO CINTICO QUMICAMENTE
ESTRUCTURADO
8.- RESUMEN Y CONCLUSIONES
8.1.- RESUMEN
8.2.-CONCLUSIONES
9.- NOMENCLATURA
10.- BIBLIOGRAFA
404
41/
4/1
419
43 1
43 7
iv
1.- INTRODUCCIN
Introduccin
1 .- INTRODUCCIN
Los procesos llevados a cabo con microorganismos han llegado a ser una fuente
importante de numerosos productos comerciales, principalmente en la industria
farmacutica y alimentaria, pero tambin en otras industrias, tales como la cosmtica, el
anlisis clnico y qumico, en la biorremediacin con fines ambientales, etc.
Desde que hace varias dcadas se empezaron a producir antibiticos, el cambio de
escala de los procesos desarrollados en laboratorio ha sido considerado un problema de gran
complejidad, donde la metodologa empleada en los procesos qumicos puede ser aplicada.
Los modelos fenomenolgicos, basados en fenmenos de transpone acoplados a las
reacciones qumicas, pueden ser desarrollados y aplicados para el diseo del biorreactor. La
dificultad que se plantea en el estudio de este tipo de sistemas se debe a su naturaleza: son
sistemas trifsicos gas-lquido-slido. La peculiaridad de estos sistemas radica en que en la
fase slida se realizan las transformaciones que llevan tanto al desarrollo del propio slido o
cultivo microbiano (crecimiento) como a la sntesis de los productos de inters. Dichas
transformaciones necesitan la presencia de gran cantidad de nutrientes que se encuentran
principalmente en la fase lquida, siendo de especial importancia la llegada del oxgeno,
desde el aire, en sistemas aerobios.
1
Jntroduccwn
En el cambio de escala de este tipo de procesos, la importancia relativa de los
diferentes fenmenos involucrados va cambiando. As, se deben considerar varios
fenmenos que hay que estudiar de forma aislada para, una vez que el conocimiento de los
mismos es suficiente, ser acoplados con vistas a la descripcin del proceso global. Durante
el proceso de cambio de escala lo que va variando es la velocidad relativa de los diferentes
fenmenos y, quizs, la etapa controlante de la velocidad global del proceso. Debido a la
complejidad de estos sistemas microbianos, el cambio de escala no se realiza en un solo
paso desde la escala de laboratorio a la escala de produccin. En el laboratorio generalmente
se opera con Erlenmeyers, donde se buscan nuevos productos, mecanismos de control,
medios de produccin y se mejoran las cepas. Despus se pasa a un biorreactor, de 1 a 2
litros de volumen, donde el contacto gas-lquido es muy distinto de la etapa anterior,
despus a un tamao mayor, entre 1 0 y 20 litros. A esta escala, que de forma general se
llama Planta Piloto, se estudian o se comprueban los efectos de diferentes variables, tales
como la velocidad de agitacin, el caudal de aire, la temperatura, el control del pH, etc.,
buscndose la simplificacin de los problemas. En la primera etapa, a escala de laboratorio,
tambin se aborda el estudio de los diferentes fenmenos y variables de forma aislada, para
facilitar tanto el estudio como la comprensin. Cuando todos estos fenmenos sean
suficientemente conocidos deben ser acoplados, y el conjunto debe describir el proceso
global. As, se puede proceder al diseo del biorreactor donde llevar a cabo la produccin,
para Jo que se deben conjugar todos los factores de modo que la productividad sea la
mxima alcanzable. Por tanto, es necesario realizar un cambio de escala teniendo en cuenta
que el comportamiento del microorganismo, en cada nivel de produccin, puede no ser el
mismo; las diferencias pueden ser debidas a que las cantidades de energa y materia
involucradas son distintas para producir la transformacin. La complejidad de los sistemas
que usan microorganismos lleva, en la prctica, a utilizar varias etapas de comprobacin en
el cambio de escala, y no solo una -de planta piloto- como ya es habitual en la Industria
Qumica.
Entre los fenmenos bsicos a tener en cuenta en el caso de transformaciones
microbianas son destacables la transferencia de materia entre las fases del sistema, la
descripcin de la compleja red de reacciones que tiene lugar en el interior de las clulas y
el posible dao o stress que sufren las clulas debido a las condiciones hidrodinmicas
necesarias en el sistema para que el primero de los fenmenos comentados no sea la etapa
limitante del proceso.
2
Introduccin
Transferencia de materia entre fases
El mecanismo global de transporte de nutrientes a las clulas, su utilizacin y la
produccin y eliminacin de metabolitos, se pueden dividir en una serie de etapas
(Figura 1 .1 ), cada una de las cuales ofrece una resistencia. Estas etapas se pueden
resumir de la forma siguiente (Quintero, 1 981 ; Moo-Young y Blanch, 1 987):
- Transporte de nutrientes o productos desde el seno del gas hasta la interfase gas-
lquido.
- Intercambio en la interfase gas-lquido.
- Transporte desde la interfase al seno de la fase lquida.
- Transpone a travs de la fase lquida.
- Transporte a travs de la pelcula de lquido que rodea la clula.
- Transporte a travs de la membrana o pared celular.
- Transporte en el interior de la clula, hasta el lugar donde se produce la reaccin
bioqumica.
Este sistema puede generalizarse a otros donde la fase continua no sea un lquido
sino un gas, e incluso, en casos especiales, puede ser un slido (fermentaciones en
estado slido, de compostaje, por ejemplo) y la fase dispersa una o ms de las
siguientes:
- Slidos, tales como clulas, partculas con enzimas soportadas y sustratos slidos.
- Lquidos, tales como sustancias insolubles.
- Gases, como aire, dixido de carbono y metano.
En la mayora de los biorreactores, la resistencia en la fase lquida supone el control
global de la transferencia de materia, siendo una de las siguientes la etapa
controlante del proceso (Moo-Young y Blanch, 1 987):
- La combinacin de la resistencia en la pelcula del lquido y la interfase gas-
liquido. Estas resistencias son frecuentemente la etapa controlante en la
transferencia de oxigeno, debido a la baja solubilidad de este compuesto en agua.
3
Introduccin
- Resistencia en la fase lquida en la separacin del medio acuoso continuo y la fase
dispersa. Su importancia puede ser minimizada mediante una buena mezcla.
- Resistencia de la fase lquida en la proximidad de la interfase slido-liquido. Esta
resistencia puede ser significativa debido a la poca diferencia de densidad entre el
medio acuoso continuo y la fase dispersa (microorganismos, clulas vegetales y
animales).
- Resistencia de la fase liquida en la cara de la fase slida dispersa. Esta resistencia
puede ser significativa en procesos con clulas floculadas y enzimas inmovilizadas.
Como ya se ha comentado, los sistemas microbianos son heterogneos, normalmente
gas-lquido-slido. Es por tanto imprescindible prestar atencin al transporte de los
nutrientes en el sistema, ya que su disponibilidad por parte del microorganismo es
totalmente necesaria para el conecto desarrollo del proceso de produccin. De
especial importancia es el transporte gas-lquido en los sistemas aerobios, ya que el
oxgeno es necesario para un gran nmero de reacciones.
La mxima productividad y concentracin del producto alcanzable en un proceso
microbiolgico aerobio, en la obtencin de biomasa o producto, puede estar limitada
por la velocidad de transporte de oxigeno, la cual a su vez est determinada por el
valor del coeficiente volumtrico de transferencia de materia, kLav. El valor de este
coeficiente depende de muchas variables, como el tipo de biorreactor empleado, el
sistema de aireacin y mezcla y de las propiedades fisicas del fluido (Yagi y
Yoshida, 1 975; Gmez, 1995). Dentro de las propiedades fisicas, la viscosidad es
una de las propiedades ms significativas en los procesos de produccin de
polisacridos microbianos, ya que la reologa del cultivo es uno de los factores que
determina la capacidad cte transporte de materia y calor en los biorreactores (Pace y
Righelato, 1 980: Gmez, 1 995). Un descenso de la concentracin de oxigeno por
debajo del valor critico puede provocar un descenso acusado en la produccin del
metabolito (Yang y Wang, 1 992; Santos 1 993), la produccin de otro metabolito
distinto al deseado (Moes y col,, 1 985; Galindo y Herrera, 1 989; Zhou y col., 1 992)
e incluso daos irreversibles en las clulas (Meijer, 1 989; Meijer y col., 1 994).
4
Introduccin
El mantenimiento de las condiciones hidrodinmicas necesarias para el correcto
aporte de nutrientes a los microorganismos puede resultar perjudicial para el
proceso, sometiendo a los microorganismos al denominado stress hidrodinmico o
dao celular. Este efecto lo pueden sufrir las clulas cuando se someten a unas
condiciones que favorecen el transporte de oxigeno o de nutrientes en general-,
pero que sus estructuras, tanto internas como externas, no son capaces de soportar,
afectando a su metabolismo, y por tanto a su comportamiento general. Sin embargo,
este fenmeno no ha sido todava sistemticamente estudiado ni descrito para poder
ser incorporado en la descripcin global de un sistema microbiano (Meijer. 1 989;
Merchuk, 1 991 ).
Resistencias en el Transpone de Materia
Figura 1 .1 .- Esquema de las resistencias en el transporte de oxgeno desde el gas hasta el
microorganismo, o la fase slida con enzima o clulas inmovilizadas.
Po
2
tG
lA8
Gr
o
Gf l
Interfase Gas-Lquido
Membrana
Co2
0
4
ni
ni o:
o

o:
4
4
4:
u

4
o:
4
4:
o
o
Gr
5
Introduccin
Transformacin dentro del Microorganismo
Se trata siempre de una transformacin compleja, es una red de reacciones
enzimticas de varios tipos, de xido-reduccin, oxidativas, de sntesis, de
produccin de energa, etc. El microorganismo durante su crecimiento produce
numerosas macromolculas complejas a partir de 1 00 unidades de monmeros. En
las rutas bioqumicas, para llevar a cabo estas transformaciones, intervienen
alrededor de 1 000 enzimas diferentes. El metabolismo bioqumico es dividido en dos
rutas generales: rutas anablicas, para la sntesis de molculas complejas y los
precursores de los intermedios, y rutas catablicas, que aportan la energia necesaria
para los procesos anablicos. Estas dos actividades divergentes estn estrechamente
ligadas, tal como se muestra en la Figura 1 .2, la cual es un esquema del entramado
de red de reacciones que ocurren durante una transformacin microbiana. En esta
figura se muestran solo las principales rutas de biosntesis y sus principales
conexiones con las rutas catablicas, de una forma muy simplificada.
Esta enorme complejidad se podra solventar si se considerase al microorganismo
como un catalizador, que por un complejo mecanismo produce un servicio o un
producto. Pero este planteamiento no resulta vlido, pues estas reacciones tienen un
cierto carcter autocataltico, debido al crecimiento del microorganismo, y para ello
se utiliza reactantes (nutrientes), con lo que el proceso se complica notablemente, no
siendo evidentes las relaciones estequiomtricas, o en otras palabras, el catalizador
interviene en la estequiometra de la(s) reaccin(es).
Esto implica medir un mayor nmero de componentes para describir el sistema, lo
que a su vez lleva implcito un nmero elevado de parmetros en las ecuaciones
cinticas, que hay que determinar, y que no es fcil llegar a valores por ajuste de
datos experimentales. Por tanto, el abordaje del problema es enormemente complejo,
como ya se ha indicado, ya que ocurren cientos de transformaciones en el interior de
cada microorganismo. El metabolismo incluye sustratos -frente de carbono y
nitrgeno- y otros nutrientes (fsforo, azufre, metales, etc) y, dependiendo del caso,
la produccin de energa, sntesis de protenas, cidos nucleicos, enzimas que
conllevan el crecimiento dcl microorganismo, etc,
6
Introduccin
ANABOLISMO CA TABOLISMO
ANABOLISMO
MX
NADA
DNA
ATP
RNA
A
Nudetidos
Desoxinucletidos
A cido Flico
p-aminobenwato
p-hidroxibenzoato
hexosa
41
Pentosa
Nucletidos Glicsidos
Triosa Glicerol
Tetrosa P-Gticerato
Fosfoenolpiruvate

P iruv ato
Quit,J respiratoria
Aspartato
} sI!
Porjirinas
Acetil-CeA
4
Serbia fr
01cina
$
Cisteina
Glutamina
cidos grasos, Lpidos,
P oliqutidos
Meya/enato, Esteroides,
Carotenoides, Terpenos
Oxalacetato .~. Citrato
Arginina
Pretina
Succinato < 2-Oxoglutarato
Figura 1 .2.- Esquema general de las rutas anablicas y del catabolismo central
Histidina
Tirosina
Triptofano
Triglicridos
U,iidos membrana
Purinas
Pirbnidinas
+
Porfirinas,etc.
Purinas
Treonina
so/encina
1! etionina
Lisina
Giutamato
1 f r
Glutamina
Transferencia
NH
4
t
- 7
Introduccin
Esta red de reacciones es complicada de describir, por un lado se cuenta con el
apoyo de los mtodos matemticos para la resolucin del problema de clculo de
parmetros~ no obstante, con el actual desarrollo y facilidad del clculo numrico, la
principal dificultad sigue siendo la medida de un elevado nmero de especies
qumicas, cuyo anlisis permitir conocer la evolucin de las concentraciones que
podrn ser descritas a travs de un modelo cintico de mayor o menor grado de
dificultad.
Nelsen y Villadsen (1 994) dan como definicin de modelo cintico para la
descripcin de un proceso microbiano la siguiente: .. la correlacin verbal o
matemtica entre velocidades y concentracin de reactantes/productos, los cuales
son insertados en balances de materia y permiten la prediccin del grado de
conversin de sustratos y el rendimiento de productos individuales en otras
condiciones de operacion
La complejidad de los modelos cinticos para describir el cambio producido dentro
de la clula durante una transformacin microbiana puede ser muy amplia. Se han
propuesto numerosos modelos cinticos, los cuales se pueden clasificar segn se
recoge en la Tabla 1 .1 (Garca-Ochoa y col., 1 999a).
Los modelos cinticos ms simples son los modelos cinticos no estructurados-no
segregados que consideran al microorganismo como un nico componente que, de
forma genrica, denominan biomasa (expresada como masa de microorganismo seco
por volumen de sistema, pero esto solo por la forma habitual de realizar la medida).
Los modelos denominados metablicos consideran rutas metablicas simplificadas
dentro del microorganismo en las que nicamente est involucrado el sustrato
carbonado. En un modelo estructurado o de clula se considera el metabolismo del
sustrato nitrogenado, describiendo el crecimiento mediante esquemas simplificados
de reaccin. Cuando se unen los esquemas simplificados de reaccin procedentes de
modelos metablicos y de modelos de clula se obtienen los modelos qumicamente
estructurados, en los que se describe el metabolismo microbiano global de forma
simplificada, considerando al microorganismo formado por multitud de componentes
internos que reaccionan entre s. Un modelo segregado es aquel que considera que
8
Introduccin
una poblacin est formada por microorganismos diferentes. En el caso de los
microorganismos presentes en un cultivo puro, en el que se presentan distribuciones
de alguna propiedad como edad, tamao, etc. Se pueden denominar tambin como
modelos morfolgicamente estructurados. En el caso de los cultivos mixtos, la
segregacin puede referirse nicamente a la consideracin de diferentes biomasas
empleando para la descripcin de cada una de ellas modelos no estructurados-no
segregados (Garca-Ochoa y col., 1 999b).
Los modelos ms sencillos o no estructurados no-segregados son empleados para
numerosas aplicaciones en la solucin de problemas de ingeniera, pero para una
mejor descripcin del sistema es necesario utilizar modelos que tengan en cuenta
esquemas de reaccin complejos, es decir que tengan en cuenta las rutas del
metabolismo de cada microorganismo.
Tabla 1 .1 .- Clasificacin de Modelos Cinticos.
Modelo Cintico Concepto
NO ESTRUCTURADO-
-NO SEGREGADO
La biomasa se considera como un nico componente
Se considera una clula media como representativa del
cultivo.
METABLICO
Normalmente no estructurado-no segregado.
Se describen las rutas metablicas como una red de
reacciones empleando un esquema simplWcado de
reaccin, con relaciones este nimtricas de midas.
ESTRUCTURADO
(o de CLULA)
La descripcin de la biomasa se realiza considerndola
formada por varias especies. Se tienen en cuenta los
componentes intracelulares.
QUMICAMENTE
ESTRUCTURADO
Se considera a la biomasaformada por varias especiesy
tambin un metabolismo simplWcado (una red de
reacciones).
SEGREGADO
En la descripcin del microorganismo se considera la
distribucin de alguna propiedad No se considera un
microor anismo medio.
9
Introduccin
1.1.-OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO
El presente trabajo de investigacin trata de conseguir la aplicacin de diferentes
modelos cinticos de diferente grado de complejidad a un proceso microbiano,
comprobando la mejora en la descripcin del sistema. Es decir, pretende realizar una
aplicacin de la metodologa de la Ingenieria Qumica en un sistema de produccin
llevado a cabo por un microorganismo, el cual sintetiza un producto de inters industrial.
El sistema a modelizar es la produccin de xantano, un sistema bien conocido.
Este proceso ya ha sido estudiado y desarrollado en un trabajo previo (Santos, 1 993) y se
tiene el conocimiento suficiente de las variables que influyen en el proceso de produccin,
concretamente la temperatura, la composicin del medio y la velocidad de transporte de
oxigenojuegan un papel relevante en el proceso de produccin.
Los modelos cinticos que se plantearn tratan de conseguir la descripcin de la
influencia de ciertas variables en dicho proceso de produccin, considerando
posteriormente todos los diferentes fenmenos involucrados, de forma que el conjunto
sirva como modelo predictivo de la evolucin del sistema y su respuesta a perturbaciones en
el medio, variables de operacin, etc.
Los modelos que se van a proponer a lo largo de esta Tesis Doctoral son de diferente
grado de complejidad. El primer paso es comenzar por un modelo sencillo, de los conocidos
como no estructurados, pues desde un punto de vista tcnico tiene sentido iniciar un
estudio de este tipo con los modelos cinticos ms sencillos. Adems, el abordaje, tanto
experimental como matemtico, es relativamente asequible, lo que hace que el primer
planteamiento al comenzar a modelizar un sistema sea con modelos de este tipo. Se
determinar si este modelo es suficiente para la descripcin del sistema, para lo cual se
estudiar la influencia de dos variables sobre la evolucin de los parmetros del modelo
(temperatura y concentracin de nitrgeno inicial). En caso de que no exista una relacin de
parmetros con las variables a estudiar, se modificar el modelo planteado de modo que
sea capaz de tener en cuenta la evolucin de los parmetros con la variable, y as poder
obtener una relacin en funcin de la variable estudiada. En caso de no ser suficiente este
modelo se ir complicando hasta [legar a modelos estructurados, que, si bien ms
complejos, se acercan ms a la realidad, es decir tienen ms sentido fisiolgico.
10
Introduccin
La progresiva complicacin en el planteamiento de modelos para la descripcin del
sistema microbiano debe llevar consigo una mejora en la consideracin de algn aspecto en
la propia descripcin del sistema, es decir, debe de ser capaz de subsanar deficiencias
encontradas en los modelos ms simples desarrollados y aplicados a los datos
experimentales en las primeras etapas dcl presente trabajo.
En definitiva, el objetivo final de esta Tesis Doctoral es llegar a aplicar un modelo
cintico de los denominados qumicamente estructurados, pues probablemente sean los
nicos capaces de tener en cuenta los cambios en la composicin del medio, especialmente
en lo referente al sustrato nitrogenado, tan ligado al crecimiento del microorganismo. Para
llevar a cabo la aplicacin de este tipo de modelos ser preciso un conocimiento profundo,
tanto bioqumico y microbiolgico, de la bacteria Xanthomonas campestris. Adems, se
hace necesario realizar un estudio exhaustivo y puesta a punto de mtodos rpidos y fiables
para el anlisis de compuestos intracelulares de forma cuantitativa. Para ello, se van a
comparar diferentes tipos de tcnicas de anlisis de estos componentes, desde las tcnicas
bioqumicas convencionales, pasando por tcnicas espectrofluorimtricas. hasta llegar a una
tcnica cada vez ms utilizada en microbiologa como es la citometria de flujo.
Finalmente ser necesario desarrollar una metodologa para hacer frente a la dificil
tarea de proponer y aplicar modelos cinticos estructurados. Hay que tener en cuenta que
apenas hay antecedentes en la literatura en cuanto a la propuesta de este tipo de modelos, y
no se encuentra ajuste de datos experimentales, y el consiguiente clculo del valor de los
parmetros, ni, desde luego, la relacin de los valores de los parmetros en diferentes
experimentos realizados en condiciones diversas.
11
introduccion
1.2.- MODELOS CINTICOS
A continuacin se realiza una breve revisin sobre los diferentes tipos de modelos
cinticos planteados en la literatura de acuerdo a la clasificacin comentada en la Tabla 1 .1 .
1.2.1.- Modelos Cinticos No Estructurados- No Segregados
Los modelos ms sencillos del crecimiento -modelos no estructurados- estn
expresados en trminos de unidades abstractas de vida, generalmente se emplea el trmino
poblacin microbiana o biomasa, ignorando completamente la estructura interna de las
clulas que componen dicha biomasa, ya que consideran a la poblacin como una unidad
homogneamente distribuida. Aunque los modelos no estructurados son una gran
simplificacin del problema real, suelen ser tiles para ser empleados con fines
tecnolgicos, ya que proporcionan ecuaciones sencillas con sentido fisico, en las que se trata
al microorganismo como una especie reactante sencilla. El esquema ms complicado al que
podra responder este tipo de modelos es el que se representa en la Figura 1 .3, donde
aparece el consumo de sustratos por las clulas, tanto para crecer como para producir, as
como los conceptos de respiracin endgena y energa de mantenimiento, que sern
comentados ms adelante.
Los modelos no estructurados recogidos en la literatura incorporan parte del
esquema representado en la Figura 1 .3. Para poder realizar una revisin de este tipo de
modelos se han dividido en dos grupos: modelos de crecimiento y modelos de consumo de
sustratos y formacin de productos.
12
Introduccin
Energia de Mantenimiento
Lisis celular
CELULAS NO
VIABLES
PRODUCTOS
Figura 1 .3.- Esquema de reaccin simplificado de los Modelos No Estructurados
1.2.1.1.- Modelos No Estructurados de Crecimiento
Dentro de este tipo se encuentran modelos que relacionan el crecimiento del
microorganismo nicamente con la propia concentracin de biomasa y otros que hacen
depender el crecimiento de la concentracin de un sustrato, que suelen denominar sustrato
limitante.
En el primer grupo de esta clasificacin se encuentra la Ley de Malthus, que est
planteada para describir el crecimiento balanceado, es decir, las actividades de sntesis
celular estn coordinadas de manera que la composicin celular media no se ve afectada por
la proliferacin de la poblacin. Por ello, es capaz de representar la fase exponencial de
crecimiento en fermentaciones en discontinuo o batch y las fermentaciones en continuo,
ya que al mantenerse el valor de las variables en estado estacionario, se obtiene un valor
constante de la velocidad de crecimiento (ji), lo que se aproxima mucho a lo que se
considera un crecimiento balanceado.
Respiracin Endgena
/3
Introduccwn
La Ley de Maithus se emplea de forma amplia en estudios microbiolgicos sobre el
crecimiento, debido a la gran simplicidad del modelo, pues solo es necesario conocer la
evolucin experimentaJ de la biomasa con el tiempo. La citada expresin de Malthus viene
dada por la siguiente ecuacin:
dC~ [1 .1 ]
dt
Este modelo es incapaz de predecir la concentracin de biomasa en la fase
estacionaria, ya que su tendencia es al crecimiento infinito. Esto es debido a que, en
realidad, la velocidad especfica de crecimiento no es constante durante todo el proceso del
crecimiento en discontinuo y, por tanto, no es capaz de predecir todas las fases del ciclo de
crecimiento. En consecuencia, cuando se plantea la representacin de un sistema microbiano
en discontinuo, teniendo en cuenta no solo su crecimiento, sino tambin el consumo de
sustratos y la formacin de productos, la ecuacin [1 .1 ] no se puede emplear dentro del
conjunto de ecuaciones necesarias, ya que llevara al absurdo del crecimiento infinito. Sin
embargo, puede proporcionar resultados aceptables en sistemas en continuo, aunque nunca
con sentido fisico.
La segunda expresin empleada para representar el crecimiento, y que es nicamente
dependiente de la concentracin de biomasa, es la conocida como ecuacin logstica, que
resulta de la integracin de la siguiente ecuacion:
____ cx dC~ = C~. 1 [1 .2]
di C~.
La ecuacin [1 .2] presenta, para una concentracin inicial de biomasa determinada,
dos parmetros: ji y C~,,. La ecuacin logstica es capaz de proporcionar una curva con las
tres fases de crecimiento del microorganismo: latencia, exponencial y estacionaria. Esta
ecuacin fue propuesta de forma emprica, como modelo para el estudio del crecimiento de
microorganismos, debido a que la forma de la funcin matemtica era similar a la observada
para el crecimiento de microorganismos en discontinuo, posteriormente fue deducida de
forma mecanstica (Santos, 1 993).
14
Introduccin
Las expresiones que hacen depender el crecimiento de microorganismos, tanto de la
concentracin de biomasa como del sustrato limitante, hacen que esta dependencia de la
concentracin del citado sustrato est incluida dentro de la velocidad especfica de
crecimiento (ji), siendo la ecuacin general:
dC~ _
dt y(C
5).Q~ [1 .3]
La primera expresin de este tipo fue la propuesta por Blackman (1 905):
4Cs)11m.iCs>It,nB
[1.4]
Cs
B
donde B es una constante. Este modelo plantea que hasta que la concentracin de sustrato
no haya llegado a cierto valor no influye en el crecimiento y se puede aplicar la ley de
M a l t h u s .
Posteriormente, MKendrick y Pai (1 91 0) eliminaron la primera parte de la
expresin de Blackman (1 905), planteando para todo el intervalo de concentracin de
sustrato la siguiente expresin:
di
proponiendo, por primera vez, una relacin estequiomtrica entre la velocidad de consumo
del sustrato y la de produccin de biomasa:
d ? 5 _ 1 dC~ [1 .6]
dt Y~ ch
A partir de estas expresiones (ecuaciones [1.5] y [1 .6J), se deduce la ecuacin
logstica:
Cx0 expQu.t) [1. 7]
c
~i~A~- exp[u .41
15
futrod; tccwjj
siendo:
= ~t,,, c~ = . (ci. -4-C
8j [1.8]
Y tI
AS \YS 1
C~ =C~ Y~ C8 [1.9]
Otra ecuacin que relaciona la velocidad especfica de crecimiento con la
concentracin de un sustrato limitante es la propuesta por Tiesser (1 942):
dC1 Lex~KE )j.c [1 .1 0]
Posteriormente, NIonod (1 949 y 1 950) propuso otra expresin del tipo de [a
ecuacin [1 .3], de forma emprica, y similar a la ecuacin ya propuesta por Michaelis-
Menten para las reacciones enzimticas. El planteamiento se basaba en que, en realidad, las
reacciones que tienen lugar en el interior del microorganismo son enzimticas:
dC~ [1 .1 1 ]
di
El modelo propuesto por Monod est formado por las ecuaciones [1 .7] y [1 .1 1 ]. Este
modelo se simplifica en las siguientes condiciones particulares:
dC~ _
K5 C5 ~. ____ p 45 [1. 12]
di
K ~ d~i% Mm c .cj [1 .1 3]
La simplificacin que lleva a la ecuacin [1 .1 2] corresponde a la Ley de Malthus,
mientras que cuando K5 es mucho mayor que la concentracin de sustrato, la ecuacin
[1 .1 3] se simplifica a la expresin propuesta por MKendrick y Pai (1 91 0). Estas mismas
condiciones particulares se corresponden con el modelo propuesto por Blackman (1 905)
(ecuacin [1 .4]).
16
Introduccin
A partir de los diferentes modelos comentados hasta el momento, se observa que la
expresin fundamental de la cintica microbiana es el modelo propuesto por Monod (1 949 y
1 950) (ecuaciones [1 .7] y [1 .1 1 ]), ya que excepto la propuesta por Tiesser (1 942) -que no
parece tener explicacin mecanstica- el resto de las expresiones comentadas pueden
entenderse como simplificaciones del citado modelo, segn la concentracin de riutriente
limitante presente en el medio; ya que la concentracin del citado nutriente varia durante la
fermentacin, el modelo propuesto por Monod se puede simplificar a unas u otras
expresiones durante el transcurso de la misma. Este hecho es corroborado de forma patente
en el trabajo de Esener y col. (1 982) sobre modelos no estructurados, en el que se ajustan los
mismos datos experimentales con diferentes modelos, no siendo capaces de discriminar
entre ellos.
Un concepto importante, que fue tenido en cuenta posteriormente en los modelos
cinticos no estructurados, es la respiracin endgena, introducido por Herbert (1 958),
que plantea que parte de la propia masa celular se emplea en mantener las clulas en estado
viable, dndose este proceso a velocidad constante, independientemente del valor de la
velocidad especfica del crecimiento:
dC~ =(p(q),ue). ? x [1 .1 4]
dr
Esto conleva un descenso en la cantidad de biomasa, una vez agotado el nutriente o
sustrato que aporta energa.
Tambin se han propuesto expresiones para el crecimiento bajo la suposicin de que
el microorganismo se ve inhibido por la presencia de alguna sustancia -que puede ser
sustrato o producto- en cierta cantidad. Las expresiones ms comunes son:
Inhibicin por sustrato, fue propuesto por Wayman y Tseng (1 976); estos autores
consideran que existe una concentracin crtica de sustrato, por debajo de la cual no
s e p r o d u c e i n h i b i c i n d e l c r e c i m i e n t o .
Inhibicin por producto, propuesto por Hinshelwood (1946) plantea que la
inhibicin del crecimiento, por parte del producto, depende de la concentracin del
m i s m o .
7
introduccin
1 .2.1 .2.- Modelos dc Consumo de Sustratos y Formacin de Productos
La primera relacin propuesta para el consumo de sustratos es la comentada
a n t e r i o r m e n t e , q u e r e l a c i o n a l a v e l o c i d a d d e c r e c i m i e n t o d e l a p o b l a c i n c o n l a d e c o n s u m o
d e l s u s t r a t o m e d i a n t e u n r e n d i m i e n t o m a c r o s c p i c o (Y
5j, r e p r e s e n t a d o e n l a e c u a c i n
[1. 4].
P o s t e r i o r m e n t e , P i r t (1965) obsev que el citado rendimiento macroscpico no
p r e s e n t a b a v a l o r e s c o n s t a n t e s a l o l a r g o d e l a t r a n s f o r m a c i n , p o r l o q u e c o n s i d e r q u e e l
s u s t r a t o s e e m p l e a p a r a f u n c i o n e s a s o c i a d a s y n o a s o c i a d a s a l c r e c i m i e n t o , p r o p o n i e n d o l a
siguiente relacin:
1 1 .4-21- [1. 15]
r~ ir
Introdujo as el coeficiente de mantenimiento (ms), el cual trata de explicar el
consumo de sustrato para el mantenimiento de la biomasa en estado viable. Esto es
normalmente aplicable slo al sustrato empleado como frente energtica (generalmente
azcares). Sustituyendo la expresin [1 .1 5] en la [1 .7), se obtiene la siguiente ecuacion:
d ? 8 _ ( 1 d ? 7 _ m8 dC~j [1. 16]
di Y~ dt y di)
Esta expresin proporciona el consumo de sustrato, cuando se emplea tanto para el
crecimiento como para el mantenimiento celular del microorganismo.
Cuando el sustrato energtico se emplea tambin para la produccin, se define un
n u e v o r e n d i m i e n t o m a c r o s c p i c o de sustrato en producto (Ypsmt, incorporndose el
trmino de consumo del sustrato para la p r o d u c c i n en la ecuacin [1 .1 6), de la s i g u i e n t e
forma:
d ? 5 (__1 dC7 dc,. m5 [1. 17]
di di J$7 di y 4
18
Introduccin
En cualquier caso, se hace necesario disponer de una expresin de la evolucin del
p r o d u c t o c o n e l t i e m p o q u e s e p u d i e r a s u s t i t u i r en la ecuacin anterior. El planteamiento de
l a s e c u a c i o n e s d e l a v e l o c i d a d d e f o r m a c i n d e p r o d u c t o s d e p e n d e d e l t i p o d e p r o d u c t o d e
q u e s e t r a t e . A s , s e g n R l e i s y Ko s s e n (19 78 ) , b a s n d o s e e n l a t e r m i n o l o g a p r o p u e s t a p o r
Ga d e n (19 59 ) , c l a s i f i c a l o s p r o d u c t o s e n l a s s i g u i e n t e s c a t e g o r a s :
P r o d u c t o s n o a s o c i a d o s a l c r e c i m i e n t o
P r o d u c t o s a s o c i a d o s a l c r e c i m i e n t o
P r o d u c t o s p a r c i a l m e n t e a s o c i a d o s a l c r e c i m i e n t o
La v e l o c i d a d d e p r o d u c c i n d e l p r o d u c t o e n c u e s t i n p u e d e e x p r e s a r s e d e a c u e r d o a
l a e c u a c i n d e n o m i n a d a d e Lu e d e ki n g -P i r e t (19 59 ) :
___ d ? ~
di di
E l p r i m e r t r m i n o d e e s t a e x p r e s i n r e p r e s e n t a l a p r o d u c c i n n o a s o c i a d a a l
c r e c i m i e n t o y e l s e g u n d o l a p r o d u c c i n a s o c i a d a a l c r e c i m i e n t o , p o r l o q u e p a r a l o s
p r i m e r o s t i p o s d e p r o d u c t o s , s e d e b e e m p l e a r n i c a m e n t e u n o d e l o s t r m i n o s d e e s t a
e c u a c i o n .
1 . 2 . 1 . 3 . - Influencia d e l a s Va r i a b l e s en los Parmetros
Las variables ms estudiadas que influyen en la velocidad de cambio de los sistemas
m i c r o b i a n o s s o n : t e m p e r a t u r a , p H y , e n s i s t e m a s a e r o b i o s , l a c o n c e n t r a c i n d e o x i g e n o
d i s u e l t o .
De b i d o a l a e x i s t e n c i a d e u n a t e m p e r a t u r a p t i m a d e c r e c i m i e n t o , l a v a r i a b l e m s
e s t u d i a d a e n e s t e t i p o d e s i s t e m a s h a s i d o l a t e m p e r a t u r a (Esener y col., 1 983; Ratkowsky y
c o l . , 19 8 3 ; B a i l e y y O l l i s , 19 8 6) ; e n p a n i c u l a r , s u i n f l u e n c i a e n l a velocidad especfica
m x i m a d e c r e c i m i e n t o . A s , Esener y col. (1 983) y Bailey y Ollis (1 986) expresan la citada
v a r i a c i n d e l a siguiente forma:
19
lnroducctau
iH
k
0, exp( RT
AH2 [1. 19 ]
+ . exp( ----)
RT
m i e n t r a s q u e S i n c l a i r (19 8 7) y S h u y Ya n g (19 9 1) p l a n t e a n :
E2
= k~ exp()k1>, exp( RT~ [1 .20]
y, por ltimo Ratkowsky y col. (1 983) emplean la expresin:
,aJT) / C1 (7 - 7 ,,) /1 - exp( c2 . (7 Trnat))j}2 [1 .21 ]
La i n f l u e n c i a d e l a t e m p e r a t u r a e n e l r e s t o d e p a r m e t r o s h a s i d o m e n o s e s t u d i a d a :
Esener y col. (1 983) plantean la variacin del rendimiento macroscpico del sustrato
c a r b o n a d o e n b i o m a s a (Yx s ) y d e l c o e f i c i e n t e d e m a n t e n i m i e n t o (m s ) , m i e n t r a s S h u y Ya n g
(19 9 1) l o h a c e n p a r a l o s p a r m e t r o s d e [ae c u a c i n d e Lu e d e k n g -P i r e t (m y n ) . A p e n a s h a y
d a t o s e n l a l i t e r a t u r a s o b r e e s t o s a s p e c t o s .
La i n f l u e n c i a d e l p H e n l o s p a r m e t r o s c i n t i c o s d e e s t e t i p o d e modelos, apenas ha
s i d o e s t u d i a d a , n i c a m e n t e S i n c l a i r (19 8 7) p r o p o n e u n a e x p r e s i n d e s u influencia en la
v e l o c i d a d e s p e c f i c a m x i m a d e c r e c i m i e n t o , c o m o l a s i g u i e n t e :
P,n(PH) = [1 .22]
El mximo proporcionado por esta funcin estar ms o menos desplazado en la
escala de PH dependiendo del tipo de microorganismo de que se trate (basfilo, acidfilo o
n e u t r f i l o ) .
En los procesos aerobios, se le est dando gran importancia al estudio de la
e v o l u c i n d e o x g e n o d i s u e l t o e n e l s i s t e m a (Ch o y Wa n g , 19 9 0 ; Ho o ji m a n s y c o l . , 19 9 1) .
En un proceso fermentativo, la evolucin de oxigeno disuelto responde a la siguiente
ecuacin (Moo-Young y Blanch, 1 987):
20
Introduccin
dC
0
di k~a~ (C0 ? < > ) ? ~ [1 .23]
E l s e g u n d o s u m a n d o d e l s e g u n d o m i e m b r o i n d i c a l a v e l o c i d a d t o t a l d e c o n s u m o d e
oxgeno debida al microorganismo, que se corresponde con la suma del oxgeno necesario
para mantenimiento celular y para el crecimiento (Pinches y Pallent, 1 986; Cho y Wang,
19 9 0 ) :
1
q< > ? ~ =m< > ~ ? ~< + .dc~ [1 .24]
%~ di
sustituyendo la ecuacin [1 .3] en la [1 .24], se obtiene:
+ 1 [1 .25]
q u e e n o c a s i o n e s p u e d e s e r r e d u c i d a a (Ch o y Wa n g , 19 9 0 ) :
qQ [1.26]
En el caso de que sea el oxigeno el nutriente limitante del crecimiento, se pueden
emplear las ecuaciones cinticas tipo Monod, tanto para la velocidad especfica de crecimiento,
como para el consumo de oxigeno (Cho y Wang, 1 990), de acuerdo, respectivamente, a las
s i g u i e n t e s e x p r e s i o n e s :
[1 .27]
/1=
K ?
0, 02
q7X
.
= K-i-? [1 .28]
OQ Q
Para poder plantear un modelo cintico no estructurado, donde se tenga en cuenta no
slo el crecimiento, sino tambin el consumo de sustratos y la formacin de productos, es
i m p r e s c i n d i b l e t e n e r d a t o s e x p e r i m e n t a l e s e n l o s q u e s e a n a l i c e n l o s s u s t r a t o s , p r o d u c t o s y
biomasa a lo largo del tiempo. En definitiva, se trata de observar s i l o s s u s t r a t o s i n f l u y e n en el
crecimiento y en la produccin para incluir o no los trminos correspondientes en las
2/
Introduccin
velocidades de produccin de cada uno de los compuestos que intervienen. En el caso de que
la expresin de velocidad de produccin del sustrato limitante del crecimiento se vea afectada
por la produccin, se tendrn que repasar las suposiciones realizadas para el planteamiento de
la expresin para describir el crecimiento. Esto es particularmente importante en el caso de
adoptar la ecuacin logstica, ya que esta ecuacin parte de la suposicin de que el crecimiento
y el consumo del sustrato limitante estn relacionados nicamente por un rendimiento
macroscpico o coeficiente estequiomtrico constante a lo largo de la transformacion.
En definitiva, para el planteamiento de un modelo cintico no estructurado no
segregado, que sea capaz de describir el crecimiento, el consumo de los sustratos y la
p r o d u c c i n , s e d e b e n d e o b t e n e r d a t o s e x p e r i m e n t a l e s a p a r t i r d e l o s c u a l e s s e p u e d a s a b e r , e n
principio, qu trminos se deben incluir en las expresiones de las velocidades de produccin de
los diferentes compuestos. Es decir, hay que plantear el esquema de reaccin simplificado entre
los compuestos comentados, a partir de los datos obtenidos. De otra forma, siempre se pueden
ajustar los datos experimentales con diferentes expresiones que tomen en cuenta distintas
posibilidades, y elegir el mejor ajuste, es decir, un ajuste razonable con el menor nmero de
parmetros posible. Seria entonces aplicable, en ambos casos, la metodologa establecida para
la discriminacin entre modelos cinticos de reacciones mltiples (Kittrell, 1 970; Froment,
1 975: Garca-Ochoa y Romero, 1 993).
Los modelos descritos hasta ahora, esto es, los modelos no estructurados sern
buenos cuando los microorganismos posean una composicin celular que est
aproximadamente en estado estacionario. No obstante, cuando tienen lugar cambios en la
composicin celular, los modelos no estructurados proporcionan, en la mayora de los casos,
una pobre aproximacin a la realidad. Es tambin lgico pensar que los modelos no
estructurados no sean capaces de reflejar la influencia de ciertas variables,
fundamentalmente la composicin del medio. Para estos casos se han propuesto un tipo de
modelos que tienen en cuenta cambios en la estructura interna del microorganismo y, en
casos muy complejos, nicamente modelos de este tipo sern capaces de explicar la
evolucin del cultivo.
Este tipo de modelos, ms complejos, se corresponden con la clasificacin que fue
mostrada en la Tabla 1 .1 y pueden resumirse de la siguiente forma:
22
Introduccin
Modelos metablicos, son modelos que podran englobarse dentro de tos no
estructurados, pero emplean un esquema simplificado de reaccin para describir las
rutas metablicas de consumo de sustrato y formacin de productos como una red de
reacciones. Describen el crecimiento como en los modelos no estructurados.
Modelos de clula, describen la biomasa considerndola formada por varias
especies, teniendo en cuenta los componentes intracelulares y proponiendo para su
d e s c r i p c i n u n e s q u e m a d e r e a c c i n s i m p l i f i c a d o .
Modelos qumicamente estructurados, se pueden considerar como la suma de los
dos tipos de modelos anteriores,
Modelos segregados, en la descripcin del microorganismo se considera la
distribucin de alguna propiedad. Estos modelos no consideran un microorganismo
m e d i o , c o m o e n t o s c a s o s a n t e r i o r e s .
E l p r o b l e m a d e p l a n t e a r e s t e t i p o d e m o d e l o s e s r e l a t i v a m e n t e p a r e c i d o a l a b o r d a d o
en estudios de ciertos sistemas qumicos reaccionantes extraordinariamente complejos,
aunque menos que la mayora de las transformaciones biolgicas, es decir, del uso de
microorganismos para obtener productos de inters. As como para la descripcin de
procesos qumicos complejos, tales como el craqueo de hidrocarburos o la oxidacin de
hidrocarburos se ha desarrollado y aplicado una metodologa que ha cubierto distintas
etapas, o al menos ha considerado distintas posibilidades; el camino y posibilidades tomados
en cuenta han sido, conceptualmente, bastante parecidos a lo hecho, en las tres ltimas
d c a d a s , e n e l a n l i s i s d e s i s t e m a s m i c r o b i a n o s . P o r e je m p l o , e n e l c r a q u e o y o x i d a c i n d e
h i d r o c a r b u r o s , p r i m e r o s e d e s c r i b i e l s i s t e m a c o m o s i s e t r a t a r a d e u n a reaccin simple,
a a d i e n d o u n a distribucin de productos, en funcin de ciertas variables, normalmente
c o n d i c i o n e s d e o p e r a c i n (Ga r c a -O c h o a y c o l . , 19 9 0 a ) ; s e intent tambin describir el
s i s t e m a c o n t o d a s u c o m p l e ji d a d , a n a l i z a n d o c i e n t o s d e r e a c c i o n e s c o n decenas de especies
qumicas, incorporando los valores de los coeficientes cinticos calculados de forma
individual por otros autores, o suponiendo valores similares a los calculados para reacciones
o etapas parecidas (Sundaram y Froment, 1 978; Milhail y col., 1 983; Navarro, 1 986). Estos
dos extremos tienen su correspondencia en el estudio de las transformaciones microbianas,
en la simple reproduccin de la biomasa con el tiempo, de acuerdo a ecuaciones simples, sin
23
Introduccin
justificacin mecanstica (ecuacin de Malthus, por ejemplo), y en la reciente propuesta de
modelos de clula con cientos de reacciones y decenas de especies qumicas participando
en el esquema (simplificado) del metabolismo celular (Jeong y col., 1 990). El camino
a d e c u a d o p a r e c e s e r i n t e r m e d i o , con la utilizacin de esquemas de reaccin simplificados,
p e r o r e a l i s t a s , u t i l i z a n d o iumping o u n a a s o c i a c i n d e e s p e c i e s q u m i c a s p a r a s i m p l i f i c a r l o ,
y u n a metodologa para la discriminacin entre modelos posibles pasando por el clculo de
p a r m e t r o s (S u n d a r a m y F r o m e n t , 19 77; Ga r c a -O c h o a y c o l . , 19 9 0 b ) . E n l o s s i s t e m a s
biolgicos, esta metodologa se corresponde con la propuesta de modelos estructurados en
Compartimentos, capaces de describir las transformaciones de forma simplificada, pero
mucho ms cercana a la realidad que los modelos sencillos, siempre que su grado de
complejidad no sea exagerado. Segn Shuler (1 985), en su revisin sobre modelos cinticos
estructurados, para que un modelo cumpla esa situacin de compromiso ... debe presentar
un mnimo de parmetros ajustab es, la mayora de los parmetros deben ser determinados
a partir de experimentos independientes o estimados por una serie objetiva de reglas. Debe
ser tratable matemticamente y debe tener alta fidelidad en los procesos biolgicos,
teniendo que ser posible la verWcacin experimental del modelo
1 .2.2.- Modelos Metablicos
Este tipo de modelos plantea estructura slo para el metabolismo del o de los sustratos
carbonados, sin diferenciar panes en la biomasa, ya que la siguen considerando como en los
modelos no estructurados; es por ello que se pueden considerar como modelos no
estructurados-no segregados. Dentro de este tipo, existen modelos muy diferentes, muchas
v e c e s p r o p u e s t o s p a r a p r o b l e m a s m u y e s p e c f i c o s d e f o r m a t e r i c a (Va n De d e m y M o o -
Young, 1 973; Geraats y col., 1 990; Bibila y Flickinger, 1 991 ), realizando una simulacin a
partir de unos parmetros estimados de una manera que no siempre queda clara.
Otros autores plantean estudios metablicos ms generales, como es el caso de Koga y
col. (1 969) y de Barford y col. (Barford, 1 990; Hall y Barford, 1 981 ; Barford y Hall, 1 981 ;
Barford y col. 1 992a y 1 992b; Montes y col., 1 998), aunque en todos los casos se plantea para
ej caso especfico de la levadura fermentativa Saccharomyces cerevisiae.
24
introduccin
Los modelos metablicos planteados en la literatura, estn todos realizados con la
l e v a d u r a Saccharomyces cerevisie. E s t o s m o d e l o s r e s p o n d e n , d e f o r m a g e n e r a l , a l e s q u e m a
planteado en la Figura 1 .4, donde el sustrato carbonado es introducido en la clula mediante un
sistema de transporte. La clula puede utilizar este sustrato como esqueleto para sintetizar
nuevas clulas (crecimiento), o bien transformar este sustrato carbonado en un intermediario
r e d u c i d o (I R ) , e l c u a l p u e d e s e r f e r m e n t a d o a e t a n o l o b i e n s e r i n t r o d u c i d o en la mitocondria
p a r a , a t r a v s d e l c i c l o TCA y l a r e s p i r a c i n o b t e n e r e n e r g a e n f o r m a d e A TP .
s
Figura 1 .4.- Esquema general de los modelos metablicos para la levadura Sacchoromyces
cerevisie, e x i s t e n t e s e n l a l i t e r a t u r a .
25
Introduccin
El modelo de Koga y col. (1 969) plantea seis reacciones dentro del metabolismo de
la
levadura Saccharomyces cerevisi, y que responderan al esquema planteado en la Figura 1 .4.:
- Gl i c o l i s i s (r j:
5 + YTPO . ADP -e~ YTP.G ATP + Y/RO . IR [1.29]
- Metabolismo anablico (rA):
[1 .30]
N.A N+yT,. A TP * YATP. ADP + X
- Metabolismo catablico (rc)
ATP * ADP + Pi [1.31]
-Ci c l o TCA (r
1):
IR + NADH~ Ysrnx . NAD [1 .32]
Respiracin (rR):
YYID.R NADH+YITPR ADP+~2 >YVADR . NAD
4 + r~i~,.> ~ . ATPr.up. M
[1 .33]
F e r m e n t a c i n (rF):
IR> YP , F P [1. 3 41
Los autores proponen ecuaciones cinticas globales tipo Monod- para cada una de dichas
r e a c c i o n e s :
- Gl i c o l i s i s :
cs
rrcma
~ Cx
KATP +CATP
- Metabolismo anablico:
[1. 3 5]
r2rA~.,~ Kv + ? \;
Cx CTPCX
[1 .36]
26
Introduccin
- Metabolismo catablico:
rk
0C TP C [1. 3 7]
- Ciclo TCA:
C Pv
Cx [1.38]
KNAD+Crv An Ka +Cp
- Respiracin~
rsrp~; CNADHCX [1 .39]
- F e r m e n t a c i n :
u6 k FC ~ ,~. [1 .40]
El conjunto de las velocidades de produccin se puede escribir en funcin de una matriz
de coeficientes estequiomtricos (yij), como en el tratamiento cintico clsico de reacciones
mltiples (Garca-Ochoa y Romero, 1 993):
d 6 [1 .41 ]
It
4/
Koga y col. (1 969), no estiman los parmetros del modelo por ajuste de datos
e x p e r i m e n t a l e s s i n o q u e t o m a n e s t o s p a r m e t r o s d e l a b i b l i o g r a f i a , r e a l i z a n d o d e e s t a f o r m a
s i m u l a c i o n e s c o n e l m o d e l o .
E l e q u i p o d e B a r f o r d p r o p o n e u n m o d e l o a l g o s e n c i l l o . Co m i e n z a s u p l a n t e a m i e n t o e n
19 8 1 (B a r f o r d y Ha l l , 19 8 1) y s e c o m p l e t a e n 19 9 0 (B a r f o r d , 19 9 0 ) , s i e n d o a m p l i a d o a l c a s o d e
mltiples sustratos en 1 992 (Barford y col., 1 992a y 1 992b).
E l e s q u e m a d e r e a c c i n q u e p l a n t e a n v i e n e d a d o p o r e l s i g u i e n t e g r u p o d e e c u a c i o n e s :
- Para el transpone del sustrato carbonado a travs de la membrana plasmtica, (ri):
[1 .42]
- Transformacin del sustrato en el IR (r2):
S*~~>7p IR+y~ ATP [1 .43]
27
Introl,.ccon -
Formacin de etanol por fermentacin de IR (r
3):
IR ~ P + (O.
Ciclo de TCA (r4):
IR + 3 0,> JCO,+SH,0+(473 +!)ATP
-Para el crecimiento (r5):
Y + 5 + . R + YA J4TP - 2X
La s e c u a c i o n e s c i n t i c a s q u e p r o p o n e n e s t o s a u t o r e s t a m b i n s o n t i p o M o n o d :
C
r~k ~
!K+C/ x
rskj < y
Kw + Cm
r4C4 Cii
?
Cx
Km +Cii?
rs kv Ci Cx
r2, la obtienen a partir de la suposicin de estado pseudoestacionario para
dC5~

0rl-r2-vs
Por lo tanto el
It
rs r ri-v~rs
[1 .51 ]
m o d e l o f i n a l v i e n e d a d o p o r e l s i g u i e n t e g r u p o d e e c u a c i o n e s
diferenciales (velocidades de produccin):
- Sustrato carbonado:
dC5
___ :t-I,I
dt
Biomasa:
dC~
dt
[1 .53]
5
((.44]
[1 .45]
[1 .46]
[1 .47]
[1 .48]
[1 .49]
[1 .50]
La v e l o c i d a d
[1.52]
28
Introduccin
- ffitermediario reducido:
dC
15 =r~ .r, r3 r4 ~y, r5 [1.54]
di
- O x g e n o d i s u e l t o :
dC< , =3 r, [1. 55]
It
- P a r a e l A TP :
dCTP =(~>~ +1)r4 +y~ .y~, ~~Y r5 [1.56]
dt
Como puede observarse el planteamiento del modelo es muy similar al de Koga y col.
(1 969), pero este modelo es ms sencillo pues el nmero de componentes clave se ha reducido
a cinco , en lugar de tener once como en el caso anterior.
Los parmetros del modelo de Barford se estiman, en todos los casos, a partir de datos en
bibliografa o tomando en consideracin datos experimentales, pero por mtodos particulares,
no por regresion.
Un modelo metablico ms reciente, tambin realizado sobre Saccharomyces cerevisie es
el propuesto por Montes y col. (t998), basado en el modelo de Bardford, el cual, a su vez,
est basado en el concepto de que el metabolismo aerobio de las levaduras es determinado
m e d i a n t e e l t r a n s p o r t e d e a z c a r a l i n t e r i o r c e l u l a r y l a v e l o c i d a d d e t r a n s p o r t e d e p i r u v a t o
d e n t r o d e l a m i t o c o n d r i a . Lo s p a r m e t r o s d e e s t e m o d e l o s o n o b t e n i d o s d e f o r m a e x p e r i m e n t a l ,
p o r a ju s t e d e d a t o s c o n e l m o d e l o p r o p u e s t o .
De l o s modelos metablicos planteados en la literatura se puede concluir que este tipo de
modelos son abordables tanto desde el punto de vista matemtico como desde el punto de vista
experimental, pues, como se ha visto, el nmero de parmetros que presentan no es elevado y
l o s p r o d u c t o s o componentes clave que son necesarios analizar no suelen precisar de mtodos
de anlisis complicados.
29
Introduccion
1.2.3.- Modelos Estructurados o de Clula
Como se ha comentado previamente, este tipo de modelos se caracteriza por que la
descripcin de la denominada biomasa se realiza de forma estructurada, es decir, se
considera que est formada por componentes que reaccionan entre s. Los modelos
encontrados en la literatura clasificables dentro de este tipo se pueden dividir a su vez en
dos:
- Modelos Compartimentados, en los que la consideracin de los componentes internos
de la biomasa no se realiza de forma explcita. Se divide la biomasa en subunidades o
compartimentos a las que se le asigna una funcin, pero que no representan a
compuestos intracelulares especficos.
- Modelos de Clula: e s t o s m o d e l o s p r o p o n e n e s q u e m a s s i m p l i f i c a d o s d e r e a c c i n e n l o s
que los compuestos intracelulares aparecen explcitamente.
1.2.3.1.- Modelos Compartimentados
Los modelos compartimentados agrupan detalles del metabolismo microbiano en
grupos. estando el metabolismo total tratado en trminos de un nmero de componentes-
bloques o compartimentos- ms o menos limitados que, a veces, tienen una definicin
bioqumica aproximada. Estos modelos suelen presentar pocos parmetros (entre 5 y 1 5). Es
u n c o n c e p t o p a r e c i d o a l lumping e m p l e a d o e n reacciones mltiples (Garca-Ochoa y col.,
1 9 9 0 b ) .
El modelo compartimentado m s s e n c i l l o e s e l f o r m a d o p o r d o s b l o q u e s ; e s t e t i p o d e
modelos se comenz a desarrollar a mediados de los 60 y se siguen empleando en la
actualidad. Dentro de este tipo de modelos de dos compartimentos se encuadran los debidos
a : Dean y Hinshelwood (1 966); Williams (1 967); Ramkrishna y col. (1 967): Verhoff y col.
(1 972); Bijkerk y Hall (1 977); Esener y col. (1 982); Bleecken (1 984); Nielsen y col. (1 991 a
y 1 991 b) y Nikolajsen y col. (1 991 ). Todos estos modelos, excepto el primero, identifican
los compartimentos con partes de la biomasa (DNA, protenas, etc.), denominando a las
partes en que dividen a la biomasa de diferentes formas, como por ejemplo: componente
sinttico, gentico o estructural.
3 0
Introduccin
El modelo planteado por Ramkrisna y col. (1 967), divide el citoplasma en dos
componentes estructurales, cuya interaccin entre s y con el ambiente que les rodea,
produce el crecimiento. Denominan masa O al gnipo formado por cidos nucleicos (DNA y
RNA) y masa D a las protenas; proponiendo el esquema simplificado formado por cuatro
reacciones en el que la formacin de un inhibidor del crecimiento puede dar lugar a formas
muertas de las masas G y D (N
0 y ND).
C+75,< S *2G [1 .57]
O + y> 5 > 0+Dy,,. T [1 .58]
0+ T * + (17,,)T [1 .59]
DT-4 ND [1 .60]
El citado modelo proporciona curvas de crecimiento con todas las fases observadas
experimentalmente, incluyendo la f a s e d e l a t e n c i a . La concentracin total de protoplasma
viable es la suma de las concentraciones de los dos compartimentos. El modelo predice
fenmenos observados en el crecimiento en discontinuo, ya que las curvas obtenidas
d e p e n d e n d e l a s s i g u i e n t e s v a r i a b l e s (Ts u c h i y a y c o l . , 19 66) :
i ) La p r o p o r c i n r e l a t i v a e n t r e O y D e n e l i n c u l o , l o que influye en la longitud de la
f a s e d e l a t e n c a .
u) E l t a m a o d e l inculo, cuyo aumento proporciona una disminucin de la fase de
latenca.
Co m o p l a n t e a m i e n t o t e r i c o , p a r e c e c o h e r e n t e , e l p r o b l e m a e s t e n d e t e r m i n a r l a
s u s t a n c i a i n h i b i d o r a d e l c r e c i m i e n t o y e n a n a l i z a r l a c a n t i d a d d e l a m i s m a p r e s e n t e e n l a s
c l u l a s ; p a r a p o d e r o b t e n e r l o s p a r m e t r o s d e l m o d e l o p o r r e g r e s i n d e d a t o s
e x p e r i m e n t a l e s .
De l o s m o d e l o s d e d o s c o m p a r t i m e n t o s c i t a d o s , e l q u e h a t e n i d o m a y o r r e p e r c u s i n
p o s t e r i o r h a s i d o e l m o d e l o d e Wl l a m s (19 67) . E n e s t e m o d e l o s e d i s t i n g u e n d o s
c o m p a r t i m e n t o s : l a s e c c i n s i n t t i c a (K) y l a seccin gentico-estructural (O). Se supone
que las clulas se dividen tan pronto como el compartimento O se ha doblado en tamano.
Wi l l i a m s s u g i r i q u e e l c o m p a r t i m e n t o O e s t f o r m a d o p o r DNA y p r o t e n a s , y e l K p o r
R NA y m o l c u l a s p e q u e a s . E l e s q u e m a d e r e a c c i n p l a n t e a d o e s e l s i g u i e n t e :
3 1
Introduccin
S*K +G
[1.61]
Co n l a s s i g u i e n t e s e c u a c i o n e s c i n t i c a s :
(C~ + C
0)
= k,, C5 C~ .
[1 .62]
[1 .63]
Sin embargo, R6els y Kossen (1 978) modifican el modelo incluyendo diferentes
cambios:
a) Se dan dos tipos de reacciones:
i) Reacciones gobernadas por las concentraciones por unidad de biomasa (fase
bitica).
u) Reacciones en las que son de importancia las concentraciones referidas a
unidad de cultivo (fase abitica).
b) Incluyen coeficientes estequiomtricos en el esquema de reaccin.
c) Proponen ecuaciones cinticas potenciales, del tipo:
[1 .64]
1sI( flCJCY
=fI 4 - 1
donde i est referido al cultivo y el indice j a la biomasa. Por lo tanto, al
a u m e n t a r l a v e l o c i d a d r~ aumenta la biomasa en la misma proporcin.
Estos autores calculan los parmetros del modelo por regresin no lineal y
reproducen datos experimentales.
Las ltimas modificaciones del modelo de Williams (1 967) son las realizadas por
Nielsen y col. (1 991 a y 1 991 b); Nikolajsen y col. (1 991 ). En estos modelos se incluyen los
dos compartimentos, aunque cambia la nomenclatura empleada, denominan compartimento
A o parte activa de la clula (protenas y RNA) y compartimento G o parte inactiva (DNA e
hidratos de carbono). El modelo desarrollado por el equipo de Villadsen (Nielsen y col.,
1 990a y 1 991 b; Nikolajsen y col., 1 991 ) incluye dos tipos de sustratos (carbonado y
nitrogenado) y la formacin de productos, suponiendo que el sustrato nitrogenado slo
3 2
Introduccin
i n t e r v i e n e e n l a f o r m a c i n de biomasa, mientras que el sustrato carbonado se emplea tanto
para el crecimiento como para la produccin. El esquema general se da en la Figura 1 .5.
E s t e m o d e l o d e b i d o a q u e i n c l u y e l a f o r m a c i n d e d o s p r o d u c t o s , podra ser clasificado
d e n t r o d e los modelos Qumicamente Estructurados, en el que el metabolismo se considera
d e f o r m a c o m p a r t i m e n t a d a .
Estos autores (Nielsen y col., 1 99 la y 1 99 lb) calculan los valores de los parmetros
a p a r t i r d e l o s e x p e r i m e n t o s r e a l i z a d o s , p e r o n o p o r r e g r e s i n , y c o m p r u e b a n l a
r e p r o d u c c i n d e d a t o s e x p e r i m e n t a l e s (Ni e l s e n y c o l . , 19 9 1) d o n d e a u m e n t a n e l n m e r o d e
s u s t r a t o s c a r b o n a d o s a t r e s r e p r o d u c i e n d o p o s t e r i o r m e n t e a d a t o s experimentales.
s
N
P
Figura 1 .5.- Esquema general del Modelo de Nielsen y col. (1 991 a y 1 99 Ib).
3 3
Introduccin
Dentro de los modelos compartimentados hay modelos con ms de dos
c o m p a r t i m e n t o s , c o m o e l p r o p u e s t o p o r Ha r d e r y R d e l s (19 8 2) , q u e e s t f o r m a d o p o r t r e s
compartimentos segn el esquema de la Figura 1 .6. El compartimento K representa el RNA,
el compartimento U las protenas y el compartimento R la biomasa restante, principalmente
hidratos de carbono y precursores. tales como cidos nucleicos y aminocidos. Se supone
que los tres compartimentos se sintetizan a partir de un sustrato interno y hay slo una
frente de carbono que se emplea tanto para la sntesis de ATP como para precursores. Se
s u p o n e q u e e l s u s t r a t o l i m i t a n t e e n t r a e n l a poblacin celular y se incorpora directamente al
compartimento R; los compartimentos K y G se forman a partir de precursores que hay en
R; K y U se pueden degradar dando lugar de nuevo a precursores, que retornan al
c o m p a r t i m e n t o R ; e s t o l t i m o s e p u e d e i d e n t i f i c a r c o n e l m a n t e n i m i e n t o . La s e x p r e s i o n e s
c i n t i c a s s u g e r i d a s p o r Ha r d e r y R e l s (19 8 2) e s t n b a s a d a s e n l a s u p o s i c i n d e l e s t a d o
p s e u d o e s t a c i o n a r i o p a r a e l A TP y l o s p r e c u r s o r e s . La ju s t i f i c a c i n d e e s t a h i p t e s i s e s q u e
l o s t i e m p o s d e r e l a ja c i n p a r a l a a d a p t a c i n d e l A TP y l o s p r e c u r s o r e s s o n m u c h o menores
q u e p a r a l o s o t r o s c o m p o n e n t e s (R , G y K). Shuler (1 985) critic la aplicacin que hicieron
l o s a u t o r e s d e l m o d e l o a u n l o d o a c t i v a d o , p a r t i e n d o d e p a r m e t r o s o b t e n i d o s p a r a E.coli,
s i n t e n e r e n c u e n t a l a s p o s i b l e s iteracciones entre las diferentes especies presentes.

R
4
Figura 1 .6.- Esquema del modelo de Harder y Rels (1 982).
3 4
Introduccin
1 .2.3.2- Modelos de Clula
Como ya se ha comentado anteriormente, la principal caracterstica de este tipo de
modelos es que considera la biomasa formada por componentes intracelulares, identificando a
estos compuestos no como un compartimento, como sucede en los modelos compartimentados,
sino teniendo en cuenta al compuesto en s en un entramado de reacciones que puede ser ms o
menos complejo. Para desarrollar un modelo de clula se debe tener un conocimiento d e t a l l a d o
del microorganismo, por lo que los modelos encontrados en la literatura estn desarrollados
para microorganismos muy conocidos, como Escherichia coli, Bacillus subtilis o
Sacharomvces cerevisiae. Este tipo de modelos se caracteriza por un elevado nmero de
parmetros (entre 74 y 200) que los autores generalmente estiman a partir de datos que existen
en bibliografia. Estos modelos estn desarrollados nicamente de forma terica y explican slo
el crecimiento del microorganismo.
Dentro de estos modelos complejos de crecimiento, se incluye el trabajo pionero del
grupo de Shuler, en el que se desarrolla el modelo de Comel para E. coil. Un esquema del
modelo inicial (Shuler, 1 985) se representa en la Figura 1 .7. En este modelo se considera a la
clula como un reactor que es libre para cambiar de forma y volumen y responder a cambios en
las concentraciones de glucosa y amonio, que se incorporan a la clula para dar lugar a las
reacciones en su interior. Se emplea lumping en el planteamiento del esquema de reaccin es
decir, se agrupan, por ejemplo las proteinas citoplasmticas y de pared en un solo compuesto,
se agrupan todos los aminocidos en otro, se agrupan ribonucletidos y deoxirribonucletidos,
etc-, en total, consideran 1 8 componentes, para los que plantean sus velocidades de
produccin, con expresiones cinticas generalmente tipo Monod. El modelo presenta 88
parmetros que estiman de forma independiente realizando experimentos especficos, en los
que parece aislarse ciertas partes del modelo para obtener los valores deseados. El modelo lo
plantean como una buena herramienta para testar cuantitativamente los mecanismos de control
celular.
El modelo de Cornell, propuesto por el grupo de Shuler, fue evolucionando con el
tiempo, siendo considerados diferentes aspectos: en 1 984 (Domach y col., 1 984), se aplic a
3 5
Introduccin
poblaciones: en 1 985, fue ampliado (Shuler, 1 985) para incluir situaciones de anaerobiosis,
alterando los mecanismos de generacin de energa en la clula; en 1 986 fue modificado por
Peretti y Bailey (1 986) examinando las interacciones huesped-plsmido.
Otro ejemplo de este tipo de modeJos es el propuesto por Jeong y col. (1 990). Estos
autores desarrollan un modelo muy complejo para la descripcin del crecimiento y la
esporulacin de Bacillus subtilis. El esquema de reaccin considerado se recoge en la Figura
1 .8. Este modelo tiene en cuenta 35 componentes intracelulares, en los que se incluyen
intermedios metablicos de la glicolisis, gluconeognesis, ciclo TCA, y una representacin
detallada del metabolismo de los nucletidos. En total est formado por 39 ecuacIones
diferenciales que contienen 200 parmetros.
El modelo se emplea para simular el crecimiento en un bioreactor tanque operando en
discontinuo, empleando valores de los parmetros obtenidos de bibliografa, con los que los
autores obtienen una buena reproduccin de los datos que observan experimentalmente.
Simulan la evolucin de los 35 componentes, pero no analizan los citados componentes, de
hecho, en el trabajo publicado, no aparecen datos experimentales.
En ninguno de los modelos de clula encontrados en la literatura se obtienen los
valores de los parmetros del modelo mediante ajuste de datos experimentales, debido a que el
anlisis de muchos de esos componentes no se realiza, dada la complejidad de dichos anlisis.
Por lo tanto, y como se ha indicado anteriormente, estos modelos tan complicados no parecen
los ms adecuados, al menos desde el punto de vista tcnico (Esener y col., 1 983). De hecho,
para la simulacin de una transformacin microbiana, y la eleccin y diseo del reactor ms
conveniente, no es necesario ir al nivel de complejidad que exigen estos modelos. Sin embargo,
puede que en el futuro haya que emplearlos, ya que, en la actualidad, los modelos cinticos
ms sencillos, ajustados a datos experimentales conseguidos en diferentes experimentos,
proporcionan unos parmetros, en general, no relacionables. Es decir, no se consiguen
ecuaciones cinticas con los parmetros en funcin de las variables de operacin (temperatura,
pH, composicin del medio empleado, velocidad de transporte de oxigeno, etc.) que sean
capaces de predecir los resultados en experimentos llevados a cabo en variedad de las citadas
condiciones de operacin. Esto debe ser el gran logro de los modelos cinticos estructurados,
3 6
Introduccin
frente a la simplicidad de los modelos no estructurados. En cualquier caso, aunque los modelos
de clula sean necesarios, es de suponer que sern modelos ms sencillos que los propuestos
hasta ahora, con menos componentes clave, y, por tanto, con necesidad de medir menos
compuestos, de tal forma que el clculo de parmetros por regresin sea abordable. Esto
implica hablar de modelos con no ms de 7 a 1 0 componentes clave, el mismo nmero de
etapas en el esquema de reaccin, y no ms de 20 parmetros.
Figura 1 .7- Esquema del modelo de Domach y col. (1 984), siendo:
A
1 = amonio
A2= glucosa(componentes asociados en laclula)
W= productos residuales (CO2, H20)
P1 = aminocidos
P2~ ribonucletidos
P3= desoxiribonucletidos
P4= precursores envueltacelular
M1 = protena (citoplasmtica y de envuelta celular)
M2R-1 RNA inmaduro estable
M2RTM= RNA maduro estable
M2~ RNA mensajero
M3= DNA
M4= porcin no proteicade la envoltura celular
M5 glicogeno
PG= ppUpp
E2,E3= molculas implicadasdirectamente en la formacin de la paredcelular
GLN= glutamina
E1 = glutamina sintetasa
*- material presente en el medio externo
37
Introduccin
Figura 1 .8.- Esquema del modelo de Jeong y col. (1 990)
1 .2.4.- Modelos Qumicamente Estructurados
Ya se ha comentado que este tipo de modelos considera la biomasa formada por
varias especies, de la misma forma que en los modelos de clula pero, adems, los modelos
qumicamente estructurados describen el metabolismo como una red de reacciones
empleando esquemas simplificados de reaccin, como en los modelos metablicos ya
descritos. En definitiva, un modelo qumicamente estructurado se formula por la unin de
un modelo metablico -en el que se describe la produccin del producto de inters teniendo en
cuenta el sustrato carbonado dentro de la red simplificada de rutas metablicas-, junto con el
modelo de clula que describe el crecimiento del microorganismo productor-.
Los modelos ms complejos empleados hasta ahora han sido los modelos de clula con
los cuales era posible realizar una buena descripcin del crecimiento teniendo en cuenta la
3 8
co; NH
Introduccin
evolucin de componentes intracelulares durante el mismo. Estos modelos eran realizados
sobre sistemas de sobra conocidos como Ecol o Bacillus subtilis y no con microorganismos
e m p l e a d o s c o n u n i n t e r s i n d u s t r i a l . E n c o n s e c u e n c i a n o e s p o s i b l e o b s e r v a r l a a p l i c a c i n d e
tales modelos desde este punto de vista, ni poder predecir el comportamiento del
microorganismo cuando se realiza un cambio de escala.
Por esta razn, es necesaria la propuesta de los modelos qumicamente estructurados, es
decir, los que tienen en cuenta los principios del modelo de clula pero adems del modelo
metablico con lo que, en principio ser posible modelizar una produccin de inters industrial,
permitiendo realizar simulaciones en el cambio de escala del proceso. Adems podra permitir
la relacin de parmetros del modelo en funcin de las variables del proceso, como
temperatura, oxgeno disuelto, composicin del medio, etc.
Aunque tericamente estos modelos presentan grandes ventajas respecto a los
comentados anteriormente, no existe en la literatura ningn modelo de este tipo. La
modelizacin ms compleja vista hasta ahora se ha quedado en el nivel de modelos de clula,
donde se realiza un estimacin de parmetros sin ajuste de datos experimentales y sin
aplicacin en un sistema de produccin de inters industrial.
1 .2.5.- Modelos Segre2ados
El desarrollo de modelos segregados se comenz en la dcada de los aos 60,
plantendose modelos de escasa aplicacin prctica (Tsuchiya y col., 1 966; Matsumura y col.,
1 973; Kobasyashi, 1 966), debido a que estos primeros modelos segregados pertenecen a la
clase de modelos de balance de poblacin, que se basa en la defmicin de una funcin de
distribucin de propiedad que expresa la probabilidad de que la citada propiedad presente
cierto valor y, en el caso de los modelos desarrollados en la dcada comentada, la propiedad
elegida era la edad celular, siendo difcil de medir e incluso de definir la edad celular en un
cultivo microbiano: es dificil enlazar el concepto de edad con la teora bioqumica existente y
no es satisfactorio suponer que lo que tiene influencia en el proceso sea la edad en s misma en
lugar de los cambios en la composicin.
3 9
Introduccin
En la literatura inicial sobre modelos segregados se encuentra un grupo de modelos que
usa el tamao o masa celular como propiedad a considerar en la funcin de distribucin
(Eakman y col., 1 966). Este tipo de modelos basados en el tamao o la masa celular han sido
los precursores de los modelos segregados que se desarrollan y emplean en la actualidad en la
descripcin de sistemas microbianos, en los que el microorganismo es de tipo filamentoso
(hongos, principalmente). Los hongos filamentosos forman parte de un subgrupo de hongos
muy importante a nivel industrial, ya que se emplean en la sntesis de metabolitos, tanto
primarios como secundarios.
El metabolismo primario de los hongos filamentosos es muy similar al de las levaduras.
El mecanismo de crecimiento de los hongos filamentosos es, sin embargo, completamente
diferente del de los microorganismos unicelulares. Los modelos descritos hasta este punto son
vlidos nicamente para microorganismos unicelulares, ya que en ellos se combina el modelo
celular con un modelo de poblacin no segregado que considera a todas las clulas idnticas.
En el caso de microorganismos filamentosos, el modelo que describa la evolucin del sistema
debe tener en cuenta los cambios morfolgicos que all se producen, es decir, debe ser un
modelo segregado. Este tipo de modelos es denominado por algunos autores como modelos
morfolgicamente estructurados fNielsen y Villadsen, 1 992; Nielsen, 1 993).
Los modelos para microorganismos filamentosos se pueden de nuevo dividir en dos
grandes grupos:
- Modelos de crecimiento
- Modelos de crecimiento y produccin
Modelos de crecimiento de hongos filamentosos
Las clulas de los hongos filamentosos estn unidas en estructuras denominadas hifas,
estos elementos hifales crecen slo en las clulas situadas en los extremos de las hifas,
denominadas puntas o yemas, producindose nuevas yemas en clulas intermedias de la hifa
por un mecanismo denominado ramificacion.
40
Introduccin
El crecimiento de las yemas o puntas se produce generalmente a cierta velocidad de
extensin constante, que est condicionada por la composicin intracelular y el entorno que la
rodea; por lo tanto, el crecimiento exponencial de un cultivo de hongos filamentosos se deber
slo a la existencia de una frecuencia de ramificacin de la hifa. As, mientras que el
crecimiento de un microorganismo unicelular se caracteriza por una velocidad especfica de
crecimiento, para caracterizar el crecimiento de hongos filamentosos se necesitan tanto la
frecuencia de ramificacin como la velocidad de extensin de la yema (Nielsen y Villadsen,
1 992). Sin embargo, estas variables son dificiles de evaluar y, debido a la falta de mejores
medidas, la velocidad especfica de crecimiento se emplea tambin para caracterizar el
crecimiento de hongos filamentosos.
Nielsen y col. (Nielsen, 1 992; Nielsen y Villadsen, 1 992; Nielsen 1 993) refieren el
ndice de crecimiento de la hifa que se emplea generalmente es la unidad de crecimiento hifal,
a la masa de la hifa (miigi3:
lbgu [1 .56]
= [1.57]
n
Mb [1.58]
Nielsen (1993) plantea la relacin entre ellos:
~ [1.59]
4
Este autor (Nielsen, 1 992) comprob que la unidad de crecimiento hifal referida a la
masa de la hifa es aproximadamente constante en diferentes condiciones y para diferentes
especies de hongos filamentosos; sin embargo, el dimetro de la hifa vara, lo que implica que
launidad de crecimiento hifal referida a la longitud de la hifa tambin ser variable.
41
Introduccin
Segn Nielsen y Villadsen (1 992), si la citada unidad de crecimiento hifal (ecuacin
[1 .65]) es constante, tanto la velocidad de extensin de las yemas como la frecuencia de
ramificacin son proporcionales a la velocidad especfica de crecimiento de la biomasa, y para
ambas variables la constante de proporcionalidad es la unidad de crecimiento hifal.
Segn el valor de esta constante se obtiene un tipo u otro de estructura macroscpica:
- Si m~g presenta un valor elevado: hifas Largas con pocos puntos de ramificacin.
- Si m,gu presenta un valor bajo: densa estructura hifal con muchos puntos de ramifcacion.
Estas estructuras se denominan pdllets .
Esta estructura macroscpica presenta gran importancia, ya que en el caso de un
tamao de pellet elevado se pueden presentar problemas respecto a la difusin del sustrato
hasta la zona interna de la hifa.
Los modelos empleados en la literatura para describir el crecimiento de hongos
filamentosos son generalmente modelos no estructurados, ya que siguen expresando la
cantidad de microorganismo presente en el cultivo en trminos de biomasa (Yang y col., 1 992;
Nielsen, 1 993; Viniegra-Gonzlez y col., 1 993; Patankar y col., 1 993> , empleando,
generalmente, expresiones como la ecuacin logstica o la ecuacin de Monod, para su
descripcin.
Entre los modelos propuestos para el crecimiento de microorganismos filamentosos
existe uno especialmente curioso, el propuesto por Aynsley y col. (1 990) en el que se identifica
a la hifa con un reactor tubular autoextensible para simular su crecimiento.
Modelos de crecimiento y produccin en hon2os filamentosos
Nielsen y Villadsen (1 992) incluyen en su revisin tres modelos sobre hongos
filamentosos (Matsumura y col., 1 981 ) tambin segregados, ya que consideran reacciones de
metamorfosis o diferentes formas morfolgicas, pero con la particularidad de ser estructurados
de tipo metablico, ya que, debido a que prestan especial atencin a la produccin (de
42
Introduccin
a n t i b i t i c o s , e n z i m a s , e t c . ) d e s a r r o l l a n l i g e r a m e n t e e l m e t a b o l i s m o d e l s u s t r a t o e n e l i n t e r i o r
del hongo. En el modelo de Matsumura y col. (1 981 ), se consideran tres tipos de reacciones:
toma de sustratos, reacciones de metamorfosis y reacciones de los sustratos en el interior del
microorganismo, enfocadas a la produccin. Los citados autores plantean ecuaciones cinticas
para los dos ltimos tipos de reacciones, siendo, generalmente, expresiones tipo Monod o
potenciales.
1 .2.6.- La In2enieria Metablica
Diversos autores (Esener y col., 1 983; Nielsen y Nikolajsen, 1 992; Garca-Ochoa y
Romero, 1 993) coinciden en la idea de que los modelos cinticos para transformaciones
microbianas, que van a desarrollarse y aplicarse en la(s) prxima(s) dcada(s), son modelos
estructurados, pero simplificados, con un nmero reducido de componentes intracelulares
(dos, tres o cuatro), que se puedan medir, y, por lo tanto, obtener los parmetros por regresin
de datos experimentales. Pero dichos modelos tienen una tarea pendiente, deben ser capaces de
explicar o de relacionar variables, observaciones o fenmenos, que no sean capaces de
explicar los modelos no estructurados, ms sencillos.
La gran dificultad de desarrollar y aplicar modelos estructurados es, fundamentalmente,
de anlisis. La metodologa es en todo similar a la desarrollada para determinar modelos
cinticos de redes de reacciones (Garca-Ochoa y Romero, 1 993), siendo las principales
herramientas matemticas a utilizar la regresin mltiple no lineal (Marquardt, 1 963),
aplicando una solucin de multirrespuesta a un problema de dicha naturaleza. Pero como se ha
indicado, el modelo tiene que ser simplificado, con un nmero de componentes clave reducido,
de cuatro a ocho parece un nmero razonable, que hay que medir. Algunos de estos
compuestos son intracelulares: DNA, RNA, protenas, ATP, etc, son los ms frecuentes a
determinar. Por ello, es necesario medir stos y otros componentes, calcular parmetros por
ajuste de datos experimentales, y reproducir dichos datos.
Los modelos segregados estn especialmente indicados y quizs slo en esos casos,
para describir el crecimiento de microorganismos filamentosos de los que se obtienen
productos de gran inters.
43
lutroduccion
La n e c e s i d a d d e a u m e n t a r l a c o m p l e ji d a d d e l o s m o d e l o s c i n t i c o s p a r a d e s c r i b i r
l a e v o l u c i n d e p r o c e s o s m i c r o b i a n o s e s c l a r a , s i n e m b a r g o e l p r o p s i t o d e l o s m o d e l o s
metablicos y, especialmente de los modelos qumicamente estructurados, entra dentro
del desarrollo de la denominada Ingeniera Metablica (Bailey, 1 991 : Stephanopoulos,
1 991 ). La utilizacin de microorganismos como fbricas de productos sumamente
especficas ha llevado al desarrollo de herramientas para conseguir mejorar el
rendimiento del compuesto deseado. Durante bastante tiempo, la citada mejora se ha
realizado por mutagnesis al azar de cepas microbianas o por cambio en las condiciones
del cultivo. Este tipo de trabajo se llevaba a cabo porque muchos cambios genticos del
microorganismo potencialmente beneficiosos no eran evidentes, Incluso, los sistemas
enzimticos que gobiernan los cuellos de botella del metabolismo celular pueden estar
situados lejos del sistema enzimtico que finalmente sintetiza el compuesto bioquimico
deseado. En muchos casos, las reacciones energticas del metabolismo primario deben
ser reconducidas para aumentar la productividad (Vallino y Stephanopoulos, 1 993).
Durante las dos ltimas dcadas, se ha ido desarrollando una tcnica ms racional
para conseguir la produccin ptima del producto deseado (Bailey , 1 991 ), tratando por un
lado de identificar la reaccin crtica o cueiio de botella del metabolismo en la produccin
del compuesto deseado y por otro, minimizar esfuerzos en la optimizacin del proceso. Esta
tcnica es la denominada Ingeniera Metablica.
En los aos 70 (Heinrich y Rapoport, 1 974), comenz el estudio de la identificacin
de los citados cuellos de botella, a partir de la definicin de ciertos coeficientes (de control
y ciertas relaciones entre ellos (teoremas). En realidad, se trataba de un anlisis de
sensibilidad del sistema que proporciona una base cuantitativa para el estudio de la
regulacin de sistemas metablicos. El desarrollo de estos estudios se realiz,
principalmente, durante la segunda mitad de la dcada de los aos 80 (Fel y Sauro. 1 985;
Kell y Westerhoff, 1 986; Reder, 1 988; Westerhoff y Kell, 1 989). Para su aplicacin, es
preciso el anlisis de compuestos intracelulares, dificilmente analizables -se ha propuesto
realizar su seguimiento mediante istopos de C (Zupke y Stephanopoulos, 1 994), por lo que
se ha llegado a intentar la simulacin de estas rutas metablicas in vitro (Delgado y col.,
1 993).
44
Introduccin
A principios de los aos 90 ya se encuentran revisiones completas sobre estos
estudios (Fel, 1 992; Liao y Delgado, 1 993); sin embargo, su aplicacin prctica no se
encuentra extendida.
La identificacin del sistema metablico, y su influencia en la produccin del
metabolito de inters, se ha abordado desde el punto de vista estequiomtrico (Hamer,
1 989; Noorman y col., 1 991 ; Goel y col., 1 993; Vallino y Stephanopoulos, 1 993); la razn
principal de este cambio de estrategia es el gran error que conleva la determinacin de los
coeficientes de control y elasticidad necesarios, as como la necesidad de conocer en
profundidad la cintica enzimtica de la red de reacciones que forman la ruta metablica
estudiada (Pons y col., 1 996). En los antecedentes citados, se emplea un mtodo que
denominan de balance de materia, suponiendo para los metabolitos intermedios un estado
pseudoestacionario, aproximacin que evita la necesidad de su medida. Caben destacar tres
grupos de investigacin en la aplicacin de esta herramienta de la lingeniera Qumica a
procesos de produccin microbianos: el grupo de Delft (Holanda) (Noorman y col.,
1 991 ;De iong-Gubbles y col., 1 995; Gulik y Heijnen, 1995; Vanrolleghem y col., 1 996), el
grupo de Michigan (E.E.U.U.) (Varma y col., 1 993; Varma y Palsson, 1 994a y 1 994b;
Varma y Palsson, 1 995), y, por ltimo, el grupo de Lyngby (Dinamarca), que ya en su libro
sobre Ingeniera de la Biorreacin (Nielsen y Villadsen, 1 994) incorporan este estudio en el
capitulo de anlisis estequiomtrico de reacciones, como paso previo al desarrollo de
modelos cinticos de este tipo de procesos (Nielsen y Villadsen, 1 992; Jorgensen y col.,
1 995; Noronha Pissara y col., 1 996).
La utilidad potencial que Varma y Palsson (1 994) asignan en su revisin a esta
tcnica es amplsima: la interpretacin de datos experimentales, el diseo de mtodos para
trabajar con tcnicas de Ingeniera Gentica, la formulacin de medios ptimos, la
optimizacin de las condiciones de operacin y el diseo de bioreactores para bioprocesos.
Todo ello alcanzable con cierta sencillez, aunque sigue siendo necesario el anlisis de los
componentes clave obtenidos a partir del estudio estequiomtrico, ya que adems, el
nmero de compuestos intracelulares que es necesario analizar est en funcin de las
simplificaciones empleadas en el citado estudio (lumping o agrupacin de molculas
similares, hiptesis de estado pseudoestacionario, etc.).
45
f Y? tYO d cel n
Bailey (1 995) destaca La aportacin de la metodologa que la Ingeniera Qumica ha
desarrollado en el estudio de reacciones qumicas complejas, en el desarrollo y optimizacin
de procesos de produccin microbianos. Por tanto, hoy da parece que se puede trasladar la
metodologa desarrollada en el estudio de redes complejas de reaccin (Garca-Ochoa y
Romero, 1 993) al planteamiento de modelos cinticos para este tipo de procesos. No
obstante, hay que tener presente que es necesario tener en cuenta otros fenmenos para el
cambio de escala de estos procesos, como ya se indic al comienzo de este capitulo, estos
son los relacionados con la transferencia de oxigeno y el dao celular o stress
hidrodinmico que se puede causar al microorganismo por el propio fenmeno de la
energa involucrada para aumentar la transferencia de oxgeno.
-/ 6
introduccin
1 . 3 . - GOMA de XANTANO
El xantano es un biopolimero de origen microbiano. En el trmino biopolmero se
mcluyen un gran nmero de molculas de elevado peso molecular, tales como cidos
nucleicos, polisacridos y lpidos, producidos por una amplia variedad de sistemas biolgicos
(Higgins y col., 1 985). Desde un punto de vista industrial han tenido importancia los
biopolmeros denominados gomas. En trminos prcticos o funcionales, las gomas son
compuestos de peso molecular elevado, con propiedades coloidales que, en un disolvente
adecuado o agente suspendedor, producen geles o suspensiones de elevada viscosidad. En la
industria, tcnicamente, se emplea el trmino goma referido a polisacridos obtenidos de
plantas o animales, as como a sus derivados, que son dispersables en agua fra o caliente para
producir geles o disoluciones viscosas.
La importancia industrial de las gomas se fundamenta en dos caractersticas
importantes:
La capacidad para alterar las propiedades de flujo de agua.
La posibilidad de formar geles capaces de actuar como emulsificantes, adhesivos,
floculantes, formadores de pelcula, lubricantes, reductores de friccin y enlazadores.
Segn la fuente de obtencin, las gomas se pueden clasificar en gomas naturales
modificadas o semisintticas y sintticas. Las gomas naturales son las obtenidas a partir de
plantas (semillas, algas, cereales, tubrculos), microorganismos (bacterias, hongos) o animales
(leche, huesos). Las gomas semisintticas se pueden obtener tambin de plantas y
microorganismos pero la molcula obtenida es modificada qumicamente y, por ltimo, estn
las gomas obtenidas por sintesis qumica o gomas sintticas.
Los biopolimeros obtenidos mediante procesos microbianos presentan ciertas ventajas
respecto a las que se extraen de plantas (Sutherland, 1 983; Pace, 1 987; Galindo, 1 988):
Su produccin no depende de las condiciones climticas, contaminacin marina o
limitaciones de la cosecha.
La variabilidad en la calidad y cantidad del producto es menor, ya que las gomas
producidas por plantas varian su composicin segn las necesidades metablicas de las
mismas.
47
I f l tl O ( hiC C iO f l
Finalmente, a nivel microbiano se puede realizar una manipulacin gentica que permita
obtener gomas con propiedades reolgicas fijadas, lo cual est lejos de conseguirse con las
especies vegetales.
Entre los biopolmeros que estn teniendo mayor potencial de comercializacin se
encuentran los polisacridos de origen microbiano. Desde finales de los 50 se han venido
publicando numerosos trabajos sobre la produccin de polisacridos de origen microbiano, la
mayor parte no explotados comercialmente. Las investigaciones que han proporcionado
mejores resultados fueron las realizadas por los laboratorios N.R.R.L. del Departamento de
Agricultura de Estados Unidos, que a fmales de los 50 comenzaron una investigacin
exhaustiva sobre las aplicaciones industriales de biopolimeros microbiolgicos. El dextrano,
sintetizado por la bacteria Leuconostoc mesenteroides, fue el primer polisacrido microbiano
producido y utilizado en la obtencin de sustituyentes del plasma sanguneo. A ste le sigui
el xantano, que luego cobr mucha mayor importancia.
Los polisridos de origen microbiano son macromolculas orgnicas formadas por
cadenas de monosacridos, unidos entre si mediante enlaces glucosdicos. Son uno de los
tipos de molculas naturales ms comunes en los seres vivos, siendo frecuentemente
producidas por bacterias, levaduras, hongos y algas. Su sntesis est relacionada con distintas
funciones biolgicas, tales como conseguir una reserva energtica, formar parte de las
membranas celulares, actuar como barrera protectora contra el ataque de virus y anticuerpos y
proteger al microorganismo de la desecacin (Petitt, 1 979; Aspinal, 1 982; Pace, 1 987).
Los polisacridos, dependiendo de la constitucin de la cadena, pueden clasificarse en
honiopolisacridos, cuando contienen un nico tipo de azcar, tal como glucosa, fructosa o
manosa -como por ejemplo el dextrano, el levano y el escleroglucano- y heteropolisacridos,
cuando contienen dos o ms azcares, como glucomananos o arbigo-xilanos -como la goma
xantano-. Desde otro punto de vista, los polisacridos microbianos pueden clasificarse, segn
su origen, en tres grandes grupos (Margaritis y Zajic, 1 978): polisacridos intracelulares,
polisacridos estructurales y polisacridos extracelulares. Estos ltimos tienen distintas
funciones biolgicas; unos son producidos por bacterias, dando lugar a cpsulas microbianas
que rodean su pared; otros forman una pelcula viscosa, en la parte exterior de la pared celular,
que tiene la capacidad de difundirse al medio lquido donde se encuentra el microorganismo.
48
Introduccin
La goma de xantano fue descubierta a fmales de los 50, como ya se ha indicado, por
los Nothem Regional Research Laboratories (N.R.R.L.) del Departamento de Agricultura de
los Estados Unidos, durante unos trabajos de investigacin sobre las aplicaciones industriales
de polisacridos microbiolgicos y la utilizacin de excedentes agrcolas. Los estudios
realizados mostraron que el polisacrido, producido por la bacteria Xanthomonas campestris
NRRL B-1 459, posea propiedades muy interesantes. Propiedades que hicieron pensar que el
polisacrido podra suplir, por sus mejores caractersticas reolgicas, a otras gomas naturales y
sintticas solubles en agua (Kennedy y Bradshaw, 1 984; Kang y Pettit, 1 993).
Su importancia industrial se basa en su capacidad de controlar la reologia de los
sistemas de base acuosa. incluso a bajas concentraciones, las soluciones de goma de xantano
presentan un alto grado de viscosidad, en comparacin con disoluciones de otros polisacridos,
como carboximetil celulosa, goma de guar y de garrofin (Rocks, 1 971 ; Cottrell y Kang, 1 978;
Pettit, 1 979; Casas, 1 989).
Las soluciones de xantano tienen gran estabilidad y compatibilidad con sales, excepto
con iones polivalentes a valores elevados del PH (Margaritis y Zajic, 1 978). Las soluciones,
especialmente en presencia de electrolito, tienen una estabilidad trmica excelente, y su
viscosidad, en presencia de cantidades moderadas de electrolito (0,1 % NaC), es independiente
del pH en el intervalo de 5 a 9 (Margaritis y Zajic, 1 978).
El xantano presenta una gran cantidad de aplicaciones industriales, debido a la alta
viscosidad que proporciona en disolucin, incluso a bajas concentraciones, siendo la
consistencia de dichas disoluciones muy estable en amplios intervalos de temperatura, pH y
pK (Margaritis y Zajie, 1 978). Por ello, presenta un amplio abanico de aplicaciones en gran
cantidad de industrias. En la Tabla 1 .2 se recogen las aplicaciones ms importantes de la goma
xantano.
En general, las casas comerciales establecen dos calidades del producto: grado
alimentario y grado tcnico. Su presentacin es generalmente en forma de slido, aunque en
aplicaciones especficas en el campo de la recuperacin del petrleo utilizan caldos de
fermentacin clarificados. De cualquier forma, el xantano debe cumplir una serie de requisitos
referentes a sus caractersticas fisicas y qumicas.
49
Introduccin
TABLA 1 .2.- Aplicaciones del xantano en los diferentes tipos de industrias.
INDUSTRIA APLICACION GONG~TRAC[ON PUNCIONES
ALIMENTARIA
Aderezos pa ra ensa la da s 0,1 - 0.5 a dherencia ; ma ntiene en suspensin la s
Productos de pa steleria y pa na dera 0,1 - 0,4 Retiene el a gua , mejora la textura
Bebida s 0,05-0,2 Mejora la pa la ta bilda d,esta bliza
Productos insta ntneos 0,05- 0,2 ~e a da r cuerno
solubijida d enfro yen ca ente
Alinsentos enla ta dos 0,1 -0,3
Control de viscosida d dura nte el
procesa do
Sopa s, sa lsa s yjugos 0,05- 0,5 Mejora la textura , contribuye a da r
cuerno
Hela dos~a limentos congela dos 0.05-0,2
Controla la forma cin de crista les;
contribuye a la textura crenlosa
Confitera 0,1 -0,4
esta bilida d trmica , fa cilita
Proporciona el procesa do
Productos lcteos 0,05- 0,2
Inhibe la sinresis; esta biliza la
emulsin
Productos dietticos 0.3- 0,5 Mejora la textura , esta biliza . ba jo
contenido ca lrico
Productos crnicos 0,2- 0,5 Esta biliza ; retiene el a gila ; inhibe la
sinresis
COSMETICA
Pa sta s dentfrica s 0.7-1,0 Proporciona fcil extra ccin de los
titosy buena perma nencia en e cepillo
Crema s y lociones 0,2 -0,5 Esta bilza la s emulsiones, proporciona
consistencia cremosa
Cha mpes 0,2- 0,5 Controla la reologia
FARMACEUTIGA
Suspensiones y emulsiones 0,1- 0,5
Esta biliza la semulsiones y proporciona
esta bilida d frente a la s fluctua ciones
trmica s
Ta bleta s- o,s- ~o ingredientes a ctivos Prolos~a efliempo deconta ctodelos
ALINIENTACION
ANIMAL.
Sucedneosde leche 0,05-0,2 Esta bliza la suspensin de los
ingredientes insolubles
Alimentos enla ta dos pa ra a nima les
domesticos
0.1 -0,4 Evita la sinresis, contnbuye a da r
cuerpoa los jugos
VARIOS
Productos a groquimcos 0,1 -0,3 Suspende los ingredientesa ctivos;
controla la a dherencia del escurrido
Limpia doresy pulimentos 0,2-0,7
Proporciona esta bilida d frente a va lores
extremosde pH, prolonga el tiempo de
conta cto
Pintura s 0,1-0,3 Controla la reologia
Esta mpa do de textilesy a lfombra s 0.2 -0,5
Controla la migra cin el color; mejora
el procesa do
Adhesivos 0,1 -0,3 Controla la penetra cin
Industria pa pelera 0,1 -0,2 Conrola la spropieda des de flujo
Mineria 0,1-0,3
Controla la sedimenta cin en procesos
de sepa ra cin, mejora la esta bilida d de
la espuma
Tinta s 0,05-0,1 Controla la reologia
Esma ltes cermicos 0,3- 0,5 Proporciona buena esta bilida d de
slidosen stispensin
EXTRACCION
DEL
PETROLEO
Perfora cin 0,1-0,4 Proporciona buena esta bilida d frente a
la sa l,tempera tura y ciza lla do
Recupera cin forza da del petrleo 0,05-0,2 Confiere esta bilida d, buena movilida d y
ela sticida d en la inyeccin de polimeros
.50
Introduccin
E n c u a n t o a l p r o c e s o d e p r o d u c c i n y p u r i f i c a c i n , e l x a n t a n o s e o b t i e n e
industrialmente mediante un proceso de fermentacin sumergida desarrollado en los aos
s e s e n t a . E n l a F i g u r a 1. 9 s e m u e s t r a e s q u e m t i c a m e n t e , el diagrama de produccin para la
o b t e n c i n d e l p o l m e r o . E l d e s a r r o l l o d e l p r o c e s o s e p u e d e r e s u m i r e n l a s s i g u i e n t e s f a s e s :
Produccin del polisacrido
Aislamiento y purificacin
Produccin del polisacrido: para llevar a cabo el proceso, son necesarias unas
etapas previas, como la conservacin, mantenimiento y crecimiento de la bacteria con
el fin de preparar el inculo que se emplear posteriormente en la citada produccion.
En cualquier etapa del proceso, es fundamental mantener la esterilidad para evitar
posibles contaminaciones. Las etapas de conservacin de la cepa, as como el
crecimiento del microorganismo, son criticas en el proceso, ya que el estado del
microorganismo en el reactor influir de forma notable, tanto en la duracin de la fase
de latencia durante la produccin como en la calidad del xantano que se obtenga. Las
condiciones de fermentacin son muy importantes, ya que tanto el crecimiento de la
bacteria como la biosntesis del xantano se encuentran afectadas por numerosas
variables (Santos 1 993, Garca-Ochoa y col., 1 997): el inculo previo, la composicin
del medio de cultivo, la aireacin y agitacin del medio, el pH del medio de cultivo y
la temperatura de fermentacin
Aislamiento y Purificacin: una vez obtenido el caldo resultante, es precisa la
eliminacin de las bacterias del mismo para posteriormente obtener el xantano. Es
necesana una etapa de desactivacin y eliminacin de las bacterias -pasteurizacin y
posterior clarificacin-, seguida de la obtencin del xantano, generalmente mediante
precipitacin con disolventes orgnicos. La repercusin del coste de esta etapa, sobre
el coste final del proceso es muy importante, debido a que los caldos son muy
viscosos y el mezclado con cualquier reactivo necesita un aporte de energa elevado,
siendo necesaria la dilucin en algunas etapas del proceso. El xantano se somete
posteriormente a tratamientos de lavado, secado y molienda, siendo necesario evitar
efectos como la degradacin, la decoloracin o la prdida de solubilidad que puedan
afectar a la propiedades fisico-quimicas del polisacrido.
si
Introduccin
BACTERIA
Xanlwmonas campestris
ESTERILIZACIN
r
r
MEDIO de PRODUCCIN
Sustratos (C,N)
Nutrientes:
Macro
NIlero
r
CALDO DE FERMENTACIN
Y
PASTEURIZACIN
Fsica,Quimica y/o Enziintica
CLARIFICACIN
Filtracin, Centrifugacin
PRECIPITACIN
Alcoholes, Sales, Mezclas
FILTRACIN
LAVADO, SECADO, MOLIENDA
XANTANO
PROPIEDADES
Figura 1 .9.- Esquema del proceso de produccin del xantano
CONSERVACIN
y
MANTENIMIENTO
CRECIMIENTO
Medio
Composicin
Temperatura
Transporte de 0~
4
INCULO
Volumen
1 Fases en la preparacin
BIORREACTOR
Temperatura
PH, control
Oxgeno disuelto
- Caudal
- Agitacin
1
Humedad
Cenizas
Nitrgeno
Acetato
Piruvato
Peso Molecular
VISCOSIDAD
52
Introduccin
La estructura qumica de la molcula de xantano es bsicamente similar a la molcula
de celulosa. La goma de xantano contiene manosa, glucosa y cido glucurnico. Cada bloque
repetido contiene cinco unidades de azcar -dos unidades de glucosa, dos unidades de manosa
y una unidad de cido glucurnico- que forman una cadena principal y una cadena lateral (ver
Figura 1 .1 0). La cadena principal est constituida sobre unidades de B-D-glucosa enlazadas a
travs de las posiciones 1 y 4, como sucede en el caso de la molcula de la celulosa. La cadena
lateral consiste en las dos unidades de manosa y la unidad de cido glucurnico. La unidad
terminal < 3-D-manosa est unida glicosidicamente a la posicin 4 del cido glucurnico, que
vuelve a unirse glicosdicamente con la posicin 2 de la ct-D-manosa (Jansson y col., 1 975;
Kennedy y Bradshaw. 1 984). Esta cadena lateral de tres azcares se une a la posicin 3 de
cualquier otro residuo de glucosa de la cadena principal. La distribucin de las cadenas
laterales es desconocida. Alrededor de la mitad de los residuos de D-rnanosa terminales
contienen un residuo de cido pirvico, unido va grupo ceto a las posiciones 4 y 6 de la citada
molcula de azcar. La distribucin de estos grupos piruvato tambin es desconocida. La
unidad D-manosa tenninal contiene un grupo acetilo en la posicin 6 (Kennedy y Bradshaw,
1 984). Debido a la presencia de las unidades de cido pirvico y cido glucurnico en la
molcula, el xantano es un polisacrido anionco.
La distribucin de pesos moleculares es amplia, el peso molecular del polmero vara
entre 2.1 06 y 20.1 06 Daltons. En disolucin acuosa, a baja temperatura, presenta un ficticio
mcremento en el peso molecular, como consecuencia de la tendencia que tienen estos
polimeros a formar estructuras ordenadas de las molculas en disolucin (estructura terciaria).
En el xantano se han detectado dos conformaciones -hlice y ovillo-, dependiendo de la
temperatura de disolucin (Horton y col., 1 985; Garca-Ochoa y Casas, 1 993).
El hecho de que se trate de un polisacrido ramificado explica, en parte, la
extraordinaria capacidad espesante y de estabilidad que presentan las disoluciones acuosas de
esta goma, lo que ha hecho que sus aplicaciones industriales sean muy amplias, incluyendo la
industria alimentaria, la recuperacin forzada del petrleo, la industria papelera, etc, como ya
se ha indicado previamente. Existen diversos derivados del xantano tales como xantano
desacetilado, carboxymetil ter y el propilen-glicol ster. Sin embargo, hasta el momento,
ninguno de ellos tiene la importancia industrial del biopolimero (Kang y Pettit, 1 993).
53
Introduccin
CH
2 OH
CH2 OH 1
:oo M o
c
CH3
Figura 1.10.- Esquema de la molcula de xantano
Se han realizado muchos trabajos para estudiar y optimizar las condiciones de
produccin industrial del biopolmero (Moraine y Rogovin, 1 966, 1 971 ,1 973; Cadmus y col.,
1 978; Davidson, 1 978; Kennedy, 1 982; De Vuyst y col., 1 987a y 1 987b; Hassler y Doherty,
1 990; Shu y Yang, 1 991 ; Santos, 1 993; Garca-Ochoa y col., 1 995a). Los procesos de
produccin pueden ser mejorados con el conocimiento de la ruta de sntesis del xantano por la
bacteria Xanthonzonas campestris. Sin embargo, en la actualidad, es an limitada la
informacin existente sobre la sntesis de xantano, ya que se trata de un proceso complejo en el
que interviene un sistema multienzimtico (Santos, 1 993).
Sutherland (1 977) generaliza la sntesis de polisacridos extracelulares indicando que
se lleva a cabo en cuatro grandes procesos: consumo de sustrato, formacin de intermedios
metablicos, produccin y modificacin del polisacrido. En la Figura 1 .1 1 se muestra el
mecanismo propuesto para la biosntesis del xantano (Sutherland, 1 977; Pace, 1 980; Kennedy
.54
r
co~
OH
- Na , K~, 1 1 2 Ca
2
Introduccin
1.11.- Xantlwinonas campestris
Xanthomonas es un gnero de la familia Pseudomonaceae. Son bacilos rectos aislados,
que miden de 0,4 a 0,7 ~m de ancho y de 0,7 a 1 ,8 vm de largo. No poseen vaina ni se conocen
estados de reposo. Son bacterias Gram negativas mviles, ya que poseen un flagelo polar.
Estos microorganismos son aerobios obligados y su metabolismo es estrictamente respiratorio,
nunca fermentativo. Son bacterias no desnitrificantes y no reducen los nitratos, son catalasa
positivas y oxidasa negativas (Bradbury, 1 984), forman colonias usualmente amarillas, lisas y
viscosas.
La cpsula de este tipo de bacterias no presenta una estructura especial, por observacin
microscpica con tcnicas simples de tincin. Sin embargo, la tincin capsular con tinta Indio
ha llevado a observar cpsulas en muchos cultivos de Xanthomonas y especialmente de X
campestris (Bradbury, 1 984). La produccin de gran cantidad de estos polisacridos capsulares
-o goma de xantano- se lleva a cabo cuando se emplean medios ricos en hidratos de carbono.
En cuanto a la pared celular, es similar a otras clulas Gram negativas. Ya se ha
comentado que poseen un solo flagelo, observable por tincin y en microscopio electrnico en
cultivos jvenes. Su longitud suele ser de 1 ,79 j.tm, pero ocasionalmente varia entre 2 y 3 gm.
No se ha observado piti en Xanthomonas, pero esto no indica la ausencia de estas estructuras.
En lo referente a pigmentos, la mayora de las bacterias del gnero Xanthomonas presentan
pigmentos amarillos -denominados xanthomonadinas-, que son polienos aril-bromados. En la
Figura 1 .1 2. se puede observar una fotografia de Xanthomonas campestris realizada mediante
Microscopia Electrnica de Transmisin (MET) donde se aprecia una clula en la fase de
divisin, y se ve claramente el flagelo polar as como la morfologa de la bacteria. Las especies
de Xanthomonas son quimioorganotrofas, son aerobias estrictas y emplean el oxgeno como
aceptor de electrones. Son bacterias oxidasa negativas, capaces de crecer en un medio sinttico
puro, conteniendo minerales, nitrgeno amnico y una fluente de carbono como glucosa y
suplemento de aminocidos (Bradbury, 1 994).
.56
Introducc,n
y Bradshaw, 1 984; Sutherland, 1 985). Hay que destacar la importancia de los lpidos
intennedios de la sntesis, que parecen ser los que transportan el monmero de xantano hasta la
membrana celular y gracias a ellos, se unen a diferentes monosacridos para la formacin del
esqueleto carbonado (Sutherland, 1 975 y 1 977). El residuo de piruvato proviene del
fosfoenolpiruvato (P.E.P) - obtenido generalmente por va de Entner-Doudoroff, que es la ruta
por la que la bacteria lleva a cabo el metabolismo de la glucosa (Bradbury, 1 984: Pons y col.,
1 989)- unindose, finalmente, al esqueleto carbonado ya formado (lelpi y col., 1 981 a y 1 981 b).
Sic GP .- *GIc 1 P
LIPIDOP
UDPSIc
UMP
Sic LIPIDOP-P-G(c
DF- DF
UDP-Ac SIc LIPIDO-P-P-Gc-GIc
Entier GP*Ma n- GP*Ma n
LIPIDO-P-P-GIc-GIc- Man
Doudoroff 1
PEP
LIPIDO-P-P
UD P
LPIDO- P-P-GIc-Glc- Ma n
Ac- Sic
LIPIDO-P-P-GIc- Sic-Ma n
- Ac-Gk
Ma n
y,
1 r
LIPIDO-Glc- Sic- Ma n- Ac-GIc
PYR=Ma n
MONOMERO DE XANTANO
1
Sic- Sic
Ma n
Ac Sic
Mcin=Pyr
Figura 1.11.- Esquema de reacciones de la sntesis de xantano.
55
Introduccin
Figura 1.12.- Fotografia de Xanthomonas campestris realizada mediante MET (1 2000
aumentos).
En cuanto al metabolismo de carbohidratos, oxidan la glucosa, siendo la ruta de Entner-
Doudoroff la predominante en el catabolismo de la glucosa, solo desvan de un 8 a un 1 6% de
la glucosa a la ruta de las pentosas fosfato. El ciclo de la hexosa no se emplea de forma
significativa. Tanto el ciclo del cido tricarboxilico como el ciclo del glioxilato estn presentes
en todo el gnero Xanthomonas (Bradbury, 1 984).
El xantano se produce por bacterias del gnero Xanthomonas; aunque es,
principalmente, la especie Xanthomonas campestris, la ms estudiada y empleada para llevar a
cabo la produccin. Se ha observado la sntesis de polisacridos similares al xantano a partir de
otras especies de Xant/zomonas (Slodki y Cadmus, 1 978). A partir de Xi mannihotis se obtiene
un polisacrido formado tambin por D-glucosa, D-manosa, cido glucurnico y cidos actico
y pirvico, aunque en diferentes relaciones molares, obtenindose un 2,2% del polisacrido a
57
Introduccin
partir del 4 al lOOo de azcar. Si se emplea Al phaseoli se puede Llegar a obtener hasta 1 0 gIL
de una goma de caractersticas similares, con una composicin similar, al xantano. pero con
diferente relacin molar entre los azcares que lo forman. Otras especies, como Xi
ma!vacearurn, Xi heredae, Xi papavericola y Xi vesicatoria, producen polisacridos formados
por las mismas unidades de azcar (Margaritis y Zadic, 1 978; Bradbury, 1 984). Es la goma
sintetizada por Xsrewartii la que presenta una clara diferencia con el resto, ya que las unidades
de azcar que la forman son D-glucosa, D-galactosa y cido glucurnico (Slodki y Cadmus,
978). La mayora de las bacterias del gnero Xanthomonas producen una familia de
polisacridos extracelulares, cuyo papel parece ser proteger a las clulas de la desecacin y
otras condiciones adversas, ya que es, en realidad, la cpsula bacteriana (Bradbury, 1 984). En
la Tabla 1 .3 se resumen a composicin de diversos biopolmeros sintetizados por diferentes
especies del gnero Xanthomonas.
Tabla 1 .3.- Composicin media (en porcentaje) de Los diferentes polisacridos sintetizados por
Las bacterias del gnero Xanthomonas (Kennedy y Bradshaw, 1 984).
Especie O-Glucosa 0-Manosa Ac. D-Glucurnico Piruvato Acetato
36 campestrus 30.1 27,3 t4.9 7.1 6.5
36 olbilneans /739 30,2 27,5 1 3.9 53 5.8
36 a/ti lineans 2257 25,2 26,1 1 4,2 5.8 5,1
X w conopod is 457 30,6 28,6 1 3,7 7,2 5, 5
36 fregara 1 469 32,5 28,5 1 5,1 7.0 3,9
XIfragarza 1 822 24,6 26,1 1 4,0 4.9 5.5
36 gurnnsucians 2182 34,8 30,7 1 6,5 4,7 1 0,0
Xjug/andis 4 1 1 33.2 30,2 1 6,8 6,9 6,4
3 6 inanihotis 4 4 59 33,3 28,7 1 6,7 7.6 6,8
3 6 phaseoli 556 29,1 34,2 1 7,8 7,7 1 ,8
36 phaseoli 1 /28 30,9 28,6 1 5,3 1 ,8 6,4
36 vu.scu omm 702 34.9 30,2 1 7.9 6,6 6,3
3 6 v ascul arum 79 6 22.2 26,2 1 5,3 5,4 8,8
a
contiene O-Galactosa
58
Introduccin
Como ya se ha comentado, la especie ms ampliamente utilizada para La produccin
de xantano es Xanthomonas campestris. Aunque esta bacteria no es dificil de cultivar en
medios estndar de laboratorio, se han observado variaciones en las cepas, tanto en cultivo en
continuo (Silman y Rogovin, 1 972), como en discontinuo (Cadmus y col., 1 976), que afectan a
la calidad y al rendimiento del xantano producido.
Se han descrito tres tipos diferentes de cepas de esta bacteria (Slodki y Cadmus, 1 978;
Cadmus y col., 1 976 y 1 978; Jeanes y col., 1 976; Kidby y col., 1 977):
Cepa L (Large): presenta colonias mucoides amarillas brillantes, de 4 a 5 mm
de dimetro. Proporciona buen rendimiento en xantano y con un nivel alto de
piruvato (tambin influye el medio de produccin empleado).
Cepa Sm (Small): colonias mucoides de color amarillo ms oscuro que la
cepa L y de unos 2 mm de dimetro. Proporciona menor rendimiento en
xantano que lacepa L y con menor contenido en piruvato.
Cepa Vs (Very Small): produce colonias no mucoides, de color indefinido y
de un dimetro mximo de 1 mm. No produce xantano apreciablemente y no es
muy frecuente.
Parece que las cepas Sm y Vs se producenpor degeneracin de la cepa L; normalmente
debido a un envejecimiento del cultivo, que puede ser acelerado por una conservacin
deficiente. Por lo tanto, es necesario mantener la bacteria como cepa L, para obtener un
xantano con buenas propiedades y con buen rendimiento.
1 .3.2.- Produccin de Xantano
Un factor importante a tener en cuenta es el estado del microorganismo empleado como
inculo en la produccin, pues afecta a la duracin del proceso y a la composicin del xantano
obtenido. Los diferentes autores han abordado este problema creando un inculo a partir de
varios ciclos de crecimiento, es decir, en etapas (Rogovin y col., 1 961 ; Suman y Rogovin, 1 970
y 1 972; Moraine y Rogovin, 1 971 ; Cadmus y col., 1 976 y 1 978; De Vuyst y col., 1 987a y b;
59
In/toduccin
Peters y col.. 1 989: Pons y col., 1 989 y 1 990; Santos, 1 993). El tiempo necesario para la
preparacin del inculo est influido por la composicin del medio empleado para el desarrollo
del microorganismo- algunos autores varian la composicin de una etapa a otra (Rogovin y
col., 1 961 ; Cadmus y col, 1 978; Peters y col., 1 989; Pons y col., 1 989) - y por la temperatura
empleada para el crecimiento de Xi campestris, existiendo un intervalo ptimo de 25 a 30
0C,
para llevarlo a cabo (Thonart y col., 1 985; Shu y Yang, 1 990).
En trabajos previos (Santos, 1 993), tras un cuidadoso estudio, se ha concluido que el
mculo debe realizarse en dos etapas, para que de este modo el microorganismo se aclimate a
las condiciones del fermentador, tanto al medio como a la agitacin mecnica. La primera
etapa del inculo consiste en incubar el microorganismo en tubo de ensayo con medio YM,
durante 1 2 horas a 280 C y 21 0 r.p.m., para, a continuacin, pasarlo a un Erlenmeyer con medio
YM-T e incubarlo durante 6,5 h, a 28 0C y 21 0 r.p.m..
El medio de produccin empleado en los primeros estudios realizados sobre la
produccin de xantano (Rogovin y col., 1 961 y 1 965) era de tipo complejo; se empleaban
sustancias abundantes en Estados Unidos para probar la sntesis del polisacrido (azcar de
maz, CSL, etc.). El desarrollo del proceso de produccin ha llevado a la propuesta de
diferentes tipos de medios, entre los que todava se encuentran sustancias complejas, corno son
la peptona (Kennedy y col., 1 982; Pinches y Pallent, 1 986; Lee y col., 1 989; Pons y col., 1 989
y 1 990), extracto de levadura (Pons y col., 1 989 y 1 990; Shu y Yang, 1 990 y 1 991 ), CSL
(Kennedy y col., 1 982; De Vuyst y col., 1 987a y b), extracto de Pharmamedia (Patton y Dugar,
981 ) y DDS (Moraine y Rogovin, 1 971 ; Silman y Rogovin, 1 972; Cadmus y col., 1 976;
Kennedy y col., 1 982). Sin embargo, en general, para mejorar el sistema de produccin de
xantano, poder controlar las concentraciones de los diferentes nutrientes que se incorporan al
medio y observar su influencia en el proceso, se suele trabajar con medios sintticos
(Davidson, 1 978; Cadmus y col., 1 978; Souw y Demain, 1 979 y 1 980; Trilsbach y col., 1 984;
Tait y col., 1 986; Peters y col., 1 989; Schweickart y Quinlan, 1 989; Suh y col., 1 992).
Las fuentes de carbono ms ampliamente utilizadas son glucosa y sacarosa (Moraine y
Rogovin, 1 966 y 1 971 ; Silman y Rogovin, 1 972; Cadmus y col., 1 976 y 1 978; Davidson, 1 978;
Souw y Dennin, 1 979 y 1 980; Kennedy y col., 1 982; Trilsbach y col., 1 984; Thonart y col.,
1985; Tait y col., 1 986; Pinches y Pallent, 1 986; Funahashi y col., 1 987; De Vuyst y col.,
1 987a y b; Lee y col., l989; Peters y col., 1 989; Qadeer y Baig, 1 989; Vashitz y Sheintuch,
60
Introduccin
1 991 ; Zaidi y col., 1 991 ; Suh y col.. 1 992). Sin embargo, parece que es la sacarosa, en
concentracin entre 20 y 40 gIL, la que proporciona mejores resultados (Souw y Demain,
1 979; Funahashi y col., 1 987; De Vuyst y col., 1 987a; Santos, 1 993).
Respecto a! nutriente nitrogenado a emplear en la produccin, existe una gran
discrepancia en la literatura; mientras que hay autores que destacan el efecto beneficioso, sobre
la produccin del polisacrido, de fuentes nitrogenadas orgnicas o complejas (Souw y
Demain, 1 979 y 1 980; Kennedy y col., 1 982; Qadeer y Baig, 1 989), otros autores comentan
que es mejor, para el transporte en el caldo, cuanto menor y ms sencilla sea la molcula
empleada (Slodki y Cadmus, 1 978). La idea general sobre el sustrato nitrogenado parece
i n d i c a r q u e s e d e b e e m p l e a r u n c o m p u e s t o o r g n i c o (u r e a , c i d o g l u t m i c o ) o s u s t a n c i a s
c o m p l e ja s (CS L, DDS ) . No o b s t a n t e , S a n t o s (19 9 3 ) r e a l i z u n a c o m p a r a c i n d e [ap r o d u c c i n
o b t e n i d a c u a n d o e l n i t r g e n o s e a a d e a l m e d i o d e f o m i a i n o r g n i c a , c o m o a m o n i o y c u a n d o
l a f r e n t e n i t r o g e n a d a e s d e n a t u r a l e z a o r g n i c a , o b s e r v a n d o q u e , p a r a l a m i s m a c a n t i d a d d e
n i t r g e n o , l a c a n t i d a d d e x a n t a n o p r o d u c i d a c o n a m o n i o e r a m a y o r q u e c u a n d o s e i n c l u a u n a
f u e n t e n i t r o g e n a d a d e n a t u r a l e z a o r g n i c a .
E n c u a n t o a l r e s t o d e l o s n u t r i e n t e s , s u i n c o r p o r a c i n a l m e d i o s e s u e l e r e a l i z a r d e
f o r m a s i n t t i c a , c o n c o m p u e s t o s i n o r g n i c o s ; e x c e p t o e n l o s c a s o s e n l o s q u e l a s u s t a n c i a
c o m p l e ja e m p l e a d a c o m o f u e n t e n i t r o g e n a d a (DDS ) i n c o r p o r e l a s c a n t i d a d e s n e c e s a r i a s d e l o s
c i t a d o s n u t r i e n t e s .
E n l o s m e d i o s d e p r o d u c c i n s e s u e l e i n c o r p o r a r c i d o c t r i c o , y a q u e s e h a
c o m p r o b a d o e l e f e c t o b e n e f i c i o s o e n l a p r o d u c c i n d e c i e r t o s c i d o s o r g n i c o s a a d i d o s e n
p e q u e a s c a n t i d a d e s e n e l m e d i o (S o u w y De m a i n , 19 8 0 ; Tr i l s b a c h y c o l . , 19 8 4) .
La c o m p o s i c i n d e l m e d i o f u e o p t i m a d a e n t r a b a jo s p r e v i o s (Ga r c a -O c h o a y
c o l . , 19 9 2; S a n t o s , 19 9 3 ) m e d i a n t e d i s e o f a c t o r i a l d e e x p e r i m e n t o s . La c o m p o s i c i n d e
e s t e m e d i o a p a r e c e d e t a l l a d a e n e l c a p i t u l o 2 d e e s t a M e m o r i a y h a s i d o e l m e d i o e m p l e a d o
p a r a l a p r o d u c c i n d e x a n t a n o e n e l p r e s e n t e t r a b a jo e n t o d o s l o s e x p e r i m e n t o s . La
c o n c e n t r a c i n p t i m a d e a m o n i o e s d e 0 , 257 g I L, c o n c e n t r a c i o n e s s u p e r i o r e s p u e d e n
o c a s i o n a r u n e f e c t o t x i c o e n l a s c l u l a s , p u d i e n d o v e r s e a f e c t a d o t a n t o e l c r e c i m i e n t o c o m o
l a p r o d u c c i n d e x a n t a n o . S i n e m b a r g o , p o r m o t i v o s q u e l u e g o s e e x p l i c a r n , l a
c o n c e n t r a c i n d e l a f u e n t e n i t r o g e n a d a h a s i d o v a r i a d a . E n c u a n t o a l a f u e n t e d e c a r b o n o s e
61
Introduccan
ha empleado sacarosa en una concentracin de 40 gIL, la cual es lo suficientemente elevada
para favorecer la sntesis del polisacrido, pero no para tener efecto negativo en la
produccin por inhibicin del crecimiento (Souw y Demain, 1 979).
El resto de variables que influyen en el proceso de produccin son: temperatura,
agitacin, caudal de aire y pH. En la Tabla 1 .4 se muestra las condiciones de operacin
empleadas por diferentes autores en biorreactores tipo tanque agitado.
Tabla 1 .4.- Condiciones de operacin empleadas por diferentes autores para llevar a cabo la
produccin de xantano en un tanque agitado.
Autores V(L) Q(L/L/min) N(r.p.m.) T(
0C) pH1
Ca dinus y col. (1978) lO 1 .5 225-300 20-30 6.8
(control)
Rogoviny col(1 965) 227
2268
0.5 90-290
30-250
28 7
Mora ine y Rogovin 0966) --- 1 1000 28 7
Mora ine y Rogovin (1971) 8 1 500-1 000 28 72.1
(control)
Mora ine y Rogovin (1973) --- --- --- 28 (
(control)
S ouw yDesnain (1 980) --- 0 .5 500 25 (
(control)
Pinchesy Pallent(1 986) 1 0
2.5
0,4 600
1 000
30 (
(control)
De Vuysty col. (1 987) 6 1 250-700 28 7
Funahashl y col. (1 987) 6 1 350-1 200 30 7
Peters y col (1989) --- 0.3 200-800 28 (
(control)
ShuyYa ng(l990) --- 1 .1 6 800 20-34 (
(control)
Ponsy col. (1990) 3.6 0,3, 0.6 500-900 29 6.9
(control)
Kennedy y col. (1 982) 3.5 0.5 400-600 30 (
(control)
SchweikartyQuinlan(1 989) 1 .2 1 300-1 300 26 (
(control)
Sa ntos(1993) 1 ,5 1 21 0-1 300 28 7
Como puede apreciarse en la tabla, la temperatura que se debe emplear para llevar a
cabo la produccin se encuentra en el intervalo de 25 a 33 0C. La gran mayora de los autores
emplean la misma temperatura en la preparacin del inculo que en la produccin (Rogovin y
col., 1 961 y 1 965; Moraine y Rogovin, 1 966, 1 971 y 1 973; Suman y Rogovin, 1 970 y 1 972;
Davidson, 1 978; Souw y Demain, 1 979 y 1 980; Kennedy y col., 1 982; Trilsbach y col., 1 984;
62
Introduccin
P i n c h e s y P a l l e n t , 19 8 6; Ta i t y c o l . , 19 8 6; F u n a h a s h i y c o l . , 19 8 7, De Vu y s t y c o l . , 19 8 7a y b ;
Peters y col., 1 989; Lee y col., 1 989; Qadeer y Baig, 1 989; Pons y col., 1 989 y 1 990; Zaidi y
col., 1 991 ; Suh y col., 1 992). Sin embargo, se ha propuesto el empleo de temperaturas
diferentes en ambas etapas del proceso (Thonart y col., 1 985; Shu y Yang, 1 990 y 1 991 ).
En trabajos previos (Santos, 1 993 y Garca-Ochoa y col., 1 997) se determin que la
temperatura ptima para la produccin de xantano es 28
0C, si bien no existe una gran
diferencia con la temperatura de 31 0 C.
Debido a que Xanthomonas campestris es una bacteria estrictamente aerobia, la
transferencia de oxgeno en la fermentacin se convierte en una variable de gran
trascendencia. En cada tipo de reactor las variables de operacin que pueden afectar a la citada
transferencia de oxgeno son diferentes. Como el reactor ms empleado para la produccin de
xantano es el tipo tanque agitado, las condiciones de operacin que ms influyen son el caudal
de aire y la agitacin.
Aunque los valores del caudal de are empleados son dispares (de 0,3 a 1 ,5 L/L/min),
todos los autores mantienen constante la citada variable. Por tanto, la transferencia del oxgeno
en el caldo depende nicamente de la velocidad de agitacin. Sobre esta ltima variable
citada, hay dos tendencias: por una parte hay autores que la mantienen constante durante toda
la fermentacin (Souw y Demain, 1 980; Pinches y Pallent, 1 986; Shu y Yang, 1 990 y 1 991 ),
mientras que otros la van aumentando a medida que aumenta la viscosidad del caldo (Rogovin
y col., 1 961 y 1 965; Moraine y Rogovin, 1 971 ; Cadmus y col., 1 978; Kennedy y col., 1 982;
Funahashi y col., 1 987; De Vuyst y col., 1 987a y b; Schweickart y Quinlan, 1 989; Pons y col.,
1 990).
Diversos autores (Santos, 1 993) han propuesto que la velocidad de agitacin
empleada debe ir incrementndose a medida que aumentar la viscosidad del caldo, para
mejorar la transferencia del oxgeno, ya que los microorganismos se encuentran recubiertos de
una capa de polisacrido que evita su rotura por efecto de la elevada velocidad de agitacin,
que es necesario alcanzar para mantener la concentracin de oxgeno disuelto a niveles
adecuados. Para un caudal de aire constante de 1 L/L/min, la velocidad de agitacin inicial
debe ser de 21 0 r.p.m. y tiene que ir aumentando a medida que crece la viscosidad del caldo
en el biorreactor, hasta alcanzar un valor entre 800 y 1 000 r.p.m..
63
Introduccin
Finalmente, respecto a la ltima de las variables citadas anteriormente, el pH,
nicamente Thonart y col. (1 985) proponen realizar la preparacin del inculo a un valor de 5,
el resto de los autores comienzan la fermentacin partiendo de un inculo crecido a pH cercano
al neutro y con el medio de produccin ajustado tambin a un valor cercano a 7. La diferencia
entre unos trabajos y otros radica en controlar o no esta variable durante la fermentacin, e
incluso se estudia la mejor base a emplear para realizar el citado control. Hay autores que
sealan, de forma especial, el beneficio del control del pH durante la fermentacin (Moraine y
Rogovin. 1 971 ), mientras que otros autores nicamente trabajan empleando el citado control,
pero sin comentar si esta variable ha sido o no estudiada (Cadmus y col., 1 978; Davidson,
1 978; Souw y Demain, 1 980; Patton y Dugar, 1 981 ; Pinches y Pallent, 1 986; Tait y col., 1 986;
Robinson y Wang, 1 988; Pons y col., 1 989; Lee y col., 1 989; Peters y col., 1 989; Schweickart
y Quinlan, 1 989; Shu y Yang, 1 990 y 1 991 ; Suh y col., 1 992). Moraine y Rogovin (1 971 )
sealan la mejora que supone el empleo de hidrxido amnico como lcali para realizar el
control del pH.
En la literatura, sin embargo, existe tambin un gran nmero de trabajos en los que
se realiza la fermentacin sin llevar a cabo el control del pH (Rogovin y col., 1 961 y 1 965;
fvloraine y Rogovin, 1 966; Suman y Rogovin; 1 970 y 1 972; Souw y Demain, 1 979; De Vuyst
y col., 1 987a y b; Funahashi y col., 1 987). Santos (1 993) y Garca-Ochoa y col. (1 997)
proponen realizar la produccin sin control de pH pues no resulta beneficioso para la
produccin. Durante el periodo de crecimiento, el pH del medio prcticamente se mantiene
constante en este valor, pero al llegar a la fase estacionaria de crecimiento el pH disminuye,
si se controla esta variable la produccin se detiene.
Finalmente, en la Tabla 1 .5 se muestra la comparacin entre la cantidad de xantano
producido, as como el rendimiento obtenido, en las condiciones empleadas por Santos (1 993)
en comparacin con otros autores en tanque agitado y en discontinuo. Como puede observarse,
Shu y Yang (1 990) obtienen mejor rendimiento en xantano que el obtenido en dicho trabajo,
pero la concentracin del polisacrido obtenida por estos autores es apenas la mitad que la
obtenida por Santos (1 993), siendo un factor ms importante llegar a una concentracin de
xantano elevada. Slo Funahashi y col. (1 987) han obtenido la misma concentracin de
xantano, pero han necesitado un da ms de tiempo de fermentacin.
64
Introduccin
Desde que se comenz a estudiar la sntesis del xantano, su produccin se ha
llevado a cabo en reactores tipo tanque agitado, realizndose la operacin de forma
discontinua. Existen, desde entonces, una gran cantidad de trabajos que, incluso en la
actualidad, siguen llevando a cabo la fermentacin en las mismas condiciones de
operacin y tipo de reactor (Rogovin y col., 1 961 y 1 965; Moraine y Rogovin, 1 966, 1 971
y 1 973; Cadmus y col., 1 976 y 1 978; Souw y Demain, 1 979 y 1 980; Kennedy y col., 1 982;
Thonart y col., 1 985; Dussap y Gros, 1 985; Pinches y Pallent, 1 986; De Vuyst y col.,
1 987a y b; Funahashi y col., 1 987; Peters y col., 1 989; Shuy Yang, 1 990 y 1 991 ; Pons y
col., 1 990). A partir de los aos 70 comenzaron a realizarse estudios para llevar a cabo el
proceso en continuo (Silman y Rogovin, 1 970 y 1 972; Davidson, 1 978; Patton y Dugar,
1 981 ; Trilsbach y col., 1 984; Tait y col., 1 986; Lee y col., 1 989), aunque la produccin a
escala industrial se sigue realizando en operacin discontinua, ya que el problema es evitar
la contaminacin del cultivo con microorganismos indeseables (Kennedy y Bradshaw,
1 984) y la degeneracin de las cepas. En los ltimos aos, han comenzado a realizarse
trabajos en reactores diferentes al tanque agitado, como son columnas de burbujeo y
airlifts (Pons y col., 1 989 y 1 990; Zaidi y col., 1 991 ; Suh y col., 1 992), los cuales, segn
estos autores, presentan ventajas en algunos aspectos respecto a los de tanque agitado
mecnicamente, como menor stress hidrodinmico, aumento en la velocidad de
transferencia de materia y calor, mejores condiciones de mezcla y menores limitaciones en
el cambio de escala. Incluso se han empleado reactores prototipo, como es el T.O.R.U.S.
(Krebser y col., 1 988), llevndose a cabo el proceso, en todos los casos, de forma
discontinua. En trabajos previos (Santos, 1 993; Garca-Ochoa y col. , 1 997), se ha
empleado un tanque agitado en operacin en discontinuo. La Tabla 1 .6. muestra de forma
comparativa los resultados obtenidos por diferentes autores que llevan a cabo el proceso en
diferentes tipos de biorreactores, apareciendo tanto la concentracin de xantano alcanzada,
como el rendimiento del proceso y el tiempo en que se alcanza la concentracin que se
especifica.
65
!ntoduccon
Tabla 1 .5 .- Produccin de xantano y rendimientos obtenidos
t r a b a ja n d o e n t a n q u e a g i t a d o y a e r e a d o
p o r l o s d i f e r e n t e s a u t o r e s
Autores t(h) P(g/L)
Cadmus y col. (1 978) 46 72-96 1 4
Rogovinycol.(1 966) 67 96 1 5
Moraine y Rogovin (1 966) 70 96 1 5
Moraine y Rogovin (1 966) 73 40 1 4.6
Moraine y Rogovin (1 966) 75 96 29
Souw y Demain (1 980) 50 60 1 0.5
Pinches y Pallent (1 986) 76 45 7
DeVuystycol.(1 987) 75 1 44 27.9
Funahashi y col. (1 987) 96 30
90 1 8.5
52 1 9
50 1 3
Kennedy y col. (1 982)
Schweikart y Quinlan (1 989)
Santos (1 993)
P r o d u c c i n d e x a n t a n o y r e n d i m i e n t o s o b t e n i d o s e n d i f e r e n t e s t r a b a jo s
e n o p e r a c i n d i s c o n t i n u a y d i f e r e n t e s c l a s e d e b i o r r e a c t o r e s .
Autores Xp ~ t (h) Cp (g / L) F e r m e n t a d o r
Ponsycol., 1990
=9 80 1 2 Colunna de Burbujeo
65 50 3 Tanque agitado
Ponsycol.. 989 50 1 20 20 Columnadel3urbujeo
Zaidiy col, 1 991 Plugging jet
Suhycol.. 1 992
Kessler y col.. 1 993
Santos, 1 993
Fermentacin en dos etapas, primera
tiempo en las 49 h de fermentacin.
etapa 1 2 h en tanque agitado, no siendo considerado este
66
Tabla 1.6-
Introduccin
1 . 3 . 3 . - Transpone de Ox2eno
El estudio de la transferencia de oxigeno en la produccin de xantano es de suma
importancia debido a dos aspectos fundamentales. Por un lado, la bacteria que lleva a cabo
este proceso, esto es, Xanthomonas campestris es estrictamente aerobia, lo que quiere decir
que el microorganismo necesita para crecer y producir el biopolmero, el oxgeno; este
nutriente debe tomarlo de la fase lquida y debido a que su solubilidad en agua es muy
pequea, debe ser suministrado de forma continua al medio. Por otro parte, en la
produccin en discontinuo de xantano, la viscosidad del cultivo aumenta considerablemente
como consecuencia de la acumulacin del biopolmero, produciendo una significativa
disminucin de la transferencia de materia. En estas circunstancias, la velocidad de
transporte de oxgeno controla, o influye notablemente, la velocidad del proceso global; por
lo que el parmetro caracterstico de este transporte, el coeficiente volumtrico de
transferencia de materia, kLav, debe ser conocido.
Por otra parte, teniendo en cuenta que, para efectuar cambios de escala en
fermentaciones aerobias, uno de los criterios ms ampliamente utilizado es el de mantener
valores similares de la concentracin de oxgeno disuelto o su velocidad de transferencia, se
entiende que la determinacin de este parmetro sea de gran inters.
La importancia de la transferencia de materia gas-lquido en las biotransforrnaciones
aerobias donde la mxima concentracin de producto alcanzable est generalmente limitada
por la velocidad de transpone de oxigeno- hace que en los ltimos aos haya sido objeto de
numerosos trabajos (Yagi y Yoshida, 1 975; Figuciredo y Calderbank, 1 979; Nishikawa y col.,
1 981 a y b; Ogut y Hatch, 1 988; Poizat y col., 1 992; Nocentiol y col., 1 993; Roman y col.,
1 993; Pedersen y col., 1 994; Garca-Ochoa y Gmez, 1 998). Sin embargo, es escasa la
informacin que existe sobre la influencia de las variables de operacin en el coeficiente de
transporte y su prediccin, en los cultivos de elevada viscosidad (Margaritis y Zajie, 1 978;
Vashitz y col., 1 989; Suh y col., 1 992; Ivlerbst y col., 1 992; Gmez, 1 995). Sin duda, esta falta
de informacin en caldos con microorganismos se debe a que se supone que los datos
obtenidos con caldos simulados -donde los trabajos han sido ms extensos- son extrapolables
a la fermentacin en presencia de los microorganismos, sin tener los inconvenientes del
trabajo con microorganismos (Dussap y col., 1 985; Vlaev y Valeva, 1 990; Kawase y col.,
1 992).
67
Introduccin
Como ya se ha comentado, en los procesos de fermentacin aerobios es necesario
proporcionar al microorganismo la cantidad de oxigeno suficiente para que ste satisfaga
s u s r e q u e r i m i e n t o s m e t a b l i c o s . La u t i l i z a c i n d e l o s n u t r i e n t e s p o r p a r t e d e l o s
microorganismos, principalmente la oxidacin de la fuente de carbono y su posterior
transformacin en biomasa, productos y dixido de carbono slo es posible con el suficiente
aporte de oxgeno desde la fase gas. Cuando, en un biorreactor, u n c o m p o n e n t e p o c o s o l u b l e
como el oxgeno, debe ser transferido desde el gas aire- al medio liquido, donde se
encuentran los microorganismos, el balance de oxgeno puede expresarse como (Moo-Young
y Blanch, 1 987):
C L =kLaV (C
0 *3 0$
dt - q02 C~ [1 .60]
Siendo, el primer sumando a la derecha de la expresin, el trmino referido al transporte de
oxigeno y el segundo sumando, el referido al consumo del oxigeno por parte del
microorganismo.
Se han desarrollado un gran nmero de tcnicas experimentales de medida, con
distintas variantes, todas ellas aplicables dentro de un intervalo restringido de condiciones de
o p e r a c i n y q u e s e p u e d e n c l a s i f i c a r e n : t c n i c a s d e m e d i d a i n d i r e c t a y t c n i c a s d e m e d i d a
directa.
La s t c n i c a s d e m e d i d a i n d i r e c t a s o n a q u e l l a s q u e s e l l e v a n a c a b o e n s i s t e m a s d o n d e
no se est produciendo una biotransformacion. Los valores de kLa v o b t e n i d o s e n m e d i o s
artificiales que simulan los caldos de fermentacin se emplean, generalmente, para realizar
comparaciones entre diferentes biorreactores que operan en condiciones similares o en la
obtencin de correlaciones empricas que permitan estimar el coeficiente de transporte y poder
describir la transferencia de materia gas-lquido (Dussap y col., 1 985; Vlaev y Valeva, 1 990;
Yasukawa y col., 1 991 a; Leckie y col., 1 991 b; Garca-Ochoa y Gmez, 1 988).
E n e s t o s c a s o s , e n a u s e n c i a d e t r a n s f o r m a c i n m i c r o b i a n a , e l t r m i n o correspondiente
a l c o n s u m o d e o x i g e n o , q 0 , - C~, de l a e c u a c i n [1. 60 ] e s c e r o , r e s u l t a n d o l a s i g u i e n t e
ecuacin:
dC0, =kLaV.(CO C0) [1 .61 ]
dt
68
Introduccin
Los datos experimentales para la resolucin de esta ecuacin se pueden obtener
m e d i a n t e d i f e r e n t e s t c n i c a s o mtodos, que pueden ser clasificados en qumicos y fisicos. Los
mtodos qumicos, se basan en la medida de la concentracin de oxgeno disuelto a travs de
una reaccin qumica tal como la oxidacin del sulfito (Yoshida y col., 1 960; Dussap y col.,
1 985; Yang y coL, 1 992), la adsorcin de CO
2 (Danckwerts y Gillham, 1 966; Danckwerts,
19 70 ) o l a o x i d a c i n d e l a h i d r a c i n a (O n ke n y col., 1 985). Los mtodos fisicos utilizan la
r e s p u e s t a d e u n e l e c t r o d o d e o x g e n o , a l o s c a m b i o s e n l a c o n c e n t r a c i n d e e s t e g a s e n e l
medio, en condiciones no estacionarias o dinmicas. Este ltimo tipo de mtodo es el ms
a m p l i a m e n t e u t i l i z a d o y s e b a s a e n l a m e d i d a d e l a c o n c e n t r a c i n d e l o x g e n o d i s u e l t o d u r a n t e
la absorcin o desorcin de oxgeno de la disolucin (Dussap y col., 1 985; Costa y col., 1 982a
y 1 982b; Merchuk y col., 1 994; Arranz, 1 993; Gmez, 1 995, Garca-Ochoa y Gmez, 1 998).
Su aplicacin presenta ciertas restricciones que es necesario tener en cuenta para la obtencin
de valores correctos, como son la adecuada disposicin en el reactor del electrodo de medida
del oxgeno disuelto, el tiempo de respuesta y la linealidad del mismo (Nocentini y col., 1 993;
Merchuck y col., 1 994).
Las tcnicas de medida directa son aquellas en las que se determina la velocidad de
t r a n s f e r e n c i a d e m a t e r i a e n p r e s e n c i a d e m i c r o o r g a n i s m o s , e s d e c i r , e n l a f e r m e n t a c i n r e a l p o r
lo que el valor obtenido es ms representativo del sistema en estudio. La medida de la
variacin de la concentracin de oxgeno en el biorreactor puede realizarse en condiciones
estacionadas o no estacionarias o dinmicas.
La tcnica directa ms utilizada por su sencillez y relativa exactitud es la tcnica
dinmica (Dussap y Gros, 1 985; Yang y col., 1 988; Gao y Lee, 1 992; Rane y Sims, 1 994;
Gmez, 1 995). Este mtodo se basa en el balance de o x g e n o d i s u e l t o e n e l b i o r r e a c t o r ,
e x p r e s a d o e n l a e c u a c i n [1. 60 ], m i d i e n d o l a e v o l u c i n d e l a c o n c e n t r a c i n d e l o x g e n o
disuelto durante la interrupcin de la aireacin del caldo y su posterior aireacin. Si a su
vez, se mide la concentracin celular del medio de cultivo se puede determinar el consumo
especfico de microorganismo, qo2.
En la Figura 1 .1 3 se recoge, de forma esquemtica, las distintas fases de aplicacin
de este mtodo. En una primera fase, se suspende la aireacin del medio de cultivo,
registrando el decrecimiento de la concentracin del oxgeno disuelto con el tiempo, de
forma que la ecuacin [1 .60], en estas condiciones, se reduce a:
69
Introduccin
dc
0,
dt ~~1o. C\
Co
2 *
Co2
e
[1 .62]
Figura 1 .1 3.- Esquema de la tcnica dinmica (rgimen no estacionario) para la medida del
coeficiente de transferencia de materia.
Antes de que la concentracin de oxgeno disuelto alcance un valor crtico, se reanuda
la aireacin del medio de cultivo y se registra la variacin de la concentracin de oxigeno
disuelto con el tiempo. En estas condiciones, la ecuacin [1 .601 se puede expresar como:
de0 , =k,a~ .<Q, * 9, )dtq0 .9, dr
Teniendo en cuenta que, en el momento que se inicia la aireacin del caldo de
fermentacin, las condiciones iniciales son t t~ y C Cm, la ecuacin [1 .63] se puede
ntegrar, obtenindose la siguiente expresion:
[1 .63]
C ~ _ ______
02 02 k,a,
AIRE
ETENIDO
FASE 1 1
Ccrit 1 FASE 1
AIREACIN
*~c )
q0, 1-.
dt
t
70
Introduccion
q
0, C~ (t~lm)+(Co, ~Cm) kLaVIj (C0, *C02).dt [1 .64]
ecuacin, que una vez integrada, permite calcular el valor de kLav a partir de la variacin de
la concentracin de oxigeno con el tiempo, una vez conocido el valor del consumo del
microorganismo, q0 C,< , de la pendiente de la primera parte de la curva.
La transferencia de oxgeno en un biorreactor tipo tanque agitado -el ms
ampliamente utilizado en este tipo de procesos- es funcin de numerosas variables, tales
como las propiedades fisicas del lquido (viscosidad, tensin superficial, etc.), la geometra
del tanque y del agitador, el tipo de difusor empleado y las condiciones de operacin.
Este elevado nmero de variables hace que existan numerosas correlaciones empricas
para predecir el valor de kLaV que podemos clasificar en dos categoras. Unas tienen una
forma dimensional, correlacionando kLav con la velocidad de agitacin (o potencia por unidad
de volumen, la velocidad superficial del gas y, en caso de que el fluido sea no-Newtoniano,
con la viscosidad. Segn una expresin del tipo:
o bien, si se utiliza la potencia suministrada por el agitador:
Pi?
kLaV =C,V~(-) -p~ 1 1 .661
Los valores de las constantes, C1 y C2, y de los exponentes en ambos tipos de
ecuaciones cambian para los distintos autores, dependiendo, principalmente, de los
parmetros geomtricos del tanque. En la Tabla 1 .7 se presentan los valores de los
exponentes de cada una de las variables en algunas de las correlaciones propuestas en la
literatura.
La segunda categora, tiene una forma adimensional y expresan, generalmente, el
nmero de Sherwood como una funcin del nmero de Reynolds, Aireacin y Weber.
Sh C ReN) . NaX2 WC3 [1 .67]
Ambos tipos de ecuaciones, son nicamente aplicables, en un restringido intervalo de
las condiciones de operacin y son especficas de cada recipiente.
71
introduccin
Tabla 1.7.- Valores de los exponentes encontrados por distintos autores en correlaciones
dimensionales.
FLUIDO Autores N INI T
NEWTONIANOS
Ya gi y YosI,ida ( 975) 2,2 - 02 - -0.4 -
Rguciredo ~Ca lderba nk 1979) 0,6 08 .0 -
Nishka wa ycol. (1981) - 0,8 0.3 - - -
Moo-Young y Bla nch ([987) - 0,4 0.r - -
Ogu y F-la tch < 988) 0,9 - 0.7 0,5 - -
Poiza l yco. ( 992) 2,7 - 0.6 - -
Nocent n y col. ( 993) - 0,6 04 - - 2 -
koma i,y col. (1993) 0.5 0.4 0.5
L nek y col (19944 - 0,7 0.4 -
Pedersen y col. (1994) 2.0 - 0.5 -
NO NEWTONIANOS
N,shka wa y col. (1981) 2,4 0,8 0.3 -2.5 -0,5 -
Costa y col ( 982> 2,0 0.4 2,5 -0,4 -
Dtissa p y col. < 985) 1,5 - 0.5~ - -0, -
bock y Va cek (1988) - 0,9 0.4 - - -
Ogiit y Ha tch (1988) 0,5 - 0.5 0,1 -0.4 -
- 0,02 0,9 - -0,6 -
Linek y col (1991) - 1,1 0.4 - -
Pedersen el a l. (1994) 2,7 - 0.6 - - -
Ga rcia --Ochoa y Gmez. (1998)
Ga rca -Ochoa y Gmez ( 998)
2,0 - 0.67 - -0,67 -1,0
- 0.6 0.67 - -0,67 -1,0
En un trabajo previo, llevado a cabo por este equipo de investigacin, se realiz un
amplio estudio de la transferencia de oxgeno en este proceso, determinndose kla tanto en
disoluciones de xantano como en caldos de fermentacin, durante la biotransformacin, en un
amplio intervalo de condiciones de operacin y geometras de tanque (Gmez, 1 995). En
ambos casos, se emple una tcnica dinmica.
En el caso de disoluciones de xantano y para un biorreactor de 25 litros, cuando la
r e o l o g a s e d e s c r i b e m e d i a n t e e l m o d e l o de Ostwald-de Waele, se obtuvo la siguiente
ecuacion:
72
Introduccin
[1 . 68]
y para uno de 2 litros:
kLaI, =c, y
72 N1 u~E 3 [1 .69]
El exponente de la viscosidad cambia cuando la viscosidad se describe mediante el
m o d e l o r e o l g i c o de Casson, tomando un valor de 1 .
Los valores obtenidos son acordes con los propuestos en la bibliografia. En la Figura
1 .1 4 se comparan los valores obtenidos a partir de la ecuacin [1 .69] con las correlaciones
propuestas por otros autores para sistemas anlogos y en el mismo mtervalo de condiciones de
operacin. En la misma se observa, que l o s v a l o r e s o b t e n i d o s p o r O g u t y Hatch (1 988) son
significativamente superiores al resto de los trabajos, siendo las diferencias tanto ms
significativas cuanto menor es la velocidad de agitacin. La presencia de electrlitos y la
aplicacin de una tcnica poco adecuada (el mtodo qumico del sulfito) que proporciona
valores muy superiores, no comparables a los obtenidos mediante mtodos fisicos. Las
d i f e r e n c i a s o b t e n i d a s p o r o t r o s a u t o r e s y l a s c a l c u l a d a s c o n l a e c u a c i n [1. 69 ] s e e x p l i c a n p o r
e l e f e c t o d e l o s p a r m e t r o s g e o m t r i c o s s o b r e e l c o e f i c i e n t e d e t r a n s p o r t e e n e l b i o r r e a c t o r
usado en el estudio (altura, tipo de agitador, tipo de difusor, etc.) y las propiedades fisicas del
fluido.
Asimismo, en presencia del microorganismo Xanthomonas campestris, la correlacin
entre las variables de operacin que influyen en el sistema y el coeficiente d e t r a n s p o r t e , e n u n
biorreactor de 2 litros es:
kLak. = 3 ,O8.1O~ . . N 75 p3 9 [1 .70]
Como puede observarse, la influencia, sobre el coeficiente v o l u m t r i c o d e
transferencia de materia, de la velocidad superficial del gas es similar; mientras que la
velocidad de agitacin es mayor y la influencia de la viscosidad aparente, menor. As
mismo, los resultados experimentales obtenidos muestran que los valores del coeficiente de
t r a n s p o r t e s o n s u p e r i o r e s e n p r e s e n c i a d e m i c r o o r g a n i s m o q u e c u a n d o s e r e a l i z a e n
a u s e n c i a d e t r a n s f o r m a c i n m i c r o b i a n a . P o r e l l o , e n e l r e s t o d e l t r a b a jo s e u t i l i z a r e s t a
ltima ecuacin para la determinacin del coeficiente de transporte, en su aplicacin a los
modelos cinticos.
73
Introduccin
2 4 6 8
N (r.p.s.)
0,1
~iz 0.01
.2
0.001
1 0
Figura 1 .1 4.- Prediccin de diferentes correlaciones adimensionales para valores de kLav
o b t e n i d o s p o r d i f e r e n t e s a u t o r e s . Vs O , 0 0 2 m i s ; g ~ > -
t ~ 8 . 1 o3 a 30.1 0 Pas.
1. 3 . 4. - A i s l a m i e n t o y P u r i f i c a c i n
Un a v e z o b t e n i d o e l x a n t a n o , q u e d a b a s t a n t e d i l u i d o e n e l c a l d o d e f e r m e n t a c i n , y
se encuentra mezclado con una gran variedad de otros compuestos componentes del medio
utilizado que no ha empleado el microorganismo (sales y nutrientes), las propias clulas,
etc.-. La composicin media de un caldo resultante de una fermentacin para realizar la
p r o d u c c i n d e x a n t a n o e s , a p r o x i m a d a m e n t e , la siguiente de: 1 a 4% de xantano, de 0,2 a
O,50o de clulas y de 0,1 a 1% d e s a l e s y a z c a r e s n o c o n s u m i d o s . A d e m s , d e b i d o a l a
p r e s e n c i a d e x a n t a n o , e l m e d i o e s m u y v i s c o s o , u n o s 10 0 Kg / m s . P o r t o d o e l l o , l a
recuperacin del xantano del caldo de fermentacin no es sencilla, ya que se debe de
74
0,0001
Introduccin
eliminar cerca del 95% del caldo. Para conseguir este fin se pueden emplear tanto mtodos
f i s i c o s c o m o q u m i c o s (Ke n n e d y y B r a d s h a w, 19 8 4) , d e n t r o d e l o s q u e s e e n c u e n t r a n :
Tratamientos preliminares, enfocados a la degradacin y eliminacin de las
clulas.
Precipitacin del polisacrido.
Etapas finales, como son lavado, secado, molienda y empaquetado.
E n l a l i t e r a t u r a s e h a n p r o p u e s t o y e m p l e a d o d i f e r e n t e s t c n i c a s p a r a l l e v a r a c a b o
este proceso. As, los tratamientos preliminares empleados son de naturaleza trmica
(Smith, 1 983; lnkson y Wilkinson, 1 981 ), qumica (Jnkson y Wilkinson, 1 981 ; Patton y
Holman, 1 968) y/o fisica (Patton y Holman, 1 968; Bouniot, 1 976; Towle, 1 977; Inkson y
Wi l ki n s o n , 19 8 1) .
En cuanto a la etapa de precipitacin, sta se puede llevar a cabo disminuyendo la
solubilidad de la goma por adicin de alcoholes o cetonas de bajo peso molecular, tales
como metanol (Smith, 1 983), etanol e isopropanol (Smith, 1 983; Inkson,1 979; Bouinot,
19 76) , t -b u t a n o l (B o u i n o t , 19 76) , a c e t o n a (S m i t h , 19 8 3 ) , e t c . E n la mayora de los trabajos,
el disolvente empleado es isopropanol (Smith, 1 983; Inkson y Wilkinson, 1 981 ; Bouinot,
1 976), en cantidades referidas a volumen de caldo entre 1 ,8:1 y 2,5:1 (y IPA/v caldo).
O t r o s a u t o r e s (P a t t o n y Ho l m a n . , 19 68 ; P a c e y R i g h e l a t o , 19 8 1; A l b r e t c h y c o l ,
1 964; Kenedy y col., 1 981 ) han propuesto la adicin de cationes polivalentes a las
s o l u c i o n e s d e x a n t a n o , r e a l i z n d o s e l a p r e c i p i t a c i n d e l x a n t a n o d e b i d o a l c a r c t e r
polelectrolitico del polisacrido. Se puede realizar la precipitacin por la adicin de sales
de calcio (Patton y Holman, 1 968; Macneely y OConell, 1 966) a pH bsico (entre 8,5 y 1 2)
o por sales de aluminio (Albretch y col., 1 962 a pH cido (entre 4 y 4,5). De este modo se
o b t i e n e u n a s a l d e x a n t a n o i n s o l u b l e , q u e d e b e d e s e r t r a n s f o r m a d o e n u n c o m p u e s t o
soluble, en forma de sal sdica o potsica, para su empleo comercial.
75
Introduccin
Otra posibilidad es el empleo combinado de ambos efectos (debido al disolvente y a
la presencia de cationes en la disolucin). Smith (1 983) seal la posibilidad de aadir al
caldo sales de calcio, magnesio y cinc- as como isopropanol, disminuyendo en gran
m a n e r a l a c a n t i d a d d e d i s o l v e n t e n e c e s a r i a p a r a l l e v a r a c a b o l a p r e c i p i t a c i n . E l e m p l e o d e
sales polivalentes se debe a que, cuanto mayor es la carga del catin empleado, menor es el
v o l u m e n n e c e s a r i o d e d i s o l v e n t e p a r a c o n s e g u i r l a p r e c i p i t a c i n d e l a m i s m a c a n t i d a d d e
xantano (ver Figura 1 .1 5).
Las etapas finales empleadas dependen de las propiedades comerciales y los usos a
los que se vaya a dedicar el xantano purificado.
Fernndez (1 992) propuso un mtodo para realizar el citado proceso de aislamiento y
purificacin del xantano, dentro de las especificaciones exigidas para su comercializacin.
Este procedimiento consiste en diluir el caldo de fermentacin con alcohol. La adicin del
alcohol cumple una doble misin, por un lado la dilucin de los caldos, provocando una
notable disminucin en su viscosidad, y por otro actuar como un biocida, destruyendo la
actividad bacteriana, as como, en muchos casos, su pared celular. Una vez diluidos, los
c a l d o s s e f i l t r a n , s e p a r a n d o a s l a s c l u l a s d e l m e d i o .
El xantano se separa del medio por precipitacin al adicionar ms cantidad de
a l c o h o l o a l c o h o l y s a l e s , s i e n d o e l a l c o h o l i s o p r o p l i c o e l m s a d e c u a d o y a q u e g e n e r a b a u n
menor coste en disolventes, pues aunque cantidades similares de acetona produce la misma
s e p a r a c i n , t a n t o p o r l a c a n t i d a d r e q u e r i d a c o m o , s o b r e t o d o , p o r s u m e n o r t o x i c i d a d , e s
preferible el empleo de IPA, como puede apreciarse en la Figura 1 .1 5. Adems, este
comportamiento es bastante parecido a distintas concentraciones de xantano en disolucin.
La a d i c i n d e s a l e s a l m e d i o h a c e r e d u c i r n o t a b l e m e n t e l a c a n t i d a d d e alcohol
n e c e s a r i a p a r a l a p r e c i p i t a c i n d e l x a n t a n o , a u n q u e h a y u n a g r a n d i f e r e n c i a e n t r e u t i l i z a r
sales monovalentes, divalentes o trivalentes, cuanto mayor es la carga del catin, menor es
la cantidad de alcohol necesaria para obtener La precipitacin del xantano (Figura 1 .1 5> . El
aumento de la concentracin de sales en el medio reduce, tambin, la cantidad de alcohol
necesaria para la precipitacin (Garca-Ochoa y col., 1 993). En la Figura 1 .1 6 se observa la
influencia de la concentracin de sales empleada sobre el volumen de P A n e c e s a r i o p a r a l a
precipitacin del xantano. Las sales de cationes monovalentes pueden ser las elegidas para
76
Introduccin
realizar el proceso, ya que evitan la etapa posterior de conseguir que la sal de xantano
insoluble, obtenida en el caso de emplear sales de cationes polivalentes sea transformada en
soluble por cambio del catin.
Cu a n d o e l x a n t a n o e s s e p a r a d o d e l c a l d o s e l e s o m e t e a sucesivos lavados con
alcohol o con diversas mezclas alcohol-agua. De esta forma se eliminan las sales que haya
podido arrastrar en el proceso, tratando de evitar la redisolucin de parte del xantano.
6
2
o
Figura 1 .1 5.- Utilizacin de diferentes agentes para la precipitacin del xantano.
77
Introd cc n
a>
y
Figura 1 .1 6.- Influencia de la adicin de sales sobre un volumen de WA para
la precipitacin total de xantano
1 .3.5.- Proniedades del Xantano
Las propiedades y caracteristicas exigidas al xantano, que deben cumplir las
especificaciones comerciales son las siguientes:
- Contenido en cenizas y humedad.
- Contenido en nitrgeno, acetato y piruvato.
- Vi s c o s i d a d (c o m o i n d i c a c i n d e l p e s o m o l e c u l a r ) y c o m p o r t a m i e n t o r e o l g i c o .
De b i d o a q u e l a p r o p i e d a d m s c a r a c t e r s t i c a d e l x a n t a n o e s l a e l e v a d a v i s c o s i d a d
en disoluciones acuosas se han realizado diversos estudios de esta propiedad. En un trabajo
previo (Casas, 1 991 ), se estudi el comportamiento reolgico empleando un viscosmetro de
cilindros concntricos, marca Brookfield, modelo LVT-Sinchrolectric, ampliamente
e m p l e a d o e n l a i n d u s t r i a y e n l a l i t e r a t u r a p a r a d e t e r m i n a r l a v i s c o s i d a d d e los caldos de
78
(~0 o a6 1,0
Introduccin
fermentacin. La naturaleza polielectrolitica del xantano obliga a estabilizar su
c o n f o r m a c i n e n d i s o l u c i n , p o r a d i c i n de pequeas cantidades de sal (generalmente
NaC), siendo esta la nica forma de obtener resultados reproducibles y evitar as posibles
comportamientos tixotrpicos o de agregacin de molculas.
Las disoluciones de xantano presentan un comportamiento claramente
pseudoplstico, aumentando extraordinariamente la viscosidad al aumentar la concentracin
en disolucin, como se aprecia en la Figura 1 .1 7. La viscosidad se ve poco afectada, pero
disminuye algo, al aumentar la temperatura de medida, como pone de manifiesto la Figura
1 .1 8, y varia de una forma poco habitual con el cambio de la tertiperatura de disolucin,
segn se aprecia en la Figura 1 .1 9. Esta extraa influencia de la temperatura de disolucin
en la viscosidad se debe a un cambio en la conformacin de la molcula de xantano en
disolucin, lo que se denomina estructura terciaria. La conformacin que adquiere el
xantano depende de la temperatura a la que se realiza la solubilizacin, pudiendo adquirir
una conformacin ordenada (doble hlice, a temperaturas de disolucin comprendidas entre
25 y 4fl0 C) o una conformacin desordenada (de ovillo, para temperaturas de disolucin
ms elevadas, 60~80O C). El cambio conformacional se observ por medidas tanto de
rotacin ptica como de dicroismo circular. Este cambio en la molcula de xantano en
disolucin no fue relacionado claramente con la variacin de la viscosidad, y se estableci
claramente la diferencia entre la variacin de la temperatura de disolucin y la de medida,
aunque en otros trabajos no se indica si el cambio conformacional se produce con una
variacin de la temperatura de medida o a la que se utiliza-, siendo independiente de la
temperatura a la que la molcula se ha disuelto.
En el trabajo previo citado se determin la viscosidad de las disoluciones de xantano,
e n d i s t i n t a s c o n d i c i o n e s d e c o n c e n t r a c i n d e x a n t a n o , t e m p e r a t u r a d e d i s o l u c i n y
temperatura de medida, y se ha correlacionando utilizando distintos modelos, como los que
a p a r e c e n e n l a Ta b l a 1. 10 . Lo s c i t a d o s m o d e l o s r e p r o d u c a n d e forma satisfactoria los
resultados experimentales que obtuvieron los autores. Aunque todos ajustaban bien los datos
experimentales parece observarse una menor dispersin en la reproduccin de datos al
u t i l i z a r e l m o d e l o d e Ca s s o n ; e s t a d i f e r e n c i a e s m s notoria cuanto mayores sean los valores
de viscosidad. En el ajuste con el modelo de Horschel-Bulkley se obtienen valores para te
(esfuerzo cortante aparente) muy prximos a cero, lo que hace que este modelo se reduzca
al de Ostwald- de Waele.
79
Introduccin
Ta b l a 1. 10 . - M o d e l o s r e o l g i c o s p a r a d i s o l u c i o n e s a c u o s a s d e x a n t a n o .
MODELO FUNCION
Ostwald- de Waele y = k y
tYp
0 = 1< yfl~I)
Casson 2 ~ + k0 .~< 2
Horschel-Bulkley ~- = +
E
2
11
lo-;
2
lo
roo
1
lo
-2
lo
Figura 1 .1 6.- Comportamiento pseudoplstico de las disoluciones de xantano.
Influencia de la concentracin del polisacrido.
80
io~ 1 02
4-y ls-)
102
Introduccin
u
o
s
3
o
TMUC)
20 26080
e TM(C)
F g u r a 1. 17. - I n f l u e n c i a d e l a t e m p e r a t u r a d e m e d i d a e n l a v i s c o s i d a d d e d i s o l u c i o n e s d e
xantano.
1 1
Key C,(><
a
o 1 5
o
<A
E
o
2
l o
3
o
T
0 60C
Y 7.92r
1 1

25
0C
y 792s -
r
20 ~C 60 80
8]
Jniroduccz< vn

Figura 1.18.- Cambio conformacional en la molcula de xantano. Variacin de la

v i s c o s i d a d , n g u l o d e r o t a c i n p t i c a y d i c r o i s m o c i r c u l a r c o n l a
temperatura de disolucin
La reologa del xantano cambia con la naturaleza del polmero, es decir, depende de
su peso molecular y del nivel de acetilacin de la molcula (Tako y Nakamura, 1 984) y del
grado de piruvatizacin (Peters y col., 1 993; Kang y Pettit, 1 993). Estos niveles en el
c o n t e n i d o d e a c e t a t o y p i r u v a t o v a r a n c o n l a s c o n d i c i o n e s e n l a s q u e c r e c e l a b a c t e r i a
(S o u w y De m a i n , 19 79 ; Ca d m u s y c o l . , 19 78 ; De Vu y s t y c o l . , 19 8 7) , c o n l a s c o n d i c i o n e s
82
(Kg/ms>
SO
1,rc
Introduccin
d e o p e r a c i n (Tr i l s b a c h y c o l . , 19 8 4; P e t e r s y c o l . , 19 9 3 ) y c o n l a e s p e c i e d e Xanthonionas
sp empleada (Cadmus y c o l . , 19 76; Ke n n e d y y B r a d s h a w, 19 8 4; Ta i t y c o l . , 19 8 6) .
Un xantano con un nivel alto de acetato y, especialmente, de piruvato, aumenta la
viscosidad de las disoluciones acuosas al favorecer las asociaciones intermoleculares (Tako
y Nakamura, 1 984).
Existen numerosos trabajos que abordan el estudio de las condiciones de operacin
en la estructura y peso molecular. La variable ms estudiada, es la influencia de las
propiedades sobre el grado de piruvatizacin, debido a que esta variable es indicativa de la
calidad del polisacrido (Cadmus y col., 1 978).
En cuanto a la influencia de la temperatura, algunos autores (Cadmus y col.,
1 978; Shu y Yang, 1 990) han observado la influencia de esta variable en el grado de
piruvatizacin, llegando a obtener el mximo contenido en piruvato cuando el proceso se
realizaba a 27
0C. En el trabajo realizado por Casas y col. (1 999), se observ que el
contenido en piruvato no variaba con la temperatura de produccin, pero el contenido en
acetato del xantano obtenido, a bajas temperaturas 25 y 280 C era mayor que el contenido a
temperaturas ms altas. En cuanto al peso molecular del xantano, este es mayor a medida
que disminuye la temperatura. Concluyeron que la concentracin de producto obtenida era
mayor cuando la temperatura de operacin era de 280 C. Para un intervalo de temperatura
entre 25 y 34 0C, la viscosidad de las disoluciones de xantano es mayor cuanto menor es la
temperatura de produccin. Los parmetros de los modelos de Ostwald-de Waele y de
Casson- indice de consistencia (K) y esfuerzo cortante aparente (to)- aumentan a medida
que disminuye la temperatura del proceso de fermentacin.
La composicin del medio de produccin tambin influye en la estructura
molecular del xantano. Este aspecto ha sido estudiado teniendo en cuenta varios nutrientes,
pero la mayora de los trabajos se centran en el estudio de la fuente de nitrgeno. Hay
autores que encuentran un mayor grado de piruvatizacin cuando la fuente de nitrgeno
empleada es de naturaleza orgnica (Qadeer y Baig, 1 989; Kennedy y col., 1 982), pero
Cadmus y col (1 978) concluyen que la mejor frente de nitrgeno para conseguir un xantano
con alto contenido en piruvato es (NH~)
2HPO4. Sin embargo, De Vuyst y col., (1 987)
observaron una influencia inversa del in (PO3)
3~ y el grado de piruvatizacin. Kennedy y
83
Introduccin
col. (1982) encontraron un incremento en e l c o n t e n i d o e n p i r u v a t o c u a n d o l a c o n c e n t r a c i n
d e n i t r g e n o e n e l m e d i o s e a u m e n t a b a , p e r o Da v i d s o n y c o l . (19 78 ) o b t u v i e r o n m a y o r
p i r u v a t i z a c i n y m e n o r c o n t e n i d o e n a c e t a t o c u a n d o l a f u e n t e n i t r o g e n a d a e r a e l n u t r i e n t e
l i m i t a n t e . Tr i l s b a c h y c o l . (19 8 4) n o e n c o n t r a r o n r e l a c i n e n t r e e l c o n t e n i d o e n p i r u v a t o d e
la molcula y la composicin del medio. Posteriormente, Casas y col. (1 999), tambin
e s t u d i a r o n l a i n f l u e n c i a d e e s t a v a r i a b l e s o b r e l a s p r o p i e d a d e s d e l a m o l c u l a . A s , e n e l
trabajo realizado se muestra que la concentracin de nitrgeno no afecta al contenido en
p i r u v a t o y a c e t a t o n i a l p e s o m o l e c u l a r d e l p o l m e r o . A d e m s e n s u e s t u d i o s e o b s e r v LLfl
mximo d e p r o d u c c i n d e x a n t a n o , c o i n c i d e n t e c o n l a concentracin de amonio optimizada
por Santos (1 993), por debajo o por encima de esta concentracin (0,257 g/L de amonio) la
concentracin de xantano es menor. En lo referente a la viscosidad de las disoluciones de
xantano. se observ que es mayor cuanto menor es la concentracin de sustrato nitrogenado
empleado en el medio de produccin.
La influencia de la concentracin de oxgeno disuelto h a s i d o e s t u d i a d a , s o b r e
t o d o e n e l c o n t e n i d o e n p i r u v a t o (Ca d m u s y c o l . , 19 78 ) y e n e l p e s o m o l e c u l a r (S u h y c o l . ,
19 8 7; P e t e r s y c o l . , 19 8 9 ) . Ca d m u s y c o l (19 78 ) e s t u d i a r o n e l g r a d o d e p i r u v a t i z a c i n
c u a n d o e l p r o c e s o s e l l e v a b a a c a b o c o n d i f e r e n t e s c a u d a l e s , n o e n c o n t r a n d o d i f e r e n c i a s
s i g n i f i c a t i v a s e n t r e c a u d a l e s d e 0 , 75 h a s t a 1, 5 L/ L/ m i n . P e t e r s y c o l . (19 8 9 ) e s t u d i a r o n l a
i n f l u e n c i a d e l o x i g e n o d i s u e l t o s o b r e e l p e s o m o l e c u l a r (c a m b i a n d o l a v e l o c i d a d d e
a g i t a c i n y e m p l e a n d o a i r e e n r i q u e c i d o ) , o b s e r v a r o n q u e e l p e s o m o l e c u l a r d e l x a n t a n o
a u m e n t a b a c u a n d o n o e x i s t a n l i m i t a c i o n e s d e l o x g e n o d u r a n t e e l p r o c e s o . E s t a i n f l u e n c i a
tambin ha sido observada por Casas y col (1 999) que han llevado a cabo el estudio de la
i n f l u e n c i a d e l o x g e n o d i s u e l t o , v a r i a n d o l a v e l o c i d a d d e a g i t a c i n e n e l b i o r r e a c t o r ,
o b s e r v a n d o q u e l a i n f l u e n c i a d e e s t a v a r i a b l e s e v e r e f l e ja d a e n l a m a y o r p r o d u c c i n
o b t e n i d a c o n e l a u m e n t o d e l a c o n c e n t r a c i n d e o x g e n o d i s u e l t o e n e l b i o r r e a c t o r . Cu a n t o
m a y o r e s l a c o n c e n t r a c i n d e o x g e n o d i s u e l t o , m a y o r e s l a v i s c o s i d a d d e l o s c a l d o s d e
f e r m e n t a c i n . E l c o n t e n i d o e n p i r u v a t o e s i n d e p e n d i e n t e d e l a c a n t i d a d d e o x g e n o d i s u e l t o
e n e l m e d i o , s i n e m b a r g o , s e o b t i e n e u n m a y o r g r a d o d e a c e t i l a c i n c u a n d o l a p r o d u c c i n s e
r e a l i z a c o n u n a a g i t a c i n e l e v a d a (50 0 r . p . m . ) ; p o r o t r o l a d o , e n c u a n t o a l p e s o m o l e c u l a r , l a
l i m i t a c i n d e o x g e n o d i s u e l t o d a l u g a r a p o l i s a c r i d o s d e m e n o r p e s o m o l e c u l a r .
84
2. - PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Procedimiento Experimental
2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El trabajo descrito en esta Memoria ha precisado de la utilizacin y puesta a punto de
d i v e r s a s t c n i c a s , t a n t o d e e x p e r i m e n t a c i n c o m o d e a n l i s i s ; a c o n t i n u a c i n s e d e t a l l a n c a d a
una de ellas, as como los equipos y el materia] que ha sido empleado.
2.1.- EQUIPOS
En este apanado se describen los numerosos equipos e instalaciones necesarios para
llevar a cabo la experimentacin realizada en este trabajo.
Para obtener los datos experimentales necesarios para modelizar la produccin de
x a n t a n o s e h a n r e a l i z a d o e x p e r i m e n t o s e n u n b i o r r e a c t o r c o m e r c i a l , e m p l e a n d o u n a i n c u b a d o r a
o r b i t a l p a r a l a p r e p a r a c i n d e l o s i n c u l o s . A d e m s d e estos equipos, ha sido necesaria la
u t i l i z a c i n d e o t r o s p a r a c o n s e g u i r l a e s t e r i l i d a d d e l o s m e d i o s y l a s t e m p e r a t u r a s p r o g r a m a d a s
en el mantenimiento y crecimiento del microorganismo. Tambin ha sido necesario utilizar y
disponer de un buen nmero de aparatos de medida para analizar la evolucin de los diferentes
componentes del proceso objeto de estudio.
85
Procedirnieu/o Experimental
A continuacin se dan las caracteristicas principales de los equipos empleados:
FERMENTADOR COMERCIAL
El proceso de fermentacin con microorganismos se ha llevado a cabo en un
b i o r r e a c t o r B I O S TA T M d e t i p o t a n q u e a g i t a d o , d i s e a d o y c o m e r c i a l i z a d o p o r B R A UN. E s t
c o n s t i t u i d o p o r u n t a n q u e d e c u l t i v o d e 2 L d e c a p a c i d a d y c o n l o s s i s t e m a s d e m e d i d a , c o n t r o l
y r e g u l a c i n d e p H, o x g e n o d i s u e l t o , t e m p e r a t u r a y v e l o c i d a d d e a g i t a c i n , d e a c u e r d o a u n
d i s e o m o d u l a r e i n s e r t a d o s e n u n a c a b i n a m e t l i c a . E n l a F i g u r a 2. 1 s e m u e s t r a u n e s q u e m a
d e l b i o r r e a c t o r e m p l e a d o , q u e c o n s t a d e l o s s i g u i e n t e s e l e m e n t o s :
Reactor: est construido en borosilicato con un volumen total de 2 L y un volumen de
t r a b a jo d e 1, 5 L. La v a s i ja e s t c o n s t i t u i d a p o r u n a d o b l e p a r e d d e v i d r i o q u e s e
e n c u e n t r a c u b i e r t a p o r u n a c a p a d e a c e r o i n o x i d a b l e c o n t r e s o r i f i c i o s d e 19 m m d e
d i m e t r o y s i e t e o r i f i c i o s d e 6 m m d e d i m e t r o , u n i d a s m e d i a n t e u n a n i l l o d e a c e r o
i n o x i d a b l e , q u e s e d e t a l l a e n l a F i g u r a 2. 2.
Sistema de Medida y Control de Temperawra: e l f e n n e n t a d o r B I O S TA T M l l e v a u n
c o n t r o l a d o r P I D, c o n u n a l t o g r a d o d e e f i c a c i a . La t e m p e r a t u r a d e l m e d i o d e c u l t i v o e s
m e d i d a m e d i a n t e u n s e n s o r d e t e m p e r a t u r a P t -l O 0 , a l a v e z q u e u n s e g u n d o s e n s o r
m i d e l a t e m p e r a t u r a d e l f l u i d o c a l e f a c t o r q u e c i r c u l a a t r a v s d e l a c a m i s a d e l r e a c t o r .
A m b a s s e a l e s s o n l l e v a d a s a l r e g u l a d o r d e t e m p e r a t u r a q u e o p e r a s o b r e e l s i s t e m a
m e d i a n t e u n a r e s i s t e n c i a d e 50 0 W (F i g u r a 2. 3 ) . La t e m p e r a t u r a d e o p e r a c i n e s
seleccionada y ajustada mediante un indicador digital, con una sensibilidad de 0,1 0 C.
Sistema de azitacMn y aireacin: la unidad de agitacin est formada por un motor de
70W de potencia mxima, que ejerce su accin sobre una varlla de acero inoxidable,
sobre la que se encuentran dos agitadores de turbina de cuatro palas rectas. Este
s i s t e m a g a r a n t i z a u n a v e l o c i d a d d e a g i t a c i n a d e c u a d a e n p r o c e s o s e n l o s q u e s e l l e g a a
alcanzar una elevada viscosidad en el caldo.
La velocidad de agitacin es medida por un tacmetro, ajustable entre O y 1 990 r.p.m.,
c o n u n a r e s o l u c i n d e 10 r . p . m . E l v a l o r f i ja d o s e p r e s e n t a e n u n i n d i c a d o r d i g i t a l y e s
regulado mediante un controlador PI.
86
Procedimiento Experimental
La a i r e a c i n d e l c a l d o s e c o n s i g u e s u m i n i s t r a n d o a i r e m e d i a n t e u n c o m p r e s o r ,
f i l t r n d o s e a t r a v s d e u n f i l t r o q u e p o s e e u n a m e m b r a n a d e 0 , 2 ~ m , p a r a c o n s e g u i r l a
esterilizacin del aire que se introduce en el reactor. El aire se distribuye en el interior
m e d i a n t e u n d i f u s o r t o r o i d a l . E l c a u d a l d e a i r e e s a ju s t a d o m e d i a n t e u n a v l v u l a y
medido por un rotmetro.
Sistema de medida y control de oxgeno disuelto: La medida del oxgeno disuelto es
r e a l i z a d a e m p l e a n d o u n e l e c t r o d o e s t e r i l i z a b l e , f a b r i c a d o p o r I I NGO LD. E s t e e l e c t r o d o
f u n c i o n a m e d i a n t e e l p r i n c i p i o d e p o l a r i z a c i n y c o n s t a d e u n n o d o d e p l a t a y c t o d o
de platino separados de la disolucin a medir por una membrana de tefln.
La seal de medida es amplificada y convenida en una seal digital. La concentracin
d e o x g e n o d i s u e l t o p u e d e s e r c o n t r o l a d a m e d i a n t e l a a c c i n s o b r e e l c a u d a l d e a i r e o
b i e n m e d i a n t e l a v e l o c i d a d d e a g i t a c i n . E n l a F i g u r a 2. 4 s e p r e s e n t a u n e s q u e m a d e l
s i s t e m a d e c o n t r o l d e o x i g e n o d i s u e l t o .
Sistema de medida y con trol de oH: El pH del medio de cultivo es analizado en lnea
m e d i a n t e u n e l e c t r o d o e s t e r i l i z a b l e f a b r i c a d o p o r I NGO LD. O p e r a e n u n r a n g o d e
m e d i d a d e 2 a 12 u n i d a d e s d e p H, d i s p o n i e n d o d e u n a c o m p e n s a c i n m a n u a l o
automtica de temperatura. La seal de medida, previamente amplificada, es
alimentada a un controlador de tipo PI. Una vez fijado el valor de pH al que se desea
t r a b a ja r e s m a n t e n i d o p o r l a a c c i n d e l c o n t r o l a d o r s o b r e s e n d a s b o m b a s d e
a l i m e n t a c i n d e l c a l i o c i d o , c o m o s e m u e s t r a e n l a F i g u r a 2. 5.
Sistema de medida y control de Espuma: la aparicin de e x c e s i v a e s p u m a e s c o m b a t i d a
m e d i a n t e l a i n t r o d u c c i n d e u n c o m p u e s t o a n t i e s p u m a n t e . P a r a l a d e t e c c i n d e e s p u m a
s e u t i l i z a u n s i m p l e s e n s o r d e c o n t a c t o , d o n d e l a p a r t e m e t l i c a d e l r e a c t o r a c t a c o m o
t i e r r a . La s e a l d e s a l i d a d e l s e n s o r e s e n v i a d a a l m d u l o d e c o n t r o l d e e s p u m a q u e
acta sobre la bomba de dosificacin de antiespuniante. El tiempo de respuesta del
c o n t r o l a d o r p u e d e s e r a ju s t a d o m e d i a n t e u n p o t e n c i m e t r o . E n l a F i g u r a 2. 6 s e m u e s t r a
un esquema del sistema de medida y control de espuma.
87
P-ocedinienw Experimental
Figura 2.1.- Esquema del Fermentador Braun modelo BIOSTAT M.
Fermernador comercial de 2 1 .
88
Procedimiento Experimental
Figura 2.2.- Alzado de la vasija de fermentacin.
89
Poced niien o Experimental
Figura 2.3.- Esquema del sistema de medida y control de temperatura.
SE AL CONTROLADOR DE
CONSIGNA TENFERATURA
SALIDA DE AGIlA
90
Procedimiento Experimental
Figura 2.4.- Esquema del sistema de medida y control de oxgeno disuelto.
F~LTR O
AIR E
RO! AMETR O
AIR E
AMPLIFICADOR
DE S E AL
COUTR OLADOR
ELECTR ODO ~.~J~jjjjjj-- 1 S E AL
CONS IGNA
DE Di
---e- WQR OLAOOR
OC V ELOCIDAD
9
Procedimiento Evpcrirnental
Figura 2.5.- Esquema del sistema de medida y control del pH.
92
Procedimiento Experimental
Figura 2.6.- Esquema del sistemade control y medida de espuma.
~--2
CONTROLADOR
1
TIEMPO GE
DOSIFICACION
D UR A O O N
DOS IP O AGIO N
SUSTANGIA
ANTIE SP U MA NT E
93
Procedimiento Experimental
INCUBADORA ORBITAL
Para el crecimiento de los microorganismos durante la preparacin de los inculos en
matraces Erlenmeyers se ha empleado una incubadora orbital GALLENKAMP modelo
IINR-200. Con las siguientes caractersticas:
Rango de temperatura: de + 5 0(3 a 70
0C.
Va r i a c i n m x i m a d e t e m p e r a t u r a : + 0,50(3.
F l u c t u a c i n d e t e m p e r a t u r a i n t e r n a : 0 , 10 C.
Rango de velocidad de agitacin: de 40 a 400 r.p.m. y con un radio orbital de 32 mm.
Ca p a c i d a d : 3 0 E r l e n n i e y e r s d e 250 m l o n m e r o e q u i v a l e n t e d e o t r o t a m a o , c o n c a m b i o
de plataforma.
ESTUFA DE CULTIVO
La estufa bacteriolgica empleada de la marca SELECTA, modelo 2000207, es de
conveccin natural. Posee una homogeneidad de 2,5 % y una estabilidad de + 0,5 %,
p u d i e n d o r e g u l a r l a t e m p e r a t u r a d e s d e l a a m b i e n t a l + 5 0C hasta 600C.
CAMARA DE FLUJO
P a r a l a m a n i p u l a c i n d e m i c r o o r g a n i s m o s e n c o n d i c i o n e s e s t r i l e s s e h a t r a b a ja d o e n
u n a c m a r a d e f l u jo l a m i n a r v e r t i c a l d e l a f i r m a TE LS TA R m o d e l o M I CR O -V, c a p a z d e
d e s a r r o l l a r u n a v e l o c i d a d d e i m p u l s i n d e 0 , 45 m I s .
ESTIJFA DE SECADO Y ESTERilIZACIN
Esta estufa es de la firma SELECTA, modelo S-202, con termmetro de referencia,
termostato de regulacin de la temperatura y termostato de seguridad.
9 4
Procedimiento Experimental
BALANZADE PRECISIN
Para la cuantificacin del peso de los diferentes compuestos empleados se ha u t i l i z a d o
una balanza digital marca SARTORIUS, modelo Handy. Esta balanza permite obtener pesadas
del orden de miligramos con una fiabilidad de + 0,1 mg.
CENTRIFUGAS
Para la centrifugacin de las muestras se han empleado dos tipos de centrfugas, una
de la firma HERMLE, modelo Z 230, con capacidad para ocho tubos de 1 0 ml cada uno;
alcanza un mximo de 5000 r.p.m.- lo que corresponde a 2000 g- durante un tiempo
controlado de hasta una hora.
Para la preparacin de las muestras para citometra de flujo, la centrfuga empleada fue
de la marca SELECTA, modelo Centrolit con una capacidad para 30 Eppendorf, alcanza una
velocidad fija de 1 0000 r.p.m. (1 8000 g) durante un tiempo que puede ser programado.
URMIETRO
La medida del pH de las muestras se ha realizado con un pHmetro de la marca
CRISON, modelo MICROPTII 2002. Tiene una resolucin de 1 0 y lleva incorporada una
sonda CAT de temperatura, por lo que es capaz de realizar la correccin automtica de la
lectura del pH ante un cambio de temperatura.
VISCOSIMETRO
Para la medida de la viscosidad se ha empleado un viscosmetro BROOKFJELD
SYNCHRO-LECTRIC modelo LVT, con microadaptador, capaz de medir a 0,3; 0,6; 1,5,; 3,
6; 12; 30 y 60 r.p.m., con un spindle del n
0 1 8; se ha utilizado, conectado al microadaptador, un
bao termostatizado marca TANSON TC9, con una precisin de + 1 0C.
95
Procedimiento Experimental
ESPECTROFOTMETRO de ABSORCIN tJV/VIS
La medida de la absorbancia de las muestras se ha realizado en dos espectrofotmetros
13 V/ VI S , u n o d e l a f i r m a S HI I NI A DZU , m o d e l o S HI M A DZU LI V 160 3 y o t r o d e l a marca
PERKIN ELMER, modelo 552 1 3V/VIS.
ESPECTROFOTMIETRO de FLUORESCENCIA
P a r a m e d i r l a f l u o r e s c e n c i a d e l a s m u e s t r a s s e h a e m p l e a d o un espectrofluormetro de la
m a r c a P E R KI I 4 E LM I E R m o d e l o M I P F -44 E .
P a r a e l J o d u r o d e P r o p i d i o , l a l o n g i t u d d e e x c i t a c i n y emisin fueron, respectivamente,
de 536 y 623 nm, empleando una rendija de 1 9 para excitacin y de 5 para emisin.
Para el Isotiocianato de Fluoresceina, las longitudes de onda de excitacin y emisin
f u e r o n , r e s p e c t i v a m e n t e , d e 49 4 y 520 t u n , c o n u n a r e n d i ja d e 4 p a r a e x c i t a c i n y d e 2 p a r a
emisin.
AUTOCLAVE
Para la esterilizacin del material, a 1 200 C durante 20 minutos, se ha empleado un
autoclave marca RAYPA, serie Sterilmatic-C modelo AE-l 1 0.
ELECTRODO de AMONIO
En la medida de la concentracin del nutriente nitrogenado disuelto se ha utilizado un
analizador electro-qun-co marca ORION, modelo 720A. La medida se realiza por
desplazamiento del amonio contenido en las muestras al aumentar el pH. Las molculas de
amonio en disolucin pasan a amoniaco y ste atraviesa la membrana selectiva del electrodo.
El amoniaco que se introduce en el electrodo es capaz de producir una seal elctrica que, una
vez analizada y comparada con la curva de calibrado, proporciona la medida de Ja
concentracin de amonio. El intervalo de concentracin puede variar entre 1 M y 5.1 ~ M.
96
Procedimiento Experimental
CROMATOGRAFA LIOUIDAde ALTA RESOLUCIN (HPLC
)
El equipo de cromatografia lquida de alta resolucin, HPLC, que se esquematiza en
l a F i g u r a 2. 7, p r e s e n t a l a s s i g u i e n t e s c a r a c t e r i s t i c a s t c n i c a s :
Bomba: KONTRON JKSYRUMENTS (325 System), capaz de m a n t e n e r u n c a u d a l
constante entre 0,1 y 5 mL/mm a una presin que puede variar entre 1 y 450 bar. Puede
t r a b a ja r t a n t o en rgimen isocrtico como en gradiente, tanto de caudal como de
composicin, ya que est dotada de un mezclador de tres canales.
Inyector Automtico. KONTRON JNSTRUMENTS-3 60, con capacidad para 60
muestras contenidas en viales de 2 mL. Tiene la posibilidad de termostatizar las
muestras y variar la cantidad de muestra inyectada, aunque en todos los anlisis
realizados se ha utilizado un volumen de muestra de 20 mL.
Horno: PERiKJN-ELMiER LC-l 00, mantiene la temperatura 5
0C por encima de la
ambiental y hasta 99 0C, con una precisin de 0,1 0C. La transmisin de calor se
r e a l i z a p o r c o n v e c c i n f o r z a d a d e a i r e c a l i e n t e . E s t d i s e a d o p a r a a l b e r g a r d o s
columnas de cromatografia de hasta 3 5 cm de longitud.
Detector: SEDEX 45, detector de dispersin de luz ( light scattering). Se basa en la
dispersin de luz que se produce al incidir un rayo sobre un nebulizado que contiene la
muestra a analizar. Es necesario fijar unas condiciones de temperatura de medida y de
composicin y presin en el gas que se utilizar para nebulizar la muestra.
97
Procedimiento Experimental
Filtro
u
Reserva de
disolvente
Precolumna
Bomba
Inyector automtico
Columna
lI~tector de di spersion de luz
Adquisicin de datos
Figura 2.7.- Representacin esquemtica del equipo de HPLC utilizado.
CONTADOR de PARTCULAS
Para el contaje del nmero de clulas, necesario para el procesamiento de las muestras
por Citometra de Flujo, se emple un contador COULTER modelo ZM empleando un tubo
de 30 ~tmy un canalizador acoplado marca COULTER, modelo CHANNELIZER 256.
CITOMETRODE FLUJO
Para el anlisis de componentes intracelulares, se ha empleado un citmetro
IBRYTE-HS (Biorad, Hempstead 1 3K), con lmpara de Xenon de 75 W, filtro de excitacin
de 488 nm, filtros de emisin de 51 0 nm para la fluorescencia verde y de 600 nm para la
fluorescencia roja. El equipo pertenece al Centro de Citometra de Flujo (CMF) de la
U.C.M., situado e n l a F a c u l t a d d e F a r m a c i a . Los componentes bsicos de un citmetro de
flujo son los siguientes (Figura 2.8):
98
Procedimiento Experimental
Sistema de Flujo de Fluidos: El flujo producido es un flujo laminar, en el que se
mezclan dos tipos de fluidos: el fluido de la muestra y el fluido de la vaina. Las
p a r t c u l a s o c l u l a s d e b e n e s t a r e n s u s p e n s i n , y s o n a n a l i z a d a s u n a a u n a , e n e l s e n o
del lquido.
Sistemas Opticos y Fotodetector: El flujo de partculas o clulas pasa a travs de una
zona iluminada por un rayo de luz focalizado. El impacto del rayo con cada clula
genera seales pticas que, una vez recogidas por medio de detectores, son
convertidas en seales o eventos electrnicos que miden la magnitud de cada pulso.
Sistema Electrnico y Computador: Los pulsos generados son a su vez digitalizados
y computerizados en un tiempo de milisegundos. Todo esto permite, por un lado, la
visualizacin en pantalla en tiempo real de las medidas efectuadas en relacin a cada
u n o d e l o s p a r m e t r o s a n a l i z a d o s , l a d i s c r i m i n a c i n d e p a n c u l a s o c l u l a s y
establecer ventanas, puertas o regiones electrnicas de acotacin o exclusin, que
posibilitan la adquisicin, almacenamiento y/o anlisis de eventos correspondientes
nicamente a unas determinadas subpoblaciones de inters, o bien la separacin
fisica de subpoblaciones. Adems la CMF permite la obtencin de medidas
semicuantitativas y anlisis multiparamtricos muy precisos.
99
Procedimiento Experimental
Agua
presuriza da lE*
r 1
S uspensin
W
celular
f luorescente , , Detector
Coleccin de
lentes
N
N .
Flujo N .
NS
luz Q .$ ijjj
6% % %
Fuente d~~X
Mistogramas
4
Figura 2.8.- Representacin esquemtica de un citmetro de flujo
R ayo de luz
excitado
1~
cg
1
NS
Detec tbr,~
de luz
disnersa
NS
100
Procedimiento Experimental
2.2.- MATERIALES EMPLEADOS
2.21.- Nlicroor2anismo
El microorganismo empleado en el presente trabajo ha sido Xanthomonas campestris
NR R L B -1459 . La b a c t e r i a s e obtuvo solicitndola a la siguiente coleccion:
Microbiologist Culture Collection Research. Fermentation Laboratory of United States.
Department Agricultural. 1815 North University Street. Peona. Illinois. 61604 U.S.A.
Existen tres cepas del microorganismo, como ya ha sido indicado en la Introduccion.
Como all se coment, las cepas Sm y Vs se producen por degeneracin de la cepa L, debido a
un envejecimiento del cultivo, que puede ser acelerado por una conservacin deficiente. Por lo
tanto, es necesario mantener la bacteria como cepa L, para obtener un xantano con buenas
propiedades y con buen rendimiento. En la Figura 2.9 se muestra una placa de la cepa L, donde
puede apreciarse el aspecto de las colonias de la bacteria.
Para la conservacin y el mantenimiento de la cepa de Xanthomonas campestris se
describen en la literatura dos procedimientos (Jeanes y col., 1 976> :
- Conservacin a 1 ar20 plazo: es un tipo de conservacin no propagativa (la bacteria no
crece ni se reproduce). Este tipo de conservacin se recomienda realizarla liofilizando una
pequea parte del cultivo que se encuentra en condiciones ptimas. Tambin se han descrito
otras tcnicas como la congelacin y la conservacin en tiras de papel (Jeanes y col., 1 976).
- Conservacin a corto plazo: este tipo de conservacin es semipropagativa (la bacteria
crece y se reproduce). Se realiza en slants (tubos con medio slido), pero requiere una
renovacin del cultivo cada quince das (De Vuyst y col., 1 987a y b; Suman y Rogovin, 1 970)
ya que si no se realizan transferencias del cultivo ms o menos frecuentes, la cepa puede
degenerar a Sm (Cadmus y col., 1 976).
En este trabajo se realiz la conservacin de la siguiente forma:
101
Procedimiento Experimental
- A largo plazo: se conserv el microorganismo tanto liofilizado como por congelacin. El
liofilizado se realiz en la empresa PI-IARMAMAR S.A.. creciendo previamente, en medio
lquido el liofilizado obtenido de la coleccin americana y realizando una centrifUgacin del
caldo, paraobtener las clulas que posteriormente se liofilizan y e n c a p s u l a n . La c o n g e l a c i n
e realizada en Eppendorfs con glicerina al 1 0% y posterior congelacin a la temperatura
de-25
0C.
- A corto plazo: el microorganismo es conservado en medio slido, en este trabajo se ha
empleado medio YMagar. Los slants son incubados durante un periodo de 1 8 a 20 horas en
estufa de incubacin a 250 C y manteniendo posteriormente el slant a 40 C durante un
periodo de 1 4 das como mximo. Tras ese tiempo se renueva el cultivo traspasndolo a otro
slant con medio YM-agar.
Figura 2.9.- Fotografla de las colonias formadas por Xantho,nonas campestris sobre YMagar.
102
Procedimiento Experimental
Para observar la viabilidad de la cepa de X campestris, el procedimiento consiste en
realizar siembras por agotamiento de asa en placa Petri en YM agar. Las placas se incuban a
250 C durante tres das.
2.2.2. Reactivos Utilizados
En la Tablas 2.1 a 2.6 aparecen los reactivos empleados, tanto para la preparacin de
los medios de cultivo como aquellos que se han ido utilizando en el anlisis de los diferentes
componentes del sistema.
En la Tabla 2.1 se muestran los reactivos empleados para la conservacion,
mantenimiento y crecimiento del microorganismo. En la Tabla 2.2 se recogen los reactivos
empleados en la preparacin del medio ptimo de produccin, denominado en lo que sigue
como medio A (Garca-Ochoa y col., 1 992). En la Tabla 2.3 se indica el agente precipitante
e m p l e a d o e n l a e x t r a c c i n d e l p r o d u c t o . E n las Tablas 2.4 y 2.5 figuran los reactivos
utilizados en este trabajo para el anlisis de los componentes intracelulares y, finalmente, en
la Tabla 2.6, los empleados para el anlisis de algunos de los componentes extracelulares.
Tabla 2.1 .- Reactivos empleados para los medios de crecimiento y mantenimiento de
microorganismos
Compuesto Marca Cdigo
Agar-Agar PROBUS 2921 0
D(+) Glucosa Anhidra PANREAC 1 41 341
Extracto de Levadura OXOUJ L2 1
Extracto de Malta OXOID L39
Peptona Bacteriolgica OXOID L37
103
Procedimiento Experimental
Tabla 2.2.-. Reactivos empleados
(Garca-Ochoa y col., 1 992).
para el medio de produccin de xantano, Medio A
Compuesto Marca Pureza
Qumica
Cdigo
Cloruro de Magnesio
Acido Ctrico Crista/Lado
PROBUS
PROBUS
Puro
1 2041 0
1 1 51 0
cido Brico PANREAC
Puro
23687
cido Clorhdrico PANREAC
Puro
35%
1 41 01 9
Nitrato de Amonio PROBUS 21 31 0
Carbonato Clcico PROBUS
Puro
1 092 1
Puro
Cloruro de Hierro (III) PROBUS
Puro
91 41 0
Oxido de Zinc PANREAC 1 5682
Fosfato Potasio Mono-bsico PANREAC
Puro
98%
1 41 509
Hidrxido de sodio PANREAC 1 41 687
970
Sacarosa PANREAC 1 76820
Puro
Ta b l a 2. 3 . - R e a c t i v o s e m p l e a d o s p a r a l a p r e c i p i t a c i n y e x t r a c c i n d e l p r o d u c t o o b t e n i d o .
Compuesto Marca
Pureza
Qumica
Cdigo
isopropanol
VIUDA e HIJOS de
MANUEL RIESGO
Puro
104
Procedimiento Experimental
Tabla 2.4.- Reactivos empleados
Espectrofluorimetria.
en los anlisis por Citometra de Flujo y en la
Compuesto Marca Pureza Cdigo
Qumica
Tris (hidroximetil) aminometano PANREAC Puro 13 1940
Cloruro Sdico PANREAC Puro 141659
Glutaraldehdo RIEDEL-DE HAEN 25% 62621
Deoxiribonucleasa 1 SIGMA 90 % DN-25
Ribonucleasa A SIGMA 85 % R5503
loduro de Propidio SIGMA 95-98% P-4170
Isotiocianato de Fluorescena SIGMA 90 % F-7250
Rojo Nilo SIGMA - N-3 013
Albmina de Suerode Bovino BOEHRINGER-MANNHEIN - 10222
DNA de Timo de Bovino BOEHIRIINGER-MANNHEIN - 109223
RNA de Levadura BOEHRIINGER-MANNHEIN - 104175
Tabla 2.5.- Reactivos empleados para la realizacin de anlisis mediante pruebas
bioqumicas.
Compuesto Marca Pureza Cdigo
Qumica
Lisozima I3 OEHRINGERMANNHEIM Puro 107255
Citrato de Sodio SIGMA 99% 54641
Dodecii Sulfato de Sodio SIGMA >99% L5901
Sulfato Cprico PANREAC Puro 141648
Tartrato de Sodio y Potasio PANTREAC Puro 141729
Reactivode Folin ANALEMA Puro PS
Fenol PANREAC Puro 1413 22
los
Procedimiento Experimental
Tabla 2.6.- Reactivos empleados para el anlisis de azcares
Compuesto Marca Pureza
Qumica
Cdigo
Kit enzimticoSacarosa/Glucosa BOEI-IIRINGER-MANNHEIN - 1 39041
Acetonitrilo RIEDEL-DE HAN 99,8 % 34881
2.2.3 - Composicin de los Medios Empleados
MEDIOde CRECIMIENTO
VM Extracto de Levadura 3 g/L
E x t r a c t o d e M a l t a 3 g/L
Glucosa Anhidra 1 0 gIL
MEDIOde PRODUCCIN
MEDIOA
Acdo Brico 0,006 g/L
Acido Ctrico 2,1 00 g/L
Acido Clorhdrico 0,1 30 mL
Carbonato Clcico 0,020 g~L
Cloruro de Hierro (III) 0,0024 g/L
Oxido de Zinc 0,0060 g/L
Fosfato Potsio Mono-Bsico 2,866 g/L
Cloruro de Magnesio 0,507 gIL
Sulfato Sdico 0,089 gIL
Nitrato Amnico 1 ,1 440 gIL
Sacarosa 40,00 gIL
Se ajusta el pH a 7 con una disolucin de NaOH.
106
Procedimiento Experimental
2 . 2 . 4 . - Composicion de las Disoluciones
DISOLUCIONES
Tampn y Preparaciones nara Anlisis
TAMPN
Tris Hidroximetil Aminometano
Cloruro Sdico
0,1 M
0,IM
Se ajusta el pH a 7,5 con HCI
TAMPN B
Dodecil Sulfato Sdico
Tris Hidroxim. Amino Met.
Citrato Sdico
Cloruro Sdico
1 ,5%(w/v)
1 0 mM
lmM
1 0 mM
Se ajusta el pH a 8 con HCI
REACTIVOS LOWRY (Lowry y col., 1 951 )
LOWRY A
LOWRY B
LOWRYC
Carbonato de Sodio
Hidrxido Sdico
Sulfato de Cobre
Tartrato de Sodio y Potasio
LOWRY A: LOWRY B
TAMPN TRIS
2 % (w/v)
0,1 N
0,5%(w/v)
1 ,O%(w/v)
50:1
107
Procedituienbo Experimental
2.3.-REALIZACIN de un EXPERIMENTO
To d o s l o s e x p e r i m e n t o s l l e v a d o s a c a b o e n e l presente trabajo se han realizado en
fermentador. Para ello, se ha empleado un biorreactor de la marca Braun, modelo B I O S TA T
M, tal y como se ha comentado en el apartado 2. 1 . El desarrollo de un experimento se detalla
a contrnuacon:
Para la preparacin del inculo e inoculacin en el fermentador, se pa rte de un slani del
microorganismo que no tenga ms de tres das. Con a sa de siembra, se obtiene un ioop de
inculo que se transfiere a l medio de crecimiento, en el que se va a preparar el inculo
(contenido en Erlenmeyer o en tubo de ensayo, segn el caso); en esta operacin se debe
tra ba ja r siempre cerca de la lla ma del mechero Bunsen y flamear la boca del Erlenmeyer o del
tubo de ensayo, tanto despus de a brirlo, como antes de cerrarlo. El medio de crecimiento
inoculado se cultiva en la incuba dora orbital en las condiciones ptimas para Xanthomonas
carnpeshls (Santos, 1993),que son las siguientes: temperatura2S~ C, velocidad de agitacinde
210dura nte 12 h en el medio de crecimiento YM.
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin del inculo, se lleva ste a la cmara de flujo
-previamente esterilizada con alcohol- y se toma, de modo estril, una pequea cantidad para
realizar diluciones y conocer la concentracin de biomasa obtenida. Este ltimo detalle es
inprescindible para la repetitivida d de los resultados obtenidosen diversos experimentos.
El procedimiento a seguir para llevar a cabo la esterilizacin del biorreactor es el siguiente:
antes de ser introducido en el citado autoclave, se prepara, de modo que se conecte al cuerno
del fermentador lo ms rpidamente posible. Se deben colocar filtros, tanto para la entrada de
aire como a la salida del refrigerante, que se cubren cuidadosamente con papel de aluminio y
se sellan con cinta adhesiva. Mi mismo, se colocan los electrodos de oxigeno disuelto,
antiespuma y pH -ste ltimo debe calibrarse antes de la esterilizacin- y se cubren tambin
con papel de aluminio y con cinta adhesiva. Tambin se cubre con papel de aluminio el
conector de la sonda de temperatura Pt-l 00 y la salida de muestras.
El ferinentador se debe esterilizar con el medio a emplear dentro, por lo que se deben
pinzar todas las gomas de salida y entrada para evitar prdidas. Cuando el medio que se va a
emplear en el experimento no se puede esterilizar todo junto -por contener la mente carbonada
y sales inorgnicas-, se introduce en el reactor una parte del mismo, conteniendo todos los
componentes excepto la mente de carbono. El sustrato carbonado se prepara en un frasco
aparte -de los preparados para control del pH, con salida al fermentador- y se esteriliza unido al
mismo, tomando la precaucin de pinzar la goma que los une, para evitar que ha ya paso de
liquido de uno a otro.
/08
Procedimiento Experimental
Una vez introducido todo en el autoclave, se esteriliza a 1 20
0C durante 30 minutos. Despus
de la esterilizacin, se quita la cinta adhesiva y el papel de aluminio y se conecta el
ferinentador al cuerpo del mismo; tambin se conecta la entrada y la salida de agua de la
camisa y se abre la vlvula de llenado. Se conectan el agitador, los tres electrodos y la bomba
peristltica, para que se introduzca el sustrato carbonado, si es el caso. El biorreactor se debe
dejar durante al menos seis horas despus de realizar los pasos comentados, para que el
electrodo de oxigeno disuelto se polarice antes de ser calibrado. Transcurrido el tiempo de
polarizacin, el fermentador ya se encuentra a la temperatura deseada. Una vez es introducida
la fluente de carbono, se calibra el electrodo de oxigeno con nitrgeno y aire, fijando asi el cero
vel l00% de saturacin, respectivamente, antes de realizarla inoculacin. Se fija la agitacin
en 21 0 r.p.m. y el caudal de aire en 1 L/L/ntn.
Finalmente, se realiza la inoculacin, una vez preparado el inculo, como se ha comentado
previamente, y conocida la concentracin de biomasa en el medio, se procede a la inoculacin
en el fermentador. Para ello, se introduce a travs de una membrana preparada al efecto,
mediante una jeringa estril. La membrana se cubre con alcohol y se prende fuego cuando se
va a realizar la inoculacin.
Para llevar a cabo el seguimiento de la evolucin de este sistema durante el proceso, sc realiza
la toma de las muestras a distintos tiempos, as como el anlisis de las mismas. En el
fermentador, la toma de muestras se realiza por la salida superior. Una vez tomada la muestra
se pinza la goma y se introduce alcohol por el e x t r e m o i n f e r i o r , h a s t a l a s i g u i e n t e muestra, para
evitar contaminaciones.
Las muestras deben ser tomadas en condiciones lo ms aspticas posibles, por lo que los tubos
donde van a ser almacenadas deben ser esterilizados previamente. Una vez tomada la muestra,
e s centrifugada a 4000r p m . < 28 60 g > d u r a n t e 3 0 m l i i . c o n e l f i n d e s e p a r a r e l c a l d o d e l a s
clulas, y de esta forma parar el crecimiento y la evolucin de sustratos y productos. Una vez
centrifugadas son almacenadas a 40 C para el posterior anlisis de cada compuesto.
Preparaciones especiales de las muestras, como las necesarias para contar el nmero de
clulas, o analizar por fluorescencia, citometra de flujo o microscopia electrnica, se detallan
en puntos siguientes, dentro de los protocolos especficos para el anlisis de cada componente.
109
P,-ocedmicn/o Experimental
2.4.- METODOS DE ANLISIS DE COMPONENTES EXTRACELULARES
2.4.1 .- Anlisis de Biomasa
Para el anlisis de A? campestris como biomasa se ha empleado un mtodo
turbidimtrico, es decir un mtodo ptico basado en la absorbancia que presentan las bacterias
en longitudes de onda del espectro visible. Consiste en medir la absorbancia de la muestra a
una cierta l o n g i t u d de onda, frente a un blanco. La longitud de onda empleada en el presente
t r a b a jo , p a r a e s t e a n l i s i s , f i je d e 540 n m y e l b l a n c o u t i l i z a d o , a g u a d e s t i l a d a .
El calibrado del m t o d o se r e a l i z en un trabajo previo (Santos, 1 993). El ajuste de los
datos experimentales por regresin lineal a la expresin de Lambert -Beer aparece en la
ecuacin [2.1 ].
c~~j (g L) 0.285 . < 540 nm) [2.1 ]
En la Figura 2.1 0 se muestra la recta de calibrado obtenida de la relacin entre la
absorbancia medida a 540 nm y la concentracin de la bacteria.
En cuanto al seguimiento de la biomasa durante los experimentos las muestras
obtenidas, durante la produccin de xantano, eran tratadas segn el siguiente protocolo
experimental:
Se toma una muestra del biorreactor y se diluye con agua destilada, de modo que la
alisorbancia medida entre dentro de la regin lineal de la curva de calibrado. El valor de
absorbancia obtenido a 540 nm es convenido en concentracin mediante la ecuacin
[2.1],que luego es corregida de acuerdo a la dilucin realizada previamente.
110-
Procedimiento Experimental
.4
u
20
Figura 2.10.- Recta de calibrado para la medida de biomasa de Xanthomonas
campestris por relacin entre la absorbancia y el peso seco.
2.4.2.- Medida de la Concentracin del Sustrato Carbonado
Para la determinacin de la concentracin del sustrato carbonado, esto es sacarosa, se
han utilizado dos tcnicas distintas, una basada en una prueba enzimtica que ha sido
realizada mediante un kit comercial y la otra basada en la cromatografia lquida de alta
resolucin (HPLC) utilizando un detector de dispersin de luz. La primera tcnica se emple
inicialmente, pero cuando se dispuso del equipo de cromatografia lquida de alta resolucin se
emple esta tcnica en lugar de latcnica enzimtica.
Para la determinacin de la sacarosa, mediante un kit enzimtico comercial se emple
un test de combinacin de la marca Boehringer- Mannheim(n
0 de catlogo 1 39041 ). Antes de
aplicar el kit de medida a las muestras, es necesario someterlas a un determinado tratamiento
trmico, para detener las reacciones enzimticas de las clulas bacterianas que puedan
interferir en la medida. Dicho tratamiento se realiza conforme al siguiente protocolo:
Se introducen las muestras en bao de agua a 800C, durante unos 1 5 minutos, y se
centrifugan posteriormente a 5000 r.p.m. durante 20 mm., siendo el sobrenadante de esta
ltima operacin, generalmente diluido, el que se utiliza para la determinacin del azcar
correspondiente.
\~ 4=
7 fl$>
~1 ~
Q5 1,0 1,5
Abs(S~ mi)
Proccdim en/o Experimental
Para cl anlisis de sacarosa, se determina el contenido en D-glucosa antes y despus de
la hidrlisis enzimtica de la sacarosa. Una vez preparada la muestra como se ha indicado, los
pasos a seguir son los siguientes:
Inversinenzimtica: La sacarosa se hidroliza mediante la 1 3-fructosidasa (invertasa) a pH 4,6
en O-glucosa y D-flvctosa, de acuerdo a:
Sacarosa * Fructosa /3Fructosidadasa glucosa + i~ fructosa
D [2.2]
Determinacin de glucosa: Se aade la enzima hexokinasa (1 -1 1 K), que cataliza -a pH 7,6- la
fosforilacin de la O-glucosa con adenosn-5-trifosfato (ATP) bajo la forma simultnea de
adenosn-5-difosfato (ADP). La glucosa-E-fosfato formada (G-6-P) es oxidada
especficamente por el nicotinarnin-adenin-dinucletido (NADP> en presencia de la glucosa-
6-fosfato-dehidrogenasa (G6P-DH) a gluconato6-fosfato, formndose, a la vez,
Nicotinamin-adenin-dinucletido-fosfato (NADPH). La cantidad de NADPH fonnada
durante la reaccin es estequiomtrica, con respecto a la cantidad de 0-glucosa, y se
determinapor su absorbancia a 340 nm.
D <Pu c~ a + -IT? Ffexoqunasa (Y/u casaE P + <ID? [2.3]
<36-- 1 + NADP~ (36PDfcf. G/uconuto6p NADPfI w 1< [2.4]
El clculo de la cantidad de sacarosa presente en la muestra se realiza prinero sustrayendo
de la lectura de la absorbancia de la muestra la obtenida para el blanco:
AA = AA
9- AM [2.5]
Yel clculo de la cantidadde sacarosa, por la siguiente ecuacin:
U
= /000 [2.6]
Siendo: V, el volumen del test, V~ el volumen de la nuestra, M el peso de la sustancia
analizada el peso de la sustancia analizada d el paso ptico de la cubeta y 3 el coeficiente de
extincin molar del NADPH.
Como ya ha sido comentado, el anlisis de este disacrido tambin fUe realizado
mediante I{PLC. Para esta tcnica, la preparacin de la muestra solamente precisa la
separacin de las clulas del caldo de fermentacin. Esta separacin puede realizarse tanto por
centrifUgacin a 5000 r.p.m (2000 g) durante 1 5 minutos, como por filtracin a travs de un
1/2
Procedimiento Experimental
filtro Millipore de 0,2 ~tm. Como ya se ha comentado, para este anlisis se ha utilizado un
cromatgrafo marca KONTRON, modelo SEDEX 45, con detector de dispersin de luz. Las
condiciones utilizadas han sido las siguientes: la columna empleada ha sido tipo Nucleosil
NH
2 de Sgm, con unas dimensiones de 250 x 4,6 mm. Se ha empleado como eluyente una
mezcla Acetonitrilo/agua Mili Q en proporcin 75:25, con un caudal de 1 L/min. En cuanto al
d e t e c t o r , es de dispersin de luz, trabajando con una ganancia d e 6, u n a p r e s i n d e a i r e d e 1, 9
atm. y a 280 C de temperatura.
En la Figura 2.1 1 se muestra la curva de calibrado para la s a c a r o s a y l a E c u a c i n [2. 7]
da la relacin entre el rea del cromatograma y laconcentracin de este azcar.
Cs(g/L) = 0,00863 A
[2.7]
.4
1
2.4.3.- Anlisis del Sustrato Ntro2enado
La concentracin de nitrgeno (en forma de sal de amonio) ha sido medida en
discontinuo, mediante un electrodo de membrana semipermeable de la casa ORJON, modelo
720A. El procedimiento seguido para el anlisis del amonio ha sido el siguiente:
~oo
A
Figura 2.1 1 Recta de calibrado en HPLC para el anlisis de sacarosa.
113
Procedimiento Experimental
Sc toma una muestra de 1 0 mL y se adiciona una disolucin de NaOH, hasta alcanzar valores
de pH superiores a lo (momento en el que el indicador suministrado por el fabricante, azul de
timol. vira de incoloro a azulado); a pH alcalino se libera el nitrgeno amnico presente en la
muestra, pasando a amonio gaseoso. El amoniaco generado atraviesa la membrana
semipermeable del electrodo y produce una seal en el detector. Esta seal se compara con los
datos del calibrado y~ automticamente, aparece en la pantalla del aparato la concentracin de
nitrgeno presente en la muestra. El calibrado se realiza introduciendo dos patrones de
concentracin conocida (1 0 y 1 00 p.p.m.). El intervalo de concentracin de calibrado es de O a
00 p.pm. l~os patrones son analizados del modo indicado y la pendiente es calculada y
almacenada por e] aparato de modo que, una vez realizado el calibrado, la concentracin es
leida directamente en el aparato.
2.4.4.- Anlisis de Xantano
El anlisis del xantano se llev a cabo estableciendo una relacin entre la viscosidad
del caldo y la concentracin de xantano en u n a m u e s t r a d a d a . La viscosidad se mide
generalmente a 30 r.p.m. entre 25 y 30
0C (Silman y Rogovin, 1 970 y 1 972; Cadmus y col.,
1 976 y 1 978: Souw y Demain, 1 979; Tait y col., 1986; De Vuyst y col., 1987a y 1987b). En el
presente trabajo, el anlisis del contenido en xantano de las muestras se realiz mediante la
determinacin_de la viscosidad, medida a 25 0C y 30 r.p.m. , de acuerdo a un procedimiento
previamente establecido (Santos, 1 993).
Para relacionar la viscosidad del caldo con la concentracin de xantano en el mismo, se
r e a l i z e l c a l i b r a d o del mtodo. Segn las caractersticas del xantano disuelto, la relacin entre
la viscosidad de la disolucin y la concentracin de xantano puede ser muy diferente (Casas,
1 989); en consecuencia, para calibrar este mtodo de anlisis se emple el propio xantano
obtenido en cada experimento para realizar el calibrado. El procedimiento seguido fue el
siguiente:
Se toma un caldo resultante de la fennentacin y se aade un volumen conocido de alcohol
isoproplico (IPA), precipitando el xantano y quedndose en suspensin las bacterias. La
relacin caldo:IPA es normalmente superior a 1 :2,3, debido a que no se emple ninguna sal
para no falsear la medida por pesada. Despus de filtrar, lavar y secar, se mantiene en una
estufa a temperatura de 50 0c, hasta pesada constante. Por otra parte. se realizan varias
dilucionesdelcaldodefermentacinysemidesu viscosidada 25 0C y 30 r.p.m. Los valores
obtenidos en cada caso se ajustaron a una ecuacin de tipo potencial, por lo que las ecuaciones
114
Procedimiento Experimental
de calibrado se recogen en cada experimento, es decir, cambian los valores de a y de b en la
ecuacin siguiente:
= a 4 [2.8]
La r e l a c i n e n t r e l a v i s c o s i d a d a p a r e n t e d e l x a n t a n o (g ~ ) c o n s u c o n c e n t r a c i n (g I L)
d e a c u e r d o c o n l a E c u a c i n [2. 8 ] p a r a c a d a e x p e r i m e n t o , s e m u e s t r a e n l a Ta b l a 2. 7.
Ta b l a 2. 7- Va l o r e s d e l o s p a r m e t r o s a y b d e l a e c u a c i n [2. 8 ]p a r a l o s d i f e r e n t e s
experimentos realizados en los que se varian las condiciones que se indican
en la primera columna.
Experimento b
25
0C, 257 pp.mNB0 0,1 2 0,97
280 C. 257 p.p.m NH2 0,34 0.70
31 0C,257p.p.mNH 0,43 0,51
340 C, 257 p.p.m NI-l< 2,05 0,34
28~ C, 65 p.p.m NI-1 $ 0,77 0,32
280 C, 1 30 p.p.m NH 0,77 0,31
280 C, 475 p.p.mNH 0,23 0,71
115
Procedimiento Experimental
2.5.- ANLISIS de COMPONENTES INTRACELULARES
P a r a e l d e s a r r o l l o d e M o d e l o s Cinticos Qumicamente Estructurados es necesario
realizar el anlisis de ciertos componentes intracelulares durante el proceso, como ya se cit
e n e l p r i m e r c a p t u l o d e e s t a M e m o r i a . E l a n l i s i s d e estos componentes permite explicar la
evolucin del sistema cuando el microorganismo es sometido a determinados factores
externos que pueden afectar al crecimiento y por tanto a la evolucin de sus componentes
estructurales.
La Citometra de Flujo (CMF) parece ser la mejor tcnica para poder realizar un
s e g u i m i e n t o d e l p r o c e s o , t e n i e n d o e n c u e n t a l o s c a m b i o s p r o d u c i d o s i n t r a c e l u l a r m e n t e
c u a n d o e l m i c r o o r g a n i s m o s e e n c u e n t r a bajo diferentes condiciones ambientales.
La tcnica de la CMI es analtica y preparativa, y se puede utilizar para el anlisis
de clulas tanto eucariotas como procariotas. Se basa en la medida de la emisin de
fluorescencia y dispersin de luz inducidos por la iluminacin apropiada de clulas o
p a r t c u l a s e n s u s p e n s i n p a r a s e r a n a l i z a d a s e n e l s e n o d e u n l q u i d o c o n f l u jo l a m i n a r
(M a f t a h y c o l . , 19 9 3 ) .
La CM F p r e s e n t a i m p o r t a n t e s v e n t a ja s c o n r e s p e c t o a otras tcnicas analticas, por
ejemplo permite la caracterizacin de clulas individuales en trminos de distribucin de sus
componentes, tales como DNA, RNA, y proteinas, o bien de sus propiedades tales como
viabilidad, tamao, variacin morfolgica (complejidad), etc.; adems, permite anlisis
multiparamtricos con alto grado de precisin. En la Tabla 2.8 se muestran algunos de los
principales parmetros biolgicos ana]izables por CMIF, tanto mediante el uso de
fluorocromos como sin ellos, siendo posible tambin el anlisis simultneo de varios de
estos parmetros.
El citmetro empleado en este trabajo, como ya se indic en el apartado 2.1 ,
pertenece al CAL del servicio comn de investigacin de la Facultad de Farmacia de la
U.C.M (marca Bryte, modelo HS, Biorad Hemptead UK).
116
Procedimiento Experimental
Tabla 2.8.- Parmetros analizables mediante Citometria de Flujo.
PARMETROS
ESTRUCTURALES
PARMETROS
FUNCIONALES
SIN
FLUOROCROMO

Volumen Celular
Complejidad Celular
Pigmentos
Potencial REDOX
Viabilidad celular
CON
FLUOROCROMO
Macromolculas
Orgnulos Subcelulares
Receptores
Metaboltos de Bajo Peso molecular
Etegridad de membrana
Movimientos inicos
Potencial de Membrana
Viabilidad Celular
Sntesis de DNA
Transporte Celular
Esta tcnica ha sido habitualmente utilizada para analizar clulas eucariotas (Hullet y
c o l . , 19 69 ; Cr i a s m a n y c o l . 1975), e s p e c i a l m e n t e c l u l a s s a n g u n e a s . S u a p l i c a c i n p a r a e l
anlisis de clulas procariotas es menor, debido a que el contenido en constituyentes objeto
de anlisis (componentes intracelulares), en dichas clulas procariotas, es de dos a cuatro
rdenes de magnitud inferior que en eucariotas, lo cual hace que se requieran equipos
mucho ms sensibles (Steen y Boye, 1 980; Steen y col., 1 982).
Existen pocos estudios donde se empLee la CMF para el seguimiento de los
componentes de la poblacin durante un proceso fermentativo, esto es, para el estudio de
transformaciones microbianas (Bailey, 1 978; Fazel-Madjlessi y col., 1 979; Agar y Bailey,
1 982; Alberghina y col., 1 99; Alberghina y Porro, 1 993).
Bailey y colaboradores (Bailey, 1 977; Bailey y col., 1 978; Fazel-Madjlessi y Bailey,
1 979) emplean la CMIF para conocer la evolucin de componentes intracelulares en
bacterias, apuntando la necesidad de conocer la cantidad de cada componente para la
aplicacin de Modelos Cinticos.
A. pesar de las enormes ventajas de la CMIF frente a otras tcnicas, como las
microbiolgicas o bioqumicas convencionales, esta tcnica presenta inconvenientes a la
hora de emplear los datos necesarios para la formulacin de Modelos Cinticos, debido a
117
Procedimlento Experimental
que dichos datos vienen dados en unidades relativas (unidades de fluorescencia) y no en
absolutas (unidades de concentracin), como es necesario para dicha tarea
Para obtener valores cuantitativos mediante Citometra de Flujo es necesario
disponer de estndares con los que poder comparar, para interpretar correctamente los
resultados relativos obtenidos por CMF (Alberghina y col. 1 991 ). Para las distribuciones de
tamao y volumen celulares en diferentes experimentos, el canalizador puede ser calibrado
mediante estndares de tamao y volumen conocido. Sin embargo la medida de
fluorescencia es siempre relativa, no disponiendo de estndares de componentes
intracelulares de concentracin conocida para el calibrado del aparato. Algunos autores
realizan una comparacin entre los datos de Intensidad de Fluorescencia (IF) con los datos
cuantitativos obtenidos mediante otras tcnicas; por ejemplo, Agar y Bailey (1 982) y
Alberghina y col. (1 991 ) emplean tcnicas bioqumicas para determinar esta relacin, pero
slo Agar y Bailey. (1 982) muestran una correlacin entre el nmero de canal del citmetro
con la cantidad de componente por clula obtenido por anlisis mediante tcnicas
bioqumicas.
Basados en el trabajo llevado a cabo por Agar y Bailey (1 982), se abord el estudio
para establecer una correlacin entre los datos obtenidos mediante CMF con otras tcnicas
de anlisis.
2.5.1 .- Anlisis de Componentes Intracelulares por Espectrofotometra de Absorcin
Con el fin de llevar a cabo una cuantificacin de los componentes celulares y, de
esta forma, obtener datos cuantitativos con los que relacionar los de Intensidad de
Fluorescencia (IF) obtenidos mediante CMF, se realiz la puesta a punto de tcnicas para el
anlisis de protena total, DNA y RNA a lo largo de una fermentacin llevada a cabo por
Xanthomonas campestris realizada en fermentador y bajo las condiciones ptimas de
produccin de xantano (Santos, 1 993).
2.5.1 .1 .- Anlisis de Protenas
Para realizar la cuantificacin de protenas totales se emple el mtodo de Lowry
(Lowry y col., 1 951 ), por ser una de las tcnicas ms habitualmente utilizadas. Se trata de
1/8
Procedimiento Experimental
un mtodo colorimtrico basado en el hecho de que los grupos fenlicos de las tirosinas
presentes en las protenas reducen el reactivo de Folin, dando un complejo de color azulado
cuya intensidad es proporcional a la concentracin de protena. Para la formacin del
complejo azulado es necesario que las tirosinas estn accesibles al reactivo de Folin, para lo
cual se aaden iones calcio que se unen a las protenas dando complejos protena - calcio.
Previo a la aplicacin de esta tcnica, fUe necesario poner a punto un protocolo de
rotura celular y homogeneizacin de las clulas que es detallado a continuacin.
El primer paso a realizar es el la va do y rotura de clulas, con esta etapa se pretende
obtener el homogeneizado de la muestra sobre el que se va a realizar el anlisis. Para ello,
se toma un volumen determinado de muestra y se centrifuga durante 30 minutos a 4000
r.p.m. (2860 g) con el fin de separar las clulas del medio de cultivo. Se resuspende el
precipitado en tampn Tris. Esta operacin se debe realizar al menos cinco veces, con el
fin de eliminar todo el polisacrido que pudiera estar pegado a las clulas, lo cual
introducira un error enorme en este ensayo en concreto, debido a la interferencia entre el
vantano con el reactivo de Folin.
Se vuelve a centrifugar a 4000 r.p.m (2860 g) durante 1 5 minutos y el precipitado se
resuspende en 2 mL de una disolucin de lisozima (1 0 mg/mL en tampn Tris). Se agita
y sonica durante 1 minuto para romper los agregados que pudieran dificultar la accin de
la enzima. A continuacin, se incuba la muestra a 37 oc durante 30 minutos; pasado este
tiempo se aade lOO ktL del Tampn B. Se incuba con este tampn durante 1 0 minutos a
37
0C. Finalmente, se adiciona 1 mL de una disolucin de NaOH IN para detener la
reaccinenziuntica.
Una vez obtenido el homogeneizado, se toma 1 mL y se le aaden 5 mL del reactivo
Lowry C (Lowry A:Lowry B, 50:1 ), se agita e incuba durante 30 minutos a temperatura
ambiente. A continuacin se aaden 0,5 mL del reactivo de Folin (dilucin 1 /2), se agita
bien la mezcla e incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Finalmente se procede a la lectura de la absorbancia a 500 nm, empleando como
blanco agua destilada a la que se le haya efectuado el mismo tratamiento que a las dems
muestras desde la etapa de adicin de la lisozima, la cual ser cuantificada tambin como
protena y cuya concentracin debe ser restada en todas las muestras.
Los valores de absorbancia obtenidos son extrapolados en la curva patrn previamente
realizada con patrones de Albmina de suero de bovino (BSA) con concentraciones
entre 1 0 y 1 00 pg/mL.
119
Procedimiento Experimental
La Ecuacin [2.9] es la obtenida mediante ajuste por regresin lineal de los valores de la
absorbancia con la concentracin, el valor del coeficiente de correlacin obtenido de este
ajuste es r0,998. En la Figura 2.1 2 se muestran los resultados obtenidos.
cA =4/~,674>
PR
[2.9]
Figura 2.12.- Calibrado para protenas obtenido mediante el mtodo de Lowry.
Se realizaron medidas de la evolucin de protenas a lo largo de una fermentacin
para la produccin de xantano empleando este mtodo. La Figura 2.1 3 muestra los
resultados obtenidos para dos ensayos realizados con cada una de las muestras tomadas a
diferentes tiempos. Como puede observarse, ambos ensayos proporcionan resultados
similares, lo que estara indicando la buena reproducibilidad del mtodo de Lowry para el
anlisis de protenas.
0,16
A(500nm)
120
Procedimlento Experimental
O lO 20 30 40 50 60
t(h)
protenas intracelulares de Xanthomonas campestris por
mtodo Lowry.
o
0.6
0,4
0,2
0
Figura 2.13.- Evolucin de
anlisis con el
2 . 5 . 1 . 2 . Anlisis de cidos Nueleicos
Los cidos nucleicos de la bacteria objeto de estudio fueron extrados y purificados a
partir de las clulas mediante un procedimiento que puede considerarse una modificacin
del mtodo de Sambrook (Maniatis y col., 1 983).
El anlisis requiere de la digestin enzimtica con RNAasa para la medida del DNA
y con DNAasa para el anlisis de RNA, pues ambos componentes interfieren en el anlisis
debido a que la tcnica se basa en la absorbancia a 260 nm que es la longitud de onda
caracterstica de los cromforos de los cidos nucleicos, esto es, de las bases nitrogenadas.
Inicialmente se realiz el anlisis previa rotura de clulas y posterior digestin con la
enzima correspondiente, pero debido a la labilidad de las molculas de cido nucleico se
invirti el orden en este protocolo, es decir una primera etapa en la que se trataba con
DNAasa o RNAasa (previa permeabilizacin de las clulas a las enzimas) y una posterior
etapa de rotura celular, de esta forma se consigui una significativa mejora en la
repetitividad de los resultados.
0
121
Procedimiento Experimental
El protocolo de preparacin de las muestras para el anlisis de cidos Nucleicos
mediante el mtodo de Sambrook Modificado se detalla a continuacin:
En primer lugar debe realizarse el lavado de las clulas mediante centrifligacion a 4000
r.p.m. (2860 g) durante 30 minutos y resuspensin del precipitado en el tampn Tris. Esta
operacin se repite 5 veces para eliminar el xantano adherido a las clulas. A
continuacin se procede al f ijado de las clulas, con ello se pretende abrir poros en la
pared de la bacteria para permeabilizarla a las enzimas que se van a emplear. Para ello,
una vez lavadas las clulas se centrifugan a 4000 r.p.m. (2860 g) durante 1 5 minutos y se
resuspenden en 3 mL de la disolucin de glutaraldehido al 3% en Tris 0.1 M - NaC 0.1
M. se agita y sonica durante 1 minuto para disgregar los agregados de clulas, que se
forman con frecuencia, y finalmente se incuba durante 4 horas a 4
0C.
Una vez eliminado el glutaraldehido mediante centrifugacin a 4000 r.p.m. (2860 g)
durante 1 5 minutos, y la posterior resuspensin en tampn Tris, las muestras son pasadas
a Eppendorf previamente esterilizados. Las clulas son centrifugadas a 1 0000 r.p.m.
(18000 g) durante 1 0 minutos y resuspendidas en una disolucin de DNAasa 1 mg/mL
cuando se quiera analizar RNA y en una disolucin de RJNAasa 1 mg/mL cuando lo que
se quiere analizar es DNA. Se incuba, en ambos casos a 370C. durante 30 minutos.
Pasado el tiempo de incubacin, las clulas son tratadas para conseguir su rotura. Para
eflo, se centrifuga a 1 0000 r.p.m. (1 8000 g) durante 1 0 minutos y se resuspende el
precipitado en una solucin de lisozima lO mg/mL se agita e incuba durante 1 5 minutos
a 37 T y, a continuacin, se aade lOO gL de tampn 3, se incuba durante 1 5 minutos
a 370 C y se mezcla cada 5 tninutos por inversin.
Pasado el tiempo de incubacin, se realiza la extraccin y purificacin del cido
nucleico, pa ra lo cual se aaden 400 gL de fenol (equilibrado en tampn Tris), se agita
sua vemente y se centrifuga durante 5 minutos a 10000 r.p.m. con esto se consigue la
desproteinizacin, quedando el cido nucleico en la fase superior. Dicha fase se pasa a un
Eppendorf limpio, aadindose 400 .ii de una disolucin de cloroformo - alcohol
isoamulico. se agita y centrifuga a 1 0000 r.p.m. durante 5 minutos. Se pasa la fase
superior a Eppendorf limpio y se repite esta operacin 2 3 veces (fenol, cloroformo-
alcohol isoarnilico). Finalmente se pasa la fase superior a un tubo de vidrio estril y se
aaden 2 mL de etanol al 90 % (a 40C) dejndolo resbalar por las paredes para que
quedendos fases. Se deja precipitar de 1 a 4 horas a -700C.
Se recoge el cido nucleico precipitado mediante centrifugacin, se lava el precipitado
con 500 4L de etanol al 70 %.y despusseresuspendeenimL de tampn Tris.
122
Procedimiento Experimental
Luego se preparan diluciones a partir del cido nucleico resuspendido empleando el
mismo tampn.
Se lee la absorbancia a 260 nm. Tambin es necesario medir la absorbancia a 280 nm
para conocer si el cido nucleico extrado esta impurificado con protenas. Si el cociente
entre la lectura de absorbancia a 260 nm y el de 280 nm es aproximadamente 1 ,8 el DNA
est puro; en cuanto al RNA este cociente debe ser prximo a 2, para poder considerar
que se ha purificado. Para convenir los valores de absorbancia en concentracin se
realiza de la siguiente forma (Sambrook y col., 1 987):
Para RNA: 1 unidad de absorbancia es aproximadamente 40 yig/mI.
Para DNA: 1 unidad de absorbancia es aproximadamente 50 .tg/mL.
Los resultados experimentales del anlisis de las muestras tomadas del fermentador
se muestran en la Figura 2.1 4 para el DNA y en la Figura 2.1 5 para el RNA. Como se
puede observar, los valores obtenidos en cada ensayo son bastante diferentes y, por tanto, el
mtodo no permite obtener resultados repetitivos. La dispersin obtenida en los resultados
proporcionados por el anlisis descrito hace que este mtodo no sea aplicable para conseguir
datos utilizables en el desarrollo de modelos cinticos, ya que en ocasiones el error llega al
70%. No obstante, hay que comentar que desde un punto de vista cualitativo los resultados
son buenos, debido a la buena purificacin del cido nucleico.
0,4
0,2
Q
0.0
0 0 20 30 40 50 60
t (h)
Figura 2.1 4.- Evolucin de la concentracin de DNA
el mtodo de Sambrook modificado.
de Al campestris medida por
223
Procedimiento Experimental
.4
0
30
(h)
Figura 2.15.- Evolucin de la concentracin de RNA
por el mtodo de Sambrook modificado.
De todo lo anterior sobre el anlisis de componentes intracelulares mediante pruebas
bioqumicas basadas en la medida de absorbancia por espectrofotometra de absorcin se
puede concluir que el mtodo Lowry permite una buena cuantificacin de las protenas,
mientras que el mtodo de anlisis de cidos nucleicos no aporta resultados repetitivos,
debido a ciertos inconvenientes que pueden resumirse en los siguientes aspectos:
Las sucesivas centrifttgaciones requeridas en el anlisis pueden provocar la prdida de
cierta cantidad del componente.
2.- Puede existir un elevado error en el mtodo debido a la interferencia 1 y en la
absorbancia a 260 nm, entre las protenas y los cidos nucleicos.
3< - La ruptura y degradacin de las molculas a analizar (debido a su labilidad) pueden
suponer tambin una fuente importante de error.
de Xi campestris medida
124
Procedimiento Experimental
2.5.2.- Tcnicas de Fluorescencia
Debido a que no se obtuvieron buenos resultados con las tcnicas basadas en la
espectrofotometra de absorcin para la cuantificacin de componentes intracelulares y su
posterior relacin con los datos obtenidos mediante CMI, fue necesario buscar otra tcnica
que permitiese solventar los inconvenientes observados, bsicamente relacionados con la
rotura y extraccin del componente intracelular.
Por ello, la tcnica que se emple fUe la Espectrofluorimetra (EFM), que se basa, al
igual que la CMI, en la medida de la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos
unidos de forma especfica al componente objeto de anlisis. La gran ventaja ofrecida por
esta tcnica es que la preparacin de las muestras es idntica a la seguida para Citometria de
Flujo, es decir no implica rotura celular ni extraccin del componente. Adems permite
obtener curvas patrn para la correlacin entre la intensidad de fluorescencia con la
concentracin del componente.
El fluorforo ms habitualmente empleado para la tincin de protenas es el
[sotiocianato de Fluorescena (ITCF), el cual forma uniones covalentes permitiendo el
anlisis de protena total (Petit y col., 1 993).
El protocolo de preparacin de las muestras para el anlisis de protenas mediante
ambas tcnicas t1 uorimtricas (CMF y EFM) se detalla a continuacin y se presenta
esquematizado en la Figura 2.1 6.
En primer lugar debe realizarse el lavado y fijado de las clulas, siendo esta etapa
idntica a la ya descrita en el apanado anterior. Con ello, adems de eliminar el xantano
pegado a las clulas, se consigue la perrneabilizacin de la pared del microorganismo
para que entren tanto los fluorocromos como las enzimas.
Con el fin de llevar siempre un determinado nmero de clulas al Citmetro, es necesario
ajustar la concentracin de las mismas. Este ajuste se ha realizado por contaje mediante
el contador de partculas Coulter Counter con un tubo de 30 l.tm, y diluyendo las muestras
en tampn Tris para llevar un nmero de clulas en un intervalo entre 500-2000 cel4tL.
Una vez ajustada la concentracin, las muestras son pasadas a Eppendorf estriles con el
fin de proceder a la tincin especfica.
125
Procedimiento Experimental
MUESTRA
Cenrijugac on :000 r.p.m.
1 0 mnuut
SOBRENADANTE PELLET
(Clulas)
LAVADO Cenlrifugacin 5000 r.p.m.
110 mm
CELULAS LAVADAS
Cenrrifugacin 5000 r.p.m., 10 muz
FIJADO Resuspensin Re/le Glutaraldehido 3 00
4/r 40(
CELUL4S FIJADAS
} Cenrjgacin 5000 r.p.m.
L O mit? .
Resuspensi n en Tampn Tris
AJUSTE CONCENTRClON
~NAS
TINCIN con Tel (0.1 ng/mL)
I
Incubar 4 C
40 mm
LAVAR E
DICESTIONRNAasa DIGESTIN DNA aso
(1 mg/LI, 3 7 C, 4Omin) < 1 mg/mL. 3 7( , 40 mm.)
TINCIN conIP (0.1 mg/mL)
I ncub ar 4 C , / 0
MEDIDA en CITMETRODE FLUJOy en FLUORMETRO
Figura 2.1 6.- Protocolo de preparacin de las muestras para anlisis por
Espectrofluorimetria y Citometra de Flujo.
126
Procedimiento Experimental
Para la tincin con ITCE se centrifuga a 1 0000 r.p.m. (1 8000 g) durante 1 0 minutos. El
precipitado es resuspendido en una disolucin de ITCF de 0,1 mg/mL se agita e incuba a
4
0C durante 1 hora, posteriormente se lavan las clulas tres veces en Tampn Tris, para
eliminar el exceso de fluorforo que podra provocar problemas en la fluorescencia de
fondo en el anlisis.
Para la lectura de f luorescencia en el espectrofluormetro, la longitud de onda de
excitacin ha sido 498 nm con una rendija de 4, para la emisin, la longitud de onda fue
de 520 nm y una rendija de 2. La temperatura de anlisis fue 250 C en todos los casos.
Los valores de fluorescencia obtenidos son extrapolados en la curva patrn previamente
realizada con uSA (albmina de suero de bovino) de concentracin conocida, para
obtener las curvas correspondientes se realiz el calibrado de la siguiente forma:
Ca libra do del Anlisis por Fluorimetra sara Protenas
Para el calibrado de protenas se emple albmina de suero de bovino (BSA). Debido a
que el fluorforo empleado para la tincin de protenas (Isotiocianato de Fluoresceina)
emite fluorescencia tanto si se encuentra unido a las molculas de protena como si no lo
est, fue necesario eliminar el exceso de ITCF para evitar de esta forma la fluorescencia
de fondo. Para ello, se aplic una disolucin de 1 mg/mL a una columna de filtracin de
membrana (PO lO). Las primeras fracciones son las correspondientes a la proteina unida
al ITCE. Se realiz una valoracin de la concentracin proteica de esta fraccin, para lo
cual se emple el mtodo de Lowry (Lowry y col., t951 ). A partir de esta disolucin se
preparan muestras en un intervalo de concentracin entre 0,01 a 0,5 mg/mL. Los
resultados de la relacin intensidad de fluorescencia (IF) con la concentracin de
protenas se reflejan en la Ecuacin [2.1 0], en este ajuste el coeficiente de correlacin fue
de r0,952.
c;~(g/L) = 1,93 1W3 .jJ7F ED [2.10]
La Figura 2.1 7 muestra los resultados obtenidos al analizar la evolucin de las
protenas mediante espectrofluorimetra a lo largo de la fermentacin. Los datos son
expresados en concentracin, por extrapolacin de la intensidad de fluorescencia de
acuerdo a la ecuacin [2.1 0]. Los resultados para los dos ensayos realizados son repetitivos
al igual que ocurra con el anlisis mediante el mtodo Lowry.
Aunque los resultados obtenidos para el anlisis de protenas mediante el mtodo
Lowry eran repetitivos, se decidi realizar la correlacin de los datos obtenidos mediante
127
Procedimiento Experimental
CrVIF con los obtenidos mediante espectrofluorimetra. La razn ftmndametnal es que la
preparacin de las clulas por ambas tcnicas de anlisis es idntica.
0
0.
Para llevar a cabo el calibrado de los datos obtenidos por CMF con los obtenidos
por EFM se emplearon 50 muestras, las cuales se obtuvieron a lo largo de un proceso
fermentativo con el fin de obtener datos a lo largo de toda la fase de crecimiento del
microorganismo y as obtener todo el intervalo de concentracin posible de protenas. La
Figura 2.1 8 muestra la relacin entre el valor de Mean (intensidad media de fluorescencia
por clula) con el contenido por clula (g/clula) de protena obtenido al extrapolar los datos
de IFF en la Ecuacin [2.1 0]. La curva de calibrado se ha obtenido con muestras con un
nmero de clulas comprendido entre 200 a 2000 cel! gL. La Ecuacin [2.1 1 1 muestra la
correlacin obtenida de esta forma:
C(g/L) = (0,25 IF5,9S) ED NC [2.1 1 ]
0,8
o
0.4
(It
Figura 2.1 7.- Evolucin de protenas obtenida mediante EFM.
128
Procedimiento Experimental
-
Q
IF (nnn)
Figura 2.1 8.- Calibrado CMF - Espectrofluorimetra para Protenas.
Para el Anlisis de cidos Nuteicos, el fluorforo empleado para la tincin de
ambos tipos de cidos nucleicos es el loduro de Propidio (II) que es un agente intercalante
entre pares de bases en cidos nucleicos de doble hebra; por tanto se une tanto a DNA como
a RNA, lo que implica que debe realizarse un tratamiento previo con RNAasa o con
DNAasa en fUncin del cido nucleico a analizar (Petit y col., 1 993).
Se pueden emplear tambin fluorforos especficos para cada tipo de cido nucleico,
por ejemplo naranja de acridina para RNA y DAPJ para DNA (Mafiah y col., 1 993), pero,
en principio, se decidi realizar el estudio con IP, por ser uno de los fluorforos ms
habitualmente empleados.
El protocolo de preparacin de las muestras para el anlisis de cidos nucleicos
mediante ambas tcnicas fluorimtricas (CMF y EFM) se muestra tambin de forma
esquemtica en la Figura 2.1 6, presentada anteriormente, el protocolo de este anlisis se
detalla a continuacin:
15,
20 30 40 60 60 70 80
129
Procedimiento Experimental
En primer lugar, debe de realizarse el lavado y fijado de las clulas, siendo esta etapa
idntica a la va descrita en el apartado anterior. Con ello, adems de eliminar el xantano
pegado a las clulas, se consigue la permeabilizacin de la pared del microorganismo
para que entren tanto los fluorocromos como las enzimas.
Con el fin de llevar siempre un parecido nmero de clulas al citmetro, es necesario
ajustar la concentracin de las mismas. Esta operacin se ha realizado mediante el
contador de paniculas Conter Counter con un tubo de 30 ~m,y diluyendo las muestras
en tampn Tris para llevar un nmero de clulas en un intervalo entre 500-2000 cel4tL.
Debido a que cliP se une tanto a DNA como a RNA, debe hacerse un tratamiento previo
con DNAasa o RNAasa, segn el componente a analizar (Petit y col., 1 993). Las etapas a
seguir, una vez fijadas las clulas, son las siguientes:
Digestin con enzimas. S e reparte 1 mL de cada muestra en tubos lBppendorf y se
centrifugan a 1 0000 r.p.m. (1 8000 g) durante 1 0 minutos. Se resuspende el precipitado en
una disolucin de DNAasa 1 mg/mL en Tris 0.IM-NaCI, (pH 7,4) para el anlisis de
RNA, y en tina disolucin de RNAasa de 1 mg/mL en Tris 0,1 M-NaCI, (pH 7.4) para el
de DNA; se agita e incuba a 37
0C durante 40 minutos.
Para la tincin con IP primero es necesario centrifugar a 1 0000 r.p.m. durante lO
minutos para eliminar la enzima. El precipitado se resuspende en una disolucin de IP de
0,1 mg/mL en Tris posteriormente sc debe agitar y, protegido de la luz, incubar a 4 ~C
durante lO minutos.
Para la lectura f luorescencia de las muestras teidas con IP deben emplearse las
siguientes condiciones de anlisis en el Espectrof luorimetro: longitud de onda de
excitacin de 536 nin y una rendija de 1 9. Para la emisin se emple una longitud de
onda de 623 nm y una rendija de 5. La temperatura empleada durante el anlisis fue de
25~ C en todos los casos.
Los valores de fluorescencia obtenidos son convenidos en concentraciones de DNA y
RNA por calibrado. Para obtener las curvas correspondientes se realiz el calibrado de
la siguiente forma:
Calibrado del Anlisis por Fluorimetra para cidos Nucleicos
Para el calibrado de DNA y RNA se emplearon, respectivamente, patrones de DNA de
timo de bovino y RNA de levadura en un intervalo de concentraciones entre 0,001 a 0.1
mg/mL. Tiendo con loduro de Propidio 0,02 mg/mL. ya que se comprob que sta era la
concentracin de saturacin de la disolucin de 0,1 mg/mL de DNA y RNA para el IP.
13 0
Procedimiento Experimental
Los resultados obtenidos del ajuste por regresin lineal de los datos de concentracin de
las disoluciones patrn con los valores de Intensidad de Fluorescencia (
1pE), se muestran
en las ecuaciones [2.1 2] y [2.1 3]:
< g L)=3 ,68!0 UF> ED [2.1 2]
Cj(g Lp 3 ,4610> lE . ED 1 2.1 3]
Siendo [F~ la intensidad de fluorescencia medida en el fluorimetro y FD el factor de
dilucin de la muestra analizada.
Para el anlisis de las muestras en el Citmetro de Flujo las condiciones empleadas son:
Filtro para la excitacin de 488 mn, mientras que para emisin el filtro empleado fue de
600 nm. La fuente de iluminacin fue una lmpara de xenon de 75 W.
Una vez preparadas las muestras procedentes del fermentador, siguiendo el protocolo
que se ha indicado ms arriba, se obtuvieron los resultados tanto de su anlisis mediante
EFM como por CMF.
En el caso del anlisis utilizando CMI, se obtiene un histograma por muestra, con
una serie de datos estadsticos, como son la media de la intensidad de fluorescencia por
clula (Mean) y el coeficiente de variacin (CV), adems de indicar el nmero de clulas
por unidad de volumen. Los histogramas obtenidos en el anlisis de muestras lo han sido de
forma monoparamtrica para cada componente. La abcisa representa la distribucin de la
seal de fluorescencia en canales y la ordenada el nmero relativo de clulas. En la Figura
2.1 9 se muestra un histograma tipo, de los obtenidos para una muestra analizada mediante
CMF. Se muestra en la citada figura un histograma correspondiente a la fluorescencia verde
(FLI) que es la fluorescencia emitida por las protenas teidas con isotiocianato de
fluorescena. El otro histograma muestra la fluorescencia roja (FL2) que es la fluorescencia
emitida por los cidos nucleicos (DNA y RNA> teidos con loduro de propidio. En ambos
casos la fluorescencia media por clula aporta el valor Mean, necesario para realizar la
cuantificacin del componente correspondiente.
Las Figuras 2.20 y 2.21 muestran la evolucin de DNA y RNA obtenidas mediante
espectrofluorimetria a lo largo de la fermentacin. Los datos son expresados en
concentracin por extrapolacin de la intensidad de fluorescencia de acuerdo a las
13 1
Procedimiento Lrperimental
ecuaciones [2.1 2] y [2.1 3], para DNA y RNA, respectivamente. Los resultados obtenidos
para los dos ensayos realizados son repetitivos y evitan los problemas encontrados con los
mtodos basados en la espectrofotometra de absorcion.
4,
o.
0~
2
FL2
FLI 2 21 70
4.
c.
2
0
(-y
54;?
1 5 6
Figura 2.1 9.- Histograma tipo de una muestra obtenida mediante CMF. FI] es la
fluorescencia verde (protenas) y FL2 la fluorescencia roja (cidos
nucleicos).
0,4
10
7
0,0
Figuras 2.20.- Evolucin de RNA durante
Espectrofluorimetra.
la fermentacin analizado por
4
~~1
13 2
Procedimiento Experimental
0,4
0.2
rj~
0,0
50 60
Figura 2.21 .- Evolucin de RNA durante la fermentacin analizado por
Espectrofluorimetria.
De lo visto en este apartado para el anlisis de cidos nucleicos mediante tcnicas
basadas en la medida de la fluorescencia de las clulas teidas con IP, se puede concluir que
la espectrofluorimetra es una tcnica que permite la correcta cuantificacin de los
componentes intracelulares, dada la repetitividad de los resultados conseguidos en dos
anlisis de las mismas muestras. Por lo tanto, con esta tcnica se pueden obtener resultados
fiables para el seguimiento de cidos nucleicos durante un proceso microbiano. No obstante,
ya se coment anteriormente que, debido a las enormes posibilidades que presenta la
Citometra de Flujo frente a otras tcnicas, era interesante emplear esta tcnica para efectuar
el seguimiento de los diferentes componentes intracelulares. Ahora bien, es necesario
encontrar la forma de obtener resultados cuantitativos con dicha tcnica. Debido a que la
fluorimetra rinde resultados fiables para obtener una relacin cuantitativa con los datos de
intensidad de fluorescencia de la CMF como hicieron Agar y Bailey (1 982)-, se pens en
obtener una relacin entre los datos cuantitativos conseguidos mediante espectrofluorimetra
y los datos en unidades relativas obtenidos por Citometra de Flujo.
Ya que el protocolo de preparacin es idntico para ambas tcnicas, la misma
muestra fue analizada utilizando ambos mtodos de anlisis. La correlacin CMTF-EFM para
DNA y RNA fue realizada mediante el anlisis de 50 muestras para cada clase de cido
nucleico. La misma muestra era analizada mediante ambas tcnicas en un intervalo de
1 3 3
O lO 20 30 40
t (h)
Procedimiento Experimental
tiempo no superior a 5 horas, para evitar posibles errores como consecuencia de la prdida
de fluorescencia. Es importante llevar al citmetro muestras con un nmero de clulas por
unidad de volumen muy similar, prcticamente igual, con el fin de que los histogramas
fuesen siempre comparables, por lo que las muestras analizadas tenan todas tina
concentracin celular comprendida entre 200 a 2000 eel/gL. Otro aspecto importante a tener
en cuenta, a la hora de realizar el caJibrado, es el intervalo de concentracin de cada tipo de
cido nucleico pues era absolutamente necesario cubrir todo el intervalo que permitiese
posteriores anlisis, durante todo el ciclo celular de la bacteria. Para ello, las 50 muestras
analizadas fueron tomadas durante las diferentes etapas de la fase de crecimiento de
Xanthomonas campestris y, de esta forma, se obtuvo todo el intervalo de concentracin
posible. En la Figura 2.22 aparece reflejada la relacin entre las medidas conseguidas por
CMF y EFM para cidos nucleicos. Como puede verse en dicha figura, las pendientes
obtenidas al representar concentracin por clula vs. mean son iguales para ambos tipos
de cidos nucleicos, por tanto, el ajuste por regresin lineal se realiz uniendo lo obtenido
para el DNA y lo obtenido para el RNA. El resultado de este ajuste aparece reflejado en la
ecuacin [2.1 3]., en la que es necesario conocer el nmero de clulas (NC); este dato, como
ya se ha comentado, es obtenido tambin mediante Citometra de Flujo. El coeficiente de
regresin obtenido en este ajuste es r0,996.
C~\V~\~(g XL) = 0,11 JEwr ED NC [2.1 4]
o
y.,
2
70
IF(n~n)
Figura 2.22.- Relacin entre IF obtenida CMF y concentracin obtenida por EFM
20 30 40 50 60
23 4
Procedimiento Experimental
2.6.- MTODOS MATEMTICOS
Debido a que en la presente Memoria ha sido necesario la aplicacin de diferentes
tcnicas de clculo, se va a dedicar este apartado a realizar una breve descripcin de las
mismas.
Las tcnicas matemticas empleadas se pueden dividir en dos grandes grupos:
tcnicas de estimacin de parmetros a partir de datos experimentales (regresin) y tcnicas
de simulacin de la evolucin del sistema con las variables estudiadas. Todos los programas
de clculo empleados se han desarrollado para llevar a cabo este trabajo y han sido
realizados en FORTRAN 77. A continuacin se expone brevemente el fundamento y la
forma de aplicacin de estas tcnicas.
2.6.1 .- Tcnicas de Estimacin de Parmetros
Las tcnicas de estimacin de parmetros o regresiones se han empleado
principalmente en la aplicacin a datos experimentales de los modelos cinticos propuestos,
pero han sido necesarias previamente en la obtencin de las expresiones de calibrado de las
diferentes tcnicas de anlisis empleadas comentadas anteriormente.
Para la obtencin de las ecuaciones de calibrado de los diferentes mtodos de
anlisis se ha utilizado en todos los casos regresiones lineales, con ordenada en el origen o
sin ella, dependiendo del mtodo de anlisis empleado. El criterio de optimizacin
empleado ha sido el de los mnimos cuadrados:
y
t ~yexp Y eor Y -4 mnimo [2.1 5]
= 1
En los casos en los que se ha empleado este tipo de regresin, para describir el grado
de ajuste se ha tenido en cuenta el coeficiente de regresin, r.
En el caso de la aplicacin de estas tcnicas de regresin a datos experimentales,
en todos los casos se han utilizado mtodos no lineales basados en el algoritmo de
Marquardt (1 963). Dependiendo del modelo a aplicar, se ha llevado a cabo el ajuste en
13 5
Procedimiento Experimental
simple-respuesta o en mltiple-respuestaz es decir, se ha ajustado nicamente la evolucin
de un componente, generalmente debido a que en la expresin que representa su velocidad
de produccin no aparece ningn otro componente (simple-respuesta); o, por el contrario.
si las velocidades de produccin de varios o todos los componentes clave del sistema estan
tnterrelacionadas es necesario llevar a cabo la regresin simultnea de todos los
componentes (mltiple-respuesta). En este ltimo caso, se hace necesario igualar los
residuos de los diferentes componentes, en caso de que los valores de unos componentes
respecto a otros presenten diferencias significativas en rdenes de magnitud. es decir, se
hace necesario pesar los residuos para que todos los valores presenten la misma
significacin en el algoritmo de regresin, que de nuevo optimiza la suma de los cuadrados
de los residuos (ecuacin [2.1 5)).
La obtencin de todos los parmetros cinticos se ha llevado a cabo tanto en
trminos de velocidades de produccin como de velocidades de reaccin, empleando
siempre el mtodo integral, ya que es el mejor mtodo para llevar a cabo este clculo
cuando se cuenta con datos integrales (evolucin de la composicin del sistema con el
tiempo). En el caso de plantear los modelos cinticos trminos de velocidades de
produccin, es decir, como un conjunto de ecuaciones diferenciales, ha sido necesario
acoplar un mtodo numrico de integracin de las citadas ecuaciones, debido a que los datos
experimentales obtenidos son, como se ha indicado, datos integrales. El mtodo numrico
de integracin empleado ha sido el algoritmo de Runge-Kutta de cuarto orden, por lo que se
ha hecho necesario acoplar este algoritmo en forun de subrutinas a los programas
desarrollados para el ajuste de los datos experimentales a cada modelo cintico propuesto.
En la Figura 2.23 se puede observar el diagrama de flujo general del programa de regresin
no lineal empleado en los diferentes modelos cinticos ajustados.
Cuando se emplea el mtodo de velocidades de reaccin, el ajuste se lleva a cabo en
simple-respuesta, empleando como mtodo de integracin de las ecuaciones cinticas el
algoritmo de Simpson, siendo necesario, en este caso, acoplar una subrutina con el citado
algoritmo al mtodo no lineal de ajuste. En la Figura 2.24 se recoge el diagrama de flujo que
resume este mtodo de clculo.
En el caso de que el ajuste realizado con los modelos cinticos a los diferentes
experimentos llevados a cabo proporcione una evoLucin lgica de los parmetros que
1 3 6
Procedimiento Experimental
contienen, se lleva a cabo de nuevo el ajuste de todos los datos de los diferentes
experimentos introduciendo, en el lugar de los parmetros del modelo la expresin que
corresponda segn la evolucin observada en los ajustes previos.
En todas las regresiones no lineales llevadas a cabo se han considerado como
indicativos de la bondad del ajuste obtenido los siguientes parmetros estadsticos: E de
Fischer, indicativo del grado global de ajuste; t de Student, indicativo del grado de ajuste
parmetro a parmetro (relacionado con el intervalo de confianza de los parmetros: valores
mnimo y mximo proporcionados por el algoritmo de regresin); y SRC o suma de
residuos al cuadrado, indicativo de la calidad en la reproduccin de los datos
experimentales. La comprobacin de la bondad del ajuste, en lo referente a los parmetros
estadsticos comentados se realiza a partir de la comparacin con los valores de los mismos
para el 950o de confianza, segn el nmero de parmetros a calcular y el nmero de datos
que se emplean en el ajuste.
2.6.2.- Simulacin con los Modelos Cinticos
Las simulaciones o predicciones que se llevan a cabo con los diferentes modelos a
los que se han ajustado los datos experimentales sirven para comprobar qu influencias son
capaces de predecir en cada caso. Para ello, nicamente es necesario realizar la integracin
conjunta de todas las ecuaciones diferenciales que forman las velocidades de produccin del
modelo cintico del que se trate. Los programas desarrollados para realizar las simulaciones
necesitan nicamente el algoritmo de Runge-Kutta de cuarto orden para la integracin del
modelo y proporcionar los valores de las concentraciones de los diferentes componentes
clave del sistema, una vez introducidos los valores de los parmetros a emplear en la
simulacin, as como los valores de las variables a emplear (temperatura, agitacin, caudal
de aire, etc.) y los valores de las concentraciones iniciales de los nutrientes y de la biomasa.
En la Figura 2.25 se recoge el diagrama de flujo general de los programas empleados para
realizar la simulacin con los modelos cinticos.
13 7
Procedimiento Experimental
s
Figura 2.23.- Diagrama de flujo del programa de regresin no lineal en mltiple respuesta
empleado basado en el algoritmo de Marquardt (1 963).
NO
1
INVER
Clculo de inversa
k
RUNOE N
Ecuaciones
diferenciales
13 8
Procedimiento Experimental
s
Figura 2.24.- Diagrama de flujo del programa de regresin no lineal en simple respuesta
empleando el mtodo en velocidades de reaccin con el algoritmo de
Marquardt (1 963).
13 9
Procedimiento Experimental
INICIO
DIMENSIN
RUNGFN
Ecuaciones
diferenciales
ARCHIVO
RESULTADOS
RESULTADOS
Figura 2.25.- Diagrama de flujo del programa de simulacin empleado.
RLTNOKN
Algoritmo
Runge-Kutta
140
3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES
Resultados Experimentales
3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES
Se han realizado diversos experimentos, en todos ellos utilizando Xanthomonas
campestris para producir xantano, el polisacrido cuyas propiedades se describieron en la
Introduccin. En dichos experimentos se han mantenido constantes una serie de condiciones
de operacin, previamente estudiadas y optimizadas en otros trabajos (Santos, 1 993 y
Garca-Ochoa y col., 1 997). Estas condiciones de operacin son las siguientes:
- Inculo, realizado en una etapa en el medio YM a partir de un cultivo en medio
slido (YM agar) de menos de tres das. El inculo se incuba en incubadora
orbital durante 1 2 horas a 280 C.
- Medio de Produccin: este medio es el denominado Medio A, y que fue descrito
en el apartado 2.2.3 de esta Memoria, con el que se consigue un rpido
crecimiento de X Campestris y una produccin adecuada de xantano (Garca-
Ochoa y col., 1 992).
- pH inicial de 7,00 dejndolo evolucionar libremente a lo largo de la
fermentacin.
141
Resultados Experimentales
- Temperatura, la optimizada para la produccin es de 280 C. si bien se ha
experimentado a diferentes temperaturas como 25, 3 1 y 34 o C, para tratar de
describir la influencia de esta variable con un modelo cintico.
- Agitacin programada, ya que el extraordinario aumento de viscosidad, debido a
la produccin del polisacrido, hace que no pueda emplearse una agitacin fija.
Si la velocidad de agitacin es inicialmente muy alta, las bacterias sufren daos
celulares, pero si no se sube la agitacin cuando aumenta la viscosidad, no se
consigue una eficiente velocidad de transporte de oxgeno, y su concentracin
disminuye hasta cero, lo cual afecta de forma negativa al microorganismo, que es
aerobio estricto, y en consecuencia a la produccin del polisacrido.
En los experimentos realizados, se han variado dos condiciones de operacion:
- Temperatura, como ya fue establecido en un trabajo previo (Santos, 1 993) la
temperatura influye de forma considerable en la produccin, por ello se han
realizado experimentos a cuatro temperaturas diferentes 25, 28, 31 y 340 C.
- Concentracin inicial de nitrgeno, siempre en forma de amonio, se han
realizado experimentos con cuatro valores de concentracin de amonio: 65, 1 30,
257 y 475 p.p.m..
En total se han realizado 7 experimentos, cuyas condiciones se muestran en la Tabla
3.1 . La programacin de la agitacin, an siendo similar en todos los experimentos, varia,
debido a que el aumento de la agitacin es realizado segn la evolucin de oxgeno disuelto
en cada caso, y dicha evolucin no ha sido igual en los distintos experimentos, pues el
cambio de todas estas condiciones lleva a una evolucin del sistema bastante diferente.
A la hora de planificar el seguimiento de los distintos componentes del sistema a
estudiar, se hizo un planteamiento previo de los modelos cinticos que iban a ser aplicados
de modo que es lgico pensar que para los Modelos Cinticos No Estructurados, esto es los
modelos ms sencillos, el nmero de componentes a analizar sea reducido, mientras que el
142
Resultados Experimentales
nmero de componentes a seguir y/o analizar aumente con el grado de complejidad del
modelo. En los modelos cinticos ms complejos aplicados, los denominados Estructurados
o de Clula, es necesario realizar el anlisis de componentes intracelulares.
Por ello, desde el principio se realiz el seguimiento y anlisis del mayor nmero de
componentes con el fin de aplicar los diferentes tipos de modelos propuestos para los
mismos experimentos. Adems, todos los experimentos fueron repetidos dos veces con el
fin de tener el mayor nmero de datos a lo largo del tiempo de fermentacin. Debido a que
el tiempo a que se tomaron algunas de las muestras en las dos fermentaciones realizadas en
las mismas condiciones coinciden, los valores obtenidos se presentan como la media entre
ambos en la tabla correspondiente. Los resultados de los distintos experimentos se
representan en las Tablas 3.2 a 3.8, una para cada experimento.
Tabla 3.1 .- Experimentos realizados : condiciones variadas
Experimento
Medio A
Concentracin NH4~
(p.p.m.)
Temperatura
(
0C)
1 257 25
2 257 28
3 257 31
4 257 34
5 65 28
6 1 30 28
7 475 28
43
Resultados E? vperimentales
Tabla 3.2.- Resultados obtenidos en el Experimento n
0 1 . Condiciones experimentales:
250C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (21 0 r.p.m. iniciales)
Tiempo Biomasa
(It) (g/L)
0,00
1,00
2.00
4,00
5,75
7,75
9,00
10,00
12.00
16,50
1 7,00
20,00
24,00
24.50
2 5, 0 0
2 5.75
28,00
29,00
29,50
32,75
34,75
35,00
38.00
50,00
50,50
52,25
55,00
56,75
0.010
0,011
0,012
0,017
0,028
0,048
0,065
0,07 1
0,106
0,350
0,4 lO
0.62 5
0,780
0.862
0,901
0.930
0,938
0,989
1 ,222
1,400
1,53 0
1.560
1,590
1,618
1 ,620
1,680
1.680
1 ,680
O->
(0/ sat)
95,5
86.2
79,8
69,0
59,0
55,0
35,0
25.0
15,0
30,0
15,0
8,0
50
25,0
18,0
1 4,0
7.0
20,0
16,0
18,0
13,0
8,0
1 2,0
1 1 ,0
15,0
12,0
16,0
13.0
Agitacin
(rpm)
210
210
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
210
350
350
350
350
400
400
400
400
550
550
550
650
650
650
750
750
750
860
860
NH
4
(g/L)
0,310
0,300
0.290
0,270
0,250
0,2 10
0,190
0,180
0,160
0,080
0,070
0,060
0,077
0,073
0,069
0,067
0,055
0,050
0,045
0,035
0,029
0,025
0,022
0,021
0,020
0,020
0.020
0,020
Sacarosa
( gI L )
40,0
39,9
39,5
39,0
38,0
37,8
37,2
36,7
36,9
36,2
35,6
35,2
35,0
34,8
34,0
33,9
32,0
31,0
30.0
28,0
25,5
24,3
23,9
16,9
16,5
16,0
15,9
15,7
Xanrano
(g/L)
0.33
0,33
0,35
0,39
0,40
0,44
0,48
0,49
0,50
0,89
0,96
1,00
1 ,20
1,85
2,1 2
2,20
2.32
3,57
4,44
5,00
5,51
6,05
7,20
1 1 ,38
12,38
13,20
13,99
1 4,26
DNA
( gI L )
0,0025
0,0027
0,003
0,0035
0,0045
0.0082
0,011
0,019
0,022
0,036
0,070
0,150
0,190
0,2 10
0,250
0,270
0,290
0,320
0,340
0,349
0.370
0,400
0,420
0,430
0,430
0,430
0.430
0,430
RNA
(g/L)
0,0018
0,0019
0,002 1
0,0031
0,0055
0,0078
0.0095
0,012
0,019
0,063
0,073
0,108
0,1 4
0.155
0,1 62
0,167
0,168
0,178
0,2 19
0,259
0,270
0,280
0,283
0,288
0,290
0,304
0,306
0,306
Proteinas
(g/L)
0,005
0.005
0.006
0,009
0,011
0,020
0.021
0,030
0,032
0.089
0,120
0,198
0,260
0,350
0,450
0.460
0,469
0,500
0,600
0,720
0,750
0,780
0,800
0,820
0,830
0,830
0,830
0,830
44
Resultados Experimentales
Tabla 3.3.- Resultados obtenidos en el Experimento n
0 2. Condiciones experimentales:
280C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (21 0 r.p.m. inicial)
Tiempo Biomasa 02 Agitacin N1 -bt Sacarosa Xantano DNA RNA Protenas
(h) [ (g/L) (%) (rpm) (gIL) ~ J~fi~ ~ (gIL) (gIL)
0,309
0,300
0,298
0,287
0,280
0,275
0,269
0,266
0,254
0,247
0,220
0,1 90
0,166
0,140
0,1 00
0,082
0,073
0,05 5
0,045
0,025
0,013
0,001
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
36,5
36,4
36,0
36,0
35,9
35,7
35,0
34,7
34,0
33,8
33,5
32,9
32,0
31,8
28,7
26,0
25,0
24,0
23,0
21,0
20,2
1 8,0
1 7,2
1 2,0
1 0,6
1 0,6
1 0,6
1 0,6
0,00
2,00
4,00
7,00
9,00
12,00
1 3,00
14,50
1 6,00
16.50
19,50
23,50
24,00
24,50
28,00
32,00
33,50
34,00
38,00
38,50
39,50
41,50
42,00
43,75
48,00
48,50
52,00
59,00
0,070
0,084
0,099
0,130
0,156
0,209
0,229
0,2 88
0,300
0,350
0,480
0,620
0,663
0,790
0,910
1 ,220
1 ,252
1,350
1 ,400
1,450
1,500
1,548
1,560
1 ,580
1,580
1 ,580
1,580
1,580
100,0
73,0
59,0
34,0
24,0
16,5
1 0,5
8,0
5,0
35,0
25,0
1 5,0
5,0
28,0
1 9,0
1 5,4
10,2
24,5
18,5
1 0,0
5,0
1 7,0
28,0
21,8
20,3
30,0
28,0
21,0
21 0
21 0
210
210
210
210
21 0
21 0
21 0
310
31 0
310
310
380
380
380
380
550
550
550
550
650
650
650
750
850
890
890
2,1 9
2,1 9
2,19
2,19
2,23
2,29
2,33
2,39
2,59
2,62
2,99
3,90
5,82
6,21
7,30
7,59
7,78
8,10
8,40
8,90
1 0,48
11,20
12,00
13,28
14,90
15,13
15,22
15,20
0,017
0,031
0,037
0,042
0,049
0,065
0,085
0,120
0,137
0,165
0,199
0,235
0,240
0,250
0,290
0,330
0,335
0,3 50
0,370
0,3 75
0,380
0,390
0,395
0,395
0,395
0,395
0,395
0,395
0,01 2
0,020
0,021
0,030
0,035
0,042
0,048
0,054
0,081
0,088
0,1 1 0
0,1 49
0,160
0,1 70
0,199
0,215
0,229
0,230
0,255
0,260
0,265
0,269
0,270
0,270
0,270
0,270
0,270
0,270
0,035
0,039
0,044
0,050
0,058
0,069
0,089
0,092
0,115
0,129
0,135
0,21 0
0,250
0,3 20
0,480
0,600
0,7 10
0,720
0,760
0,765
0,772
0,775
0,780
0,780
0,780
0,780
0.780
0,780
1 4S
Resultados Experimentales
Tabla 3.4.- Resultados obtenidos en el Experimento n
0 3. Condiciones experimentales:
31 0C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (21 0 r.p.m. inicial).
1 1 1
Tiempo
(h)
Biomasa
ftLL.
~2
(% sat)
Agitacin
(rpm)
NH
4
...= L
Sacarosa
~
Xantano
(gIL)
DNA
(gIL)
RNA
(g/L)
Proteinas
(gIL)
0,220
0,2 19
0,21 2
0.200
0,197
0,190
0.189
0,180
0.172
0,170
0,084
0,064
0,057
0,056
0,050
0,048
0.030
0,027
0,025
0.015
0,010
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
40,0
40,0
40,0
39,9
39,9
39,9
39.89
39,80
39.50
38,20
38,00
36,50
36,00
34,00
33,00
32,00
30,00
29,70
29,20
28,30
27,00
26,02
25,60
25,00
24,60
24,20
0,00
0,50
1 ,1 5
3,00
3.50
6,00
8.00
8,50
9,00
10,00
12,00
14.50
15,00
16.00
18,50
20,00
23,50
24,00
24,50
25,00
26.50
27,00
28,00
30.00
31,75
35,00
0.130
0,150
0,158
0,169
0,173
0,199
0,230
0,25 1
0,304
0,385
0,420
0,550
0,590
0,600
0,680
0.700
0,890
0.900
0,950
0,985
0.990
1,026
1.026
1,07 3
1,058
1,058
90.0
59,0
46.0
34,1
23,0
1 4,5
35.0
22.0
1 2,8
10.0
6,0
32,0
20,0
12,0
8,0
4,0
22,0
18,8
17,0
10,0
20,0
1 8,0
15,0
20,4
16,3
15,0
21 0
21 0
210
21 0
21 0
21 0
350
350
350
350
350
450
450
450
450
450
500
500
500
500
580
580
580
700
700
700
0,39
0.39
0,39
0.46
0,47
0,53
0,60
0,67
0,87
0,87
0,91
0,99
1 ,1 0
2,30
3,20
3,50
4,30
4,80
5,20
5,90
6,20
7,00
7,21
8,07
8,67
8,60
0.01 2
0,01 2
0,01 2
0,013
0,015
0,018
0,021
0,02 8
0,030
0,032
0,036
0.048
0,067
0,072
0,082
0,100
0,126
0,129
0,130
0,132
0,143
0.145
0,152
0,158
0,160
0,160
0,003
0,004
0,006
0,007
0,010
0,016
0.010
0,021
0,024
0,030
0,033
0,040
0,055
0,065
0,078
0,099
0,116
0,1 22
0,126
0,129
0.131
0,133
0,138
0,1 42
0,143
0,143
0,010
0.01 2
0,01 4
0,025
0,027
0,050
0,07 8
0,086
0,095
0.116
0.160
0,230
0.250
0,280
0,320
0,400
0.470
0.500
0.530
0,564
0,580
0,590
0.590
0,590
0,590
0,590
146
Resultados Experimentales
Tabla 3.5.- Resultados obtenidos en el Experimento n
0 4. Condiciones experimentales:
340C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (21 0 r.p.m. inicial).
Tiempo
(It)
Biomasa
(gIL)
02
(% sat)
Agitacin
(rpm)
N1 -W~ Sacarosa
...LL....J (gIL)
Xantano
....Ls~LL...
DNA 7 RNA Protenas
~
0,00 0,045 97,70 210 0,202 40,0 0,94 0,011 0,008 0,020
3,00 0,087 81,00 210 0,175 39.8 0,99 0,021 0,015 0,043
6,00 0,104 70,00 210 0,1 61 38,9 1,00 0,026 0.019 0,520
9,00 0,122 60,00 210 0,156 38,3 1,13 0,030 0,022 0,061
12,00 0,135 67,50 250 0,148 37,9 1,16 0,033 0,024 0,067
14,00 0,191 50,00 250 0,147 36,8 1,20 0,047 0,034 0,095
14,50 0,200 45,00 250 0,145 35,7 1,30 0,100 0,036 0,102
18,00 0,280 30,00 250 0,143 34,1 1,50 0,070 0,050 0,140
20,00 0,320 29,00 250 0,142 34,2 1,90 0,080 0,057 0,160
24,00 0,407 41,20 280 0,140 33,0 2,05 0,101 0,073 0,203
24,50 0,496 32,30 280 0,139 32,5 2,20 0,124 0,089 0,248
30,00 0,698 28,10 280 0,133 31,4 4,47 0,174 0,125 0,349
33,00 0,739 20,50 280 0,127 30,5 4,98 0,184 0,133 0,369
36,00 0,820 45,00 350 0,125 28,9 5,75 0,205 0,147 0,410
36,50 0,890 40,00 350 0,122 28,0 6,50 0,220 0,160 0,440
40,00 0,950 38,00 350 0,120 27,9 7,50 0,237 0,171 0,475
42,00 1,090 43,00 350 0,119 27,8 8,00 0,272 0,196 0,540
45,00 1,089 42,00 350 0,110 27,5 8,12 0,272 0,196 0,540
48,00 1,089 45,00 350 0,110 27,2 8,12 0,272 0,196 0,540
147
Resultados Experimentales
Tabla 3.6.- Resultados obtenidos en el Experimento no 5. Condiciones experimentales
28 C, 65 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (21 0 r.p.m. inicial)
Tiempo
(h)
Biomasa O->
( IL) (%)
7~iacinNH
4~
fL~~L1 J~2
Sacarosa
(g/L)
Xantano
~
DNA
(g/L)
RNA Protenas
( L) ( /L)
0,0650
0,0620
0,0600
0,0550
0,0500
0,0400
0,0330
0.0220
0.0180
0,0120
0,0lO
0,008
0,007
0,005
0,004
0,0009
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
40,00
39,86
39,68
39,42
39,00
38,63
37,50
36.25
35.00
34,18
33,87
33,654
33,39
32,50
28,00
27,55
26,25
26,00
26,00
26,00
26,00
26,00
26,00
26,00
0,00
1,50
3,00
4,50
6,00
8,50
12,00
16,00
20,00
23,50
24,50
25.25
26,00
27.50
31,00
32,50
33,00
35,00
40,00
40.50
43.00
47,50
50.50
55,00
0.00853
0,00938
0,00980
0,01 1 0
0,0140
0,0330
0,0520
0,1 250
0,290
0,640
0,660
0,680
0,690
0,700
0,700
0,700
0,700
0,700
0.700
0,700
0,700
0.700
0,700
0,700
99.80
93.90
92.82
91 ,20
87,30
82,50
72.00
56.00
35.00
22,1 0
1 9,1 0
4 5,00
32,00
25,00
19,00
54,00
43,00
42.00
40,00
38.00
38,50
39,00
40,00
41,00
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
210
21 0
250
250
250
250
400
400
400
400
400
400
400
400
400
0,402
0,402
0,402
0,512
0.618
0,72 1
0,980
1 ,230
2,700
3,520
4,680
6,1 20
6,850
7,220
8,1 1 2
9,850
1 0,1 2
1 0,1 2
1 0,1 2
1 0,1 2
10,12
1 0,1 2
1 0,1 2
1 0,1 2
0,001
0,002
0,003
0,005
0,006
0,010
0,01 2
0,030
0,041
0,054
0,056
0,058
0,060
0.065
0,065
0,065
0,065
0,065
0.065
0,065
0,065
0,065
0,065
0,065
0.0008
0,0009
0,001
0,001
0,002
0.003
0,004
0,004
0,010
0,018
0,026
0.030
0,034
0,038
0,038
0,038
0,038
0,038
0,038
0,038
0.038
0,038
0.038
0,038
0,003
0,004
0,004
0.006
0,007
0,017
0,029
0,073
0,1 42
0,258
0,330
0,350
0,372
0,400
0,420
0.420
0,420
0,420
0.420
0,420
0,420
0,420
0,420
0,420
148
Resultados Experimentales
Tabla 3.7.- Resultados obtenidos en el Experimento n
0 6. Condiciones experimentales
280C, 1 30 p.p.m.
r.p.m. inicial).
de amonio inicial y velocidad de agitacin variable (21 0
Tiempo
(h)
Biomasa
(g/L)
O,
(% sat)
Agitacin
(rpm)
NH
4~
(g/L)
Sacarosa
(g/L)
Xantano
j(~
DNA
..sIL...
RNA
~
Proteinas
(g/L)
0,130
0,1 29
0,129
0,128
0,1 28
0,127
0,1 27
0,1 26
0,120
0,1 1 0
0,063
0,044
0,020
0,01 2
0,009
0,007
0,004
0,003
0,002
0,002
0,002
0,002
0,002
39,7
39,5
39,3
39,0
38,7
38,5
38,0
37,7
36,7
35,9
34,9
34,6
33,3
32,5
31 ,0
30,2
29,0
27,5
26,0
24,0
23,5
21,7
21,0
0,00
2,50
3,50
5,50
7,50
8.50
9,25
10,50
1 6.00
20.00
24,25
25.00
26,50
28,50
30,50
31,50
32,00
33,50
38,00
45,00
49,00
50,00
51 ,00
0,01 1
0,015
0,017
0,026
0,027
0,034
0,055
0,07 5
0,098
0,300
0,580
0,654
0,691
0,703
0,706
0,708
0,709
0,710
0,712
0,712
0,7 12
0,712
0,71 2
1 00,0
98,0
93,0
86,0
78,0
70,0
67,0
55,0
35,0
26,0
1 8,0
45,0
33,0
32,0
29,0
25,0
23,0
20,0
19,0
30,0
21,0
1 9,0
1 8,0
210
210
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
210
21 0
21 0
210
310
310
31 0
310
310
31 0
310
310
450
450
450
450
0,52 1
0,52 1
0,52 1
0,541
0,561
0,581
0,623
0,792
1 ,480
1,980
2,350
2,297
3,297
4,01 6
5,105
5,920
7,080
8,939
1 0,300
1 1 ,200
11,500
12,000
1 2,900
0,001
0,002
0,002
0,004
0,005
0,006
0,008
0,01 2
0,015
0,045
0,079
0,082
0,103
0,105
0,105
0,1 06
0,106
0,106
0,1 06
0,1 06
0,106
0,106
0,106
0,001
0,001
0,002
0,003
0,003
0,004
0,006
0.009
0,020
0,036
0,069
0,07 8
0,083
0,084
0,084
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,006
0,008
0.010
0,01 4
0,015
0,019
0,027
0,032
0,056
0,1 74
0,336
0,379
0,400
0,405
0,409
0,410
0,4 1 3
0,413
0.41 5
0,415
0,4 1 5
0,415
0,41 5
149
J? esidta los E.vperimenudes
Tabla 3.8.- Resultados obtenidos en el
Experimento n
0 7. Condiciones experimentales
280 C, 475 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (21 0 r.p.m. inicial).
Tiempo
(It)
0,00
1,00
4,00
6,00
7.50
8,50
9,50
12,00
16,00
22,50
23,00
23,50
26.00
29,00
30,50
32.50
34,00
34,50
35,00
42,00
45,00
47,50
50.50
55,00
Biomasa
(g/L)
0.005
0,006
0,009
0,012
0,022
0,031
0,047
0,068
0,085
0,180
0,21 4
0,320
0,470
0,608
0,750
0,820
0.850
0,890
0,920
0,990
0,990
0,990
0.990
0.990
O,
(%)
100,0
97,3
86.5
80,0
77.3
65,0
55.0
40,0
26.0
10,0
60,0
49,6
35,0
20,0
10,0
8,0
50,0
42.0
30.0
22,0
1 2,0
8,0
35,0
20,0
Agtacin
(rpm)
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
21 0
240
210
210
21 0
310
310
310
310
310
310
350
iSO
350
350
350
350
400
400
NH
4 Sacarosa
(g/L) -j
0.475
0,4 75
0,475
0,468
0,453
0,445
0,440
0,429
0400
0,365
0,355
0,320
0,300
0.285
0,231
0,166
0,1 40
0,135
0,130
0,1 30
0,130
0,130
0,130
0,130
40,00
38,90
39,80
39,70
39,50
38,40
37,90
37,00
36.75
36,00
35,75
35,00
34,50
34,00
33,80
33,00
29,50
28,50
27,70
26,00
25,00
23,20
23,10
23,1 0
Xantano
(gIL)
0,86
0,86
0,866
0,866
0,86
0,86
0,93
1 ,02
1,09
1 ,1 3
1 ,32
1 ,42
1 ,48
1 ,51
1 ,63
1 ,72
2,58
3,75
4,00
6,90
9,50
11,39
1 1 ,39
1 1 .39
DNA
(gIL)
0,001
0,002
0,003
0,004
0.006
0,009
0,013
0,040
0,063
0,092
0,093
0,098
0,100
0.103
0,1 25
0,1 46
0,170
0,173
0,175
0.176
0.176
0,176
0.176
0,176
RNA
(g/L)
0,001
0,001
0,002
0,003
0,003
0,008
0,01 1
0,032
0,053
0.079
0,088
0,091
0,092
0.131
0,1 42
0,1 52
0,158
0.159
0,160
0,161
0,1 6 1
0,161
0,161
0,16!
Proteinas
(g/L)
0,003
0,004
0,006
0.0II
0,015
0.023
0.034
0,065
0,160
0,230
0,245
0,253
0,255
0,350
0,420
0,465
0,467
0.467
0.467
0.467
0.46 7
0,467
0,467
0,467
150
Resultados Experimentales
Como ya se coment en el apanado anterior, Procedimiento Experimental, el
xantano se sigui por medida de la viscosidad del caldo, realizando el calibrado al final de
cada experimento, pues el xantano producido en las diferentes condiciones de operacin
empleadas no presenta siempre la misma relacin entre concentracin y viscosidad. Para
cada experimento, las ecuaciones finalmente utilizadas fueron las siguientes:
Para el Experimento nl:
C~(g XL) =0,12 y
0
097 (cp) [3.1 ]
Para el Experimento n0 2:
0 70
Cp(g/LO,3 4p< (cp) [3.2]
Para el Experimento n0 3:
C~(gXL) t0,43 .,u
0
051(cp) [3.3]
Para el Experimento n0 4:
C~(g/L) 2 ,O5.,u
0
0 3 ~(cp) [3.4]
Para el Experimento n0 5:
C~(g/L) = 0,77 y
0
03 tcp) [3.5]
Para el Experimento n0 6:
C~(g/L) = 0,77 ,u
0
03 (cp) [3.6]
Para el Experimento n0 7:
C~(gXL) = 0 ,2 3 tUa(cjJ) [3.7]
La viscosidad aparente del caldo se midi con un viscosmetro BROOKFIELD
SIINCHRO-LECTRIC modelo LVT, a una temperatura de 25 0C y a una velocidad de 30
r.p.m.
151
4.- MODELO CIN TICO
NO ESTRUCTURADO
Modelo Cintico No Estructurado
4.- MODELO CINTICO NO ESTRUCTURADO
Los Modelos Cinticos No Estructurados (MCNE) son los modelos ms sencillos
empleados para la descripcin de sistemas microbianos. La cantidad de microorganismo se
expresa mediante el trmino de biomasa o poblacin microbiana en unidades abstractas de
vida, ignorndose la estructura interna del microorganismo o clula que compone la biomasa
pues se considera a la poblacin como una unidad homognea. Como ya ha sido comentado,
este tipo de modelos son una gran simplificacin del problema real, y suelen ser usados con
fines tecnolgicos, ya que proporcionan ecuaciones sencillas con sentido fisico, en las que se
trata al microorganismo como una especie reactante sencilla, aunque para ser tiles deben de
describir un nmero suficiente de componentes del sistema; es decir, a pesar de ser los
modelos ms simples, requieren la medida de varios componentes que permitan la descripcin
de, al menos, la evolucin de la biomasa, la frente de carbono, el producto y otros sustratos,
como la frente de nitrgeno.
La produccin de xantano ha sido modelizada empleando este tipo de modelos por
varios autores (Moraine y Rogovin, 1 966 y 1 971 ; Weiss y Ollis, 1 980; Quinlan 1 986; Pinches
y Pallent; 1 986; Schweickart y Quinlan, 1 989); no obstante, estos autores no tienen en cuenta
en sus ecuaciones todos los nutrientes esenciales de este sistema.
153
Modelo Cintico No Estructurado
Estudios experimentales llevados a cabo en un trabajo previo (Santos, 1 993) apuntan
claramente la dependencia de la velocidad de crecimiento del microorganismo de las
concentraciones de nitrgeno y de oxgeno disuelto en el medio. En la Figura 4.1 se muestran
los resultados experimentales obtenidos en el Experimento 2, donde se observan claramente
estas dependencias entre nutrientes y crecimiento de microorganismo y formacin del
producto. El sustrato limitante en este experimento, debido a las condiciones empleadas (280
C, medio A. con 257 p.p.m. de amonio y programacin de la velocidad de agitacin) es la
fuente nitrogenada, de modo que, cuando el amonio se agota, el microorganismo entra en la
fase estacionaria del crecimiento. Adems, hay que destacar que la concentracin de amonio
influye en la biomasa final obtenida en cada fermentacin, de modo que con concentraciones
iniciales de amonio bajas. la biomasa final tambin lo ser; esta proporcionalidad entre
biomasa final y concentracin inicial de sustrato nitrogrenado es cierta hasta un cierto valor
de concentracin de amonio, ya que para concentraciones por encima de un valor critico,
puede tener un efecto txico para la clula.
Debido a que Xanthomonas campestris es una bacteria aerobia estricta, el oxgeno
disuelto en el medio puede ser un nutriente limitante del crecimiento del microorganismo. No
obstante, en este caso, el oxigeno disuelto no acta de limitante del crecimiento ya que los
experimentos han sido realizados con programacin de agitacin para compensar la bajada de
concentracin de oxigeno por el consumo de las clulas en el crecimiento y adems por el
aumento de la viscosidad en el medio, como consecuencia de la produccin de xantano. Como
puede apreciarse en la Figura 4.1 , su concentracin no desciende hasta cero si no que
permanece alrededor del 1 0%del valor de saturacin.
En cuanto a la formacin de xantano, se puede observar en la misma figura que se
trata de un producto asociado al crecimiento, es decir se forma a medida que el
microorganismo est creciendo, si bien el incremento mayor de concentracin se produce
cuando el microorganismo se encuentra en la fase estacionaria del crecimiento. Por otro lado,
se observa la estrecha relacin entre la formacin del producto y el consumo de la fuente
carbonada.
154
Modelo Cintico No Estructurado
0.35
.8
[.6 0,30
0 2 5
.2
~L0 0,20
U 0.8 0,15 U
0,6 ojo
0.4
0,2 0,05
0.0 0,00
2.0
3 0 z
st,
U o
1,0
U
0.5
0,0
Figura 4.1 - Resultados experimentales obtenidos en el experimento n
0 2, realizado a 280C,
con 257 p.p.m. de amonio yagitacin variable (21 0 r.p.m inicial).
Se han propuesto varios modelos no estructurados para la modelizacin de la
produccin xantano (Moraine y Rogovin, 1 966 y 1 971 ; Souw y Demain. 1 980; Pinches y
Pallent, 1 986; De Vuyst y col,. 1 987a y b). Estos modelos pueden clasificarse en dos grupos:
- Aquellos que consideran el crecimiento y la produccin dependientes de diferentes
nutrientes.
- Aquellos que expresan el crecimiento y la produccin slo en ffincin de la biomasa
y su evolucin conel tiempo.
Al primer grupo citado pertenecen los modelos propuestos por Moraine y Rogovin
(1 966 y 1 971 ), y por Quinlan y colaboradores (Quinlan y col., 1 986; Schweickart y Quintan,
155
20
30
~ifl
1 Jode/o (Putico No Estruciurado
1 989> . La diferencia entre ellos est en el tipo de ecuaciones cinticas empleadas para la
evolucin del crecimiento y la descripcin de la produccin.
Moraine y Rogovin (1 966 y 1 971 ) emplean ecuaciones tipo Monod (Ecuaciones (4.1 ]
y (4.3]). para describir la evolucin de xantano y biomasa, considerando el nitrgeno como
limitante del crecimiento, ecuacin (4.1 ] y la fuente de carbono limitante para la produccin
de xantano, ecuacin [4.3]. La evolucin de los dos sustratos con el tiempo vienen expresados
utilizando dos coeficientes estequiomtricos (ecuaciones [4.2) y [4.4)) denotados por Yp~
5 e
YXN. Este modelo puede ser expresado por el siguiente sistema de ecuaciones:
dC~ _ ~ C~ C [4.1 ]
dt K~+(j
dE 5 _ 1 dC1 , [4.2]
di Y di
dC~ _ < E 5 [43)
.Cx
dt K5-vQ
dC~ ~.dQ [4.4]
di ~ dt
El modelo de Quinlan (1 986) y Schweickart y Quintan (1 989) tambin describen el
consumo de nutrientes mediante las ecuaciones [4.2] y [4.4]; sin embargo, la biomasa y la
produccin de xantano no vienen dadas por ecuaciones tipo Monod, sino potenciales de la
forma expresada en las ecuaciones [4.5] y [4.6]:
dC~ = . ~05 [4.5]
di
dC~ = * ~
Por combinacin de las ecuaciones [4.4] y [4.5] se obtiene la ecuacin logstica:
c
dCYk A,, [4.7]
di X y - k Y.
Weiss y Ollis (1 980) y Pinches y Pallent (1 986) proponen modelos pertenecientes al
segundo grupo, es decir, aquellos dependientes solamente de la biomasa y su evolucin con
el tiempo. Expresan el crecimiento como funcin de la concentracin de biomasa mediante la
1 56
Modelo Cintico No Estructurado
ecuacin logstica, pues esta funcin presenta una tendencia similar a la curva de crecimiento
del microorganismo, ecuacin [4.8]. La produccin de xantano y el consumo de la fuente de
carbono viene dado por ecuaciones tipo Luedeking-Piret (ecuaciones [4.9) y [4.1 0]). Sin
embargo, estos autores no tienen en cuenta la fuente de nitrgeno. Por tanto, este modelo
viene expresado por las siguientes ecuaciones:
dC~ Cx [4.8]
dt
dC~ _ _.cn.dQ [4.9]
dr dt
dC~ a.c< ~.dCx [4.1 0]
dr di
El modelo de Pinches y Pallent (1 986) emplea las mismas ecuaciones para
crecimiento, xantano y consumo de la frente de carbono que el empleado por Weiss y Ollis
(1 980), pero incluyen la ecuacin [4.4] para la evolucin de nitrgeno y aaden la ecuacin
[4.1 1 ] para el consumo de oxgeno (sin incluir su transporte), el cual depende de la
concentracin de biomasa y de la velocidad de crecimiento:
dE
0 CBdCV [4.1 1 )
t di
Ninguno de estos autores emplea tcnicas de regresin para obtener el valor de los
parmetros que aparecen en las ecuaciones anteriores, por el contrario emplean tcnicas de
estimacin por simplificacin de ecuaciones en puntos singulares, obteniendo unos valores
de los parmetros que proporcionan un ajuste experimental de forma aceptable, aunque solo
para un experimento en cada caso.
En la Tabla 4.1 se resumen los modelos cinticos no estructurados para la produccin
de xantano en forma diferencial, incluyendo el que se comentar en el prximo apanado. En
ella se han considerado los cinco modelos ms representativos, as como las cinco respuestas
posibles, expresadas en concentraciones msicas (gIL). Slo dos de estos modelos consideran
las cinco respuestas.
1 57
J
~
.
O0OeOOoo
c
i
,
f
l
eO
.
e
.
ooc
h
zoOe
.
-
t
eOe
.
e~
1
o
-
oc
i
,
-
e~
1
-
t
-
t
oee
)
oo

eo
-
Oee
.
e9
G
r
oO
3
m
z
m
C
V
+~
<
K
b
*

J
t
i
-
]I
I
q
N
o
ts
t
z
~
C
t
s
t
s
t
Modelo Cinhco No Esi ructurado
4.1 .- FORMULACIN DEL MODELO
En trabajos previos (Santos, 1 993 y Garca-Ochoa y col., 1 995) se ha propuesto un
MCNE para la produccin de xantano. En este modelo se tienen en cuenta las dependencias
del crecimiento y la produccin de nutrientes, incluyendo una expresin para describir la
evolucin de otro nutriente esencial en el sistema: el oxigeno disuelto.
El crecimiento del microorganismo viene dado mediante la ecuacin logstica, la
cual es obtenida por combinacin de las ecuaciones [4.4] y [4.5].
Los resultados experimentales, obtenidos en un trabajo previo (Santos, 1 993, Garca-
Ochoa y col., 1 997), muestran claramente que cuando la fuente de nitrgeno es el sustrato
limitante, el parmetro Cxm puede ser reemplazado por:
= Cx + [4.1 2]
Si la ecuacin. [4.1 2] es sustituida en la ecuacin [4.7], se obtiene la ecuacin
logstica en forma diferencial
Ir
dC\. -~ C
1 C<j 1 [4.1 3]
di YI%v> ) C~, + li~ C~
Esta ltima ecuacin tiene en cuenta tanto el crecimiento como el consumo de la
frente nitrogenada. El consumo de la frente de carbono se expresa teniendo en cuenta que
es utilizada tanto para mantenimiento como para crecimiento, incluyendo en crecimiento
la produccin de xantano, puesto que el polisacrido es, en realidad, la cpsula bacteriana,
de acuerdo a la ecuacin [4.1 4]:
dE 5 ~, 1 dC~< . [4.1 4]
di Y~ di
La integracin de esta ltima ecuacin, con la condicin de contorno, t=0 .. C5
proporciona la siguiente expresin:
1 59
Modelo Cintico No Estructurado
ky >x< > +C~. j . <y 3
- )~iv
[4.1 5]
IC.~ )l 1
La produccin de xantano se expresa mediante la ecuacin [4.6] (Quinlan, 1 986;
Schweikart y Quinlan, 1 989) y la evolucin de oxgeno disuelto se describe mediante la
Ecuacin [4.1 6]:
dC
0 * un0 dE
)
di = kLaU (E 0 C< 3 ) C~. + [4.1 6) - - y ~it
0,1 ~
Esta ecuacin [4.1 6] incluye un trmino para la transferencia de oxgeno desde el gas
y otro para el consumo de oxgeno - tanto para mantenimiento como para crecimiento- tal y
como fue propuesto por Pinches y Pallent (1 986). Para ello, es necesario emplear una
expresin para el coeficiente de transferencia de oxgeno, para lo cual se ha utilizado la
expresin dada en la ecuacin [4.1 7] (Gmez, 1 995):
k1a~=3 ,08IcY
4V% 43 N175 ~ -0>39 [4.1 7]
Sustituyendo la ecuacin [4.1 5] en la ecuacin [4.6] se puede expresar la velocidad
de produccin de xantano de acuerdo a la ecuacin [4.1 8]:
dE
di ~ (Z~ -k< C>~..m
8
< + C~ [4.1 8]
~\IV
LnijI C~ +Y~ CV, L~exPk4 v C i.i~ < .C~ .(c~ Cx)
160
Modelo Cini ico No Estructurado
En la expresin anterior se identifican tres sumandos, el primero expresa la
produccin mxima de xantano a cada tiempo, alcanzable si el sustrato carbonado se
empleara nicamente en dicha produccin; el segundo trmino expresa la cantidad de frente
carbonada equivalente a la cantidad de xantano desviado para mantenimiento de las clulas
en estado viable; el tercer sumando indica la cantidad de xantano no producida a cada
tiempo, debida al consumo de sustrato carbonado para la formacin de masa celular, es
decir, empleada en el crecimiento.
Por tanto, el modelo consta de siete parmetros, los representativos de la biomasa,
que en este caso son e YXN, y los parmetros correspondientes a la evolucin del azcar,
el xantano y el oxigeno disuelto: ni
5, Yxs, k~, ni0 e
4.2.- AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES
La aplicacin del modelo a los datos experimentales, para el clculo de los
parmetros citados, se tuvo que realizar de la siguiente forma:
Primero se obtienen los valores de kx e Y~, representando el primero la velocidad
de crecimiento y el segundo la concentracin mxima alcanzable de biomasa a partir
de la cantidad de sustrato nitrogenado inicial empleado y la cantidad inicial de
biomasa al principio de la reaccin. La obtencin de estos parmetros se ha llevado a
cabo mediante regresin no lineal en simple respuesta acoplada al algoritmo de
Runge-Kutta, aplicada a la ecuacin [4.1 3].
Una vez calculados estos parmetros (kx e YxN), son sustituidos en la ecuacin
[4.1 3], emplendose,junto con las ecuaciones [4.1 4] y [4.1 6], para el clculo de los
parmetros ni5, Yxs y k~, por aplicacin de una regresin no lineal en multi-
respuesta acoplada al algoritmo de Runge-Kutta de cuarto orden (para la integracin
de las ecuaciones diferenciales sin integracin analtica posible).
1 61
Modelo Cintico No Estructurado
El clculo de los parmetros m
02 y Yo2x se realiza aplicando una regresin no
lineal simple-respuesta al conjunto de ecuaciones diferenciales formado por las
expresiones [4.1 4], [4.1 61 , [4.1 7] y [4.1 8] sustituyendo los valores de los parmetros
calculados hasta el momento en las tres primeras ecuaciones citadas, siendo, por
tanto, los nicos parmetros a calcular m02 e Yo2x. En este caso, al igual que con la
biomasa, no se aplica la regresin en mltiple respuesta, debido al menor peso que
en la minimizacin de la suma de residuos presentara la ecuacin de evolucin de
oxgeno.
dE 0 * ___ ___
di =kLa. (E 0 , Coijy . dCx $ ..tn<jj> E ~ [4.1 9]
En la ecuacin [4.1 6], correspondiente a la correlacin del coeficiente
volumtrico de oxigeno en el proceso, es necesario sustituir la ecuacin
correspondiente de calibrado de la concentracin de xantano en funcin de la
viscosidad para cada experimento. Por otro lado, el clculo de las concentraciones de
oxgeno disuelto en cada momento en trminos de moles/L, se realiza empleando la
expresin:
C0(mol/L) = 2,3 ~1O~ E 0 (so) [4.20]
En la que se ha supuesto que la concentracin de saturacin de oxigeno
disuelto en las condiciones de trabajo es de 2,3.1 (0 mol/L (correspondiente a 28
0C y
1 atm).
En las Tablas 4.2 a la 4.8 se recogen los valores calculados de los parmetros fisicos
y estadsticos obtenidos de la aplicacin del Modelo Cintico No Estructurado a los datos de
los experimentos realizados (experimentos del 1 al 7). As mismo, las Figuras 4.2 a 4.8
muestran la reproduccin de los datos experimentales con el MCNE aplicado. En todas las
figuras, la lnea continua corresponde a los valores proporcionados por el modelo MCNE,
y los simbolos a los datos experimentales obtenidos del anlisis de los diferentes
componentes durante la fermentacin.
1 62
Modelo Cintico No Estructurado
La Tabla 4.2 muestra los parmetros obtenidos del ajuste de] experimento n
0 1 ,
realizado a 250 C y con 257 p.p.m de amonio inicial , todos los valores de los parmetros
cumplen las restricciones estadsticas, esto es, ninguno incluye el cero en sus intervalos de
confianza y se observa que los valores obtenidos de la t de Student ms bajos corresponden
a los parmetros obtenidos del ajuste de la concentracin de oxigeno (m
0 , Y0j, y los
valores ms altos, a los obtenidos del ajuste de la concentracin de azcar ( ms, Yxs y kv).
En la Figura 4.2-a, se muestra el ajuste de la evolucin de la biomasa a la ecuacin logstica,
donde se observa la buena reproduccin de los datos experimentales a esta funcin; sin
embargo, en la misma grfica se muestran los resultados obtenidos en el ajuste de la
evolucin del nitrgeno, donde puede observarse que este modelo es incapaz de predecir un
buena evolucin de este componente. En cuanto a la evolucin del resto de componentes,
tanto la evolucin de la sacarosa y como la del xantano son buenos, mientras que para el
oxgeno no se consigue un buen ajuste (Figura 4.2-b).
Los parmetros obtenidos del ajuste al MCNE del experimento n 2 realizado a 280
C y con 257 p.p.m de amonio inicial, son recogidos en la Tabla 4.3, donde se puede
observar que los intervalos de confianza de los parmetros obtenidos del ajuste al MCNE no
incluyen el cero y que, al igual que en el experimento anterior, se observan unos valores
muy bajos de la t de Student para los parmetros correspondientes a la evolucin de
oxgeno disuelto, quedando reflejado en la mala reproduccin de este componente, tal como
muestra la Figura 4.3-b; mientras que para las concentraciones de sacarosa y xantano los
resultados del ajuste son buenos. En la Figura 4.3-a se muestra la excelente reproduccin de
la concentracin de la biomasa con la ecuacin logstica, mientras que la reproduccin de la
evolucin del amonio de nuevo es defectuosa, aunque es mejor que la obtenida en el
experimento anterior. Se reproduce bien el consumo de la fuente nitrogenada durante la fase
exponencial, no siendo bueno el ajuste en la fase estacionaria del crecimiento.
En la Tabla 4.4 aparecen reflejados los parmetros fisicos y estadsticos obtenidos
por ajuste de los datos del experimento n
0 3 realizado a 310 C y con 257 p.p.m de amonio
inicial al MCNE, donde vuelve a observarse que, aunque los valores son significativos, los
valores de la t de Student obtenidos para m
0~ e son muy bajos, quedando esto
reflejado en la mala reproduccin de la concentracin de oxgeno (Figura 4.4-b), si bien hay
que comentar que, en comparacin a los dos experimentos anteriores, la reproduccin de los
163
Modelo E ini ico No Estructurado
datos experimentales es algo mejor. En la Figura 4.4-a se muestra la reproduccin de los
valores experimentales de la biomasa y de la concentracin de amonio, siendo los resultados
muy similares a los observados en los casos anteriores, es decir, un buen ajuste para la
biomasa y peor para la evolucin de la fuente nitrogenada.
Los parmetros obtenidos para el experimento n~ 4 realizado a 340 C y con 257
p.p.m de amonio inicial se recogen en la Tabla 4.5-a. Se puede observar que al realizar el
ajuste de este experimento al MCNE el valor obtenido del parmetro m
5 es negativo, lo que
indicara que a esta temperatura este parmetro no tiene influencia y, fisiolgicamente, que
el microorganismo no consume azcar para su mantenimiento. Para poder realizar el ajuste
posterior de la evolucin del oxgeno en simple respuesta, es necesario emplear los
parmetros ms, Yxs y k~ obtenidos del ajuste en mltiple-respuesta del xantano y la
sacarosa. Debido a que no es posible introducir un valor de m~ negativo, se volvi a realizar
el ajuste fijando m8 en valor cero, obtenindose as nuevos valores de Yxs y k~, los cuales
se muestran en la Tabla 4.5-b. Estos nuevos valores de los parmetros freron utilizados para
la obtencin de los correspondientes para el oxigeno disuelto. Las restricciones estadsticas
se cumplen para todos los parmetros, los intervalos de confianza son estrechos, siendo algo
ms amplios para el parmetro Y~~,parmetro que a su vez presenta un valor de la t de
Student muy bajo, reflejndose en la mala reproduccin de los datos experimentales de la
evolucin de la concentracin de oxgeno disuelto que se muestra en la Figura 4.5-b. En
cuanto a la reproduccin de la biomasa, es buena, no siendo as para la evolucin del
amonio, tal como muestra la Figura 4.5-a.
En la Tabla 4.6 se muestran los resultados obtenidos de la aplicacin del MCNE al
experimento n
0 5 realizado a 28 0C y con 65 p.p.m. de amonio inicial. Los intervalos de
confianza para los parmetros correspondientes al ajuste de la concentracin de oxgeno son
muy amplios, presentando un valor de la t de Student bajos, estando el parmetro Y
0<
prcticamente en el lmite del valor terico, tabulado para un 95% de confianza. La Figura
4.6-a muestra la buena reproduccin de la biomasa con la ecuacin logstica, mientras que
la evolucin de nitrgeno, muestra un mal resultado en cuanto a la reproduccin de los
resultados experimentales. En la Figura 4.6-b aparece el ajuste de la evolucin de xantano y
de sacarosa, en los que el resultado es aceptable, mientras que para la concentracin de
oxgeno la reproduccin obtenida no es suficientemente buena.
1 64
Modelo Cintico A~o Estructurado
La aplicacin del MCNE al experimento n
0 5 realizado a 28 C y con 1 30 p.p.m.
de amonio inicia! proporciona los parmetros presentados en la Tabla 4.7. Para todos los
parmetros se cumplen las restricciones estadsticas impuestas, es decir ningn parmetro
incluye el cero, obtenindose los menores valores de t para el parmetro Y
0~. Esto ltimo
se refleja en la mala reproduccin de la evolucin del oxgeno, la cual aparece en la
Figura 4.7-b. Para la concentracin de sacarosa y la concentracin de xantano de nuevo se
obtiene un buen ajuste. En la Figura 4.7-a, se observa cmo la evolucin de la biomasa es
perfectamente reproducida por la ecuacin logstica. En cuanto a la concentracin de
amonio, parece que la reproduccin, obtenida por ajuste de los datos experimentales al
MCNE, es buena para este experimento, tal como se observa en la Figura 4.7-a.
Por ltimo, la Tabla 4.8 muestra los valores fisicos y estadsticos obtenidos por
ajuste a este modelo para el experimento n
0 6 realizado a 28 0C y con 475 p.p.m. de
amonio. Tanto los parmetros representativos de la biomasa, como los correspondientes a
la sacarosa y xantano cumplen tas restricciones estadsticas impuestas. El parmetro mox
proporciona un valor que incluye el cero, obtenindose un valor de la t de Student que est
por debajo del tabulado. En cuanto al parmetro Y
0~, posee un valor de t de Student
muy bajo, prcticamente en el lmite del valor tabulado al 95%de confianza. La evolucin
de oxigeno disuelto (Figura 4.8-b) obtenida de este ajuste, al igual que en todos los
experimentos anteriores, no es buena, sin embargo, tambin como en casos anteriores, la
reproduccin obtenida para evolucin de sacarosa y xantano es aceptable. La reproduccin
de la evolucin de la concentracin de biomasa (Figura 4.8-a) de este experimento, al igual
que en todos los anteriores, es muy buena. En cambio, para la evolucin del amonio, la
reproduccin obtenida no se corresponde bien con los valores experimentales, tal como se
ha ido viendo en el ajuste del resto de los experimentos.
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0 1 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 250 C, 257 p.p.m. de
amonio y programacin de agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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t(h)
Figura 4.3- Ajuste de los datos experimentales del experimento n
0 2 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 280 C, medio A (257 p.p.m.
de amonio), programacin de agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
2.0
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Figura 4.4- Ajuste de los datos experimentales del experimento n
0 3 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 31 0 C, medio A (257
p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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Figura 4.5- Ajuste de los datos experimentales del
con Xanihomonas campesiris a la
p.p.m. de amonio), programacin de
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
experimento u
0 4 al MCNE, realizado
temperatura de 340 C, medio A (257
agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
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Figura 4.6- Ajuste de los datos experimentales del experimento n
0 5 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 28 C, medio A (65 p.p.m.
de amonio), programacin de agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
0 10 20 30 40 50
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2.0
1.5 Y
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0.5
del experimento n
0 6 al MCNE, realizado
a temperatura de 280 U, medio A (1 36
de agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
Ajuste de los datos experimentales
con Xanthomonas campestris a
p.p.ni. de amonio), programacton
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxigeno disuelto
2.0
O lO 20 30 40 50 60
Qi)
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Figura 4.8- Ajuste de los datos experimentales del experimento 7 al MCNE, realizado con
Xanthomonas campestris a la temperatura de 28~ C, medio A (475 pp.ni. de
amonio), programacin de agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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180
Modelo Cintico No Estructurado
4.3 .- DISCUSIN
4.3 .1 - Variacin del Valor de los Parmetros con las Variables
4.3 .1 .t- Influencia de la Temperatura
En el primer capitulo de este trabajo, ya fue comentada la importancia de la
temperatura en la produccin de xantano. En trabajos previos (Santos, 1 993; Garca-Ochoa y
col., 1 995), se observ la influencia de esta variable sobre la produccin del polisacrido,
obtenindose un mximo de produccin a 28
0C. Como en todo proceso qumico, la
temperatura debe influir mucho, exponencialmente, en la velocidad de las reacciones qumicas.
Sin embargo, al evaluar un proceso complejo, como el crecimiento de un microorganismo y la
produccin, en este caso, de un polisacrido, dicha influencia puede quedar enmascarada. No
obstante, es de esperar que la temperatura influya en el valor de los parmetros cinticos y de
equilibrio que aparecen en las ecuaciones cinticas. Esto se analiza a continuacin.
En las Figuras 4.9 y 4.1 0 se muestran las evoluciones de los parmetros obtenidos del
ajuste al MCNE para los experimentos realizados a diferentes temperaturas.
En la Figura 4.9 (a y b) se muestran las evoluciones de los parmetros relacionados con
el crecimiento, obtenidos del ajuste de los datos experimentales a la ecuacin logstica. Se
observa que el parmetro kx, indicativo de la velocidad de crecimiento (Figura 4.9-a), muestra
una tendencia descendente con latemperatura. El parmetro Yxs (Figura 4.9-b) en cambio no
parece mostrar una evolucin clara con la temperatura. Por ello, no es posible realizar un ajuste
de estos parmetros a fimciones matemticas que los relacionen con temperatura.
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Figura 4.9.- Evolucin de los parmetros con la temperatura obtenidos por ajuste con la
ecuacin logstica.
(a)
5
(b)
5
5
1 81
Modelo Cintico No Estructurado
En la Figura 4.1 0 (a, ti, c) se muestran las evoluciones de los parmetros relacionados
con las ve!ocidades de produccin del xantano y consumo de azcar en fimcin de la
temperatura. La tendencia de m
8 y Yxs presenta un valor mximo a 31 0 C, mientras que el
parmetro k~ parece mostrar la misma tendencia pero con un mximo en 28 o
En la Figura 4.1 0 (d y e) se muestran las tendencias de los parmetros relacionados con
el oxgeno -m0 e YJ ~- respecto a la temperatura. Puede observarse que ambos parmetros
tienen una tendencia ms o menos lineal con dicha variable; m0 muestra una evolucin
ascendente, mientras que Y0~ presenta una evolucin descendente.
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35
35
Figura 4.1 0.- Evolucin de los parmetros del MCNE con la temperatura. La lnea discontinua
indica la tendencia terica de los parmetros y la continua el ajuste del modelo
en funcin de la temperatura (MCNE(T)).
(a) m~ (b) Yxs (c) k~
(d)m02 (e) Y01.
(b)
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1 82
Modelo Cintico No Estructurado
De acuerdo con estas observaciones, se pens que los parmetros correspondientes a
m~ y ky. , podan ser ajustados en funcin de la temperatura de acuerdo con la expresin de
Ratkowsky y col. (1 983), segn la ecuacin [4.21 1 :
k< T)=< Ci~(TTrnrn) Ji -exp(C
2a(T-Tmb)]}
2 [4.21 ]
El parmetro Yxs, en cambio, se supuso constante durante el ajuste en el que se dej
flotar el resto de los parmetros. debido a que el valor del parmetro obtenido para todas las
temperaturas es similar.
En la Figura 4.1 0 (d y e) se muestran las tendencias de los parmetros relacionados
con el oxigeno - e Y
0. >.. - respecto a la temperatura. Puede observarse que ambos
parmetros tienen una tendencia ms o menos lineal con dicha variable. - rn0, presenta una
evolucin ascendente, mientras, Y02~ presenta tendencia descendente.
El ajuste conjunto de todos los datos de los experimentos realizados a diferentes
temperaturas (experimentos del 1 al 4) al MCNE (T) (Modelo Cintico No Estructurado en
funcin de T) para m5, Yxs y k~ fue realizado en mltiple-respuesta, considerando como
respuestas: sacarosa y xantano. Debido a las tendencias presentadas por estos parmetros en
funcin de la temperatura, -mostradas anteriormente en la Figura 4.1 0 (a, b, c),
respectivamente- se realiz el ajuste de acuerdo a las funciones representadas en las
ecuaciones [4.22] a [4.24]. Este MCNE(T) tiene nueve parmetros: Ci, Trnin, C2, Tmax, C %, T
mli,, C 2, T ma x y C3 :
m5(T)={ Cj(T-T).H-exp< >C,.< T-T [4.22]
=( C 1 . (T - T mrn) [1 exp(C% . (T - [4.23]
Y (T)=C3 [4.24]
xs
La Tabla 4.9 muestra los parmetros obtenidos del ajuste de los cuatro experimentos
realizados a distintas temperaturas a este modelo en funcin de dicha temperatura. Como
puede observarse, los parmetros correspondientes al parmetro m5 dan un resultado
estadstico aceptable al igual que sucede con el parmetro Yxs donde se observa el valor
elevado de la t de Student. En cuanto a los parmetros C y C,, correspondientes al ajuste del
83
Modelo CinticoNro Estructurada
parmetro k~ a una funcin de tipo Ratkowsky. se observa que ambos incJuyen el cero y
ninguno supera el valor de t de Student tabulado.
En cuanto a la evolucin de la concentracin de oxgeno disuelto, el modelo en funcin
de la temperatura ha sido realizado en simple respuesta. En este caso, el ajuste de los datos
experimentales se ha hecho teniendo en cuenta la evolucin lineal de los parmetros
relacionados con este componente, esto es, ni
0 e ~%x. En este caso, se tienen cuatro
parmetros en el modelo en funcin de la temperatura: a, ~3, a, ~, tal como se muestra en las
ecuaciones [4.25j y [4.261 :
ni0 (T) = a + /T T [4.25]
= a +fi T [4.26]
Los valores de estos cuatro parmetros, as como sus valores estadsticos de se
muestran tambin en la Tabla 4.9. Como puede observarse, los parmetros ci y 13
correspondientes al parmetro Yo2x incluyen el cero, y ninguno cumple las restricciones
estadsticas impuestas, es decir, que los valores de t de Student obtenidos no superan los
valores tabulados tericos.
Los ajustes de los parmetros en funcin de la temperatura a las funciones
matemticas que se han mostrado se presentan en la Figura 4.1 0, donde aparecen como lnea
continua. Este ajuste es el resultado de sustituir las temperaturas en las siguientes
ecuaciones con los valores correspondientes de los parmetros obtenidos (con un 95% de
probabilidad):
= {O,227 . ([16,6) [i exp(&068 (T 3 554)42 [4.27]
= { O,OO I52~ (T 17,3 6)11exp(O,65] IT 3 9,23 )42 1 4.281
Y (T)=O,1445 [4.29]
xs
m0 (T) = 9,8? io-
3 + (2,6 ](74) T [4.3 0]
Y (T)=5,6O,89T [4.3 1 ]
0,X
1 84
Modelo CinticoNo Estructurado
Todos los datos experimentales obtenidos en los experimentos realizados a diferentes
temperaturas han sido reproducidos mediante la sustitucin de las ecuaciones [4.27] a [4.31 ] en
el MCNE. Las Figuras 4.1 1 a 4.1 2 muestran la reproduccin de los resultados experimentales
con dicho MCNE (T).
Como es lgico, y ya que no se ha conseguido una buena estadstica de los valores
de los parmetros en funcin de la temperatura, este modelo MCNE(T) no mejora la
reproduccin de los datos experimentales obtenidos experimento a experimento. De hecho,
en alguno de los experimentos, como a 280 C y 250 C, la reproduccin de los datos
experimentales es mucho peor que la obtenida con el MCNE, especialmente en la
descripcin de la evolucin del oxgeno. Por ello, no es posible aceptar este modelo
MCNE(T) como vlido, y podemos concluir que el modelo cintico no estructurado no es
capaz de predecir la evolucin de los parmetros en funcin de la variable temperatura.
1 85
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MCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a la
temperatura de 250 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),
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Ajuste de los datos experimentales del experimento no 2 al
MCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a la
temperatura de 2W C, medio A (257 p.p.m. de amonio),
programacin de agitacin (21 0 r.p.m. uncial).
40-
30-
~ 20
U
0
o
<u.- . .cs
E.
A;
4cr< ~
4 e
tu
4
4- 5-

4
A
a:A# 4 4..
Figura 4.11.-
lO 20 30
o)
u. Sc?
u.. ~ %. 4
4
a
e
4
4 u
a--
1~
4
-4
A 4 4 4. .4.
187
Modelo Cintico No Estructurado
-s
7;
Q -.
Figura 4.13.- Ajuste de los datos experimentales del experimento no 3 al
MCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a la
temperatura de 3 1 0 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),
programacin de agitacin (21 0 r.p.m. inicial).
40
3
0
3
fi
20-
lo-.
Figura 4.14.
O lO 20 30
o I~)
40 50
LS
20
ES
lo
05
00
Ajuste de los datos experimentales del experimento no 4 al
MCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a la
temperatura de 340 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),
programacin de agitacin (21 0 r.p.m. uncial).
LS
:0
1.5
0
1.0
05
Q Q
60
30
eh
e
o
u A
u
u. 4
4
u
4 . .. u
4 4
4 4*
.4 4
AA A A
441
AS A-A A-A
188
Modelo Cintico No Estructurado
4.3 .1 .2- Influencia de la Concentracin de Amonio Inicial
La concentracin de amonio es una variable importante en el proceso de produccin,
pues es el nutriente limitante en el crecimiento en el medio de produccin empleado. Es un
componente que influye significativamente en la concentracin de biomasa obtenida durante el
proceso. Por esta razn se ha realizado el estudio de la influencia de esta variable en los
parmetros del modelo.
La evolucin de los parmetros obtenidos de la aplicacin del MCNE a los
experimentos realizados con diferentes concentraciones de amonio se muestra en las Figuras
4.1 5 y 4.1 6.
En la Figura 4. 1 5 se muestran las tendencias de los parmetros relacionados con el
crecimiento, donde se observa que, al igual que ocurria con la temperatura, no es posible
relacionar los parmetros de crecimiento obtenidos con funciones que los relacionen con la
concentracin de amonio. Se observa que el parmetro kx -indicativo de la velocidad de
crecimiento- muestra una tendencia descendente con la concentracin de amonio. El
parmetro relativo al rendimiento de amonio en biomasa (YxI) presenta un valor mximo
en 65 p.p.m. y un valor mnimo en 51 4 p.p.m., mientras que con 1 30 p.p.m. y 257 p.p.m. no
presenta diferencias significativas.
35
~1 1
30~
25 H
20
2
~- ~-1
lOt
06 5 4
o
0 00 200 300 400 500 0 00 200 300 400 500 600
Anxn o (mm) nn,o (mm>
Figura 4.1 5.- Evolucin de los parmetros del crecimiento en funcin de la
concentracin de Amonio.
a)kx
189
1 1~1~1~
(a)
a,
5
-c
1 l 1 2
o (b)?
o
o
-Vot/e/o Cintico No Estructurado
En La Figura 4.1 6 (a, b. e) se muestran las tendencias en funcin de la concentracin
inicial de amonio, de los parmetros del MCNE relacionados con las velocidades de
produccin del azcar y dcl xantano: m
5, Yxs y k? . Laevolucin de los parmetros relacionados
con la evolucin del oxigeno, mo~eYox, aparecen en la Figura 4.ld y 4.1 6e,
respecvarnente.
Ninguno de los parmetros del MCNE muestra una tendencia clara ni lgica en
funcin de la concentracin de amonio. Por ello, en este caso no es posible siquiera plantear
ecuaciones matemticas para proponer un modelo cintico en funcin de la variable
estudiada, tal como se intent en el caso de la temperatura. Adems, con este modelo no fue
posible obtener una buena reproduccin de la evolucin del amonio, tal como fue mostrado
en las Figuras 4.2a a 4.Ba. Por tanto, es lgico pensar que el modelo es incapaz de mostrar
una evolucin de parmetros en funcin de esta variable.
03 5
0.4 4
03
5
5
5
5
(a>
5
lOO 200 300 400
AnxniO< rplr)
500
(e)
{ \
\ ./
\
\ /
4
< 1 00 200 300 400 500
Annnc (mm)
50
40
30
20
lO
o
3
5
600
600
0.(X< 4
Oti)3
0.00) -
0.000
(b)
~~1
/ Y \
It
1
5
-a.
O lOO 200 300 400 500
Ara imio (mm)
U U
O lOO 200 300 400
Anxna o (m m )
500 600
O lOO 200 300 400 500 600
Amoujo(m ~<)
Figura tU- Evolucin de parmetros del MCNE con la concentracin amonio.
03
0.
0.0
< 02<
0)5
y
600
< .0]
0005
1 (d)
N.
1 90
Modelo Cintico No Estructurado
4.3 .2.- Simulacin de una Operacin Discontinus con el Modelo Cintico No
Estructurado
La realizacin de simulaciones con modelos cinticos constituye una herramienta
predictiva muy til, permitiendo prever lo que ocurre cuando se modifican ciertas
condiciones durante el proceso, sin necesidad de experimentar, lo cual permite un gran
ahorro de trabajo y tiempo. La simulacin debe de ser realizada con un modelo correcto, es
decir aquel cuyo planteamiento y parmetros permitan predecir de la forma ms fiable lo que
puede ocurrir ante cambios en las condiciones de operacin. De esta manera, una vez
obtenidos los parmetros de un modelo bajo ciertas condiciones de operacin es posible
realizar simulaciones considerando otras condiciones iniciales (temperatura, velocidad de
agitacin, cambios en la composicin del medio, etc); otros tipos de reactores (air-lifts,
columnas, etc) o cambio en las dimensiones del reactor empleado. Todo ello implica la
utilidad de realizar una simulacin para efectuar un cambio de escala en el proceso.
Por todo ello, es importante conocer qu es capaz de predecir el modelo planteado
de forma adecuada, hay que saber, tambin, qu variables influyen en el proceso, y cunto,
es decir, evaluar la sensibilidad del sistema frente a diferentes condiciones de operacin.
La forma ms adecuada de efectuar las simulaciones con un modelo cintico -es
empleando parmetros en funcin de las variables de operacin que pudieran influir.
En este captulo se ha visto que el MCNE no ha podido ser obtenido en funcin de
ninguna de las variables estudiadas nitrgeno y temperatura-, por lo que realizar
simulaciones probando diferentes valores de estas variables no va a permitir obtener buenas
predicciones, pues el modelo no contempla esta influencia.
Se han realizado simulaciones que en principio, cabra esperar mostrasen influencia
en la evolucin de componentes, como concentracin de biomasa inicial, concentracin de
azcar inicial y concentracin de oxgeno disuelto.
Es lgico pensar que la concentracin de biomasa inicial influya en la evolucin de
componentes del sitema . Esta concentracin de biomasa inicial influye en primera instancia
191
Modelo Cint co No Estructurado
en la evolucin de biomasa tal como contempla la ecuacin [4.1 31 correspondiente a la
ecuacin logstica para el crecimiento. Adems, al influir en la concentracin de biomasa se
vern afectados el resto de componentes del sistema, es decir, concentracin de sacarosa
(ecuacin [4.15]), evolucin de oxgeno disuelto (ecuacin [4.1 6]) y evolucin de la
concentracin de xantano (ecuacin [4.1 8]), pues todas incluyen el trmino de biomasa en
sus expresiones.
En cuanto a la influencia de oxigeno disuelto, slo cabe pensar que al modificar
alguna condicin en el biorreactor que altere su concentracin (velocidad de agitacin) slo
se ve afectada la propia evolucin de este componente, pues a la vista de las ecuaciones del
modelo no estructurado, slo se reflejar la influencia en el coeficiente de transferencia de
materia (ecuacin [4.1 7]), y sta en la ecuacin [4.1 8], correspondiente a la evolucin de
oxgeno disuelto.
Finalmente, la influencia de la concentracin inicial de sacarosa se ver reflejada
tanto en la evolucin de la concentracin de producto (ecuacin [4.1 8]), como en la propia
evolucin del azcar, tal como indica la expresin dada por la ecuacin [4.1 5].
As pues, se han realizado diversas simulaciones para observar la influencia de os
factores comentados sobre la produccin, el crecimiento o la evolucin de oxgeno disuelto
durante la fermentacin.
En La Tabla 4.8 se muestran las condiciones de operacin empleadas en diferentes
simulaciones que han sido realizadas con el MCNE en operacin en discontinuo. Las
simulaciones se han realizado cambiando el valor inicial de diversos factores cuya influencia
en el proceso es de sobra conocida (Santos, 1 993).
192
Modelo Cintico No Estructurado
Tabla 4.8 .- Simulaciones realizadas con el MCNE en operacin discontinua.
Simulacin Valores
Influencia de la concentracin de
biomasa inicial
Cxo = 0,03 g/L
Cxo 0,07 g/L
Cxo = 0,50 g/L
Cxo 1 ,00 g/L
Influencia de la concentracin
azcar inicial
C
50 10g/L
Cso =20 g/L
C50 =40 g/L
Cso SOgfL
Influencia de la concentracin de
oxgeno disuelto
Agitacin constante
Perfil de agitacin
4.3.2.l~.. Influencia de la Concentracin de Biomasa Inicial
Tal como muestra
biomasa y se observ su
modelo: sacarosa, xantano,
la Tabla 4.8, se probaron cuatro concentraciones iniciales de
influencia en la evolucin de los diferentes componentes del
oxgeno disuelto y biomasa.
La influencia de la biomasa inicial en el crecimiento, a lo largo del tiempo de
fermentacin, se muestra en la Figura 4.1 7. Como puede observarse, cuanto mayor es la
concentracin inicial, mayor es la concentracin mxima de biomasa al final del periodo
exponencial de crecimiento.
En cuanto a la influencia sobre la velocidad de produccin de xantano y de
consumo de azcar (Figura 4.1 8), se puede apreciar que cuanto mayor es la concentracin
de biomasa ms rpida es la produccin, no habiendo diferencias en la concentracin final
1 93
Modelo Cintico No Estructurado
alcanzada, puesto que sta se estabiliza cuando se acaba el azcar. El consumo de sacarosa,
como es lgico. es ms rpido cuanto ms rpida es la produccion.
En la Figura 4.1 9 se observa la mala simulacin obtenida para la evolucin de
oxgeno disuelto pues, como ya ha sido comprobado a lo largo de este capitulo este modelo
no permite predecir de forma adecuada la evolucin de esta variable. En cuanto al valor de
la constante de tranferencia de oxgeno (k~av) su valor es mayor cuanto menor es la
biomasa inicial, debido, lgicamente, a la relacin de ste con la viscosidad del caldo
(relacionada a su vez con la concentracin de xantano). Si se observa la Figura 4.1 8 de
nuevo, observamos que coincide, en tiempo, que las mayores concentraciones de xantano
corresponden, en la Figura 4.1 9, a los menores valores de kLaV, para finalmente
estabilizarse, al igual que la produccin del polisacrido.
194
Modelo Cintico No Estructurado
3
2
(3<
o
0,3
0,2
cf
o,
0.0
t(h)
Figura 4.1 7.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de biomasa sobre la evolucin de biomasa.
Figura 4.18.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de biomasa sobre la evolucin de xantano y sacarosa.
0 20 40 60 80
40
t(h)
1 95
Modelo Cintico No Estructurado
25
2,5
20
2,0
~I,5 I5~
~2
x
1.0
0,5
5
0,0
Figura 41 9.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico No Estructurado: influencia de la
concentracin inicial de biomasa sobre la evolucin del oxgeno disuelto y
el kay
0 20 40 60 80
(h)
1 96
Modelo Cintico A~o Estructurado
4.3.2.2.- Influencia de la Concentracin de Inicial Azcar
Se han realizado simulaciones con cuatro concentraciones iniciales de sacarosa, tal -
como se ha mostrado en la Tabla 4.8. En cuanto a la influencia en la velocidad del
crecimiento. la Figura 4.20 muestra claramente que el modelo predice que la concentracin
inicial de sacarosa no influye en el crecimiento.
En la Figura 4.21 puede verse como influyen las diferentes concentraciones de azcar
sobre la evolucin de la biomasa durante el proceso. El modelo predice que cuanto mayor es
la concentracin de sacarosa mayor es la concentracin de xantano, siendo capaz de predecir
que la produccin cese cuando la concentracin de azcar es cero, debido a que la ecuacin
correspondiente a la velocidad de produccin de xantano aparece la concentracin de azcar.
La simulacin para observar la evolucin de oxgeno disuelto puede observarse en la
Figura 4.22, donde adems de observar la mala prediccin de este componente con el modelo
cintico no estructurado, se observa la prediccin de la evolucin del valor de kLaV mayor
cuanto menor es la concentracin inicial de sacarosa.
2,0
1,
1,
0,5
0,.
0,3
0,2
cf
0,1
0,0
70
Figura 4.20.-
t (Ii)
Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de sacarosa sobre la evolucin de biomasa.
197
Modelo Cintico No Estructurado
-s
tE
(y
3
Figura 4.21 .- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de sacarosa sobre la evolucin de xantina y
sacarosa.
y
80
70
60
SI)
40
6
30~
20
lo
o
Figura 4.22.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de azcar sobre la evolucin de oxgeno disuelto y
ktav.
198
50-
40
20
t (Ji)
t (Ji>
Modelo CinticoNo Estructurado
4.3 .2.3 .- Influencia de la Agitacin
En las Figuras 4.23 y 4.24 se muestran los resultados obtenidos al realizar
simulaciones con el MNE con diferentes programaciones de la velocidad de agitacin. Se han
realizado simulaciones con una agitacin constante y un perfil de agitacin. En la Figura 4.23
aparece la influencia de los dos tipos de agitacin sobre el crecimiento, el consumo de fuente
nitrogenada, sobre la fuente de azcar y la produccin del polisacrido, observndose que el
modelo es incapaz de predecir la influencia de la velocidad de agitacin en la evolucin de
estos componentes. Donde si se ve reflejada la influencia de la velocidad de agitacin es en
la evolucin del oxigeno y el valor de la transferencia de oxgeno. (kbav) tal como se muestra
en la Figura 4.24.
J
40
3 0
20j~
(y
lo
o
jo
tqi}
Figura 4.23.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico No Estructurado: influencia de la
velocidad de agitacin sobre la evolucin de amonio, biomasa, sacarosa y
xantano.
2,0
0 20 40 60 80
199
Modelo Cintico No Estructurado
30
25
20
46
lo
5
o
(jo
Figura 4.24.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
velocidad de agitacin sobre la evolucin de oxigeno disuelto y luLav.
0*1*115
ab
iv
0 20 40 60 80
t(h)
200
Modelo Cintico No Estructurado
4.3 .3 .- V alidez del Modelo Cintico No Estructurado
A lo largo de este apartado se han ido exponiendo los diferentes resultados obtenidos
con el MCNE propuesto, tanto en ajustes a datos experimentales como en las distintas
simulaciones. Se ha visto que se ha conseguido un buen resultado al aplicar el MCNE a los
diferentes experimentos realizados en este trabajo en las evoluciones de biomasa, xantano y
sacarosa; sin embargo, este modelo es incapaz de predecir una buena evolucin del oxigeno y
del amonio.
Se ha planteado un modelo cintico no estructurado en funcin de la temperatura (T)
de acuerdo a la tendencia que presentaban algunos de los parmetros obtenidos en los distintos
experimentos. No obstante, al reproducir los datos con el citado modelo en funcin de
temperatura, se observ que las reproducciones obtenidas con el MCNE(T) no son
suficientemente buenas.
Para la otra variable estudiada, es decir la concentracin inicial de amonio, no fue
posible siquiera obtener una relacin de este tipo, pues los parmetros obtenidos del ajuste con
el MCNE no presentaban una tendencia capaz de responder a alguna funcin matemtica que
permitiese plantear un MCNE(NH4~).
Las simulaciones fueron realizadas tomando como parmetros los obtenidos por ajuste
del experimento central aquel realizado con las condiciones ptimas (Santos,1 993)-.Se han
realizado las simulaciones oportunas con el fin de observar lavalidez del modelo planteado.
Al comparar los resultados obtenidos a partir de las diferentes simulaciones con los
resultados experimentales, se ha podido llegar a las siguientes conclusiones respecto a lo que
el Modelo Cintico No Estructurado es capaz de predecir:
La concentracin de xantano se ve influida por la concentracin inicial de amonio,
observndose un mximo en la produccin a 257 p.p.m de amonio, sin embargo el modelo no
lo predice.
201
liodelo Cintico No Estructurado
La concentracin de oxgeno en el medio se ve influida por la concentracin de xantano
fonnado, el modelo es incapaz de predecir la evolucin de oxgeno disuelto segn aumenta la
concentracin de polisacrido, ni tampoco predecir esta evolucin segn se va aumentando la
velocidad de agitacin.
El modelo es capaz de predecir bien la influencia de la concentracin de sacarosa inicial
sobre la evolucin de la concentracin de polisacrido, en cambio es incapaz de predecir de
forma adecuada la influencia del azcar en la evolucin de la biomasa.
Por todo ello, se puede concluir que el modelo cintico no estructurado permite
predecir bien la influencia de azcar inicial en el medio, y la influencia de la biomasa inicial,
en cambio no permite obtener buenas predicciones de la evolucin de oxgeno disuelto,
variable se suma importancia en este proceso. As pues, el Modelo Cintico No Estructurado
no es suficiente para la descripcin de la produccin de xantano. Se hace, pues, necesario
mejorar el modelo de modo que se consiga una mejora en las predicciones de las
evoluciones de os componentes. Ello implica tener en cuenta en el modelo factores que
influyen en el proceso y, que no han sido considerados hasta el momento. En cl prximo
apanado se aplicar un modelo cintico ms complejo, esto es un Modelo Cintico
Metablico que, es de esperar, mejore significativamente la descripcin de la produccin de
xantano.
202
5.- MODELO CINmo
METABLICO
Modelo Cintico Metablico
5.- MODELO CINTICO METABLICO
Como ya se ha visto, los modelos cinticos no estructurados son buenos para describir
el sistema cuando la composicin celular est aproximadamente en estado estacionario o no es
necesario tener en cuenta la influencia de ciertas variables en los valores de los parmetros. Sin
embargo, en una situacin en la tienen lugar cambios en la composicin celular, los modelos
no estructurados proporcionan una pobre aproximacin a la realidad. Por otra parte, es lgico
pensar que los modelos no estructurados no sean capaces de reflejar la influencia de ciertas
variables, fundamentalmente la composicin del medio, tal como ha quedado reflejado en el
apartado anterior. Para salvar estas debilidades en este tipo de casos, hay que recurrir a los
modelos estructurados.
Estos ltimos fueron clasificados por Nielsen y Villadsen (1 992) en varios tipos, tal
como se detall en el primer captulo de esta Memoria. Dentro de esta clasificacin, se
encuentran los Modelos Cinticos Metablicos (MCM), los cuales no estructuran la biomasa,
pero plantean relaciones estequiomtricas definidas para el metabolismo del sustrato carbonado
(Kogaycol. 1 969; HallyBarford 1 981 ; Barfordy col. 1 992).
203
Modelo Cintico Metablico
En La literatura hay diversos Modelos Cinticos Metablicos (MCM), entendidos como
aquellos que hacen un tipo de estructuracin slo para el metabolismo del o de los sutratos
carbonados, sin diferenciar panes en la biomasa, ya que la siguen considerando como en los
modelos no estructurados. Dentro de este tipo, existen modelos muy diferentes, muchos dc
ellos propuestos para problemas muy especificos de forma terica (Van Dedem y Moo-Young,
1 973; Gerasts y col., 1 990; Bibila y Flickinger, 1 991 ), realizando simulaciones a partir de
parmetros estimados de forma que no queda muy clara. Otros autores plantean estudios
metablicos ms generales, como es el caso de Koga y col., (1 969) y del grupo de Bardford
(Barford y col.. 1 990; Hall y Bardford, 1 981 Bardford y Hall 1 981 ; Bardford y col., 1 992a y
1 992b), estos ltimos autores proponen este tipo de modelos para el caso especfico de
Saccharomyces cerevzs ae.
El nico modelo de tipo metablico propuesto en la literatura para la produccin de
xantano es el planteado por Pons y col. (1 989). Este modelo fue formulado con datos obtenidos
en operacin tipo batch y en un reactor tipo columna de burbujeo. Consideran la biomasa como
una entidad independiente en el sistema, el crecimiento es considerado como no estructurado;
sin embargo se estructura la produccin de xantano, es decir, el modelo tiene en cuenta el
metabolismo del sustrato carbonado en el metabolismo celular. La Figura 5.1 muestra la
mterrelacin entre la sntesis del xantano y el catabolismo de la glucosa va Entner-Doudoroff
en conjuncin con el ciclo de Krebs. Las dos rutas no son independientes debido a que los
sutituyentes de la molcula de xantano, acetato y piruvato, presumiblemente derivan del
acetilCoA y del fosfoenolpiruvato (PEP). En dicho esquema se muestra adems dnde se
requieren o generan los compuestos de alta energa (ATP, GTP) y sus precursores (cofactores
reducidos, NADH,It FADH
2).
20~
Modelo Cintico Metablico
UDP- GLc
/1
UDP-Ac Gle
LIPIDO-P
.~1
1 4UMP
LIPIDO-P-P-G(c
IDP-GIc IDP
LIP!DO-P-P-GIc-GIc
Fre GP .Mari- GP .Man lP *GDP-Man
R uta III
Entner ~-UDP
Doudorof t
Ir
PE P
LIPIDO-P-P
y,
LIPIDO-P-P- Glc-GIc- Man
LIPIDO- P- P-Glc- GIc- Man
Ac-Glc
LIPIDO- P-P-GLc- GIc- Man
Ac-Glc
Man
LIPIDO-Gle-Gle- Man-Ac-GIc

PV R =Man
MONOMER O DE XANTANO
Figura 5.1 .- Rutas del catabolismo de glucosa y sntesis de xantano empleadas por
Xanthomonas campestris.
GIc

Gle S P .GIc 1 P
Gte Gle
Man
Ac Gte
Man=Pyr
205
Modelo Cintico Meablicc
Las relaciones estequiomtricas planteadas por estos autores para la evolucin de los
diferentes componentes son las siguientes:
Para la sntesis de xantano, Pons y col. (1 989) proponen tres relaciones
estequiomtricas. La primera establece la sntesis del esqueleto carbonado conteniendo cuatro
hexosas (dos manosas y dos glucosas) y una de cido glucurnico:
5C6H1206 + 1 }(ATP + 1120) +NaOH+ 2NADP * C30H47026Na + 1 ]< ADP + Pi)
(NADPH,FU) 5H20 [5.1 ]
La segunda ecuacin describe la sintesis de Acetil CoA, el precursor del constituyente
acetato:
C6HlrO + JIDP+ Pi + NADP~ + 3 N4D~ + 2CoASH ~> 2AcetilCozt + IITP
+NADPH,H~ 3 (NADH,H~)H202C02 [5.2]
El piruvato es directamente obtenido a partir del fosfoenolpiruvato (PEP):
CH/2O + Pi + NADP~ + 2NAD~ + 2CoASH > PEZ + ,4cetilCoA + NADPH, W
2(NADH, W)+ 1120CO? [5.3]
Las ecuaciones [5.1 ] y [5.3] son multiplicadas por los coeficientes estequiomtricos
que estos autores han extrado de la literatura, y se muestran la siguiente ecuacin:
5,49C6 FJj: O + 10,S9ATP+ 3 ,58(NADP~ NAD~) + ],3 SNaOH
+ 0,6CoASH+ 0,3 02 * C
3 . 3 4His 58027 3 6NQ1,3 8 + bO,89(ADP + Pi) [5.4]
3 3 8(NADPH, H
4; NADE!, H~) + 0,6 CoA + 0,6C02
Para la produccin de xantano, se considera que el peso molecular del monmero de
xantano corresponde a una frmula emprica: C
32,341 Ls,580n,36Na,,3s, por lo que su peso
molecular es 906,2 g/mol.
Para el catabolismo total de la glucosa, considerando que la ruta catablica es la de
Entner-Doudoroff en conjuncin con el ciclo de Krebs, se asume:
C6H/206 +3 (ADP + Pi) + 2FAD~ + 10NAD~ + 6H20 * 6C02 + 3 ATP
+ 10(NADH,H~ )+2FADH2 [5.5]
206<
Modelo Cintico Metablico
La energa de mantenimiento se formula como:
ATP * ADP+ Pi [5.6]
Para la fosforilacin oxidativa:
NADH,H~ + 0,502 -* NAD~ H2O
[5.7]
FADH2 + 0,502-> FAD~ + H20
Las velocidades especficas de crecimiento de las ecuaciones [5.4] a [5.7] son,
respectivamente q ~, q c, q ni, q y q p. La relacin entre las ecuaciones [5.61 y [5.7] puede
expresarse como la relacin qp/ q? , siendo la relacin P/O o nmero de molculas de ATP
formadas durante la transferencia de un par de electrones a travs de la cadena respiratoria
hacia el oxigeno, que es el aceptor fmal de estos electrones en los organismos aerobios.
Pons y col. (1 989) plantean relaciones estequiomtricas para diferentes componentes
del sistema:
Velocidad de consumo de glucosa:
qg =qj +5,49 qx [5.8]
Velocidad de produccin de CO
2:
q rn. =q c~
0 5 [5 .9]
Velocidad de consumo de oxgeno:
q
0=0,5q ~ [5 .1 0]
Velocidad de transferencia de oxgeno:
= kLaV [5.1 1 ]
CbMax(C*~Co,)
Velocidad de produccin de cofactores:
[5.1 2]
207
Modelo Cintico Metablico
VeLocidad de consumo de ATP:
qTP=]O,
89qX+q,,, [5.1 3]
Velocidad de produccin de ATP:
q T~ =3 qj qj [5.1 4]
Se asume estado pseudoestacionario para cofactores y balances de ATP. Las 7
ecuaciones ([5.8] a [5.1 4]) del modelo implican 1 0 incgnitas, donde nueve son velocidades
especificas qg, qc, qx, qccn, qo2, q? , qp, q
1 w, qATP y la concentracin de oxgeno disuelto.
Un aspecto importante que consideran estos autores es el mecanismo para la energa de
mantenimiento, proponiendo que el consumo de energa para este mantenimiento podra
proporcionar rendimientos tericos de xantano Yg.x entre 0,9 y 0,77 g de xantano/g de
glucosa para valores de P/O en un rango entre 3-0,5 respectivamente. Esto no parece apoyar los
resultados experimentales, los cuales no exceden de 0,7 g de xantanog de glucosa
Entre las suposiciones del modelo hay que considerar:
El requerimiento de ATP para la sntesis de xantano (1 O,
89qx) no iguala la velocidad
de sntesis qATP puesto que la demanda de ATP para mantenimiento q,,, es positivo.
Asumen que los requerimientos de ATP para el mantenimiento son proporcionales al
requerimiento para la sntesis de xantano, lo cual rinde:
_ [5.15]
q ~
Si se sustituye la ecuacin [5.1 5] en la [5.1 3] se obtiene la ecuacin [5.1 6]:
~ATP _
____ 89+E [5.1 6]
Esta ecuacin indica que la cantidad de ATE implicado en la sntesis de xantano es
mayor que la cantidad que estequiomtricamente predice la ecuacin [5.4].
2 08a
Modelo Cintico Metablico
Los resultados experimentales muestran la clara influencia del coeficiente de
transferencia de oxigeno sobre las velocidades especficas. Esto debe ser expresado a
travs de la limitacin de oxigeno sobre la velocidad especifica opIada al consumo
de oxgeno, de acuerdo a:
qrMCO: [5.1 7]
q = (Kc+Co
2)
Cuando el oxgeno no es limitante, se obtiene el valor mximo, qrM. Cuando el
oxgeno es limitante , es decir su concentracin es cercana a cero, la ecuacin 1 5.1 7]
queda como:
qrM Co
;
[5.1 8]
qr= Kc
La relacin fmal est basada en las investigaciones de Rbels (1 983). La relacin PO
de 3 es estequiomtricamente poco realista para los organismos en vivo. EJ valor P/O
debe ser ms pequeo debido a la fosforilacin oxidativa. Basados en la condicin de
Rels de no limitacin de oxigeno, el valor ms alto de PO es de 1 ,2 mol ATP/mol de
cofactor. Por tanto, Pons y col. (1 989) asumen que la relacin entre la tensin de
oxgeno y PO es funcionalmente similar a la relacin entre tensin de oxigeno y la
velocidad de respiracin:
q~ _ 1,2 Co; [5.1 9]
qr (Kc+Co;)
Las ecuaciones [5.1 6], [5.1 7] y [5.1 8]introducen tres nuevos coeficientes F, qrM y Cc.
La constante de Michaelis, Cc, es estimada como el valor ms bajo de tensin de
oxgeno disuelto (2% de saturacin de aire corresponde a Kc = 4 ,6 . 10.6 molfL). El
coeficiente q~ es calculado a partir de la velocidad especfica mxima de produccin
de xantano en tanque agitado con limitacin de oxgeno (qxirO,
2S g de xantano/g
biomasa h) el correspondiente valor de q~M=8.1 0~3 mol NADVg biomasa h.
Finalmente, el valor de F es estimado en 23 mo] de xantano/mol de ATP empleado
para mantenimiento. Esto rinde un valor de YX.ATP de 34 mol ATP/mol de xantano y
una importante eficiencia en el turnover de ATP en xantano de l0,89/340,32.
Por tanto, el modelo propuesto por Pons y col. (1 989) se puede escribir, adaptndolo a]
mtodo utilizado en esta Memoria:
209
klodelo Cintico A etablk~
Evolucin de biomasa:
Evolucin de xantano:
Evolucin de glucosa:
Evolucin de oxgeno:
dC
0
,
dt
= kLaV(C * Co:) ros
Asumiendo estado pseudoestacionario para la concentracin de oxgeno disuelto:
dC<
)
dt
Las velocidades de reaccin planteadas para las reacciones del esquema, en el que
intervienen la biomasa, el sustrato carbonado, oxgeno y dixido de carbono son:
Para la biomasa:
r x = Ch qr.
Para la glucosa:
Kg =C8 qr
(1 + 4. Y? -
(3 ,58 + 4~ Y r - ArZ )
Y x - MP
(5,49 + 20,77 Y ~ - p + ( --- -)
________________ 3
(3 ,58+4 Yr- ATP)
Para el oxgeno:
Para el dixido de carbono:
r o~ = 0,5 Ch qr
[5.281
r CO: =0,3 r x + Ch~
/2
dCb
=/;
dt
dCx
=
[5.20]
[5.21 ]
dCg
It
[5.22]
[5 .23 1
[5.24]
[5.25]
[5 .26]
[5.27]
21 Oa
Modelo Cintico Metablico
Las ecuaciones cinticas del modelo las plantean de la siguiente forma:
lCt [5.29]
rh=/JMCh.( )
Ch,.
q r = qrM Co: (Kc Coz) [5.301
Yr - = l,2~ Coz~ /(Kc Coz) [5.31 ]
Ch~. =6,3 5ACbCho [5.32]
Pons y col. (1 989) slo realizan ajuste de datos experimentales de la biomasa para la
cual emplean la ecuacin logstica. Para el resto de componentes realizan slo una simulacin.
Para la integracin de las ecuaciones diferenciales emplean el algoritmo de Runge Kutta de
cuarto orden. Al comparar los resultados obtenidos de la simulacin del modelo con los
resultados experimentales confirman la validez del modelo propuesto.
Pons y col. (1 989) plantean el modelo que se ha descrito para un reactor tipo columna
de burbujeo, por ello, no es posible la aplicacin directa de este modelo propuesto a los datos
experimentales obtenidos en el presente trabajo. unido a esto, tampoco realizaban un ajuste de
los datos experimentales para obtener los parmetros del modelo. Por esto, se ha formulado un
modelo cintico metablico para la produccin de xantano en un tanque agitado, teniendo en
cuenta para ello algunas de las consideraciones planteadas en el Modelo Metablico propuesto
por Pons y col. (1 989).
21]
Modelo Cintico Metablico
5.1 .- FORMuLACIN DEL MODELO
En este caso, al igual que en el anterior, el modelo propuesto describe el crecimiento
del microorganismo mediante la ecuacin logstica, como funcin de la concentracin de
nitrgeno. Sin embargo, el modelo estructura la produccin de xantano, es decir el modelo es
metablicamente estructurado, pues tiene en cuenta el metabolismo de la fuente de carbono
dentro de la clula. Se han tomado todas las relaciones estequiomtricas propuestas por Pons y
col. (1 989) a excepcin de la planteada para el xantano, pues el peso molecular medio del
precursor de xantano no es 906,2 , como suponen estos autores, sino que es prximo a 923 por
lo que la relacin estequiomtrica para la produccin de xantano queda conforme a la
ecuacin [5.33]:
549C
6 H 206 + l~89 ATP+3 .58(NADPj )VADV~ 1.3 8 NaO!!
U6CoAS!! +a3 o, -
4Cnn H
49.% O? suNaJs+O
6 CO
2 [5.33]
5.3 8-j,O1089 (ADP+Pi) +3 .58(NADPH,H~; NADH,H
t) +0.6CoA
Las relaciones estequiomtricas para el catabolismo total de la glucosa, energa de
mantenimiento y fosforilacin oxidativa, vienen dadas por las ecuaciones [5.5], [5.6] y [5.7],
propuestas por Pons y col. (1 989).
Por tanto, las velocidades de produccin de los componentes, suponiendo que toda la
sacarosa -sustrato carbonado empleado en este trabajo- es asumido en las ecuaciones como
glucosa, son:
dC
3 5,49 rir~ [5.34]
It
dC~ = ri [5.35]
dt
= 1 0,89ri+3 re--r3 rs [5 .3 6]
It
dCCof 3,58 ri + 1 2 r~ r4 [5.37]
It
dC02 =0,3 r1 0,5r4 +kLaV (CC0) [5.38]
It
212
Modelo Cintico ;Vletablico
Segn Pons y col (1 989) la cintica de la reaccin dada por la ecuacin [5.7] es:
k4Co:
______ Cx r4=
K4+Co:)
[5.39]
Para la reaccin de la ecuacin [5.33], la produccin de xantano, Pons y col. (1 989)
proponen:
=r4.[
14 Y rp
3 ,58 +4Y,trp,p
[5.40]
Suponiendo estado pseudoestaconario para los cofactores:
dCcoj = O = 3 ,58 ri + 12 r~
[5.41 ]
It
Sustituyendo en esta ltima ecuacin las ecuaciones [5.39] y [5.40] y despejando r
2, se
obtiene:
!1~3 ~58C
1+4. Y rp
3 ,584.YTrP)J
Por tanto, las velocidades de reaccin quedan de la siguiente forma:
(c~
rx=kx +Cxo
Y Yw~ )
k4Co2
ri =
K4 + Cm
1 k4~Co
,
r2 = . _________
12 K4+Co,
CxJ l Cx
Y Cxo + Yxv CNO)
Cx j3 58+4JflTPP j
[5.43]
[5.44]
[5.451 CxI 1
YATPPjI ji
Los valores de Y,~, y YATPP se han fijado en los propuestos porPons y col. (1 989):
Co
[5.46]
[5.47]
[5 .42)
Yrp W,2~
K4 + Co.
YATPP 3 4
213
Modelo Cintico Metablico
Quedando as el modelo cintico metablico (MCM), formado por el siguiente grupo
de ecuaciones diferenciales:
Para la biomasa:
dOy (Cv 6 Cx
It =kv. y
0+ C,i Cx + Yxw Cx) [5.48]
Para el azcar:
dCs J 5,94 dO 1 MCc, F( 1+4Yrp Ml
___=180 ____. ___ - . - Cx.tl3 58d
It 923 ,2 It 12 K4Co, LK 3 ,584 YITPP )jJ
1 ICx
Yxs It [5.49]
Para el producto:
k4 Co, ( 14Y
1~
,
___r:923 ,2. K4CO, K3 , Cx [5 .5 0]
It 58 + 4. YATPP
Para la evolucin de oxgeno disuelto:
ICo, 0,3 dC~ k4Co, Ck(C*C) dCx [5.51 ]
It 92 3 ,2 It K4Co Yox It
El valor del coeficiente volumtrico de transferencia de oxigeno se ha calculado
empleando la misma correlacin que para el MNE, que viene dado por la ecuacin [4.23].
Por tanto, el Modelo Cintico Metablico propuesto tiene de siete parmetros, los
representativos de la biomasa : k~ y YxN -obtenidos de la misma forma que en el MINE- y los
parmetros correspondientes a la evolucin de azcar, xantano y oxgeno disuelto: k4, 1 < 4, Y~< 5,
Yox. En este caso, la aplicacin del MCM a los datos experimentales para la obtencin de los
parmetros se realiz de la siguiente forma:
21~
Modelo Cintico Metablico
Primero se realiz el clculo de los parmetros relacionados con el crecimiento: kx eYxr.
Estos parmetros se obtienen mediante regresin no lineal en simple respuesta aplicada a la
ecuacin [5.48] (estos ajustes son, por tanto, los mismos que los realizados en el capitulo
anterior del MCNE, por lo que no se volvern a exponer).
Luego se aplic una regresin no lineal en mltiple-respuesta a las ecuaciones [5.49] a
[5.51 ], obteniendo as los valores de los parmetros k
4, K4, Yxs and Yox. Debido a que los
datos experimentales de la frente carbonada y del xantano eran 1 05 dos rdenes de
magnitud mayores que la concentracin de oxgeno disuelto, es necesario pesar los residuos
para optimizar el valor de los parmetros. Adems, en la ecuacin [4.23], correspondiente a
la correlacin del coeficiente volumtrico de oxigeno, es necesario sustituir la ecuacin
correspondiente de calibrado de la concentracin de xantano en ifincin de la viscosidad
para cada experimento.
215
Modelo Cintico Metablico
5.2.- AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES
Para la aplicacin del modelo cintico metablico planteado se han realizado los ajustes
de los experimentos del 1 al 7. Al efectuar el ajuste de los datos experimentales obtenidos, se
observ que el modelo era incapaz de ajustar los datos de ciertos experimentos debido a la falta
de convergencia del algoritmo. En la Tabla 5.1 se muestran los resultados de los parmetros
fisicos y estadsticos de los experimentos donde se pudo aplicar el MCM.
Todos los ajustes realizados han proporcionado niveles de confianza superiores al 950~,
hay que apuntar que los valores obtenidos para el parametro K4 son mucho ms altos que la
concentracin de oxgeno disuelto, por lo que las ecuaciones [5.39] y [5.46], pueden ser
simplificadas a orden 1 de la siguiente manera:
k4Co
Cx~kCo Cx [5.52]
KqCo
Yrp=L2 Co, k Co, [5.53]
K4Co, -
Los datos experimentales fueron nuevamente ajustados, teniendo en cuenta estas
modificaciones. Para diferenciar el modelo en el que r
4 e son ecuaciones de orden 1
respecto al anterior que aparecan con cinticas tipo Monod se denomin a este modelo como
Modelo Cintico Metablico Simplificado (MCMS).
En las Tablas 5.2 a 5.8 se recogen los valores de los parmetros fisicos y estadsticos
obtenidos de la aplicacin del MCMS a los experimentos del 1 al 7. Las Figuras 5.2 a 5.8
muestran las reproducciones del modelo correspondientes a cada experimento al realizar dicho
ajuste. En estas figuras, la lnea continua representa la reproduccin obtenida de la aplicacin
del modelo mientras que los smbolos indican los puntos experimentales.
En la Tabla 5.2 se muestran los parmetros obtenidos por ajuste del experimento no i,
realizado a 25
0C y con 257 p.p.m. de amonio inicial, como puede observarse, todos los
parmetros obtenidos cumplen las restricciones estadsticas impuestas, todos los parmetros
presentan intervalos de confianza estrechos, presentando valores tanto de la t de Student como
de la F de Fischer elevados. En cuanto a la reproduccin de Jos datos experimentales reflejada
en la Figura 5.2, se observa que para este experimento el modelo predice de forma adecuada
216
Modelo Cintico Metablico
tanto la evolucin de la concentracin de xantano como la concentracin de sacarosa. Para el
oxgeno, si bien no es tan bueno, el valor terico mejora notablemente la reproduccin obtenida
con el MCNE, como se puede comprobar en la Figura 4.2 del captulo antenor.
Los parmetros obtenidos del ajuste del experimento n
0 2, es decir el realizado en las
condiciones ptimas de produccin: 28 0C y 257 p.p.m de amonio (Santos, 1 .993), aparecen en
la Tabla 5.3. Todos los parmetros obtenidos rinden intervalos de confianza superiores al 95%,
si bien hay que apuntar que el valor de t de Student del parmetro Yox es relativamente bajo.
El ajuste de los datos experimentales obtenido para este experimento es significativamente
mejor que el que se obtuvo para el mismo experimento con el MCNE. Para este experimento,
el MCMS muestra una excelente reproduccin de la evolucin de los tres componentes
(sacarosa, xantano y oxigeno disuelto) tal como se observa en la Figura 5.3.
En la Tabla 5.4 se muestran los parmetros obtenidos de la aplicacin de modelo
experimento realizado a 31 0C y con 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento n0 3). Al
igual que en los dos experimentos anteriores, se cumplen las condiciones estadsticas para la
de Student y la F de Fischer. Se obtiene una buena reproduccin de los datos experimentales de
la evolucin de oxgeno disuelto, de la concentracin de xantano y de sacarosa, tal como puede
observarse en la Figura 5,4.
En cuanto al experimento n0 4, realizado a 34 0C y con 257 p.p.m. de amonio inicial,
se observa que el valor del parmetro k (Tabla 5.5) es significativamente elevado en
comparacin con el que presenta en los experimentos anteriores, mostrando un valor de t de
Student mucho menor que el obtenido en los ajustes de los experimentos realizados a otras
temperaturas. La reproduccin obtenida (Figura 5.5) no es tan buena como en los dos casos
anteriores, pero supera con mucho a la obtenida con el MCNE.
En la Tabla 5.6 aparecen los valores de todos los parmetros obtenidos al aplicar el
MCMS al experimento n~ 5, realizado a 28 0C con 65 p.p.m. de amonio. En dicha tabla
puede apreciarse que se cumplen las restricciones estadsticas, siendo el valor ms bajo de t de
Student el obtenido para el parmetro Yox. En cuanto a la reproduccin de la evolucin de los
los componentes con este modelo, se obtiene una evolucin de la concentracin de sacarosa
aceptable mientras que la evolucin de la concentracin de xantano y oxgeno disuelto
difieren bastante de las obtenidas experimentalmente, tal como muestra la Figura 5.6.
217
Modelo Cintico Metablico
Para el experimento n
0 6, realizado a 28 0C y con una concentracin de amonio inicial
de 1 30 p.p.m, vuelve a observarse que todos los parmetros superan los valores tericos
tabulados de t de Sttdent y F de Fiseher. En la Figura 5,7 aparecen las reproducciones de las
evoluciones de los diferentes componentes obtenidas al aplicar el MCMS. en esta figura puede
observarse un buen ajuste a los datos experimentales tanto de la concentracin fuente
carbonada, como de Ja concentracin de xantano y del oxgeno disuelto.
La Tabla 5.8 muestra los parmetros obtenidos del ajuste al modelo para el
experimento realizado a 28 0C con 51 4 p.p.m. de amonio (experimento n0 7). Hay que
destacar el valor significativamente alto del parmetro k, el cual es aproximadamente 2
rdenes de magnitud superior al obtenido en el resto de experimentos. Adems, el valor
obtenido para la t de Student no supera el valor tabulado con un 95% de confianza. Otro
parmetro en el que se obtiene un valor bajo de la t de Student es k, este parmetro entra
dentro del limite terico pero el valor es bajo en comparacin con los experimentos anteriores.
En cuanto a la reproduccin de los datos experimentales, en la Figura 5.8 se observa una
reproduccin aceptable para la evolucin de sacarosa, no siendo tan buena para la
concentracin de xantano ni para el oxgeno disuelto.
2/8
Modelo Cintico Metablico
Tabla 5.1 . -Valores fisicos y estadsticos de los parmetros obtenidos mediante el ajuste de los
datos de los experimentos 2,3, y 4 al MCM.
T
Pa,.
Va lorn Pa rmetros t Studeu,t F Fiseber
5RC
Mx. pt. Mio. Obtenido Ta bula do Obtenido Ta bula do
28
y 0,552 0.535 0.519 68,77
2,080 66984 317 2.0610 Nt 6.229 6,073 5,918 80.26
y 3.670 3.183 2.696 13,07
199 2778 2.48 2,09
It 5.97.10 5,95[0< 5.94102 805,6
0.2 It) 0,177 0,145 0,87
Yox [54,8 117,3 79.82 6,26
31
kx 0,472 0,446 0.421 36,71
2,145 4(42 3.74 [.4110 St 4,652 4,325 3.998 27,29
y 6,912 6,030 5,148 13.67
It 6.66.10< 6,66.102 6.66.10.2 I.38.I0~
, 0,168 0.155 0.143 24,80
3 7 .55 33.55 29,55 [6,77
1>. 0,439 0,423 0,408 57,76
2,262 4263 4,26 0.80:101
YX 5,021 4.732 4,443 34,53
y 0.808 0.759 0,711 31,45
2010 2780
It 376 [0 375.10< 3,74.10.2 9lO
Yxs 0153 0130 0,107 11,29
Yo~ 3487 31,29 27,71 1754
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Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste
experimento n
0 1 , realizado con Xant/zotnonas carnpestris a
de 250 C, medio A (257 p.p.m. de amonio), programacin de
r.p.m. inicial).
Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste
experimento n0 2, realizado con Xanthotnonas campestris a
de 280 C, medio A (257 p.p.ni. de amonio), programacin de
r.p.m. inicial).
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la temperatura
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227
Modelo Cintico Metablico
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Figura 5.4.-
Reproduccin de
experimento no 3,
de 31 0 C, medio A
r.p.m. inicial).
40-
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los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
realizado con Xanthomonas campestris a la temperatura
(257 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (21 0
2,5
2,0
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o
1 ,0
0,5
Figura 5.5-- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n
0 4, realizado con Xanthomonas carnpestr s a la temperatura
de 340 C, medio A (257 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (21 0
r.p.m. inicial).
.
. a
a. AC~,
a
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t (h)
228
Modelo Cintico Metablico
cf
Figura 5.6.-
cf
Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste
experimento n
0 5, realizado con Xanthornonas campestris a
de 280 C, medio A (65 p.p.m. de amonio), programacin de
r.p.m. inicial).
25
20
t5~
o
05
al MCMS del
la temperatura
agitacin (21 0
2,5
2,0
1
5b
1,0
0,5
0,0
Figura 5.7.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento ~0 6, realizado con Xanthomonas campestris a la temperatura
de 280 C, medio A (1 30 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin
(21 0 r.p.m. inicial).
o 3J
(h)
t (h)
229
Modelo Cintico Metablico
u
< A
y-,
Figura 5.8.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste
experimento n
0 7, realizado con Xantho,nonas campestris a
de 280 C, medio A (475 p.p.m. de amonio), programacin de
r.p.m. inicial).
al MCMS del
la temperatura
agitacin (21 0
2.5
zo
L5
o
E
o
1 ,0 ~
23 0
Modelo Cintico Metablico
5.3 . DISCUSIN
5 .3 .1 .- Variacin del Valor de los Parmetros con las Variables
5 .3 .1 .1 .- Influencia de la Temperatura
En la Figura 5.9 se muestran las tendencias de los parmetros del modelo (MCMS) con
la temperatura. No se han considerado los parmetros correspondientes al crecimiento debido a
que la biomasa se ha considerado sin estructuracin y, por tanto, los resultados son los mismos
que en el MCNE. vistos en el captulo anterior.
En cuanto a los parmetros correspondientes a la evolucin de las concentraciones de
sacarosa, xantano y de oxigeno disuelto obtenidos del ajuste de los datos a diferentes
temperaturas, la tendencia presentada por los parmetros Yox y k es muy similar, ambos
parmetros presentan un mximo, en tomo a 28 oc para Vox y a 3 o c para k. Los otros dos
parmetros del modelo -Y=~sy k- presentan una tendencia lineal con la temperatura. El
parmetro relativo a la velocidad de desaparicin del azcar, Y~< s , decrece, mientras que k,
parmetro relacionado con la velocidad de aparicin del producto, aumenta con el incremento
de dicha variable.
De acuerdo con estas tendencias, los cuatro experimentos han sido ajustados
conjuntamente al MCMS, teniendo en cuenta la influencia de los parmetros con la
temperatura, de la misma forma que se realiz para los parmetros del modelo MCNE, visto en
el captulo antenor.
Los parmetros k y Yox pueden ponerse como fUncin de la temperatura de acuerdo
con la expresin de Ratkowsky y col. (1 983), dada en las ecuaciones [5.54]y [5.55], mientras
que Yx~ y k han sido ajustados a expresiones lineales (ecuaciones [5.56]y [5.57]).
El ajuste de todos los experimentos al MCMS (T) (Modelo Cintico Metablico
Simplificado en fhncin de T) fUe realizado en mltiple-respuesta, considerando como
respuestas: sacarosa, xantano y oxigeno disuelto. Las tendencias presentadas por estos
parmetros, as como el ajuste a las ecuaciones [5.54]a [5.57] se muestran en la Figura 5.9:
23 1
Modelo Cintico Metablico
k(T) / O - (T - T,~o-,.> -[1- exp C: - IT - Tmax))Jf [5.54]
y
0(T) z{ C 1 (7 -T ,~,~) fi -exp(C -, -< 7 - [5.55]
Y~s = a /3 -7 [5.561
kYT)=a/3 -T [5.57]
Este modelo MCMS(T), tiene doce parmetros: C1 , Tmin, C2, Tn,a,c, C, Tmin, C2, Ti,,a< ,,
a, fl, a y fl, tal como se indica en las ecuaciones anteriores. En la Tabla 5.9 aparecen los
valores de los parmetros y sus estadsticas, obtenidos del ajuste de los cuatro experimentos
realizados a diferentes temperaturas, donde los parmetros relativos a la frente carbonada, al
xantano y al oxigeno disuelto han sido puestos en funcin de la temperatura de la forma
indicada. Como se observa, para todos los parmetros se cumplen las restricciones estadsticas
superando siempre el valor terico de t de Student y de F de Fischer.
Las tendencias obtenidas para estos cuatro parmetros cuando son ajustados
conjuntamente, se mostraron en la Figura 59, donde el resultado de este ajuste era el
representado por la lnea continua. Este ajuste es el resultado de sustituir los valores de
temperatura en las ecuaciones [5.54] a [5.57] con los valores de los parmetros obtenidos,
de la siguiente forma:
7 ,> (0,94- (7 -19,45)-fi- exp(1,3 99 -(7 -3 4,24 [5.58]
k (T) 2,913 + 2,048 7 [5.59]
( 0,571 - (T -24,3 5)11 - exp(0,20S (T~ 3 7,16))]/2 [5.60]
Todos los datos experimentales obtenidos en los experimentos llevados a cabo a
diferentes temperaturas han sido reproducidos mediante sustitucin en las ecuaciones [5.58] a
[5.61 ] dentro del modelo cintico. Las Figuras 5.1 0 a 5.1 3 muestran una excelente
reproduccin de los resultados experimentales con el MCMS(T).
23 2
Mode/o Cintico Metablico
1 20
1 00-
~,, 80
~ 60
~ 40-
20-
o
20 25 3 0 3 5
T<
0C)
0,25
0,2 ,% -
045 1~>
0,1
0,05
o
20 25 30 35
Tc7 C)
Figura 5.9-
Evolucin de los parmetros del MCMS con la temperatura. La lnea
discontinua indica la tendencia de los parmetros obtenidos experimento a
experimento, la lnea continua representa el ajuste a las ecuaciones [5.54] a
[5.58].
1 40
1 20-
1 007
80-
60
40-
207
o
20
1 80
1 60
1 40
1 20
x 1 00
o
> - 80
60
40
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o
20
S r
25 30 35
T(0C)
GO
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T (OC)
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oO-
j
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o
l
a
C
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U
,
O
-
o
e
Modelo CinticoMetablico
2,5
2,0
1 5 ~
o
1 ,0:
0,5
0,0
Figura 5.1 O-
(- 5-
4
$9
(y
Reproduccin de los datos
medio A (con 257 p.p.m. de
r.p.m.) al MCMS (T).
del experimento n
0 1 realizado a 250 C,
amonio) y programacin de agitacin (21 0
2,5
2,0
1,5?
ib-
1 ,0 ~
0,5
0,0
Figura 5.1 1 .- Reproduccin de los datos del experimento n0 2 realizado a 280 C,
medio A (con 257 p.p.m. de amonio) y programacin de agitacin (21 0
r.p.m.) al MCMS (T).
40
35
30
20-
15
un
25
(-5-
-4
cf
O 10 20 30 40 50 60
t (h)
t(h)
23 5
Modelo Cintico Metablico
40
3 5
30
(-5-
$9
cf
25
20
I5
I0~
5
o
Figura 5.12.-
40
35
30
$9
z
U
25
20
[5
lo
5
o
Reproduccin de los datos del experimento n
0 3 realizado a
3O c, medio A
(con 257 pp.m. de amonio) y programacin de agitacin (21 0 r.p.m.) al
MCMS (T).
2,5
2,0
l,5~
ib-
3 -
1,0
0,5
Figura 5.13.- Reproduccin de los datos del experimento ~0 4 realizado a 340 C, medio
A (con 257 p.p.m. de amonio) y programacin de agitacin (21 0 r.p.m.) al
MCMS (T).
2,0
1.5
-2
1~0
(-y
0,5
0,0
40 20
t (h)
t (h)
23 6
Modelo Cintico Metablico
5.3.1 .2.- Influencia de la Concentracin de Amonio
Como ya se vi anteriormente, el ajuste obtenido con el MCMS no permiti una buena
reproduccin de los datos experimentales de los experimentos realizados con 65 p.p.m.
(experimento n
0 6) y con 51 4 p.p.m. (experimento n0 7). Para el ajuste del experimento con 51 4
p.p.m. de amonio el valor del parmetro k era muy elevado, y el valor de la t de Student para
el citado parmetro era inferior al valor tabulado. Para el experimento realizado con 65 p.p.m.,
aunque se cumplan las condiciones estadsticas, se observ que la reproduccin de la
evolucin de la concentracin xantano y de la concentracin del oxigeno no era buena.
Los experimentos llevados a cabo con 1 30 p.p.m. y 257 p.p.m. de amonio rendan
buenos resultados, tanto desde un punto de vista estadstico, como en la reproduccin de los
resultados experimentales.
En la Figura 5.1 4 se muestra la evolucin de los parmetros del MCMS con la
concentracin inicial de amonio empleada. Aunque para el caso de los parmetros k e Yxs
(Figura 5. 1 4-b y 5.1 4-d, respectivamente) parecen mostrar una tendencia que podra ajustarse
a una fUncin matemtica tipo Ratkowsky , no ocurre lo mismo para los parmetros k e
(Figura 5.1 4a y 5.1 4c, respectivamente). Por ello, no resulta planteable ningn modelo
(MCM) en fUncin de lavariable concentracin inicial de amonio.
23 7
Modelo Cintico Metablico
5)00
-1 )00 -
x00 -
~oo-
1 000 -
O
600-
MX)
c
300
20<1 -
1 (X)
1)
n y
0 lOO 200 300 400 500
Amonio (ppm)
0 [00 200 300 400 500
Amonio (ppm)
so
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-40-
20
0
020 4
tOi5
1)10
600
o
O -:
0 1 00 200 300 400 500 600
Amonio (ppm)
1 i 1 i
lOO 200 300 400 500 600
Amonio (ppm)
Figura 5 .1 4.- Evolucin de los parmetros del MCMS con la concentracin de amonio inicia].
La lnea discontinua indica la tendencia de los parmetros obtenidos
experimento a experimento.
23 8
(a)
~
1,1 111
(b)
,,
A
~1~
0
-1 -
1- -H
1
(d) -
1~
3 $ ~
It
Modelo Cintico Metablico
5 .3 .2.- Simulacin con el Modelo Cintico Metablico
Ya fue comentado en el captulo anterior la gran ventaja predictiva de realizar
simulaciones, una vez comprobado que el modelo cintico objeto de estudio es vlido.
En este captulo se ha visto que el MCM ha podido ser obtenido en funcin de una
de las variables estudiadas, concretamente, de la temperatura. En cambio no se ha planteado
un modelo que tenga en cuenta la variacin de la concentracin inicial de amonio, lo cual es
lgico si se tiene en cuenta que la concentracin de amonio slo influye en el crecimiento -
biomasa- y, en el modelo planteado en este capitulo, se ha considerado este componente
como no estructurado, esto es, expresado de la misma forma que en el MNE y, por
consiguiente, mediante la ecuacin logstica.
Las simulaciones realizadas en este captulo son las mismas que en el captulo
anterior. Se han realizado aquellas con las que, en principio, cabra esperar mayor influencia
en la evolucin de componentes, como biomasa inicial, concentracin de azcar inicial y
concentracin de oxigeno disuelto.
La concentracin de biomasa inicial influye en la evolucin de componentes del
sistema. Esta concentracin de biomasa inicial influye en primera instancia en la evolucin
de biomasa tal como contempla la ecuacin [5.48] correspondiente a la ecuacin logstica
para el crecimiento! Por consiguiente, influir en la evolucin de la sacarosa (ecuacin
[5.49]), de la concentracin de xantano (ecuacin [5.50]) y del oxgeno disuelto en el medio
(ecuacin [5.51 ]).
En cuanto al cambio de alguna condicin que afecte a la evolucin de oxgeno
disuelto, en este modelo se ver la influencia no slo en la evolucin de este componente
sino en la velocidad de produccin de xantano, tal como se puede apreciar en la ecuacin
[5.50] y en la evolucin de la concentracin de azcar, como se indica en la expresin dada
por la ecuacin [5.49].
Finalmente, la influencia de la concentracin inicial de sacarosa se ver reflejada
en la propia evolucin del azcar, tal como indica la expresin dada por la ecuacin [5.49].
23 9
Modelo Cintico Me/abdico
Por el contrario, en la evolucin del producto no debe de influir, pues la ecuacin que
expresa la citada evolucin (ecuacin [5.50]), no presenta en su expresin la concentracin
del azcar.
En la
simulaciones
simulaciones
influencia en
Tabla 5.1 0 se muestran las condiciones de operacin empleadas en diferentes
que han sido realizadas con el MCM(T) en operacin en discontinuo. Las
se han realizado cambiando el valor inicial de diversos factores cuya
el proceso es de sobra conocida (Santos, 1 993).
Los parmetros del modelo fueron obtenidos en funcin de la temperatura mediante
expresiones dadas en !as ecuaciones [5.58] y [5.61 ], pues la forma ms adecuada de realizar
simulaciones es teniendo en cuenta la influencia de las variables en los parmetros del
modelo cintico planteado. Esto ha sido posible para los experimentos realizados a
diferentes temperaturas pero no para la variable concentracin de amonio como ya se ha
comentado.
Tabla 5.10 .- Simulaciones realizadas con el MCMT (T) en operacin
S imulacin
Valores
Inf luencia de la biomasa inicial
Influencia del azcar inicial
Influencia del porcentaje de
Oxgeno Disuelto
Influencia de la agitacin
Cxo =0,03 gIL
Cxo 0,07 g/L
=0,50 g/L
Cxo = 1 ,00 gIL
Cso IOg/l
Cso =20 gIl
40 gIl
CsoSOg/l
C
02= 1 0%
=20%
Agitacin constante
Perfil de agitacin
240
Modelo Cintico Metablico
5 .3 .2.1 .- Influencia de la Concentracin Inicial de Biomasa
La influencia de la biomasa inicial en el crecimiento, a lo largo del tiempo de
fermentacin, se muestra en la Figura 5.15. Como puede observarse, cuanto mayor es la
concentracin inicial, mayor es la concentracin mxima de biomasa al fmal de la
fermentacin.
En cuanto a la influencia sobre la velocidad de produccin de xantano y consumo
de azcar se puede observar en la Figura 5.1 6, que el modelo predice un mximo para la
produccin de xantano. Es decir, de las cuatro concentraciones iniciales de biomasa inicial
utilizadas en la simulacin, el modelo predice un mximo de produccin de xantano con la
concentracin inicial de 0,07 gIL. En cuanto a la evolucin del azcar, como es lgico, la
tendencia guarda relacin con la concentracin de xantano, esto es, en aquellos casos en los
que el modelo predice ms xantano, tambin predice mayor consumo de la fuente carbonada
y viceversa.
En la Figura 5.17 se observa la significativa mejora del MCMS(T) en cuanto a la
simulacin de la evolucin de la concentracin de oxgeno disuelto respecto a lo obtenido
con el MCNE. En la citada Figura se observa que el valor de] coeficiente de transferencia
de oxgeno (kLav), es ms bajo cuanto mayor es la concentracin de xantano obtenido. La
bajada de oxgeno disuelto tambin es mayor cuanto mayor es la produccin del
polisacrido.
241
Modelo Cintico Metablico
4
u
Figura 5 .1 5 .-
(3 -
a
cf
Simulacin MCMET con diferentes concentraciones iniciales de
biomasa, influencia en la evolucin de biomasa.
60
Figura 5.1 6.- Simulacin MCMI con diferentes concentraciones iniciales de biomasa,
influencia en la evolucin de la concentracin de xantano y de sacarosa.
0.30
025
020
0,1 5
j
0.10
0.05
0,00
t <h)
30
t (Fi)
242
Modelo Cintico Metablico
> 1
(-3
o
25
20
15-y
6
(4,
1
lo
5
o
Figura 5.1 7.- Simulacin MCMT con diferentes concentraciones iniciales de biomasa,
influencia en la evolucin del oxgeno disuelto y en la transferencia de oxgeno
kLaV.
243
2,5
2,0
0,5
0 20 40 60
t (h)
Modelo Cintico Metablico
5.3.2.2.- Influencia de la Concentracin Inicial de Azcar
Se han realizado simulaciones de cuatro operaciones con concentraciones iniciales
diferentes de sacarosa, tal como se ka mostrado en la Tabla 5.1 0.
En cuanto a la influencia en el crecimiento, la Figura 5.1 8 muestra claramente que el
modelo predice que la concentracin inicial de sacarosa no influye en la velocidad del
crecimiento, independientemente de la concentracin inicial de la que se parta, ni la
concentracin de biomasa ni el consumo de la fUente nitrogenada, se ven afectados.
En la Figura 5.1 9 puede verse como influyen las diferentes concentraciones iniciales
de azcar sobre la velocidad de produccin de xantano durante el proceso. El modelo es
incapaz de predecir la influencia del azcar en la evolucin del producto, ya que la cantidad
de xantano obtenida es siempre igual, independientemente de la concentracin de azcar de
la que se parta.
La simulacin para poner de manifiesto la influencia de la concentracin inicial de
azcar en la evolucin de oxgeno disuelto y el valor de kLav aparece en la Figura 5.20. En
ella se observa que el MCMT no es capaz de predecir cambios en la evolucin de dichos
1 -I~ 1
componemes al cambiar esta variable, lo cual es lgico, debido a que a concenLraclon ue
xantano, directamente relacionada con la viscosidad, no se ve influida por lo que el valor de
kLaV tampoco se ver afectado, ni por tanto la concentracin de oxgeno disuelto.
244
Modelo Cintico Metablico
cf
2,0
1,5
1 ,0
0,5
0,0
0,3
0,2
cf
0,I
0,0
loo
Figura 5.1 8.- Simulacin MCNE con diferentes concentraciones iniciales de
sacarosa, influencia en la evolucin de la biomasa
(-y-
(-y.>
t (Ii)
Figura 5.1 9.-
Simulacin MCMI con diferentes concentraciones iniciales de
sacarosa, influencia en la evolucin de sacarosa y xantano.
t (h)
0 10 20 30 40 50 60 70
245
A-/adela Cintico Metablica
2,5
2.0
-5
-t
O
(-3
,0
0,5
0,0
Figura 5.20.- Simulacin MCMT con diferentes concentraciones iniciales de sacarosa,
influencia en la evolucin de la concentracin de oxgeno disuelto y el
valor de kav.
25
20
I5
I
0-i
5
o
0
t (h>
246
Modelo Cintico Metablico
5 .3 .2.3 .- Inf luencia de la Agitacin ydel porcentaje de Oxgeno Disuelto
En la Figura 5.21 se ofrece la influencia de la agitacin. Se han realizado
simulaciones con una agitacin constante en todo el proceso y con un perfil de agitacion.
Puede apreciarse que al realizar la simulacin con un perfil de agitacin, se observa una
mayor velocidad de produccin de xantano. En cuanto a la evolucin de la concentracin
de sacarosa, evidentemente, cuanto mayor es la velocidad de produccin de xantano, se
predice un mayor consumo de la frente carbonada. La evolucin de generacin de la
biomasa no se ve afectada por el tipo de agitacin.
En la Figura 5.22 aparecen las simulaciones realizadas con diferentes
concentraciones de oxgeno disuelto, con 1 0 y 20%del valor de saturacin. Cuanto mayor
es la concentracin de oxgeno disuelto, el modelo predice una mayor concentracin de
xantano, y por tanto un mayor consumo de sacarosa. Al igual que en el caso anterior, la
evolucin dc la concentracin de biomasa no se ve afectada por la concentracin de oxgeno
disuelto.
2,0
1 ,5
Z 1 0
u
4
s
u
0,5
0,0
45
40
35
30
25~
u
5
lo
5
o
70
t (h)
Figura 5.21 .- Simulacin MCMST con valores de kLav, influencia en la evolucin de la
biomasa, xantano y evolucin de azcar.
247
Modelo Cintico Metablico
2- 45
40
1 ,5-
30
25~
~ tO (-5-
202
(3 <
0,5 1 0
5
0,0 0
Figura 5.22- Simulacin MCMST con diferentes concentraciones de oxgeno
disuelto, influencia en la evolucin de biomasa, xantano y sacarosa
t (h)
248
Modelo Cintico Metablico
5.3.3.- Validez del Modelo Metablico
A lo largo de este apartado se han ido exponiendo los diferentes resultados obtenidos
con el MCMT propuesto, tanto los obtenidos en ajustes a datos experimentales como en las
distintas simulaciones realizadas.
Se han obtenido buenos resultados al aplicar el MCMT a los diferentes experimentos
realizados en este trabajo, describiendo adecuadamente las evoluciones experimentales de
xantano, sacarosa y oxgeno disuelto. Entre estos resultados no se han presentado los resultados
correspondientes a la evolucin de biomasa y concentracin de amonio pues son los mismos
que en el caso del modelo anterior MCNE.
Se ha conseguido plantear el modelo cintico metablico en funcin a una de las dos
variables estudiadas, concretamente, de la temperatura (T), de acuerdo a la tendencia que
presentaban los parmetros obtenidos al realizar los ajustes de los experimentos realizados a
diferentes temperaturas con el MCMTS. Se ha realizado la reproduccin de los datos
experimentales con el MCMTS (1 ), consiguindose un mejor resultado, en cuanto a la
descripcin de la evolucin de los componentes, que los obtenidos por ajuste con el MCNE
No fue posible obtener una relacin de los parmetros cinticos calculados para
experimentos realizados con distintas concentraciones de amonio, debido a que los parmetros
obtenidos no presentaban una tendencia lgica respecto de la concentracin inicial de dicho
sustrato nitrogenado.
Las simulaciones, pues, fueron realizadas tomando los parmetros en funcin de la
temperatura. Al comparar los resultados obtenidos de las diferentes simulaciones con los
resultados experimentales, se ha podido llegar a las siguientes conclusiones, en cuanto a lo que
el Modelo Cintico Metablico es capaz de predecir:
El modelo cintico metablico es incapaz de predecir por medio de simulaciones la
influencia de la concentracin inicial de azcar en la evolucin de la biomasa. Tampoco
predice ninguna influencia de este componente en la evolucin de la concentracin de
xantano. Experimentalmente esto no es cierto, pues la concentracin del sustrato
carbonado tiene influencia en la concentracin del polisacrido (Santos 1 993).
249
Modelo Cintico Metablico
El modelo predice un mximo en la produccin de xantano cuando se realizan
simulaciones con diferentes concentraciones iniciales de biomasa (Figura 5.1 6), si bien
esto ltimo no fue observado experimentalmente (Santos, 1 993).
El MCMT es capaz de predecir la influencia del oxgeno en la velocidad de produccin
de xantano pero no en la evolucin de la concentracin de biomasa. Los resultados
obtenidos en los ajustes a datos experimentales sobre la evolucin de este componente
han permitido observar la validez del MCMT para la reproduccin de la concentracin
del oxgeno, mejorando significativamente los resultados de la evolucin de oxigeno
obtenidos por el MCNE.
Por todo esto, el Modelo Cintico Metablico permite una buena reproduccin de
datos experimentales de la concentracin de xantano, sacarosa y oxigeno disuelto. Este
ltimo componente no pudo ser reproducido de forma adecuada por el MCNE.
Por otro lado, en lo que respecta a la evolucin de biomasa o parte de crecimiento
del modelo, debera realizarse una mejora para poder explicar la influencia del oxigeno en el
crecimiento, pues desde un punto de vista fisiolgico no tiene sentido que una bacteria
aerobia estricta, como Xanthomonas campestris, no se vea influida por la concentracin de
oxigeno disuelto en el medio. Se plantea ahora la necesidad de estructurar la biomasa para
tratar, adems, de predecir la influencia de la otra variable estudiada, -la concentracin de
amonio-, que influir, como es lgico en la parte correspondiente al crecimiento del
microorganismo.
Con el MCMT se ha estructurado el metabolismo de la fuente carbonada en la
produccin, es ahora necesario estructurar la biomasa teniendo en cuenta la frente
nitrogenada. En el prximo apartado se aplicar un modelo cintico ms complejo, esto es
un Modelo Cintico de Clula, el cual describir el crecimiento de Kant/tomonos
campestris teniendo en cuenta el sustrato nitrogenado en la sntesis de componentes
intracelulares, tales como protenas y cidos nucleicos, por lo que la biomasa aparecera
estructurada en varios componentes, lo cual complica el modelo de forma significativa.
250
r
6.- MODELO CINE liCO
DE CLULA
Modelo Cintico de Clula
6.- MODELO CINETICO DE CLULA
La principal caracterstica de Los modelos cinticos de clula es que describen la
biomasa considerndola formada por varias especies, teniendo en cuenta los componentes
intracelulares, como cidos nucleicos, protenas, lpidos e hidratos de carbono, proponiendo
para su descripcin un esquema de reaccin simplificado.
Todos los modelos de este tipo existentes en la literatura explican slo el crecimiento
de microorganismos, y estn desarrollados para aquellos muy conocidos como la bacteria
Escherichia coli o la levadura Saccharomyces cerevisiae. Los modelos de clula se
caracterizan por tener un elevado nmero de parmetros (entre 74 y 200), los cuales son
obtenidos siempre de datos de la bibliografia. En ningn trabajo se presentan valores de los
parmetros calculados mediante ajuste de datos experimentales. Esto es debido
fundamentalmente a dos razones: una con relacin al elevado nmero de parmetros que
presentan los modelos cinticos de clula, lo que implica una gran dificultad a la hora de
abordar matemticamente el problema; la otra, tiene relacin con el anlisis de los
componentes clave del sistema. El seguimiento de componentes intracelulares presenta una
especial dificultad para obtener datos fiables que puedan ser utilizados en el modelo cintico.
251
Modelo Cintico de C. lula
En este captulo se propone un modelo de clula para el crecimiento de la bacteria
Xanthomonas campestris, esto es, un modelo que tiene en cuenta la evolucin de componentes
intracelulares que forman parte de la biomasa del microorganismo. Se trata pues de un modelo
de crecimiento que consta de un nmero de parmetros aproximadamente de 1 0, algo inferior
a los planteados hasta ahora en la literatura (Esener y col., 1 983) y que van a ser determinados
por ajuste de datos experimentales.
En el modelo cintico de clula que se va a plantear, se estructura tanto e] metabolismo
del sustrato carbonado como el nitrogenado en el crecimiento del microorganismo. Se incluir
el metabolismo del sustrato nitrogenado en el interior de la clula, de una forma similar a Pons
y col. (1 989), que plantearon el correspondiente al sustrato carbonado en la produccin de
xantano. En la Figura 6.1 se muestra un esquema del metabolismo simplificado de la glucosa y
el amonio, particularizando para esta bacteria, Xanthomonas campestris (Bradbury, 1 984).
A la hora de plantear el modelo de clula para el crecimiento de Xanthomonas
campestris, hay una serie de dificultades a considerar previamente.
- Como ya se ha comentado, para obtener datos experimentales que se puedan
emplear en el modelo, es necesario disponer de tcnicas de anlisis fiables para cl
anlisis de componentes intracelulares. Este es uno de los puntos crticos, sobre todo
cuando el microorganismo a analizar tiene un tamao pequeo como una bacteria
(Garca-Ochoa y col., 1 998). No resulta sencillo encontrar la tcnica de anlisis
adecuada que permita obtener una buena resolucin y fiabilidad de los datos de la
evolucin de componentes intracelulares. Como ya se describi en el Captulo 2 de la
presente Memoria, existen diferentes tcnicas para cuantificar los componentes
intracelulares, no obstante, no todas dan resultados reproducibles, lo que hace necesario
realizar un especial esfuerzo en la puesta a punto de tcnicas con tal fin. Como ya se
indic, la tcnica de Citometria de Flujo fue elegida para el anlisis de la evolucin de
los componentes intracelulares durante el crecimiento de Xanthomonas canpestris en
los experimentos llevados a cabo en este trabajo.
252
Modelo Cintico de Clula
- Por otro lado, otro aspecto fUndamental es el conocimiento detallado del
metabolismo del microorganismo cuyo modelo de clula va a ser planteado. En el
caso concreto del microorganismo empleado en este trabajo, existe suficiente
informacin en la literatura sobre las rutas catablicas y anablicas empleadas por
Kanthomonas campestris con diferentes sustratos carbonados y nitrogenados, lo cual
facilita, desde este punto de vista, el planteamiento del modelo y permite as la
simplificacin del citado metabolismo mediante el denominado lu nping, que consiste
en la agrupacin de molculas con frmulas moleculares medias que intervendrn, a su
vez, en reacciones globales, llegndose a formular un esquema simplificado de
reaccin.
ATP
GLUCOSA Ribosa-6P . Fosforihosilpirofosfato
Glucosa-6P
Ac 6 Fosfoglucnico
ir
Piruvato
,4cet1 coA
Oxaacetato
14TP
Isocilrato
IMP
4,
ATP
NAD~
k AMINOCIDOS

4,
GTP
(iMP
4
,4TP
NAD~
ir
OXIDACIN-REDUCCIN
dATP dGTP dCTP dUMP
dTTP
CO2 ATP
Figura 6.1 .- Metabolismo simplificado de la glucosa y el amonio en el crecimiento de
Xanthomonas campestris.
IMP
GMP
253
Modelo Cintico de (u/a
6.1 .- ETAPAS EN ELPLANTEAMIENTO DEL MODELO
Ya se ha comentado la prctica inexistencia de precedentes en la literatura de este tipo
de modelos, especialmente de un modelo de estas caractersticas para el sistema objeto de
estudio. Por ello, se hace necesario desarrollar una metodologa para abordar un problema tan
complejo como es el plantear, aplicar y obtener parmetros por ajuste de datos experimentales
del modelo cintico de clula para el crecimiento de un microorganismo, en este caso de la
bacteria Xanthomonas campestris. Es un problema relativamente parecido al anlisis de redes
complejas de reacciones. El anlisis cintico de dichos sistemas complejos es un problema
complicado que precisa ms infonnacin que en el caso de reacciones simples. La mayor
complejidad viene dada por una estequiometra y una termodinmica ms complejas y un
nmero mayor de posibles modelos cinticos -combinacin de esquemas de reaccin y
ecuaciones cinticas de cada reaccin- entre los que hay que discriminar.
Se han intentado varios caminos para realizar este anlisis cintico. Fundamentalmente
dos (Garca-Ochoa y Romero, 1 993):
Estudiar una a una las reacciones del esquema, para reducir la complejidad del problema a
una suma de reacciones simples, si bien no siempre es posible aplicar este procedimiento.
Proponer un esquema, a menudo muy simplificado molecular-, suponer unas ecuaciones
cinticas, calcular los parmetros y comparar con los datos experimentales obtenidos,
cambiando cualquiera de las suposiciones hasta que la coincidencia sea aceptable.
Si la reaccin es muy compleja (craqueo, oxidacin de hidrocarburos, por ejemplo), la
primera de las alternativas no es posible. La segunda de las opciones lleva a plantear esquemas
moleculares, muy simplificados, empleando lumping de las especies qumicas, y con
ecuaciones cinticas para las posibles reacciones, a ser posible, muy sencillas. Las ecuaciones
cinticas suelen ser modelos potenciales y en pocos casos hiperblicos.
Tras el clculo de los parmetros se puede proceder a la discriminacin entre las
distintos modelos cinticos. Los criterios de discriminacin utilizados normalmente han sido
estadsticos y fisicos o impuestos (Garca-Ochoa y col., 1 989a y 1 990a).
254
Modelo Cintico de Clula
En consecuencia las etapas a seguir en la formulacin del modelo cintico de clula son
las siguientes:
La primera etapa en la formulacin del Modelo Cintico de Clula es la determinacin o
eleccin de las especies quimicas que participan.
Una vez conocidas las especies quimicas, se debe plantear un esquema simplificado de
reaccin. Para llegar a l, se debe realizar un anlisis exhaustivo de los datos experimentales.
Adems, se aplicar lumping de las especies qumicas que forman este sistema, llegando,
posteriormente, a la formulacin de las ecuaciones de filiacin (o relaciones estequiomtricas
defmidas) de los diferentes compuestos que intervienen en las reacciones.
A continuacin, se debe plantear un sistema de ecuaciones diferenciales, que son las
velocidades de produccin de los compuestos clave, las nicas independientes entre s. Los
mtodos aplicados para el clculo de los parmetros del sistema citado se basan en una
regresin de las ecuaciones a los datos experimentales.
Una vez calculados los parmetros, es necesario comprobar la reproducibilidad del modelo.
Para ello debe formularse el modelo cintico, mediante combinacin de las ecuaciones
cinticas para determinar las velocidades de reaccin. Si ste no es aceptable, es necesano
recurrir a otro modelo, siendo primordial el establecimiento de criterios para realizar la
discriminacin en esta etapa (Garca-Ochoa y Romero, 1 993).
Determinacin de las Especies Qumicas
El estudio estequiomtrico del sistema objeto de estudio puede ser de notable ayuda en
los primeros pasos de la formulacin de la red de reaccin. La infonnacin que se debe obtener
es:
- El nmero de componentes clave.
- El nmero de relaciones independientes entre las especies qumicas que participan.
- Cmo pueden calcularse los cambios en la composicin del sistema conociendo los cambios
en la concentracin de los componentes clave.
255
Modelo Cintico de Clula
Esta informacin es muy importante para la determinacin del mtodo analtico capaz
de seguir los cambios en la composicin. Adems, puede ser de gran utilidad para la propuesta
del esquema de reaccin debido a que el nmero mnimo de reacciones que deben incluirse en
el esquema debe coincidir con el nmero de variables independientes y con el nmero de
componentes clave. En este caso, en principio, se ha optado por asumir la biomasa por tres
especies intracelulares: protenas RNA y DNA. Esta hiptesis se contrastar ms adelante.
Esquema de Reaccin Simplificado
La propuesta del esquema de reaccin es un aspecto que no est totalmente
sistematizado, cada autor trata de solventar su problema particularizando para su caso. El
problema puede ser muy diferente dependiendo de la complejidad del sistema objeto de
estudio, el cual cambiade acuerdo a diferentes aspectos:
- El primer paso en el planteamiento de cualquier modelo es la propuesta de un esquema
de reaccin simplificado. Para ello, ante la falta de antecedentes, parece necesario
realizar un riguroso anlisis de los datos experimentales, qumicos o bioqumicos del
sistema.
- El nmero de reacciones y de especies implicadas varian segn los casos, desde cuatro
a cinco especies hasta cientos de ellas, aunque como se ver ms adelante es muy
conveniente que coincidan el nmero de componentes clave y el de reacciones del
esquema.
- En la mayora de los casos, es casi imposible formular un esquema molecular
simplificado debido a que el clculo de cientos de parmetros por regresin de datos
experimentales es prcticamente imposible. En los casos ms complejos, hay tambin
posibilidad de formular cientos de posibles modelos cinticos, entre los que es necesano
discriminar. La mayora de los trabajos sobre casos prcticos de redes de reacciones
tratan con esquemas simplificados, con no ms de seis reacciones y, generalmente, el
mismo nmero de componentes clave y de relaciones independientes.
256
Modelo Cintico de Clula
En resumen, el esquema de reaccin debe ser relativamente simple, pero capaz de
describir la realidad del sistema, consiguiendo una descripcin con un error del mismo orden
de magnitud que el que se da en los datos experimentales.
En muchos de los casos, el nico camino para simplificar el problema es empleando
lumping, que permite reducir el nmero de componentes a considerar. El lumping asume que es
posible agrupar componentes que participan en reacciones similares dentro del sistema. La
aplicacin rigurosa del luniping solo se ha estudiado en sistemas lineales muy sencillos, en los
casos prcticos se ha aplicado de acuerdo al sentido comn: por tamao de las molculas, por
reactividad, etc. (Garca Ochoa y col., 1 989a).
Propuesta de las Ecuaciones Cinticas
Al analizar una red compleja de reacciones, como debe ser el esquema simplificado
propuesto en el apartado anterior, las ecuaciones que ligan las magnitudes medibles
(velocidades de produccin o concentraciones) con las magnitudes que hay que determinar, en
funcin de las condiciones de operacin (velocidades de reaccin), son (Garca-Ochoa y
Romero, 1 993):
NR
i1
De cuya integracin, segn el mtodo propuesto por Himeelblau y col. (1 967), se
obtiene la ecuacin:
NR
CjC
10 =Zvi~ j< r, .dtJj =]...NC) [6.2]
o
Los mtodos diferenciales estn basados en la aplicacin de la ecuacin [6.1 ]a los NC
componentes clave del sistema. As, para el caso de cinticas potenciales, la expresin dada por
la ecuacin [6.1 ]toma la forma:
dC NR
R~= ~=Zv,1.k,.fi(Cx);(C1=1...NC) [6.3]
257
Modelo Cintico de Clula
El sistema de ecuaciones diferenciales que se obtiene se puede expresar en forma
matricial como:
vr [6.4]
La aplicacin de este mtodo lleva consigo las siguientes etapas:
Clculo de las velocidades de produccin Rj, para los NC componentes clave. Este clculo
se realiza por ajuste de los datos experimentales a una funcin del tiempo conocida y
posteriormente se deriva analticamente, obtenindose los valores discretos de las
velocidades citadas si, como es habitual, se trata de datos integrales, composicin ,s
tiempo.
Clculo de los parmetros cinticos del sistema; para ello, se pueden realizar diferentes tipos
de regresin lineal o no lineal y, adems se puede realizar empleando simple o mltiple
respuesta.
El mtodo integral est basado en la aplicacin de la ecuacin [6.2] a los NC
componentes clave del sistema. En el caso de una cintica potencial. dicha ecuacin toma la
forma:
VR
CjC~
0 =Zvi1 k, ff(Ck).dt;(j=I...NC) [6.5]
El sistema de ecuaciones integrales que se obtiene, se puede expresar matricialmente de
la forma:
u~ r5 [6.6]
donde r5 representa el producto de las integrales por las constantes de la ecuacin [6.5].
Las etapas necesanas para la aplicacin del mtodo integral son:
Clculo de las integrales de las velocidades de reaccin r5, para las NR reacciones que
tienen lugar. Este clculo se puede realizar mediante el ajuste de los datos a una funcin
conocida y posterior integracin analtica, obtenindose los valores discretos necesarios de
dichas integrales.
Clculo de los parmetros cinticos del modelo. Para ello, pueden ser aplicados tanto la
regresin lineal como la no lineal, como en el caso anterior.
258
Modelo Cintico de Clula
Garca-Ochoa y col. (1 98% y 1 990b) pusieron de manifiesto la clara ventaja que
presentan los mtodos integrales frente a los diferenciales, cuando se dispone, como en este
caso, de datos de variacin de la composicin con cl tiempo, debido, ftmclamentatmente, a la
mayor precisin de los mtodos numricos de integracin frente a los de derivacin. As
mismo, propusieron el empleo de un conjunto de ecuaciones en trminos de velocidades de
reaccin, en lugar de, lo habitualmente empleado, en trminos de velocidades de produccin
de los componentes clave (Garcia-Ochoa y Romero, 1 993), de acuerdo a:
r y . R [6.7]
Aunque la ecuacin anterior solo es aplicable cuando y es cuadrada, es decir, el
nmero de componentes clave es igual al nmero de relaciones independientes, el mtodo
basado en las velocidades de reaccin presenta ventajas, tanto desde un punto de vista de
clculo -una matemtica mucho ms sencilla, donde se individualiza el clculo de cada
parmetro-, como desde el punto de vista conceptual, de tratamiento, ya que, cuando el nmero
de reacciones del esquema y el de componentes clave sea el mismo, al individualizar el clculo
de cada parmetro (k), se puede tratar un sistema complejo de reacciones como la suma de
reacciones simples. Para aplicar este mtodo en su variedad integral, hay que realizar la
transformacin de la ecuacin [6.6]en la ecuacin [6.8]:
r
5 =v -C [6.8]
La aplicacin de esta ecuacin a los NC componentes clave del modelo cintico
conduce a grupos de ecuaciones independientes que permiten calcular los parmetros cinticos
del sistema por aplicacin de una regresin lineal simple sin trmino independiente, de forma
individual (en el caso de modelos potenciales). La ecuacin [6.8] desarrollada, se puede
escribir como:
kfj1(CK ).dt=Zv (CjC~0 >;(i= INI? ) [6]
259
Modelo Cintico de Clula
Formulacin del Modelo Cintico
Una vez conocidas las cinticas aplicando mtodos como el de las velocidades de
reaccin, es necesario calcular los parmetros realizando un ajuste en mltiple respuesta, es
decir no obteniendo los parmetros de las reacciones individuales, sino de forma conjunta
mediante clculo por regresin de los datos experimentales.
Una vez calculados los parmetros es necesario comprobar la reproducibilidad que el
modelo cintico molecular proporciona de los resultados experimentales; si el ajuste no es
aceptable, se debe recurrir a otro modelo.
Los modelos propuestos pueden obtenerse por combinaciones entre distintas cinticas
dentro del mismo esquema de reaccin propuesto al formular el modelo. Muchas veces ocurre
que varios modelos son capaces de describir el sistema, de forma que, en este punto, es
primordial el establecimiento de criterios de discriminacin.
Criterios de Discriminacin de Modelos
Como se ha indicado anteriormente, a veces se plantea la necesidad de discriminar
entre un elevado nmero de modelos cinticos, si bien muchos autores solo presentan los
resultados obtenidos con un solo modelo, sin llegar a describir por qu lo han considerado el
mejor frente a otros modelos, en principio, igualmente vlidos.
Los criterios para la discriminacin de modelos se agrupan bsicamente en dos tipos
(Garca-Ochoa y col., 1 989 y 1 990): criterios estadsticos y criterios tisicos.
- Los criterios estadsticos estn basados en la comparacin de los valores de la F de
Fischer y de la t de Student obtenidos del ajuste por regresin de los datos
experimentales, siendo mejor aquel modelo que presente estos valores significativamente
ms altos. As mismo, obtener intervalos de confianza muy estrechos indica un mejor
ajuste del modelo a los datos experimentales, y por tanto un criterio de discriminacin
entre varios modelos. Tambin pueden compararse los valores de la suma de residuos al
cuadrado, considerando iguales aquellos que estn por debajo del error experimental.
260
Modelo Cintico de Clula
- Criterios Fsicos (o impuestos), el primero es el obtener valores positivos de los
parmetros (k y 1 0> 0) en todos los ajustes realizados con el modelo propuesto. El
segundo criterio es la observacinde una variacin lgica de los parmetros obtenidos en
los modelos propuestos con las variables que se estudian, por ejemplo temperatura o
variacin en la composicin del medio, en el caso que se est analizando.
6.2.- MODELO CINTICO DE CRECIMIENTO DE Xanthomonos campestris
En este apanado se va a realizar la aplicacin de todo lo comentado en el apartado
anterior, es decir, se va a proceder a realizar el planteamiento de un modelo cintico de clula
para el crecimiento de la bacteria Xanthomonas campestris. Para ello, se pondr en prctica,
paso a paso, la metodologa comentada en el apanado anterior, en este caso para un sistema
biolgico complejo como es el crecimiento de la bacteria.
6.2.1 .- Determinacin de las Especies Quimicas y Formulacin del Esquema de Reaccin
El primer paso en el planteamiento de cualquier modelo es la propuesta de un esquema
de reaccin simplificado. Para ello, ante la Ita de antecedentes, parece necesario realizar un
riguroso anlisis de los datos experimentales, del crecimiento del microorganismo, obtenidos
en este trabajo.
Se ha realizado un seguimiento de los componentes intracelulares de las clulas de
Xanthomonas campestris a lo largo de todo el crecimiento del microorganismo. La tcrnca
empleada ha sido la citomnetra de flujo. Con esta tcnica se han obtenido resultados de
concentracin de cidos nucleicos (DNA y RNA), as como de protena intracelular (tanto
protenas estructurales, como enzimas) por clula. Como ya fue comentado en el Captulo 2 de
la presente Memoria, los datos de intensidad media de fluorescencia de cada componente por
individuo, pueden ser convertidos en cantidad (g) de componente por individuo, gracias al
calibrado obtenido, como indica la Figura 6.2. Los datos de contenido en g/clula, pueden ser
puestos en unidades de g/L (gramo de componente por litro de caldo), gracias a la aplicacin
de la ecuaciones [2.1 1 1 para protenas y [2.1 4] para cidos nueleicos (DNAy RNA).
261
1VIodelo Cintico de Clula
Adems del seguimiento de los componentes intracelulares, se ha analizado otro
compuesto clave, en este caso extracelular, importante en el crecimiento del microorganismo,
esto es, la evolucin de la concentracin de amonio en el caldo. El metabolismo de este
sustrato nitrogenado es importante por ser el sustrato limitante del crecimiento en el proceso, y
porque, una vez consumido, estar formando parte de cidos nucleicos (DNA y RNA) y de
protenas, principalmente. Por todo ello, un balance de materia para el sustrato nitrogenado es,
sin duda, de ayuda para hacer la primera aproximacin al esquema de reaccin del modelo
cintico de clula.
Como ya se ha indicado, el nitrgeno (en forma de amonio) que ser consumido por el
microorganismo, ir a frmar los componentes intracelulares, pero adems parte de ste
nitrgeno puede ser empleado para sintetizar otras protenas que no quedarn en el interior
262
g componentel caldo
Figura 6.2.- Unidades de los datos obtenidos a partir del Citmetro de Flujo y su conversin
en otras para aplicar en el modelo cintico
Modelo Cintico de Clula
celular sino que sern excretadas al caldo, Estas protenas (protenas extracelulares) no han
sido analizadas, pero su evolucin puede ser obtenida realizando el balance de nitrgeno antes
comentado.
Para realizar dicho balance de nitrgeno, hay que calcular previamente la concentracin
de nitrgeno que hay en la molcula de amonio (que es como se mcorpora en el medio de
cultivo); se emple la siguiente ecuacin:
14
Para el clculo de la concentracin de nitrgeno que hay en las molculas medias de
[os componentes intracelulares (deducidas por aplicacin del lumping) se emplean las
siguientes ecuaciones:
La relacin entre La concentracin de nitrgeno y la concentracin de RNA se
calcula por (C~
5H1 1 ,750~375N3,75P3)
3 75~ 14
Cvg~~(g/L) =C~4(g/L)~
491,16 [6.1 1 ]
La relacin entre la concentracin de nitrgeno y la concentracin de DNA
(C95H1 201 335N3q5P3), es:
486,41
Para protenas, se consider la frmula media: C5,34H9640237N1 36S0099, con lo
que la concentracin de nitrgeno a partir de la concentracin de protena, se ajusta a la
siguiente relacin:
~ / L) = CJg XL) ,3 6 14 [6.1 3]
13 3 ,848
En las Tablas 6.1 a 6.7 se muestran las concentraciones de nitrgeno empleadas por
el microorganismo en la sntesis de los componentes intracelulares en los distintos
experimentos realizados en este trabajo. En las citadas tablas se muestran las evoluciones de
nitrgeno (por molcula de amonio) CNA, as como las cantidades de nitrgeno en DNA
(CNDNA), R NA (CN,R NA) y protenas intracelulares (CN,PRJ). Adems, se ha realizado la
suma de estos tres componentes (CNT), con el fin de compararlo con la concentracin inicial
263
Modelo Cintico de Clula
aadida y la que todava no ha sido consumida (en caso de que todava quede). De esta
manera, se puede calcular la cantidad de nitrgeno que emplea la bacteria, en cada caso,
para la sntesis de protena extracelular, cuyo anlisis no fue realizado, pero que puede
deducirse de acuerdo a la ecuacin [6.1 4], asumiendo que la cantidad de amonio consumido,
no inmovilizado como componente, va a parar a protenas extracelulares:
C~
2~ =CN0 C~1,- C [6.1 4]
En la Tabla 6.1 se muestran los resultados del experimento realizado con 65 p.p.m.
de amonio inicial (experimento n
05). Si comparamos la cantidad de nitrgeno total con la
aadida inicialmente en el medio de cultivo (0,0506 g/L de nitrgeno), se observa que la
cantidad de nitrgeno encontrada como suma de DNA, RNA y protenas intracelulares es
mayor que la cantidad inicial de nitrgeno, llegndose a obtener 0,083 gIL de nitrgeno
rnmovilizado en componentes intracelulares. Este balance podra indicar que el
microorganismo puede sintetizar estos componentes empleando otra fuente de nitrgeno,
por ejemplo aminocidos procedentes de! medio YM, que es el medio empleado para
realizar el inculo en el biorreactor. O bien, podra ser que el microorganismo estuviera
empleando este amonio en fabricar componentes con una composicin diferente a la que
tiene cuando la concentracin de amonio es mayor, o lo que es lo mismo, con una
estequlometra diferente. Adems, se observa en la tabla que no hay sntesis de protena
extracetular, salvo la que aparece entre las 3 a 1 6 horas de la fermentacin, pero en la fase
estacionaria de crecimiento no parece que exista excrecin de este tipo de protenas.
Para el experimento realizado con 1 30 p.p.m. (experimento n0 6), que aparece en la
Tabla 62, el balance del nitrgeno indica que el nitrgeno inicial aadido 0,1 01 1 g/L se
encuentra en los componentes intracelulares hasta una cantidad mxima 0,084 gIL
(observada en la fase estacionaria de crecimiento), teniendo en cuenta que se ha consumido
completamente el nitrgeno a lo largo de la fermentacin, el nitrgeno que falta estar
formando parte de la protena extracelular, como refleja la ltima colunma de la citada tabla.
En la Tabla 6.3 se muestra el balance de nitrgeno realizado para el experimento con
la concentracin de 257 p.p.m. de amonio inicial y una temperatura de 280C (experimento
n0 2). En l, la cantidad inicial de nitrgeno aadida en forma de amonio es de 0,24 gIL,
mientras que la obtenida corno biomasa (suma de componentes intracelulares) es de 0,1 83
264
Modelo Cintico de Clula
g/L, considerando que tambin ha habido un consumo total de nitrgeno, la ltima columna
indica la cantidad de nitrgeno que formar parte de protena extracelular.
Para el experimento realizado con 475 p.p.m. y 280 C (experimento n
0 7), que
aparece en la Tabla 6.4, la cantidad de nitrgeno inicial es muy elevada (0,369 g/L), no
obstante slo aparece en forma de componente intracelular la cantidad de 0,1 1 47 gIL. El
microorganismo, en este caso, no consume todo este nitrgeno, quedando una cantidad
residual al final de la fermentacin de 0,062 gIL. Al realizar el balance de la misma forma
que en experimentos anteriores, se obtiene cierta cantidad de nitrgeno en forma de
protena extracelular. como indica la ltima columna de la tabla. El hecho de que en este
experimento no haya consumo total de amonio indica que en este caso el sustrato
nitrogenado no est siendo el nutriente limitante del crecimiento, como ocurre en los
demas.
En la Tabla 6.5 aparecen los resultados obtenidos para el experimento realizado a
250C y 257 p.p.m. (experimento ni), al igual que en otros, el balance de nitrgeno indica
que parte es empleado para la sntesis de componentes intracelulares, (0,1 6 g/L) y otra para
la sntesis de protena extracelular, pues todo el nitrgeno aadido inicialmente (0,1 51 g/L)
se consume completamente durante la fermentacin.
En la Tabla 6.6, se presenta el balance de nitrgeno para el experimento n0 3, es
decir, el realizado a M0C y 257 p.p.m., con una concentracin inicial de nitrgeno de 0,1 7
g/L, la cual es consumida prcticamente, encontrndose casi todo el nitrgeno inmovilizado
en los componentes de la biomasa 0,1 2 gIL (nitrgeno total) en la fase estacionaria de
crecimiento, yen un porcentaje menor como protena extracelular (0,0 1 4 gIL).
Por ltimo, en la Tabla 6.7 aparece el balance para el experimento realizado a 340C y
con una concentracin de amonio inicial de 257 p.p.m (experimento n0 4). En este caso, no
llega a consumirse todo el nitrgeno aadido inicialmente (0,1 57 gIL) pues queda una
cantidad residual de 0,077 gIL. En este experimento, todo el nitrgeno consumido se
encuentra inmovilizado como componentes intracelulares, y un porcentaje de nitrgeno se
emplear para la sntesis de protenas extracelulares en la fase estacionaria de crecimiento,
como indica la ltima columna de la Tabla 6.7.
265
Modelo Cintico de Clula
Clculo del nitrgeno aprovechado
fermentacin en el experimento n
0 5,
280C.
por Xandzoinonas canipestris durante la
llevado a cabo con 65 p.p.m. de amonio y
Tiempo CN,x CRNA
(h) ( /L) ( IL)
CDNA
( /L)
CPR
(g/L)
S CDNA,R NN,PIU
IL (IL)
0 0.0505 0.000 1 6 0.00023 0.00062 0.00 1 0 0
1 .5 0.0497 0.0001 7
3 0.0482 0.0001 8
4.5 0.0466 0.00021
0.00025 0.00068 0.001 1 0
0.00026 0.00071 0.001 1 0.0011
0.0003 0.0008 0.001 3 0.0025
6 0.045 1 0.00027 0.00038 0.001 0 0.001 6 0.0037
8.5 0.0435 0.00063 0.00089 0.0023 0.0039 0.0030
1 2 0.0326 0.001 0.001 4 0.0037 0.0061 0.01 1 7
1 6 0.0256 0.0024 0.0033 0.0090 0.01 48 0.01 00
20 0.01 94 0.0055 0.0078 0.021 0 0.0344 0
23.5 0.01 32 0.01 23 0.01 72 0.0463 0.0759 0
24.5 0.0093 0.01 27 0.01 78 0.0478 0.0783 0
25.25 0.0062 0.01 30 0.01 83 0.0492 0.0806 0
26 0.001 5 0.01 32 0.01 86 0.0499 0.081 8 0
27.5 0.00078 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0
31 0.00078 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0
32
32.5
0.00078 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0
0.00078 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0
33 0.00078 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0
35 0.00078 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0
40 0.00078 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0
Tabla 6.1 .-
266
Modelo Cintico de C/ula
Tabla 6.2.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris
fermentacin en el experimento n
0 6, llevados a cabo con 1 30
amonio y 280C.
Tiempo CN.A
(h) ( /L)
0 0.1011
Cp.~
(g/L)
C~
4
(g/L)
CPR I
(g/L)
ZCDNA.R NA,PR I
<g/l)
CPR E
(g/L)
0.00021 0.0003 0.0008 0.001 31 0
2.5 0.1 008 0.00025 0.00035 0.00094 0.001 54 0
3 .5 0.0972 0.00031 0.00043 0.001 1 6 0.001 9 0.001 88
5.5 0.0855 0.00035 0.00049 0.001 3 0.0021 4 0.01 331
7 0.0746 0.00040 0.00057 0.001 52 0.00249 0.02384
8 0.0661 0.00048 0.00067 0.001 81 0.00297 0.031 92
9.25 0.0591 0.00092 0.001 3 0.00348 0.0057 0.0361 9
1 0.5
1 6
0.0528 0.001 1 2 0.001 57 0.00421 0.0069 0.041 21
0.0248 0.001 9 0.00267 0.0071 7
0.01 588
0.01 1 75
0.02602
0.06437
0.05554 20 0.01 94 0.0042 0.00592
24.25 0.0085 0.0051 0.00729 0.01 955 0.03203 0.06041
25 0.0073 0.0063 0.0089 0.0239 0.0391 5 0.05446
26.5 0.0058 0.0080 0.01 1 33 0.03041 0.04982 0.04535
28.5 0.0048 0.0092 0.01 299 0.03487 0.0571 3 0.03905
30.5 0.0031 0.01 21 0.01 7 0.04562 0.07474 0.023 1 4
31 .5 0.001 9 0.01 28 0.01 808 0.04852 0.07949 0.01 957
32 0.00078 0.01 32 0.01 862 0.04997 0.081 86 0.01 836
33.5 0.00075 0.01 38 0.01 943 0.0521 4 0.08542 0.01 483
38 0.00066 0.01 38 0.01 943 0.0521 4 0.08542 0.01 492
47 0.00008 0.01 40 0.01 97 0.05287 0.08661 0.01 431
47.5 0.00008 0.01 40 0.01 97 0.05287 0.08661 0.01 431
49 0.00008 0.01 40 0.01 97 0.05287 0.08661 0.01 431
50 0.00008 0.01 40 0.01 97 0.05287 0.08661 0.01 431
51
53.5
0.00008 0.01 40 0.01 97 0.05287 0.08661 0.01 431
0.00008 0.01 40 0.01 97 0.05287 0.08661 0.01 431
267
durante la
p.p.m. de
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.3 .- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n
0 2, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio.y 28~ C
CRN4
(g/L)
XCDNA,R NA,PR Tiempo
(h)
[ CN
Wg2 ~L=.
0 .2 4 0 3 0 .0 0 1 3
CDNA
( /L)
CpR I
(IL) J=~g~==
0.0048 1 0.0081
(gIL)
0 0.001 8 0
2 0.2333 0.001 6 0.0022 0.0058 0.0097 0
4 0.231 7 0.001 9 0.0026 0.0068 0.01 1 4 0
7 0.2232 0.0025 0.0035 0.0090 0.01 50 0.0037
9 0.21 77 0.0030 0.0042 0.01 08 0.01 80 0.0061
1 2 0.21 38 0.0040 0.0056 0.01 45 0.0242 0.0039
1 3 0.2092 0.0044 0.0061 0.01 59 0.0265 0.0062
1 4.5 0.2068 0.0055 0.0077 0.0200 0.0333 0.001 7
1 6 0.1 975 0.0057 0.0081 0.0208 0.0347 0.0096
1 6.5 0.1 921 0.0067 0.0094 0.0243 0.0405 0.0093
1 9.5 0.1 71 1 0.0092 0.01 29 0.0334 0.0556 0.01 52
23.5 0.1 477 0.01 1 9 0.01 67 0.0431 0.071 8 0.0223
24 0.1 291 0.01 27 0.01 78 0.0461 0.0768 0.0360
24.5 0.1 088 0.01 52 0.021 3 0.0550 0.091 5 0.041 5
28
32
0.0777 0,01 75 0.0245 0.0633 0.1 054 0.0587
0.0637 0.0234 0.0329 0.0849 0.1 41 3 0.0368
33.5 0.0567 0.0240 0.0337 0.0871 0.1 450 0.0401
34 0.0427 0.0259 0.0364 0.0940 0.1 564 0.0428
38
38.5
0.0350 0.0269 0.0377 0.0974 0.1 622 0.0448
0.01 94 0.0279 0.0391 0.1 009 0.1 679 0.0545
0.0581
0.061 8
39.5 0.01 01 0.0288 0.0404 0.1 044 0.1 737
41.5 0.00078 0.0297 0.041 7 0.1 077 0.1 793
42 0.00063 0.03001 0.0420 0.1 086 0.1 807 0.0606
43.7 0.00040 0.0304 0.0426 0 1 1 00 0.1 830 0.0585
48 0.00008 0.0304 0.0426 01100 0.1 830 0.0588
48.5 0.00008 0.0304 0.0426 0.1 1 00 0.1 830 0.0588
52 0.00008 0.0304 0.0426 0.1 1 00 0.1 830 0
268
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.4.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xantho nonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n
0 7, llevados a cabo con 475 p.p.m. de
amonio y 280C.
Tiempo
(h)
CN,
(gIL)
CR NA
(g/L)
CUNA
(gil)
CPR I
(g/L)
ECDN ,LNA,pR ,
(gil)
CPR E
(gil)
0 0.3694 0.0001 0.0001 6 0.00041 0.00068 0
2 0.3686 0.0001 0.00026 0.00067 0.001 1 0
4 0.3678 0.00022 0.00032 0.00084 0.001 4 0
7 0.3655 0.00043 0.00059 0.001 5 0.0025 0.0009
9 0.361 6 0.00050 0.0007 0.001 8 0.0030 0.0043
1 2 0.3562 0.00067 0.00094 0.0024 0.0040 0.0087
1 3 0.3538 0.00089 0.001 2 0.0032 0.0053 0.0097
1 4.5 0.3422 0.001 1 0.001 6 0.0041 0.0069 0.01 98
1 6 0.31 1 1 0.001 6 0.0022 0.0059 0.0098 0.0480
1 6.5 0.2761 0.001 7 0.0024 0.0062 0.01 04 0.0824
1 9.5 0.1 944 0.0024 0.0034 0.0089 0.01 49 0.1 596
23.5 0.1 400 0.0061 0.0086 0.0222 0.0370 0.1 91 9
24 0.1 1 66 0.0090 0.01 26 0.0327 0.0544 0.1 978
24.5 0.0933 0.01 1 7 0.01 64 0.0423 0.0704 0.2052
28 0.0855 0.01 57 0.0221 0.0571 0.0950 0.1 884
32 0.0661 0.01 77 0.0248 0.0640 0.1 065 0.1 963
33.5 0.0622 0,01 90 0.0267 0.0689 0.1 1 47 0.1 920
34 0.0622 0.01 90 0.0267 0.0689 0.1 1 47 0.1 920
38 0 . 0 622 0.01 90 0.0267 0.0689 0.1 1 47 0.1 920
3 8 . 5 0.0622 0.01 90 0.0267 0.0689 0.1 1 47 0.1 920
39.5 0 . 0 622 0.01 90 0.0267 0.0689 0.1 1 47 0.1 920
269
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n
0 1 , llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio y 250 C.
Tiempo
(b)
CN,.%
(g/L)
CRNA
(g/L)
CDN..x
(g/L)
CPR I
(g/L)
ECDNA,R NA,PR I
JI..
CPR E
(gIL)
0 0 0.001 7 0.0021 0.0051 0.0087 0,001 2
5.7 0.301 2 0.0061 0.0031 0.0085 0.01 76 0.0024
7.7 0.2951 0.0069 0.01 01 0.021 1 0.0369 0.0034
9 0.2922 0.01 1 1 0.01 61 0.0321 0.0582 0.0043
1 0 0.281 2 0.01 23 0.01 71 0.0351 0.0642 0.0053
1 2
1 6
0.2761 0.01 82 0.0261 0.0473 0.091 1 0.0079
0.2741 0.0591 0.0872 0.1 522 0.2961 0.01 68
1 7 0.1 81 3 0.0641 0.1 093 0.1 831 0.3562 0.0203
20 [ 0.1 241 0.1 082 0.1 325 0.281 1 0.51 83 0.0346
24 0.0901 0.1 323 0.1 922 0.3503 0.6744
0.2522 0.3802 1 0.7855
0.0679
25 0.0851 0.1 522 0.0802
28 0.0752 0.1 71 1 0.271 2 0.441 1 0.8821 0.1 271
29 0.041 4 0.1 802 0.281 1 0.4702 0.9332 0.1 438
32 0.0333 0.2301 0.351 1 0.6502 1 .232 1 0,1 764
34 0.01 1 2 0.2606 0.3824 0.7025 1 .3422 0.1 784
35 0.0091 0.2707 0.4225 0.7201 1 .3933 0.1 785
38 0.0006 0.2805 0.41 22 0.781 1 1 .4733 0.1 785
50 0.0006 0.3002 0.4300 0.781 1 1 .51 21 0.1 785
270
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.6.-
Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas catnpestris durante la
fermentacin en el expenmento n
0 2, realizado con 257 p.p.m. de amonio y 3 1 0 C.
CPR E
(gIL)
Tiempo
(b)
CNA
(gIL)
CR NA
(gIL)
CUNA
(gIL)
CPR I
(gIL)
ECDN ,~ ,PR I
J~j~[
0.01 5 6 0 0
0.5
1 .1 5
0.1 71 1 0.0025 0.0035 0.0095
0.1 697 0.0028 0.00405 0.01 08 0.01 78 0
0.1 677 0.003 0 0.00426 0.01 1 4 0.01 87 0
3 0.1 655 0.003 2 0.00456 0.01 22 0.0200 0
3.5 0.1 =95 0.003 3 0.00467 0.01 25 0.0205 0
6 0.1 51 2 0.0038 0.00537 0.01 44 0.0236 0
8 0.1 445 0.0044 0.00621 0.01 66 0.0272 0.0074
8.5 0.1 329 0.0048 0.00677 0.01 81 0.0297 0.0082
9 0.1 299 0.0058 0.0082 0.0220 0.0360 0.0054
1 0 0.1 221 0.0074 0.01 03 0.0278 0.0456 0.0031
1 2
1 4.5
0.1 061 0.0080 0.01 1 3 0.0304 0.0498 0.01 50
0.0846 0.01 05 0.01 48 0.0398 0.0652 0.021 1
15 0.0803 0.01 1 3 0.01 59 0.0427 0.071 1 0.0207
1 6 0.071 8 0.01 1 5 0.01 61 0.0434 0.071 1 0.0279
1 8.5 0.0524 0.01 30 0.01 83 0.0492 0.0806 0.0379
20 0.0423 0.01 34 0.01 88 0.0506 0.0830 0.0456
23.5 0.0243 0.01 71 0.0240 0.0644 0.1 055 0.041 0
24
24.5
25
0.0224 0.01 73 0.0242 0.0651 0.1 067 0.041 8
0.0206 0.01 82 0.0256 0.0688 0.1 1 27 0.0376
0.01 89 0.01 89 0.0265 0.071 3 0.1 1 68 0.0352
26.5 0.01 45 0.01 90 0.0267 0.071 6 0.1 1 74 0.0389
27 0.01 33 0.01 97 0.0276 0.0743 0.1 21 7 0.0359
28 0.01 1 1 0.01 97 0.0276 0.0743 0.1 21 7 0.0381
30 0.0077 0.0206 0.0289 0.0777 0.1 273 0.0359
31 .7 0.0056 0.0203 0.0285 0.0766 0.1 255 0.0398
0.0030 0.0203 0.0285 0.0766 0. 1 255 0.0424
271
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.7.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campes/Rs durante la
fermentacin en el experimento n
0 4, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio y 340 C.
Cpf tg
(g/L)
Tiempo
(h)
CN,
(gIL)
CR NA] C
DNAj
(g/L)~ ~tL....J
0.0001 9 0.00022 0.0002
S CDNA~NA,rR I
IL
CPR E1
(g/L)
0 0.1 521 DeDil 0
0,001 1 3 0.1 547 0.00029 0.0004 0.001 0 0.001 7
6 0.1 462 0.00048 0.00067 0.001 7 0.0029 0.001 3
9 0.1 361 0.00022 0.001 0 0.0028 0.0046 0.001 2
1 2 0.1 1 51 0.001 1 0.001 4 0.0036 0.0060 0.001 5
1 4 0.1 1 43 0.001 3 0.001 8 0.0047 0.0078 0.001 7
1 4.5
1 8
0.1 1 04
0.1 088
0.001 4
0.0023
0.001 9
0.0032
0.0050 0.0083
0.0083 0.01 39
0.0022
0.0081
20 0.1 052 0.0048 0.0067 0.01 74 0.0289 0.0025
24
24.5
0.1 01 1
0.0972
0.0067
0.0086
0.0094 0.0243 0.0405 0.01 01
0.01 1 0 0.01 21 0.031 3 0.0521
30 0.0933 0.01 34 0.01 88 0.0487 0.081 1 0.01 21
33 0.0855 0.01 50 0.021 0 0.0543 0.0903 0.01 52
36 0.0855 0.01 73 0,0243 0.0627 0.1 043 0.0223
36.5 0.0777 0.01 88 0.0264 0.0682 0.1 1 35 0.025]
40 0.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1 622 0.0252
0.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1 622 0,0252
0.0277 0.0269 0.0377 0.0975 0.1 622 0.0252
0.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1 622 0.0252
272
Mode/o Cintico de Clula
Todos estos resultados sugieren que el nitrgeno consumido por el microorganismo va
a formar parte fundamentalmente de la biomasa (DNA, RNA y protena intracelular), y slo
un pequeo porcentaje va a constituir las protenas extracelulares. Una excepcin la presenta
el experimento realizado a 65 p.p.m., donde no ha sido posible cenar el balance de nitrgeno,
probablemente debido a que la estequiometria asumida no es vlida con concentraciones tan
bajas de nitrgeno, aspecto que ser comentado ms adelante. Una vez realizado el balance
de nitrgeno anterior, se observ la evolucin de los componentes intracelulares implicados
directamente en el crecimiento del microorganismo, pues el conocimiento de su evolucin
con el tiempo va a titeilitar los primeros pasos en el planteamiento del modelo. En las
Figuras 6.3 a 6.9 se muestran las evoluciones de los componentes intracelulares (DNA, RNA
y protenas), as como la suma de estos tres componentes estructurales de la clula, con el fm
de comparar con la biomasa experimental. As mismo aparece en dichas figuras el consumo
de amonio, adems aparece la evolucin de la protena extracelular calculada de la forma
indicada anteriormente.
Se puede observar que las evoluciones de todos los componentes (en g/l..) en todos los
experimentos es similar. El contenido en protenas es siempre mayor que el contenido en
cidos nucleicos y, dentro de stos, la cantidad de DNA es siempre mayor que la de RNA. Por
otm lado, se observa la estrecha relacin entre la sntesis de estos componentes y e] consumo
de nitrgeno, es decir, cuando el sustrato nitrogenado se agota, el microorganismo no puede
seguir sintetizando nuevas molculas, por lo que la sntesis de aminocidos se detiene y, en
consecuencia, la sntesis de cidos nucleicos, lo que provoca que el microorganismo entre en la
fase estacionaria del crecimiento. Una excepcin a esta afirmacin es la correspondiente al
experimento realizado con una concentracin de amonio inicial de 0,475 gIL; en este caso,
cuando el microorganismo entra en la fase estacionaria del crecimiento, todava queda una
concentracin elevada del sustrato nitrogenado en el medio, por lo que la entrada en esta Ibse
se debe, probablemente, a otro nutriente que se ha agotado y no al nitrgeno. Adems, en todas
las grficas se ha representado la suma de los componentes intracelulares (DNA, RNA y
protenas), que se ha llamado biomasa terica (Cxr~), se aprecia que esta suma en todos los
casos es semejante al valor de la biomasa obtenida experimentalmente, existiendo una
diferencia -no muy significativa- en la fase estacionaria del crecimiento, debido a que no se han
considerado otros componentes, como lpidos o hidratos de carbono, que, aunque en mucha
menor cantidad, se encuentran en la biomasa, y pueden ser los responsables de esa pequea
diferencia entre la biomasa experimental y la terica (DNA, RNA y protenas intracelulares).
273
Modelo Cintico de Clula
0,8
0,6~
0,4-
(3
0,2
1 ~
0 1 0
Figura 6.3.- Evolucin de componentes intracelulares, fluente de nitrgeno y biomasa del
experimento n
0 5. Condiciones experimentales: CN665 p.p.m., Th 28 0C, N
variable (21 0 r.p.m. inicial>.
2.0
1 .5
I,0
u
0,5
0.0
0 10 20
r
30 40 50 60
t(h)
Figura 6.4.- Evolucin de componentes intracelulares, fuente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 6. Condiciones experimentales: CNO=1 30 p.p.ni., T 28 0C, N~=
variable (21 0 r.p.m. inicial)
ex
V
A
~ % rot,,+ CRNA+ CDN
-s - - a -u. ----3 .
#
2,
y. ~gt - 0Q~ O - - -
4,
It,
7 .~o ~~ v ~~v- y.
>,1
e
:
- -
20 30
(h)
40
50
e! ~ o,
5
.F
0 0004 4 0
274
Modelo Cintico de Clula
2.0
1 ,5
I,0-
o
0,5
0,0 ~
o Jo 20 30
40 50 60
t(h)
Figura 6.5.- Evolucin de componentes intracelulares, fuente de nitrgeno y biomasa del
experimento n
0 2. Condiciones experimentales: CNO=25? p.p.m., fl 28 0C, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial)
2,0
1 ,5

[0
0,5,
0,0

o 20 30 40
t(h)
Figura 6.6.
Evolucin de componentes intracelulares, fuente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 7. Condiciones experimentales: CNO=475 p.p.m., T= 28 0C, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial).
CN
AC
R NA
~ ~
o
u
mi
o o
o
O
1 P~ 000 0
o
di
o
g o
o
ji
tp
4~NA
o s
1
.cx
E,.,,
o CXT~<,~
u
Oc ,
o
u
O
.SS.. 9s.. ollo 0~ ~

275
.0
o
A CR NA
9
u. u
O o

U
T M
u...
UD ~00
o
u
o0
r
1 0 20
3 0
o-
O
40
Y
50
t (Ii)
Figura 6.7.-
2,
1,5
-4
E
o
u
1,0
0,5
0,04
O
Evolucin de componentes intracelulares, fluente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 1 . Condiciones experimentales: CNO=257 p.p.m., T= 25 0C, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial).

I0 20 30 40
t (h)
Figura 6.8.-
Evolucin de componentes intracelulares, fluente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 2. Condiciones experimentales: CN@257 p.p.nt, T 31 0C, N
variable (21 0 r.p.m. inicial).
Modelo Cintico de Clula
2,0
1 ,5
5
e
u
1 ,0
0,5
0,0
~1~
o
60
1
CN
A C~A
9
O
a (
o u.....
n-o o
u
u 0~ O- O
~
q5 0 ~~AAA A
~ WV V 7 9
a a a- ---- -
276
Modelo Cintico de Clula
2.0
1 .5
E
u
I,0
0,5
0,0
o lo 20
30 40
t (h)
Figura 6.9.- Evolucin de componentes intracelulares, frente de nitrgeno y biomasa del
experimento n
0 4. Condiciones experimentales: CNO=257p.p.m., T= 34 < C, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial).

CN
A
V C~
o
CYS i,ten
ocxT~
u ~ a.
O ~ O O O
Esa
ca
S O 0 0 0 00
~ 0 ~ O
~x x~X X XX
e. .~~~- a
277
Modelo Cintico de Clula
Considerando todos estos resultados, se puede llegar a plantear un esquema de reaccin
sencillo para explicar el crecimiento de la bacteriaXanthomonas campestris, tal como indica la
Figura 6.1 0. Una parte del amonio va a ser empleado para la formacin de aminocidos no
formadores de bases nitrogenadas (no formadores de cidos nucleicos), en defmitiva, de
aminocidos que formarn exclusivamente protenas. Estas protenas pueden ser intracelulares
o extracelulares. Otra parte del amonio se emplea para la formacin de aminocidos
formadores de bases nitrogenadas (las que formarn parte de cidos nucleicos). Estas bases,
a su vez, formarn por un lado RNA, por otro RNArn el cual se transcribe a DNA. Es decir, el
RNA intracelular que se mide ser, mayoritariamente, RNA que no evoluciona hacia DNA.
Este esquema explica la forma de las curvas de protenas y RNA, que no corresponden a
productos formados en reacciones en serie.
PROTEINA
INTRACELULAR
]
FI~7flEZZZZ4~NA
Figura 6.1 0.- Esquema de reaccin simplificado para el Modelo Cintico de Clula de
Xanthomonas campesfis.
Aminocidos no
formadores de bases
PROTEINA
EXTRACELULAR
[
1
278
Modelo Cintico de Clula
Una vez planteado el esquema de reaccin simplificado y considerado el conocimiento
que se tiene del metabolismo del microorganismo, se deben plantear las relaciones
estequiomtricas entre los diferentes compuestos.
- En la sntesis de las bases que forman RNA slo ceden tomos de carbono los que se han
denominado aminocidos formadores de bases, cuya sntesis se muestra en la ecuacin
(6.1 5]; mientras que el resto de aminocidos que intervienen en la reaccin slo ceden
grupos amino (NI-lfl, por lo que no se han considerado como frmula molecular en la
citada reaccin de sntesis de bases de RNA.
- En la sntesis de bases del DNA, a partir de las bases del RNAm, se tiene en cuenta que
se produce el mismo consumo de nitrgeno que si se estuviese sintetizando RNA. Si bien,
se conoce que, en la formacin de DNA a partir de RNAm, se produce una transformacin
en la base nitrogenada, es decir, el uracilo que forma parte de los nucletidos del RNA, se
transforma en timina en el DNA, para lo que es necesario un aporte de carbono e
hidrgeno, que se supone que viene de la frente de carbono original empleada (sacarosa).
Adems, es necesaria la presencia de un intermedio reducido (IntRed) que realice la
reduccin para pasar la ribosa a desoxiribosa (ribonucictidos a desoxirribonucletidos).
Por tanto, el metabolismo del sustrato nitrogenado supone una estructuracin de este
componente en la biomasa, ya que es el citado compuesto nitrogenado el que produce
aminocidos y stos dan lugar a protenas y bases nitrogenadas, precursoras, de los cidos
nuccicos. Si se aplica lumping en el sistema, englobando aminocidos, bases del RNA y bases
del DNA en compuestos con frmulas moleculares medias del total de molculas que los
forman, las reaccIones globales, que tienen lugar en la ruta metablica del nitrgeno, se pueden
plantear las siguientes relaciones estequiomtrieas (ecuaciones de filiacin):
279
,Vfodelo Cintico de Clula
- Sntesis de aminocidos no formadores de bases (r
1 ):
0,93 3 C6U1~O6 + 1,4NH O,2l6NAD~0,ICoASH-t-ATP 7ZZ~
C56J-J~01O~3 N~ 4S01~ O21 6(NADJ-I,fl+)+0.lCoA+3 .29h% O+(ADP+Pi)
- Sntesis de aminocidos formadores de bases (r,):
O,5C6H1,06 + + 2,2SNAD> z~ C3 [-15503 !V + 2,25(NADH, H~)
- Sntesis de RNA (r3):
1.Or6HJ,06 qH5pNZ74NF~ 3 .5ATP3 .5 WAP + 0.2EGT 3 QHf~3 N5P3 ~
CqSLJI7PR7SNThP3 5.3 4k03 .5(ADP+PP+3 .5 IV>4D[-fl- Sp-
O.2% GDP-i- Pi) +3 QHJ,q0N5P,
- Sntesis de RNAm (r4):
L0W ~H,O6 C3 H5503 N+2,74N1-4 +3 ,5A TP3 .5IN,4L1 + 0,2SGTI 3 C101-112013 N5P3zt
Q5J-I~ 75O~ ~75iV3 75P3 5,3 4H20+3 ,5(ADP+Pi) 3,5yN>4DHi- 5 ) +
O,2YGDPPO3 C10H1=010N5P2
Sntesis de DNA (r5):
0,04C6U1,06 + 0,I2SNADP+ C9 5H11 750J3 75N3 75P3 + mt Red.
C95H12013 75N3 75P3 6,125(NADPH, H~ ) + !ntOx.
[6.1 5]
[6.1 6]
[6. 1 7]
[6.1 8]
[6.1 9]
280
Modelo Cintico de Clula
6.2.2.- Pronuesta de Ecuaciones Cinticas
Ante la falta de antecedentes en la literatura, y el desconocimiento del tipo de ecuaciones
cinticas para las reacciones anteriores, se ha optado por aplicar el mtodo antes citado de las
velocidades de reaccin, junto con el mtodo integral. Dicho mtodo es aplicable al sistema
objeto de estudio debido a que el nmero de componentes clave puede hacerse igual al nmero
de reacciones del esquema simplificado, suponiendo estado pseudoestacionario de alguno de los
componentes de este sistema concreto.
La aplicacin de la ecuacin [6.8] a los NC componentes clave del modelo cintico
conduce a grupos de ecuaciones independientes que permiten calcular los parmetros cinticos
del sistema por aplicacin de una regresin lineal simple sin trmino independiente, de forma
individual.
El primer paso a realizar es el planteamiento del sistema de ecuaciones diferenciales, para
ello se han realizado dos suposiciones sobre el esquema simplificado de reaccin anteriormente
propuesto:
Simplificacin 1 (MCC-1), donde se asume estado pseudoestacionario para RNAm:
dCRNAm _ =0 [6.20]
dt R~A
puesto que
RRNAm =r
4r5 [6.21 ]
se obtiene: [6.22]
Del mismo modo, se asume estado psedoestacionario para los aminocidos no
formadores de bases:
dC00 1? =0 [6.23 ]
dt aa~/f fi
281
Modelo Cintico de Clula
puesto que
R =r,r
3 r4
se obtiene:
r,=
La velocidad de consumo de amonio viene dada por:
dc
NR4>
It
r, 2,75r3
2,75 r4
Sustituyendo las ecuaciones [6.22] y [6.25] en [6.26], se obtiene:
dCVR 1 ,4
It
r1 3,75r3 3,75~
La velocidad de formacin del RNA por:
dC
RNA =
It
Mientras que la velocidad de formacin del DNA viene dada por:
dCD =
It
La velocidad de formacin de protenas intracelulares es:
It dt
[6.24]
[6.25 ]
[6.26]
[6.27]
[6.28]
[6.29]
dCPRE
=1 3 ~ [6.3 0]
282
Modelo Cintico de Clula
S implif icacin 2 (MCC-2
Se asume estado pseudoestacionario slo para RNAm (ecuaciones [6.201 a [6.22], en este
caso no se supone esta simplificacin para los aminocidos no formadores de bases, por lo que
la velocidad de consumo de amonio vendr dada de forma diferente al modelo MCC- 1 , mientras
que el resto de velocidades (para RNA, DNA y Protenas intracelulares) son las mismas que en el
caso anterior.
Para el amonio:
dC
4+ = 1 ,4r~ ~ 2,75 r3 2,75 r4= 1 ,4r, ~~2 2,75r3 2,75r5
It
[6.3 1 ]
Una vez propuestas las velocidades de produccin para cada componente clave es preciso
plantear estas ecuaciones en trminos de velocidades de reaccin, para ello se aplica la ecuacin
[6.8] para obtener de forma individual cada una de estas velocidades.
Simplificacin 1 (MCC-1):
- rsi viene dada por:
= frl. It# CppuCPRJ)+(CPE) [6.32]
- y53 se obtiene al despejar de la ecuacin [6.28], obtenindose la expresion:
= frs . It ~RNA CRNO [6.33]
- rss se obtiene al despejar de la ecuacin [6.29], obtenindose la ecuacin:
=fI It .DNA CDO [6.3 4]
283
Modelo (lutico dc Clula
Simplificacin 2 (MCC-2):
Tanto rs corno r
53 y rs5 vienen dadas de la misma forma que en MCC- 1 , es decir por las
ecuaciones [6.32), [6.33] y [6.34], respectivamente.
La diferencia entre las dos simplificaciones la marca la ecuacin cintica r2. la cual viene
dada por la siguiente expresin obtenida al despejar de la ecuacin [6.31 ]:
S2 = fri di (2, YS(CPVA CItVO)+
2,75.(CDNACDN# O )+ l,4( C~
1 ~ C~I?I0)) [6.35]
La aplicacin de este mtodo a los datos experimentales obtenidos en este trabajo fUe
realizada en simple respuesta empleando el mtodo de integral, con una subrutina tipo
Simpson. Las funciones (f(Cj)) que se han probado para cada una de las velocidades de reaccin
han sido:
Para las ecuaciones r1 , r3, y r5, (ecuaciones [6.32], [6.33] y [6.34], respectivamente),
vlidas tanto para MCC-l como para MCC-2, se han probado tres cinticas diferentes:
- Potencial 1:
- Potencial 2:
5 k, ~ C di = ~ (CJ -CN ti = NR) [6.37]
- Hiperblica:
5 k1 .Cj . CN d=XV,1 (CjC1~ );p= 1 NR) [6.38]
CNK,
Para ri, calculada slo para la simplificacin 2 (MCC-2), como ya se ha indicado, se han
realizado ajustes con dos cinticas potenciales del tipo que indica la ecuacin [6.36] y la (6.37].
Debido a que todos los experimentos presentan resultados similares, se han elegido dos
experimentos como representativos para observar los resultados de la aplicacin de esta
metodologa, y para evitar alargar excesivamente el desarrollo de la exposicin de este capitulo.
284
Modelo Cinticode Clula
Concretamente el experimento n
0 2, realizado a 280C y con 257 p.p.m. de amonio, y el
experimento n0 4, realizado a 340C y con 257 p.p.m. de amonio.
Los resultados obtenidos para la velocidad de reaccin r
1 , aplicando este mtodo y
probando las cinticas que se han indicado, se muestran en las Tablas 6.8 a 6.1 4, donde se
observan los valores obtenidos para los parmetros de cada una de las funciones probadas.
Todos los parmetros cumplen las restricciones estadsticas impuestas, se observa que el
valor de SRC (suma de residuos al cuadrado) es menor para las cinticas hiperblica y
potencial 2. Esto se corrobora observando que las formas de las curvas, tanto en forma integral
(Figuras 6.1 1 y 6.1 2), como derivadas (Figura 6.1 3 y 6.1 4) se asemejan mucho ms a la fUncin
que para el caso de la cintica potencial 1 , cuya suma de residuos al cuadrado es mucho mayor.
Las Figuras 6.1 1 y 6.1 2 muestran los resultados, por tanto, para el valor de la integral de
r1 para el experimento n
0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y el experimento n0 4 (340C y 257
p.p.m.), respectivamente. Las ecuaciones hiperblica y potencial 2 son las que permiten
obtener mejor resultado respecto al acercamiento de las curvas a la de la funcin.
En cuanto al valor de r
1 ya derivado (Figuras 6.1 3 y 6.1 4), se observa que la forma de la
curva que corresponde a la ecuacin potencial 1 presenta una forma descendente, indicando
que no es posible considerar esta cintica en el modelo propuesto, mientras que las cinticas
hiperblica y potencial 2 reproducen bien la forma que presenta la funcin, siendo, en
principio, posible considerar cualquiera de las dos cinticas para el modelo cintico.
Tabla 6.8.- Parmetros cinticos de r1 calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 1 .
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T=250 C, CN=257 p.p.m de amonio, N= variable (21 0 r.p.m.
inicial) modelo de clula.
Cntica
Valores de los paranietros t Student F Fischer
SRC
Mix pt Ma Obt. Teor. Obt. flor.
k c
1 k,=0,1 32 k=O.1 29 k,=O,1 26 4,3.l0~ 2,086 925 4,35 0,92
c~ o u k,=1 ,097 ko,977 k,=0.857 6,3.I0~ 2,086 2432 4,35 0,23
k
1 c k1 =0,035
K1 =0,003
k,=O.028
K1 ~0,002
k1 =0,021
K,=0,00i
8.1 i0
3 2,093 3331 4,38 0,12
285
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.9.- Parmetros cinticos de r
1 calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 2.
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T=280 C, CN257 p.p.m de amonio, N= variable (21 0 r.p.m.
inicial).
Tabla 6.10.-
Cintica
V alores de los parametros t S tudent rFiseber
SRC Mx pt Nlu 0W.
k0.1 52 k=0.1 50 I< ~=0.1 48 i,iio~ 2.074 1 1 20 4,54 0,85
k
1 c~ k,=0.44 k1=0.43 k1=0.45 8.3.1 0 2.074 1 332 4.54 0.092
kft0.051 k1 ~0,050 k1 ~0.049
0< + k K1 =0.O05 K1 =0.005 K,=0,005
3.1 1 02 2.080 2331 4,60 0,01 2
Parmetros cinticos r1 calculados por ajuste de los
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas.
experimentales: T31
0 C, CN~257 p.p.m de amonio, N variable
inicial) modelo de clula.
Cintica
V alores de los parmetros t S tudent F Fiseher
SRC
Xlx pt Mm Obt. Teor. Obt. Teor.1
k,=0.31 5 k
1 =0.1 95 k1 =0,075 4,3.1 0~ 2,080 925 435 1 5 k,=0.704
k o~ k1 =0.590 k1 =0,470 6.3. o
3 2.080 2432 4,35 0.23
k ~ < jV k, 0,450 k
1=0.3 10 k,=O.170
K1 K1 0,600 K1=0.3 90 K1=0,180
s..o
3 2,086 3331 3.52 0,1 2
Tabla 6.11.-
Parmetros cinticos de r
1
4 en simple respuesta
experimentales: T34
0 C,
inicial) modelo de clula.
datos del experimento n0 3
Condiciones
(21 0 r.p.m.
Cintica
V alores de los parmetros t 5 hdent F f lscher
SRC Mx pt Mm Obt. Teor. 0W. Teor.
k kJO,1 43 k,=0.1 31 k,=0.O,1 1 4,3 1 0~ 2,060 925 4.35 3.75
c~ k
1 =0,237 k1 =0,1 50 k1 =0,063 6.3.1 0~ 2,060 2432 4,35 1 .23
< ~
C..~ K
k=0.268
K1 =0,093
k1 =0.1 73
K,~0.063
k1 =0.095
K,=0,033
8,1 .1 0~ 2.064 3331 3.52 0.82
calculados por ajuste de los datos del experimento n
0
a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
Cre257 p.p.m de amonio, N variable (21 0 r.p.m.
286
Modelo Cintico de Clula
Parmetros cinticos de r
1
2. en simple respuesta
experimentales: T=28
0 C,
inicial), al modelo de clula.
calculados por ajuste de los datos del experimento n0
a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
CN65 p.p.m de amonio, N=variable (210 r.p.m.
Tabla 6.1 3.- Parmetros cinticos de r
1
2. en simple respuesta
experimentales: T28
0 C,
Cinetica
V alores de los parmetros t S tudent F Fiseher
5 R C Mx pt Mm 0W. Teor DM Teor.
k
1 C\ k,=0.18 k,= 0,13 1 k1=0.082 4.3 .10~ 21 1 925 4,3 8 2.95
k ~
c~ k1=0.288 k~=O.lSO k1=0.13 8 6.3 .102 2 1 1 2432 4,3 8 0.55
k1 =0.1 78 k1 =0.1 73 k,=0.1 67 8,lA0~
k1 <i~ (~ ~K, K1 =0,066 K1 =0,063 K,=0.060
21 2 3 ,55 0,1 82
calculados por
a diferentes ecuaciones cinticas.
CNl3O p.p.ni de amonio, N= variable
inicial), a] modelo de clula.
Cintica
V alores de los parametros t S tudent F Fiseher
SRC Mx pt Ma CM. Teor. 0W. f lor.
k1 c< k1=0.900 k1=0.900 k1=0,900 2.102 2,069 925 3,68 1,3
k1 cj Ej k1=5,83 0 k1~5.800 k,=5,770 410 2.069 1223 3,68 0.23
(i< +K k1=0,069 k =0.069 k1=0,069 K1=0.010 K,=0,010 K1=0,010 3.102 2.074 1325 3,34 0.12
modelo de clula
Cintica
V alores de los parmetros t S tudent E Fiseher
SRC Mix pt Ma CM. flor. CM. f lor.
=0.1 31 k1 =0,1 31 k1 =O,1 31 4,3.1 0~ 2.080 95 5 4.3 0
4,3 0
0,72
0,1 1 =0.151 k1=0.l50 k~=0,149 6,3.10~ 2,080 2432
k1c~ ~ k~=0.l73 ktO,173 k0J73
8,1.10~
=0,063 K,=0,063 K1=0,063
2,086 3331 3,37 0,082
ajuste de los datos del experimento n
0
Condiciones
(210 r.p.m.
Tabla 6.1 4.- Parmetros de r
1 calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 2. en
simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas.Condiciones experimentales:
T~28O C, C=475 p.p.m de amonio, N= variable (21 0 r.p.m. inicial), al
287
Tabla 6.12.-
Modelo Cintico cte Clula

3 ~ -.
2
u
/IP
o
1
e
<u
,1
4
1 -~-u -
40 50
60
Figura 6.11.-
Figura 6.12.-
Evolucin mostrada por la integral de r
1 con el tiempopara el experimento n
0
2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes
cinticas y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
(h)
Evolucin mostrada por la integral r
1 con el tiempo para el experimento n
0 4,
realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
0,30
0.25-
020-
1 IttEnc,a1 1
2 bn~c,ai 2
SI bpcrliolica
e
-- --u- --
0.1 5
0.1 0-
0,05
u
0.00
o lo 20
30
t(h)
0.8
0 0 20 30 40 50
288
Modelo Cintico de Clula
001 2
001 0
oms
003 6
0032
a,
50 60
Figura 6.13.- Evolucin mostrada por rsi con el tiempo para el experimento n
0 2,
realizado a 280C y 257 p.p.n. de amonio inicial probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
t (h)
Figura 6.1 4.- Evolucin mostrada por r
51 con el tiempo para el experimento n
0 4,
realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
001 4
O lO 20 3 0 40
O, )
O lO 20 3 0 40 5 0
289
Alodelo Cintico de Clula
Los resultados obtenidos para la velocidad dc reaccin r
3 (de formacin de RNA),
aplicando este mtodo y probando las cinticas que se han indicado, se muestran en las Tablas
6.1 5 a ~ 1 donde se observan los valores obtenidos para los parmetros dc cada una de las
fimoiones probadas. En todos los experimentos se superan los valores estadsticos tericos de lii
Student y de la E de Fischer, obtenindose valores significativamente bajos de SRC. La
cintica potencial 1 es la que muestra valores ms altos de la suma de residuos al cuadrado, lo
que indica que describe peor la forma de la funcin para r3, que las otras dos cinticas probadas.
Los resultados de la integral de r53 para cada uno de los experimentos tomados como
representativos (experimento n
0 2 y n0 4), se muestran en las Figuras 6.1 5 y 6.1 6, mientras que
la frmncin r
3. para dichos experimentos, aparecen en las Figuras 6.1 7 y 6.1 8. Donde se puede
observar algo similar a lo que ocurra con [a velocidad de reaccin r4 - esto es, las cinticas que
mejor reproducen la forma de la fimcin son la hiperblica y la potencial 2, mientras que la
curva para la ecuacin potencial 1 , se aleja bastante de la forma de la funcin, pues es una lnea
descendente.
Tabla 6.1 5.- Parmetros cinticos de ~3 calculados por ajuste de los datos del experimento n
0
1 . en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T250 C, CNzz257 p.p.m de amonio, N= variable (21 0 r.p.m.
inicial).
Cintica
V alores de los parmetros t S tudent E Fischer
5 R C
Mx pt Mm 0W. Teor. 0W. Teor.
~< lq=O.O65 k,0.03 48 k<0,004 1 .5 .1 02 2.086 1 1 20 4 ,3 5 0.28
k u, u ,~ k,=0.295 I<~=0.25 9 k
1 =0,223 7.3.1 0~ 2.086 3 3 3 2 4.3 5 0.08
A e ~4i
k 0.03 5
K1 =0.1 1 2
k1 =0.03 44
K1 =0,03 96
k1 =0.03 3
K1 =0.03 3
4.1 .1 0 2.093 43 21 43 8 0.04
290
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.16.- Parmetros cinticos de r
3 calculados por ajuste de los datos del experimento n
0
2. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T280 C, CN257
inicial).
p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
Cintica
V alores de los parametros t S tudent E Fischer
SRC
Mix pt Mm Obt. flor. Obt. flor.
k
1 c~ k=0,1 5 2 k1 =0,045 k1 =0,1 48 1 ,1 .1 02 2,074 1 1 20 4,5 4 1 ,8
0,92 -- Q k,=0,44 k1 =0.1 29 k1 =0,45 8,3 .1 0 2.074 1 3 3 2 4,5 4
4.60 0,01 2 A1 ~ k,=0,05 1
K1 =0.005
k1 =0,01 3
K1 =0,080
k=0,049
K1=0,005
3 ,1 .1 02 2,080 23 3 1
Tabla 6.17.- Parmetros cinticos de r3
3. en simple respuesta
experimentales: T31
0 C,
inicial).
calculados por ajuste de los datos del experimento n0
a diferentes ecuaciones cinticas.
Condiciones
CN=257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
Cintica
V alores dc los parmetros t S tudent E Fischer
S R C
Mix ~>t Ma Oht. f lor. Obt. Teor.
k o
1 k
1 =0,05 2 k1 =0,0408 k1 =0,028 3 ,5 .1 02 2,080 820 4,3 5 0,84
0 c~ k,=0.224 k1 =0,1 24 k,=0,024 5 .3 .1 0~ 2,080 1 3 3 2 4.3 5 0.1 2
Cv4K,
k1 =0,026
K1 ~0.076
k1 =0.023
K1 =0,074
k1 =0,021
K1 =0,073
7.l.I0~ 2.086 5 221 3 ,5 2 0.03
Tabla 6.1 8.- Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento n
0
4. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N variable (21 0 r.p.m.
inicial).
Cintica
V alores de los paranietros t S tudent E Fiseher
5RC
Mix pt Mm Oht. flor. Obt. Teor.
k
1 c~, k1 =0,03 9 k1 =0,03 9 k1 =0,03 9 1 ,2.1 0 2,060 725 4.3 5 2.5
k1 o, - (\, k1 =0,45 5 k1 =0,45 4 k1 =0,45 3 2.3 .1 0 2,060 1 5 3 6 4,3 5 022
-
- (~ # 1
k,=0,049
K1 =0,05 7
k1 =0,049
K1 =0.05 7
k1 =0,049
K[=0,05 7
41 1 0 2,064 23 25 3 ,5 2 0,43
29]
Modelo Cintico de Cl. La
Parmetros cinticos de r
3
5. en simple respuesta
experimentales: T=28
0 C,
inicial).
calculados por ajuste de los datos del experimento no
a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
CN=65 p.p.m de amonio, N= variable < 21 0 r.p.m.
Tabla 6.20.-
V alores de los parasnetros t S tudeut E Fiseher
Cintica Mx pt Mm Obt Teor. Obt Teor. S R C
k ~
lc~=0,03 9 k,=O.03 9 k,=0.03 9 1 ,2.1 0 2,1 1 725 4.3 8 3 .1
ti Q ~< k
1 =0.45 4 k1 =O.45 4 k1 =0,45 4 2.3 .1 0 2,1 1 1 5 3 6 4.3 8 0.22
A, c~ kj0.049 k1 =O.049 k1 =0.049 4,1 .1 0 2,1 2 23 25 3 ,5 5 0.43
F,k1 K~ 0,05 7 K~=0,05 7 K~=0.05 7
Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento n
6. en simple respuesta a dif erentes ecuaciones cinticas. Condicione~
experimentales: T=28
0 C, CN 43 O p.p.m dc amonio, N=variable (21 0 r.p.m
inicial).
V alores de los parmetros t S tudeut EEischer
Cintica Mix pt ] Mm Obt. Teor. Oht. Teor. S R C
k c - k~=O.O7l k~=O.O7O k,=0.070 3 .1 0 2.069 725 3 ,68 0.98
k o o
-- k~=O.l8O k,=l.78 k~=l,76 i.io 2.069 1 5 3 6 3 .68 0,1 2
A
1 - ~-- Lis k=0.02I3 k~=0.021 2 k=0,021 2.1 0 2.074 23 25 3 .3 4 0.03
(~ +K~ K1 =O,0002 K1 =0.0002 K1 =0.0002
Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento u
7. en simple respuesta a dif erentes ecuaciones cinticas. Condicione~
experimentales: T28
0 C, CN~475 p.p.m de amonio, N variable (21 0 r.p.m
inicial).
V alores de los parmetros t S tudeat E Fiseher
Cintica Mix pt Mm 01 4. Teor. Oht. Teor. S R C
=-l
k - k
1 =0.041 7 k1 ~0.041 7 k,=0,041 7 2.1 0 2.080 725 4,3 0 4,2
k o
-Y - Y k,=O.3 95 k~=0,3 92 k1 =0.289 3 .1 0 2,080 1 5 3 6 4,3 0 0.3 3
k,=0.01 9 k1 =0,01 9 k1 =0,01 9 41 0 2086 23 25 3 ,3 7 0.1 1
k[ -
0k. ~ -v
K
1 =O.002 K1 =0.002 K~=0.O02
Tabla 6.21 .-
Tabla 6.19.-
o
292
Modelo Cintico de Clula

Figura 6.15
~
t (h)
Evolucin mostrada por la integral de r
3 con el tiempo
n
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial
cinticas y su comparacin con la funcin correspondiente.
t (h)
60
para el experimento
probando diferentes
O lO 20 30 40 50
O lO 20 30 40 50
Figura 6.16.- Evolucin mostrada por la integral de r
3 con el tiempo para el experimento
n
0 4, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes
cinticas y su comparacin con la funcin correspondiente.
293
Modelo Cintico ce Clula
001 4
001 2
0.01 &
0.038
0.01 > 6
0.0)4
0032
50 60
Figura 6.1 7.- Evolucin mostrada por r
53 con el tiempo para el experimento n
0 2, realizado
a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente.
0.01 1 6
0,004
0,092
O,cr~9
ti (h)
Figura 6.18.- Evolucin mostrada por r
53 con el tiempo para el experimento n
0 4, realizado
a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente.
O lO 20 30 40
t(h)
O lO 20 30 40 50
294
Modelo Cintico le Clula
Los resultados obtenidos para la reaccin r
5 (para la formacin de DNA), aplicando
el mtodo de las velocidades de reaccin para determinar las cinticas que pueden ser
empleadas en el modelo cintico de clula planteado, se muestran en las Tablas 6.22 a 6.28,
donde se presentan los valores obtenidos para los parmetros de cada una de las funciones
probadas. En todos los experimentos se superan los valores estadsticos tericos de t S t u d e n t
y de E de Fischer de los parmetros de cada cintica, siendo algo peor las estadsticas
obtenidas para los parmetros correspondientes a la ecuacin potencial 1 .
Las formas de las curvas para cada una de las cinticas, en comparacin con la
funcin se muestran en las Figuras 6.1 9 y 6.20 (para la integral de rs) y las Figuras 6.21 y
6.22 para r5 (derivada). Tal como ocurra en los dos casos anteriores se observa que las
cinticas que mejor describen la forma de la funcin (f(Cj)) son las correspondientes a la
ecuacin hiperblica y a la potencial 2.
Los resultados que se muestran, como en los casos anteriores, son los
correspondientes a 1 experimento n
0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y al experimento n0 4
(340C y 257 p.p.mj. Al igual que en las dos velocidades de reaccin anteriores los
resultados son similares para todos los experimentos, por lo que se muestran unos resultados
representativos.
Tabla 6.22.- Parmetros cinticos de r
5 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 1 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T250 C, CN257 p.p.m de amonio, N=variable (210 r.p.m.
inicial).
Cntica
V alores de los parmetros t S tudent E Fiseher
SRC
Mix pt Mm Oht. Teor. 01 4. Teor.
k~=0,l5 2 k
1 =0,0922 k1 0,1 48 4.1 .1 02 2,086 85 0 4,3 5 0.1 1
0~ k1 =044 k~=0.3 48 k,=0.45 5 .3 .1 0 2086 223 2 4.3 5 0,075
k, ~,
C1~K1
k1 =0,060
1 <~=0.05 8
k1=0,060
K1=0,058
k1-=0,060
K10,0
5 ,1 .1 0 2,093 5 241 4,3 8 0.03
295
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.23.- Parmetros cinticos de r
5 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 2 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T280 C, Cre257
inicial).
p.p.m de amonio, N=variable (210 r.p.m.
Cintica
V alores de los parametros t 5 tudent E Fischer
SRC
Mix Ma Obt. Teor. Obt. Teor.
ti Ej k,=0.1 5 2 k,=O.01 68 k,=0.1 48 i..1 04 2,074 1 1 20 4.5 4 0,8
0.44 k,=0,1 75 k,=0,45 g.s.io 2,074 1 3 3 2 4.5 4 0.1 9
~+K
1
k=o.oss
K1 =0,005
k,=0.021 4
K1 =0.0075
k,=0,049
K1 =0,005
3 ,1 .1 0 2,080 23 3 1 4.60 0.01
Tabla 6.24.- Parmetros cinticos de r5 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 3 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T31 0 C, CN257
inicial).
p.p.m de amonio, N=variable (210 r.p.m.
Cintica
V alores de los paranietros t S tudent EFischer
S R C Mx pt Ma 0W. Teor. Oht. Teor.
u =0.05 7 k,=0,05 7 k,=0,05 7 2,1 .1 0 2.080 1 75 0 4.3 5 0,23
=0.1 79 k,=0.1 78 k,=0,1 76 3 .3 .1 0 2.080 3 23 2 4,3 5 0,08
kO.03 7 ~
~ K=0,087
k~0.03 7
K,~0,087
k0,03 7
K
1 =0,03 7
6.1 .1 0 2.086 4241 3 .5 2 0.025
Tabla 6.25.- Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 4. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T=340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
Cintica
V alores de los parametros t S tudent yFischer
S R C
Mx
pt
Mm Obt. Teor. Obt. Teor.
k=0.05 7 k,=0.05 4 k,=0,05 1 2,1 .1 0 2.060 3 078 4.3 5 1 .4
c~ lt=O629 k,=0,629 k
1 =0.629 3 .3 .1 0 2,060 3 282 4.3 5 0.1 1
A> <.~
CV> KI
k,=0,078
I<,=0,063
k=0.078
K,=0,063
k,=0.078
K,=0.063
7.1 .1 0 2.064 2241 3 ,5 2 0.1 2
296
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.26.- Parmetros cinticos de r
3 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 5. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T280 C, CN65 p.p.m de amonio, N~ variable (21 0 r.p.m.
inicial).
Tabla 6.27.- Parmetros cinticos de r
5 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 6, en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T280 C, Crl3O p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
Tabla 6.28.- Parmetros cinticos de r
5 calculados por ajuste de los datos del
n
0 7. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas.
experimentales: T280 C, CN=475
inicial).
experimento
Condiciones
Cintica
V alores de los paranief ros t S tudent FFiseher
S R C Mix pt Mm 0W. Teor. Oht. Teor.
k=0.05 4 k
1 =0.05 4 k1 =0.05 4 2.1 .1 0 2080 3 078 4,3 0 3 .4
ti u u~ k=0.629 k=0,629 k~0,629 3 ,3 .I0~ toso 3 282 4,43 0,8
A1
1 +K~
k,=0,078
K,=O,063
k,=0,078
i(,=0,063
k1 =0,078
K,=0,063
7,1 .1 0 2,086 2241 3 2,3 7 0,5
p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
297
Modelo Cintico ce Clula
0,3-
gr
o
0.2
0. 1 -
0.0
O
Figura 6.19.- Evolucin mostrada por la integral de r
5 con el tiempo para el experimento
u
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
Jr~
(h)
Figura 6.20.- Evolucin mostrada por la integral de r
5 con el tiempo para el experimento
n
0 2, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
3
- 1 Rflo~4 1 - -u
2 R,t~,&a1 2
3 H~,al~lica
~ 1 ----
1

1 1
1
4
1
1
< 1.
<~
--a>.
lo 20 30 40
(h)
50
60
035
O lO 20 3 0 40 50
298
Modelo Cintico de Clula
0,01 00
0,0075
te
1-
0,0050
0,0025
0,0030
Figura 6.22.-
Evolucin mostrada por r
55 con el tiempo para el experimento n
0 4, realizado
a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
O lO 20 3 0 40 5 0 60
ti (h)
Figura 6.21.- Evolucin mostrada por r
55 con el tiempo para el experimento n
0 2, realizado
a 280C y 257 p.p.m.de amonio, probando diferentes cinticas y su
comparacincon la funcin correspondiente a protenas.
1 Potenca 1 2
2Potendaj 2
3 H~potIca
u
o lO 20 30 40 5 0
t(h)
299
Modelo Cintico ce Clula
Los resultados obtenidos para la reaccin r
2 (para aminocidos formadores de
bases), - vlido slo para la simplificacin 2, MCC-2-aplicando el mtodo dc las velocidades
de reaccin para determinar las cinticas que pueden ser aplicadas en el modelo planteado, se
muestran en las Tablas 6.29 a 6.3 5, donde se pueden observar los valores obtenidos para los
parmetros de cada una de las funciones probadas, en este caso slo potenciales, as como los
valores estadsticos de dichos parmetros. Como puede apreciarse, la cintica que permite
obtener mejor resultado es la potencial 1 , es decir, la que viene en funcin slo de la
concentracin de nitrgeno, pues como puede apreciarse en las tablas, en la cintica potencial
2, el valor del parmetro obtenido (k2) para muchos de los experimentos incluye cl cero en su
intervalo de confianza y la suma de residuos al cuadrado tiene valores significativamente mas
altos en todos los experimentos, que los obtenidos con la ecuacin cintica potencial 1 .
Las Figuras 6.23 y 6.24 muestran las evoluciones de las curvas para la integral de la
ecuacin r2 para los experimentos que se han tomado a modo de ejemplo (experimentos n
0
2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y n0 4 (340C y 257 p.p.m.). Las Figuras 6.25 y 6.26,
muestran estos mismos resultados para la ecuacin correspondiente a r
2, para los
experimentos u
0 2 y n0 4, respectivamente. En estas ltimas figuras se puede apreciar la
clara diferencia entre las dos cinticas potenciales probadas para esta ecuacin, siendo
significativamente mejor la obtenida con la ecuacin potencial 1 .
Tabla 6.29.- Parmetros cinticos de r
2 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 1 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T250 C, CN=257 p.p.m de amonio, N= variable (21 6 r.p.m.
inicial).
Cintica V alores de los parmetros t S tudent E Eischer S R C
Mix pt Mm 01 4. Teor. Obt. Teor.
1< u
- h=0,094 k>=0,091 k
1 =0.088 1 .1 .1 02 2,086 1 221 2.2 0.5
< Ej u~ k=0.5 80 k=0.25 0 k=-0.080 42,1 2,086 825 3.25 1 ,7
3 00
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.30.- Parmetros cinticos de r
2 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 2 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T~280 C, CN257
inicial).
p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
Cintica
V alores de los parmetros t S tudeot EFiseher
Obt. k Teor. S R C Mix pt Mm Oht. f lor.
t, ~ k,~0,1 5 2 k
1 =0,01 68 k,~0,1 48 3 ,1 .1 02 2.074 1 1 20 2.080 0.1 8
~> u~- cj k,=0,440 k1 =0.1 75 k,=-0,090 62.5 2,074

83 ,5 2,086 1 .95

Tabla 6.31.- Parmetros cinticos de r2 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 3 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T31 0 C, CN=257 p.p.m de amonio, N variable (21 0 r.p.m.
inicial).
Tabla 6.32.- Parmetros cinticos de r
2 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 en simple respuesta a diferentes
experimentales: T~340 C, Cre2S7
inicial).
ecuaciones
p.p.m de amonio
cinticas.
N variable
Condiciones
(21 0 r.p.m.
Cintica
V alores de los parmetros t S tudent EEischer
SRC
Mix pt Mm Obt f lor Oht Teor.
t - y k~=0.061 k
1 =0,05 5 k,=0,048 1 1 1 0 2060 1 225 4,3 5 0,5
o - y, k,=1 .5 21 k1 ~0,63 1 k,=0,25 9 3 5 2 2060 3 25 1 4,3 5 2,3
3 0]
Modelo Cintico le Clula
Tabla 6.3 3 .- Parmetros cinticos de r
2 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 4 en simple respuesta a diferentes ecuaciones
experimentales: T~2S0 C, CN65
inicial).
p.p.m de amonio,
cinticas.
N variable
Condiciones
(21 0 r.p.m.
V alores de los parmetros t S tudent E Fischer
Cintica XIx i Mm 01 4. ~Teor. 0W. jnor.
k <y k> =0.5 60 k>=0,3 5 0 k>=0,1 40 i,i.i03 2,1 1 5 5 2 4.3 8 0,2
o, o, k
1 =2.1 40 k,=l,25 0 kL= O.
3 S 0 8.3 .1 02 2,1 1 875 4.3 8 7,2
Tabla 6.3 4.- Parmetros cinticos de r
2 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
0 6 en simple respuesta a dif erentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T=280 C, CN=t3 0 p.p.m de amonio, N=variable (21 0 r.p.m.
inicial).
V alores de los parametros t S tndent E Eischer
Cintica Nlx pt Mm Obt. Teor. Oht. 1 Teor. S R C
=0,1 5 8 k
1 =0,1 25 k,=0,092 ij.o~ 2.069 878 3 ,68 0,23
ko-o k=1 .47 k=0,69 k>=0.1 9 25 ,3 2.069 3 25 3 .68 3 ,5
Tabla 6.35.- Parmetros cinticos de r2 calculados por ajuste de [os datos del experimento
n
0 7 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
experimentales: T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
3 02
Modelo Cintico de Clula
Figura 6.23.-
60
Evolucin mostrada por la integral de r
2 con el tiempo para el experimento
n
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
0,1 50
0,1 25
0, l03 -
r, ~
a ~o
a (25
0,030
t (h)
Figura 6.24.-
Evolucin mostrada por la integral de r
2 con el tiempo para el experimento
n
0 4, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
O iO 20 30 40 5 0
t (h)
o io 20 3 0 40 50
3 03
Modelo Cintico de Clula
0,
(> 035
0,030
0.025
0+
0,020
(9,01 5
0,0> 0
0,C05
0(1 1 90
ti (h)
F i g u r a 6. 25. - E v o l u c i n m o s t r a d a p o r r
52 c o n e l t i e m p o p a r a e l e x p e r i m e n t o no 2, realizado
a 28
0C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
01 6
0,1 4
0,1 2
0,1 0
: 0.08
0,06
0.04
0.02
0.09
t (h)
Figura 6.26.- Evolucin mostrada por r
52 con el tiempo para el experimento n
0 4, realizado
a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
0 lO 20 30 40
O lO 20 30 40 50
3 04
Modelo Cinticode Clula
De todo lo visto, se puede concluir que el mtodo aplicado para obtener las
velocidades de reaccin del modelo de clula planteado permite discernir qu tipo de
cintica se puede emplear para cada una de las reacciones del esquema elegido.
Se ha observado que las ecuaciones reacciones cinticas r
1 , r3 y r5 (vlidas tanto para
el modelo MCC-l como para el MCC-2), presentan mejores resultados con ecuaciones
cinticas de tipo hiperblico (ecuacin [6.38]) o tipo potencial 2 (ecuacin [6.37]), no
siendo posible discriminar mediante criterios estadsticos cul de las dos ecuaciones puede
ser la ms adecuada para el modelo planteado. Por este tipo de criterio se ha desechado la
ecuacin potencial 1 (ecuacin [6.361) para estas reacciones pues, aunque cumpla las
restricciones estadsticas impuestas para sus parmetros, presentaba valores de la t de
Student y de la E de Fischer significativamente ms bajos, y valores de suma de residuos al
cuadrado (SRC) ms altos, lo que indica un peor ajuste a la funcin con la que se realiza la
comparacin; esto ltimo se vea corroborado a la vista de las formas de las curvas
correspondientes para cada velocidad de reaccin, donde la tendencia en el error es
evidente. Qued patente que con la cintica potencial 1 se obtenan curvas con forma
descendente y no la curva sigmoidal que presentan estas funciones f(C,) para cinticas tipo
hiperblico y potencial 2.
Para la reaccin 2 (r2), correspondiente a la velocidad de formacin de aminocidos
no formadores de bases, slo presente en la simplificacin 2 (MCC-2), se ha mostrado que
los resultados mejores han sido los obtenidos para la cintica potencial 1 , presentndose
valores estadsticos de los parmetros significativamente mejores que con la cintica
potencial 2. En cuanto a la forma presentada por las curvas en comparacin a la funcin, se
observa claramente el mejor resultado de la ecuacin potencial 1 , tanto en las figuras en las
que la aparece r2 integrada como en las que aparece en diferencial, siendo ms clara la
diferencia en este ltimo caso.
Se va a proceder ahora a realizar el ajuste en mltiple respuesta, empleando
regresin no lineal para cada una de las simplificaciones (MCC- 1 y MCC-2) y probando
las cinticas obtenidas en simple respuesta en este apartado, con el fin de continuar con la
discriminacin y llegar a obtener modelo cintico de clula ms adecuado.
3 05
Modelo Cintico de Clula
6. 2 . 3 - Obtencin de Parmetro s por Ajuste en Mltiple Respuesta
El ajuste de los datos experimentales al modelo cintico de clula ha sido realizado
empleando regresin no lineal en mltiple-respuesta para cada una de las simplificaciones
propuestas en el apartado anterior. Se va a probar cada una de las ecuaciones cinticas
para las velocidades de reaccin que han resultado convenientes en el apartado anterior, y
para las dos simplificaciones supuestas, esto es para MCC-1 y MCC-2.
Ajuste en Mltiple Respuesta para la Simplificacin 1 (MCC-1 )
Las velocidades de produccin de este modelo, como ya fue visto en apartados
anteriores, vienen dadas por las expresiones indicadas en las ecuaciones de la [6.27] a la
[6.30].
Las ecuaciones cinticas a probar en primer lugar sern las de tipo potencial 2, de
acuerdo a lo visto en el apartado anterior y vienen dadas por las siguientes expresiones:
A, C,- - CV [6.39]
=A, - [6.40]
El modelo MCC- 1 , considera 3 respuestas (RNA, DNA y protena intracelular) y tres
parmetros (k, k,, k
5).
Los parmetros obtenidos, por ajuste al MCC-1 con cinticas dadas por las
ecuaciones [6.39] a [6.41 ], para el experimento n
0 1 realizado a 250C y 257 p.p.m.,
cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.36), si bien presentan un valor de
SRC (suma de residuos al cuadrado) relativamente alto, indicativo de que la reproduccin
de datos experimentales es poco aceptable, tal como puede comprobarse, a la vista de la
evolucin de componentes, en la Figura 6.27.
El ajuste del experimento n0 2 (280C y 257 p.p.m.) al MCC-1 permite la obtencin
de los parmetros que se indican en la Tabla 6.3 7. Los parmetros obtenidos por ajuste al
MCC-1 con las cinticas potenciales, superan los valores tericos de la t de Student y la E
3 06
Modelo Cintico de Clula
de Fischer. El valor de la suma de residuos al cuadrado, indicativo de la calidad de la
reproduccin es tambin un valor elevado, lo cual es corroborado por la mala reproduccin
de los datos del experimento realizado en estas condiciones, tal como indica la Figura
6.28.
Los parmetros obtenidos para el experimento n< 3 realizado a 31
0C y 257 p.p.n.,
de nuevo cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.38), pero la
reproduccin de los datos experimentales (Figura 6.29) no es buena.
Para el experimento realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
no 4). los valores fisicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.39,
donde se aprecia que se cumplen las condiciones estadsticas tericas, y en la Figura 6.30
muestra, a diferencia de los experimentos anteriores una buena reproduccin
El ajuste realizado al MCC-1 con cinticas potenciales para el experimento n0 5
realizado a 28C y 65 p.p.m., muestra que los parmetros obtenidos cumplen las
restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.40), si bien el valor de SRC (suma de
residuos al cuadrado) es significativamente elevado, por lo que no se obtiene una buena
reproduccin de los datos experimentales, tal como muestra la Figura 6.31 .
Para el experimento n0 6, realizado a 280C y 1 30 p.p.m., los parmetros obtenidos
cumplen las condiciones estadsticas, como se muestra en la Tabla 6.41 , en cambio, es
incapaz de reproducir de forma adecuada los datos experimentales obtenidos, tal como
muestra la Figura 6.32.
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-1 con cinticas potenciales para el
experimento n0 7 realizado a 28C y 475 p.p.m., tambin cumplen las restricciones
estadsticas impuestas (Tabla 6.42) pero no penniten una buena reproduccin de los datos
experimentales, tal como muestra la Figura 6.33.
3 07
Modelo Cintico de (lula
Tabla 6.36.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 1 .
Condiciones experimentales: T=250 C, CN~=25I p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1 .
Parmetro
Val o res de l o s parametro s
t Student F Fisch er
Mx pt Mm
0,1 29 0,1 29 0,1 29 l,i.i03
377,2 0,1 69 0,1 49 0,1 29 7,l.l0~
y 0,71 4 0,706 0,697 2,3.1 02
de Student (95% confianzar 2,080
E de Fischer (95% de confianzaft 2,49
SRC= 4 . 3
Anulo
A RN
7
O
Iixx~a
A ~
u

u ,
a
0000
uO,Q~7
~ ~ 50 ~
e. a
-
0 1 0
20 3 0
o
~AAA A
1 ~~~ ~
40 5 0 60
t (ti)
Figura 6.27.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 ( 2 5 0 C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1 .
3 08
.5
1 ,0
u
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.37.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 2.
Condiciones experimentales: Th280 C, CN257 p.p.m de amonio, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1 .
1~
Figura 6.28.- Evoluciones de los componentes
experimento n0 2 (280C y 257 p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste del
de amonio inicial) al modelo MCC-1 .
t d e S t u d e n t ( 95% confianza~ 2,080
F d e F i s c h e r ( 9 5%d e c o n f i a n z a r 2, 49
t(h)
3 09
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.38.- Parmetros calculados por ajuste de los datos
Co n d i c i o n e s e x p e r i m e n t a l e s : Th 3 1
0 U, CN=257
v a r i a b l e (210 r . p . m . i n i c i a l ) , a l m o d e l o M CC-1.
del experimento n0 3.
p.p.ni de amonio, N
Parametro
Val o res de l o s parmetro s
t Student F F sch er
Mx pt Mm
0,098 0,088 0,078 1 ,1 .1 02
573,25 0,01 4 0,01 2 0,01 0 5,i.i03
0,31 7 0,31 5 0,31 3 l,3.1 0~
de Student ( 95%confianzaft 2,080
E de Fischer ( 95%dc confianzat 2,49
Figura 6.29.- Evoluciones de los componente del sistema o b t e n i d o s por ajuste del
experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
3 10
SRC= 1 , 0 5
(1 2
O lO 20 30 40
1(h)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.39.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N=
variable (21 6 r.p.m. inicial), al modelo MCCI.
Parmetro
Val o res de l o s parametro s
t Student F Fiscber
Mix pt Mm
0,226 0,1 76 0.1 26 3,1 .l0~
~7,1 .1 0 361 ,5 k
3 0,255 0,247 0,239
0,0759 0,0759 0,0759 2,3.1 0~-
de Student (95% confianza 2,080
Fde Fischer (95% de con fianza)= 2,49
1 ,2
Lo
1
QS
Q
Q4 -
00
t(b)
Figura 6.30.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n
0 4 (340C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1 .
3 11
SRC= 0 , 85
O lO 20 3 0 40 5 0
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.40.- Parmetros calculados por ajuste de los
Condiciones experimentales: T28
0 C, CN=65
(21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1 .
datos del experimento n0 5.
p.p.m de amonio, N variable
Parmetro
Val o res de l o s parmetro s
t Student F Fiseh er
Mx pt Mm
0,580 0,577 0,574 3,1 .1 0~
92,33 0,81 8 0,804 0,790 7,1 .1 0~
1 ,375 1 ,375 1 ,375 2,3.1 02
de Student ( 95% confianza 2,080
F de Fischer (95% de confianza 2,49
0,8
04-
(1 2
00
O
u ~. u
Amiio
A RN~
y DN~
o
l1 r~a
o
<
A~A A
- -v
A
lo 20 30
t(li)
40 5 0
SRC=4 , 1 1
60
a
u
Figura 6.31 .- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1 .
3 12
1
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.4 1 .- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0
Condiciones experimentales: Th280 U, CN=l30 p.p.m de amonio,
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1 .
6.
1
Parmetro
Val o res de l o s parmetro s
t Student F Fiseh er
Mx pt Mo
0,286 0,23 0,1 74 8,1 .1 0
723,75 0,326 0,324 0,322 2,l.1 0~
Y 0,761 0,761 0,761 5,9.1 0~
de Student (95% conflanzay 2,O&O
F de Eischer ( 95% de confianza 2,49
i

SRC= 0,92
60
Figura 6.32.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 oc y 1 30 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
3 13
0 10 20 30 40 5 0
t (h)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.42.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=475 p.p.ni de amonio, N
v ariabl e ( 2 1 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1 .
Parmetro
Val o res de l o s parametro s
1 Student F Fiseh er
Mx pt Mm
0 . 0 5 2 0 , 0 4 1 4 0 , 0 3 0 1 ,1 .1 02
382,1 5 0,057 0,054 - 0,051 7,l.1 0~
Y 0,294 0,294 0,294 1 ,9.l0~
de Student ( 95% confianza 2,080
E de Fischer ( 95% de confianza 2,49
1
t (h)
Figura 6.33.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 oc y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
3 14
SRC=0 , 62
25
O lO 20 3 0 40 5 0
Modelo Cintico de Clula
De todo lo visto en este apartado, podemos concluir que, en vista de los resultados
obtenidos con MCC- 1 en mltiple respuesta, no se ha conseguido un buen resultado en el
ajuste de los datos de los experimentos realizados, si bien hay algn experimento
(experimento n
0 5), donde se ve una buena reproduccin de las evoluciones de los
componentes del sistema.
Aunque en todos los casos se superan los valores tericos de la t de Student y de la
E de Fischer, en casi todos los ajustes el valor de SRC (suma de residuos al cuadrado) ha
sido significativamente elevado, lo cual indica la mala calidad de la reproduccin de los
datos experimentales con el MCC-1 .
Como ya se vi en apartados anteriores, los criterios estadsticos pueden suponer una
forma de discriminar entre modelos. Por lo que se puede descartar el modelo MCC- 1 , de
acuerdo a este criterio.
A pesar de que los resultados estadsticos del ajuste de las reacciones individuales al
aplicar simple respuesta eran indicativos de que el MCC-l era un modelo, en principio,
adecuado para la descripcin del sistema, no es as cuando se aplica esta suposicin en
mltiple respuesta, por lo que, en adelante ya no se considerar esta simplificacin y se
tendr en cuenta slo la simplificacin 2 (MMC-2), que, como se ver, es la que mejor
resultado permite obtener para la reproduccin de los datos experimentales del crecimiento
de Xnthomonas can-ipestris.
Ajuste en Mltiple Respuesta para la Simplificacin 2 (MCC-2)
Las velocidades de produccin de este modelo, como ya fue visto en apartados
anteriores, vienen dadas por las expresiones indicadas en las ecuaciones [6.26] para el
amonio, [6.28] para el RNA, [6.29] para el DNA y [6.30] para las protenas intracelulares,
El modelo MCC-2 considera 4 respuestas (RNA, DNA, protena intracelular y
amonio), pero el nmero de parmetros depende de la cintica que se pruebe para cada
reaccin, pues se pueden considerar ecuaciones cinticas hiperblicas en algunas de las
reacciones del modelo (2 parmetros) y cinticas potenciales (1 parmetro).
3 1~5
Modelo Cintico le Clula
Como ya se ha comentado y se va a exponer a continuacin- el modelo MCC-2 es
el que mejor resultado estadstico proporciona, pero se debe llegar a la discriminacin
entre los modelos cinticos generados al tener en cuenta diferentes ecuaciones cinticas,
mediante alguno de los criterios comentados anteriormente.
Ya se mostr que la ecuacin cintica correspondiente a la velocidad de aminocidos
formadores de bases, r
2, responda a una cintica potencial 1 , mientras que la velocidad de
reaccin para aminocidos no formadores de bases (rj), y las velocidades correspondientes
a la formacin de RNA (y3 ) y de formacin de DNA (rs), podran responder tanto a
cinticas hiperblicas como potenciales del tipo que denominamos potencial 2.
De la combinacin de estas cinticas, en las reacciones r1 , r, y r5, se pueden
considerar, teniendo en cuenta la simplificacin 2, cuatro modelos:
MCC-3, supone y1, r3, r5 como ecuaciones potenciales 2 yr2potencial 1 .
MCC-4 supone r1 , r3, r5 como ecuaciones hiperblicas y r2 potencial 1 .
MCC-5 supone para r1 cintica potencial 2; para r3, r5 cinticas hiperblicas y r2
potencial 1 .
MCC-6 supone para r1 cintica hiperblica; para r,, r5 cinticas potenciales 2 y r2
potencial 1 .
MCC-3
En este caso, el modelo MCC-3, se consideran 4 respuestas y 4 parmetros. El ajuste
es realizado empleando regresin no lineal en mltiple respuesta de la forma ya indicada.
Los resultados del ajuste a este modelo se muestran a continuacin.
Los parmetros fsicos y estadsticos obtenidos por ajuste al MCC-3, para el
experimento ni (25
0C y 257 p.p.m. de amonio), se muestran en la Tabla 6.43, donde se
puede observar que se superan los valores tericos de la t de Student y E de la Fischer con
un 95~~ de confianza. Adems, en la Figura 6.34 se representan las evoluciones de los
componentes del sistema, tanto los valores tericos como los reproducidos por el MCC-3,
pudiendo apreciarse el buen ajuste entre ambos.
El ajuste del experimento n0 2 (280C y 257 p.p.m.) al MCC-3 permite la obtencin
de los parmetros que se indican en la Tabla 6.44. Los parmetros obtenidos por ajuste al
3 16
Modelo Cinticode Clula
modelo superan los valores tericos de la t de Student y la F de Fiseher reproduciendo de
forma adecuada los datos del experimento realizado en estas condiciones, tal como indica
la Figura 6.35.
Los parmetros obtenidos para el experimento n
0 3 realizado a 310C y 257 p.p.m.,
tambin cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.45), permitiendo, de
nuevo, una buena reproduccin de los datos experimentales, como muestra la Figura 6.36.
Para el experimento realizado a 340C y 257 p.pan. de amonio inicial (experimento
n0 4), los valores fsicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.46,
donde se aprecia que los valores tericos de t de Student y F de Fischer son superados en
todos los casos, y la Figura 6.37 muestra la buena reproduccin de los datos
experimentales obtenidos para este experimento con el MCC-3.
El ajuste de los datos expernentales al MCC-3 con las cinticas probadas en esta
caso para el experimento n0 5 realizado a 28C y 65 p.p.m., muestra que los parmetros
obtenidos cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.47) pero no se
consigue una buena reproduccin de los datos experimentales, tal como muestra la Figura
6.38, probablemente debido a que, en este experimento, la estequjometria supuesta no debe
ser cierta en este caso.
El ajuste del experimento n 6, realizado a 28C y 1 30 p.p.m., muestra que los
parmetros obtenidos cumplen las condiciones estadsticas tericas, como se muestra en la
Tabla 6.48, y reproduce de forma adecuada la evolucin de los componentes del sistema
con el MCC-3, tal como indica la Figura 6.39.
Lo s p a r m e t r o s o b t e n i d o s p o r a ju s t e a l MCC-3 para el experimento n0 7 realizado a
280C y 475 p.pan., de nuevo cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla
6.49); la reproduccin de los datos es aceptable, como indica la Figura 6.40, si bien es
significativamente peor que la obtenida en el testo de experimentos, con los que se ha
logrado reproducir perfectamente la evolucin de cada uno de los componentes. Esto
podra ser debido a que la concentracin de amonio es tan elevada q u e p o d r a estar
produciendo un cierto efecto txico en las clulas, por lo que existira una cierta inhibicin
d e l c r e c i m i e n t o del microorganismo.
3 17
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.43.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 1 .
Condiciones experimentales: Th250 C, Crc257 p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Parmetro
Val o res de l o s parametro s
t Siudent F Fiseh er
Mix pt Mm
0,577 0,547 0,51 7 2,2.l0~
1 823,1 0,1 62 0,1 51 0,1 40 i,i.03
0,234 0,225 0,21 6 1 ,2.l0~
0,040 0,035 0,030 3,2.1 0~
de Student ( 95% confianza 2,080
E de Fiseher ( 95% de confianza 2,49
-o
-t
Q)
l o s c o m p o n e n t e s
experimento n0 1 (25 0C y257 p.p.ni. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
3 18
SRC= 0 , 0 88
t (h)
Figura 6.34.- Evoluciones de del sistema obtenidos por ajuste del
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.44.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 2.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Parmetro
Val o res de l o s parmetro s
t Stiident F Fiseher
Mx pt Ma
0,573 0,57 0,567 5,2.1 0~
2725,1 0,1 55 0,1 52 0,1 49 4,l.1 0~
0,200 0,1 99 0,1 97 2,2.1 0~
0,040 0,038 0,036 8,2.1 0~
de Student (95%confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de confianza 2,49
1
(5
t(h)
Figura 6.35.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (28 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
3 19
SRC= 0 , 0 60
60
Modelo Cintico de Clula
Tabl a 6. 4 5 . -
Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 3.
Condiciones experimentales: Th31 0 C, C~~257 p.p.m de amonio, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mix pt Mm
0.378 0,375 0,371 3,2.10~
3825,1 0,104 0,103 0,102 3.1.10~
0,1 48 0,1 47 0,1 46 1 ,2.l0~
0.054 0,052 0,050 5,2.l0~
de Student ( 95% confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de confianza 2,49
1,25
1,00
c
o
0,75
0,50
025
0,00
Figura 6.36.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
3 20
SRC= 0 , 0 0 8
20
t (Ii)
Modelo Cintico de Clula
Tabl a 6. 4 6. - Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 4 .
Condiciones experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Parmetro
Val o res de l o s parmetro s
t Student F Fiseh er
Mx pt Mm
0,229 0,221 0,21 3 2,2.l0~
3895,1 0,083 0,082 0,081 s,i.io4
0,1 1 2 0,1 1 2 0,1 1 2 8,2.1 0~
0,024 0,022 0,020 7,2.l0~
de Student (95%confianza 2,080
Fde Fiseher ( 95%de confianza 2,49
n
E
e
3
SRC= 0,03 1
Figura 6.37.- Evoluciones de
experimento n0 4
los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
(34 0 Cy 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
3 21
t (h)
ModeloCintico de Clula
Tabla 6.47.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 5.
Condiciones experimentales: Th280 C, C~65 p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Parmetro
Val o res de l o s parmetro s
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
0,61 4 0,61 0 0.606 2,2.l0~
325,1 0,1 85 0,1 82 0,1 78 5,1 .1 0
Y 0,206 0.202 0.1 98 3,2.l0~
0,066 0,065 0.064 7,2.l0~
de Student (95% confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de confianza 2,49
SRC= 1 ,89
1
5
u
30
t(h)
Figura 6.38.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
3 22
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.48.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 6.
Condiciones experimentales: T280 C, CNl3O p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student - F Fiseher
Mx Opt Mm
0,591 0,571 0,551 2,2.l0~
986,2 0,141 0,141 0,141 ,.o4
Y 0,1 95 0,1 95 0,1 95 1,2.lO~
0,042 0,039 0,035 3,2.1 02
tde Student (95%confianza 2,080
F de Fischer ( 95%de confianza 2,49
E
1~
Figura 6.30.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0 Cy 1 30 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
3 23
SRC= 0,75
t (h)
60
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.49.-
Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, Ge475 p.p.m de amonio, N=
variable < 21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Par metro
Val o res de l o s parametro s
t Student F Fisch er
Mx pt Mm
0,61 3 0,61 0 0,607 2,2.102
295,1 0,1 84 0,1 82 0,1 80 s,.o~
0,21 2 0,202 0,1 92 3,2.1 0~
7.2.l0~ 0,067 0.065 0,062
de Student ( 95% confia nza 2,080
E de Fischer ( 95%de confianza 2,49
E
e
o
2)
SRC= 0 , 75
Figura 6.40.-
Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3 .
3 24
t (h)
Modelo Cinticode Clula
MCC-4
En este caso, el modelo considera 4 respuestas y 7 parmetros, debido a las cinticas
supuestas en cada velocidad reaccin, es decir las reacciones r
1 , it3 y r5. que se consideran
hiperblicas, mientras que la r2 se considera potencial 1 , como en los modelos anteriores.
El ajuste es realizado empleando regresin no lineal en mltiple respuesta. Los
resultados del ajuste a este modelo (MCC-4) se muestran a continuacin.
El ajuste del experimento n
0 1 (250C y 257 p.p.m.) al MCC-4 permite la obtencin
de los parmetros que se indican en la Tabla 6.50. Los parmetros obtenidos por ajuste al
modelo superan los valores tericos de la t de Student y la F de Fischer reproduciendo de
forma adecuada los datos del experimento realizado en estas condiciones, tal como indica
la Figura 6.41 .
Los parmetros fisicos y estadsticos, obtenidos por ajuste al MCC-4 para el
experimento n0 2 (280C y 257 p.p.m. de amonio), se muestran en la Tabla 6.5 1 , donde se
puede observar que se superan los valores tericos de ta Student y de la F de Fisclier con
un 950o de confianza. Adems en la Figura 6.42 se representan las evoluciones de los
componentes del sistema, tanto los valores tericos como los reproducidos por el MCC-4,
mostrndose el buen ajuste entre ambos.
Para el experimento realizado a 31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
n0 3), los valores fisicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.52,
donde se aprecia que los valores tericos de t de Student y F de Fisclier son superados en
todos los casos, y la Figura 6.43 muestra la buena reproduccin de los datos
experimentales obtenidos para este experimento con el MCC-4.
Los parmetros obtenidos para el experimento n0 4 realizado a 340C y 257 p.p.m.,
cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.53), permitiendo, tambin una
buena reproduccin de los datos experimentales, como muestra la Figura 6.44.
3 25
Moco Cintico de Clula
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-4 con las cinticas probadas en esta
caso para el experimento n
0 5 realizado a 280C y 65 p.p.m., tambin cumplen las
restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.54) pero no permiten una buena reproduccin
de los datos experimentales, tal como ocurra con el modelo anterior a ste, y se muestra
en la Figura 6.45.
Para el experimento n0 6, realizado a 280C y 1 30 p.p.m., Los parmetros obtenidos
cumplen las condiciones estadsticas tericas, como se puede ver en la Tabla 6.55, y
reproduce de forma adecuada la evolucin de los componentes del sistema con el MCC-4,
tal corno indica la Figura 6.46.
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-4 para el experimento n0 7, realizado a
280C y 475 p.p.m., cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.56) y la
reproduccin de datos es aceptable (Figura 6.47), como ocurra en el caso anterior, pero
peor que si se compara con el resto de los experimentos, lo que parece confirmar el efecto
txico del amonio a elevadas concentraciones, antes comentado.
3 26
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.50.- Parmetros calculados por ajuste de los datos
Condiciones experimentales: T25
0 C, CN~2S7
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
del experimento
p.p.nl
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
- 0,1 1 - 3 ,1 .1 O~
2225,3
0,005 0,005 0,005 7,8.l0~
0,045 0,044 0,043 7,1 .1 0~
0,049 0,048 0,047 6,2.1 0~
- 0,076 - 2,3.1 0~
0,0802 0,0801 0,080 5.1 02
- 0,05 - 5,23.1 0~
de Student (95%confianzat 2,1 2
F de Fiscber ( 95%de confianza> 2,66
1 ,75
1 ,50
1 ,25
e
o
1 ,00
0,75
0,50
025
0,00
SRC= 0,09 1
Figura 6.41.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1(25 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
3 27
o
n 1.
de amonio, N
t (Ii)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 1 .- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento u
0 2.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial) al MCC-4.
Parn etro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mix pt Mm
- 0,10 - 9,2.10~
3825,3
0,133 0,131 0,128 8,8.i03
0,203 0,203 0,203 l,i.i04
0,047 0,049 0,048 4,2.10~
- 0,039 - 1 ,1 2.1 02
0,12 0,112 0,10 2.119
0,054 2.23.102
de Student (95%confianza> 2,1 2
F de Fischer ( 95% de confianza> 2,66
u
t (h)
SRC=0,055
Figura 6.42.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento no 2 (28 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
3 28
60
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 2.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 3.
Condiciones experimentales: T31 0 C, C,~257 p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
- 0,1 02 - s,i.io~
1 4825,3
0,069 0,069 0,069 6,8.10~
0,022 0,022 0,022 2,l.1 0~
0,475 0,051 3 0,051 1 7,2.1 0~
- 0,0411 - 1 ,5.l0~
0,1 1 0,1 1 0,1 1 6.2.1 0~
- 0,1 1 3 - 5,23.1 0~
de Student ( 95%confianza> 2,080
Fde Fischer (95% de confianza> 2,49
1 ,25
1 ,00

8
0,75
0,50
0,25
0,00
t (h)
SRC=0,0045
Figura 6.43.- Evolucin de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del experimento
n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
3 29
40
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 3 .- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
- 0,1 06 - 3,1 .1 O~
1 1 31 .3
0.002 0,002 0,002 2,8.l0~
0,036 0,036 0,036 ,i.o4
0,0503 0,0502 0,0501 2.2.1 0~
0,0542 0,0541 0,054 4,2.l0~
- 0,058 - 8.23.1 0~
de Student ( 95% confia nza >2,12
SRC=0,061
E de Fiseher ( 95% de confia nza > 2,66
75
1 ,50
.25
u
1 ,00
0,75
0,50
0,25
0,00
O lO 20 30 40
t(h)
Figura 6.44.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4(3 40C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
3 3 0
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.54.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 5.
Condiciones experimentales: T2S0 C, CN65 p.p.m de amonio, N= variable
(21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
0,1 33 0,1 31 0,1 29 3,1 .1 02
1 35,3
0,1 1 2 0,1 1 0,1 1 2,8.1 0~
0,029 0,026 0,023 1 ,1 .1 0~
- 0,037 - 2,2.1 02
0,0479 0,0478 0,0477 4,2. o3
0,099 0,099 0,099 5,1 .1 0~
0,07 0,07 0,07 8,2.1 02
de Student (95%confianza 2,1 79
E de Fischer ( 95% de confianza 2,70
fi
e!
Figura 6.45 .- Evolucin de los componentes del sistema obtenidos porajuste del experimento
n0 5 (28 0C y65 p.p.n. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
3 3
SI4C= 2,1 8
30
t (ti)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 5 .- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento u
0 6.
Condiciones experimentales: Th280 C, C\1 30 p. n.m de amonio, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial), a] modelo MCC-4.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fischer
Mx pt
M
Mm
0,1 5 2 0,1 50 0,1 48 3 ,1 .1 0
1 925,3
0,090 0,089 0,088 7,g J 93
0,029 0,029 0,029 7,1 .l0~
0,03 9 0,03 5 0,03 3 6,2.l0~
0,06 0,06 0,06 2,3.1 0~
0,083 0,080 0,077 3 .1 02
- 0,05 - 5,23.10~
de Student ( 95% confianza 2,1 79
SRC=0,52
60
E de Fischer ( 95% de confianza 2,70
o
Figura 6.46.-
30
t (ti)
Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0C y 1 3 0 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
3 3 2
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 6.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, C,r475 p.p.m de amonio, N= variable
(21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
Parmetro
Valores de los parametros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
0,1 30 0,1 30 0,1 30 3,1 .1 0~
1 85,3
0,1 1 2 0,1 1 0,1 0 2,8.1 0~
0,026 0,026 0,026 i,1 .1 04
0,037 0,037 0,037 2,2.1 0~
0,0478 0,0478 0,0478 4,2.1 0~
Kl
5 0,1 00 0,099 0,098 5,i.i0
4
- 0,07 - 8,23.1 0~
de Student (95%confianza> 2,1 2
Fde Fischer ( 95% de confianza 2,66
1
SRC= 0,95
Figura 6.47.- Evoluciones
experimento n0
t(h)
de los componentes
7(28 0C y 475 p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste del
de amonio inicial) al modelo MCC-4.
333
1 ,75
Modelo Cintico de Clula
MCC-5
Ya se ha comentado que, debido a que podan ser empleadas tanto las ecuaciones
cinticas potenciales como hiperblicas en las velocidades de reaccin para protenas (r),
para RNA (r
3 ) y para DNA (r5), se han realizado ajustes con cintica potenciales en estas
tres reacciones (MCCI) y con cinticas hiperblicas (MCC-4). Se va a proceder ahora a
realizar una combinacin de estas cinticas en estas reacciones, de forma que pueden ser
planteados dos modelos ms, tal como se ha indicado anteriormente.
En este apartado se analiza el modelo MCC-5, donde se supone cintica hiperblica
para la reaccin r1 y potencial 2 para las correspondientes a cidos nucleicos, esto es para
RNA y para DNA. Para estas ltimas, se hace la misma suposicin pues es lgico pensar
que las velocidades de reaccin de estos dos componentes estn estrechamente
relacionadas, es decir respondan al mismo tipo de cintica.
El modelo considera, al igual que en los dos casos anteriores, 4 respuestas, pero
consta de 5 parmetros. El ajuste es realizado empleando regresin no lineal en mltiple
respuesta. Los resultados del ajuste a este modelo (MCC-5) se muestran a continuacin.
En este caso no se va a considerar el experimento n
0 5 (28C, 65 p.p.m. de
amonio), pues como ya se ha visto no se obtienen buenas reproducciones de los datos
experimentales con ninguno de los modelos anteriores, debido, probablemente, a que la
estequiometra supuesta no es vlida para esta concentracin tan baja de amonio.
El ajuste del experimento n0 1 (250C y 257 p.p.nt) al MCC-5 permite la obtencin
de los parmetros que se indican en la Tabla 6.57. Los parmetros obtenidos por ajuste al
modelo superan los valores tericos de la t de Student y la F de Fischer obtenindose una
adecuada reproduccin de los datos experimentales (Figura 6.48), muy similar a los dos
modelos anteriores (MCC-3 y MCC-4).
Los parmetros fisicos y estadsticos obtenidos por ajuste al MCC-5 para el
experimento n02 (280C y 257 p.p.m. de amonio), se muestran en la Tabla 6.58, donde se
puede observar que se superan los valores tericos de t de Student y F de Fischer con un
95% de confianza. Adems, en la Figura 6.49 se observa la buena reproduccin obtenida
con el modelo MCC-5 con los datos experimentales.
3 3 4
Modelo Cintico de Clula
Los parmetros obtenidos para el experimento n
0 3 realizado a 31 0C y 257 p.p.m.,
cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.59), pennitiendo, tambin una
buena reproduccin de los datos experimentales, como muestra la Figura 6.50.
Para el experimento realizado a 3QC y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
no 4), los valores tisicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.60,
donde se aprecia que los valores tericos de la t de Student y de la F de Fischer son
superados en todos los casos, y en la Figura 6.5 1 , se aprecia tambin la buena
reproduccin de los datos experimentales obtenidos para este experimento con el MCC-5.
Para el experimento n0 6, realizado a 280C y 1 30 p.p.ni., se puede observar que los
parmetros obtenidos cumplen las condiciones estadsticas tericas (Tabla 6.61 ). El MCC-
5 permite, tambin para este experimento, la reproduccin de forma adecuada los datos de
este experimento, tal como indica la Figura 6.52.
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-5 para el experimento n0 7 realizado a
280C y 475 p.p.m., cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.62) la
reproduccin es aceptable (Figura 6.53 ), como ocurra en el caso anterior, pero peor si la
comparamos con el resto de experimentos, lo que parece confirmar el ya citado efecto
txico del amonio a elevadas concentraciones.
3 3 5
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 7.- Parmetros calculados por ajuste de los datos
Condiciones experimentales: T25
0 C, CN=2S7
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-S.
del experimento n0 1 .
p.p.m de amonio, N
Parmetro
V alores de los parametros
t Student 1? Fiseher
Mx pt Mo
0,1 01 0,1 01 0,1 01 3,l.l0~
1 525.3
0,02 0,02 0,02 4,2.l0~
0,1 89 0,1 89 0,1 89 ,.o5
Y 0,200 0,200 0,200 l,1 2.l0~
- 0,048 - 5,23.l0~
de Student (95% confianza> 2,1 3
Fde Fischer ( 95% de confianza 2,60
1 ,75
1 ,50
1 ,25
-4
e
u
1 1 )0
0,75
0,50
0,25
0,00
Figura 6.48.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5.
3 3 6
SRC=0,15
t (ti)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 8.- Parmetros calculados por ajuste
Condiciones experimentales: T=28
0
variable (21 0 r.p.m. inicial) al modelo
de los datos
C, C~=25 7
MCC-5.
del experimento n0 2.
p.p.m de amonio, N=
Parmetro
V alores de los parmetros
t S tudent F Fiseher
Mix pt Mm
0,102 0,102 0,102 2,2.10~
2325,3
0,183 0,182 0,181
0,080 0,080 0,080 3,1 .l0~
0,1 1 9 0,1 1 9 0,1 1 9 2,1 2.l0~
0,0384 0,0382 0,0300 8,23.l0~
de Student (95%confianza> 2,1 31
E de Fischer ( 95% de confianza 2,60
8
SRC=0,102
Figura 6.49.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (28 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5.
3 3 7
t (ti)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.5 9.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 3.
Condiciones experimentales: T=31 0 C, CN=257 p.pan de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5 .
Parmetro
V alores de los parametros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
0,080 0.080 0,080 9,l.1 O~
3985,3
ffi
0,0640 0,063 9 0,063 8 5,3.l0~
0,1 1 9 0,1 1 9 0,1 1 9 2,1 .lO~
0,1 702 0,1 701 0,1 700 3.I2.1 0~
- 0,0949 - l,23.1 0~
de Student (95%confianza> 2,1 2
E de Fischer ( 95% de confianza> 2,85
.4
u
SRC=0,010
Figura 6.50.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
3 3 8
20
t (ti)
40
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.60.- Paranietros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 4.
Condiciones experimentales: Th340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student 1 Fiseher
Mx pt Mm
0,1 0 0,1 0 0,1 0 5,l.i05
21 1 2,8
0,0459 0,0458 0,0457 8,3.1 0~
0,1 1 3 0,1 1 3 0,1 1 3 9,1 .1 0~
0 , 16 0 , 16 0 , 16 7, 2. 10 ~
0 , 0 775 0 , 0 773 0 , 0 772 4, 23 . 10 ~
d e Student ( 95%confianza 2,080
Fde Fischer ( 95%de confianza 2,49
1 ,75
1 ,50
1 ,25
E
1~
1 ,00
0,75
0,50
0 ,2 5
0,00
L
Figura 6.51 .- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento no 4 (34 C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
3 3 9
SRC= 0,1 2
t (ti)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.61.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 6.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=1 3O p.p.m de amonio, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
Parmetro
V alores de los parmetros
t Student F Fischer
Mx pt Mm
0,1 05 0,1 0 0 , 0 9 5 3 ,l.l0~
1 1 25,3
0,045 0,042 0,03 9 4,2.l0~
0,3 02 043 02 0,3 02 i , i . o ~
0,440 0,440 0,440 l.1 2.l0~
0,0553 0,0553 0,0553 5,23.l0~
de Student ( 95% confianza 2,080
E de Eischer ( 95%de confianza2,49
O.
0.50
025
O.
SRC=0,96
60
Figura 6.52.- Evoluciones de los componentes
experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste del
de amonio inicial) al modelo MCC-5..
30
t (ti)
3 40
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.62.- Parmetros calculados por ajuste de los datos de] experimento n
0 7.
Condiciones experimentales: T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
Parmetro
V alores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
0 , 10 2 0,1 0 0,098 5,i.i03
211, 8
Kl
1 0,063 0,062 0,061 5 ,3 .l0~
0,1 99 0,1 99 0,1 99 2,1 .1 0~
0,201 0,200 0,1 99 3 ,2.1 0~
- 0,05 9 - 5 ,23 .1 02
de Student (95%confianza> 2,1 2
F de Fiseher ( 95% de confianza2 ,85
1 ,75
1 ,50
1 ,25
E
1~
1 ,00
0,75
0,50
0,25
0,00
SRC=1 ,2
t (ti)
Figura 6.53.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n
0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
3 4
Modelo Cintico de Clula
MCC-6
Este modelo consta de 4 respuestas, y 6 parmetros, debido a que las cinticas
supuestas en este caso para cada reaccin son una cintica potencial 2 para rj, hiperblicas
para r
3 y r5, y la misma que en casos anteriores, cintica potencial 1 , para r2.
El ajuste ha sido realizado empleando regresin no lineal en mltiple respuesta. Los
resultados del ajuste a este modelo (MCC-6) se muestran a continuacin
Los parmetros fisicos y estadsticos obtenidos por ajuste al MCC-6 para el
experimento n
01 (250(2 y 257 p.p.m. de amonio), se muestran en la Tabla 6.63, donde se
puede observar que se superan los valores tericos de la t de Student y de la F de Fischer
con un 95%de confianza. Adems, en la Figura 6.54 se representan las evoluciones de los
componentes del sistema, tanto los valores tericos como los reproducidos por el MCC-6,
mostrndose el buen ajuste entre ambos.
El ajuste del experimento n0 2 (280(2 y 257 p.p.m.) al MCC-6 permite la obtencin
de los parmetros que se indican en la Tabla 6.64. Los parmetros obtenidos por ajuste al
modelo superan los valores tericos de la t de Student y la F de Fiseher obtenindose una
adecuada reproduccin de los datos experimentales (Figura 6.55), muy similar a los dos
modelos anteriores.
Los parmetros obtenidos para el experimento n0 3 realizado a 310(2 y 257 p.p.mde
nuevo cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.65), permitiendo tambin
una buena reproduccin de los datos experimentales, como muestra la Figura 6.56.
Para el experimento realizado a 340(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
n0 4), los valores fisicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.66,
donde se aprecia que los valores tericos de la t de Student y de la F de Fischer son
superados en todos los casos, y la Figura 6.57 muestra la buena reproduccin de los datos
experimentales obtenidos para este experimento con el MCC-6.
3 42
Modelo Cintico de Clula
Para el experimento n
0 6, realizado a 280(2 y 130 p.p.m., los parmetros obtenidos
por ajuste al MCC-6 son mostrados en la Tabla 6.67, donde se puede apreciar que superan
los valores tericos de la t de Student y de la F de Fischer. La reproduccin de los datos
experimentales con el MCC-6 es significativamente buena, tal como indica la Figura 6.58.
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-6, para el experimento n0 7 realizado a
280(2 y 475 p.p.m., cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.68),
superando los valores tericos de la t de Student y F de Fischer, y obtenindose una
reproduccin aceptable de los datos experimentales de este experimento (Figura 6.59).
3 43
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.63.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 1 .
Condiciones experimentales: T250 (2, C~=257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-6.
Parmetro
V alores de los parmetros
t Student F Fiseher
Mx pt Mo
0,673 0,67 0,667 2,2.l0~
1 921 ,3
0 , 0 3 11 0 , 0 3 11 0 , 0 3 11 2, 5. l 0 ~
Kl
3 0,045 0,045 0,045 3,2.l0~
0,0575 0.0572 0.0569 2,1 .l0~
Kl 5 0 , 0 8 5 0 . 0 8 5 0 , 0 8 5 9 , 3 . l 0 ~
- 0,044 - 7,23.1 02
de Student ( 95%confianza 2,093
E de Fiseher ( 95% de confianza 2,63
u
SRC=0,11
60
Figura 6.5 4.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n
0 1 (250(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-6.
3 44
t (ti)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.64.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 2.
Condiciones experimentales: T280 (2 , (2NC57 p.p.ni de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial>al modelo M(2(2-6.
Parmetro
Va lores de los pa rmetros
t Student F Fiseher
Mix pt Mm
0,302 0,30 0,298 2,2.10~
1 989,3
0,01 8 0,01 8 0,01 8 7,50~
0.0502 0,05 0,05 l,2.1 0~
0 , 0 3 9 0 , 0 3 9 0,039 3 , 3 . 10 ~
0 , 11 0 , 11 0 , 11 5, 3 . l 0 ~
0 , 0 78 0 , 0 76 0 , 0 74 5,3.1 02
de Student (95%confianza 2,093
E de Fiseher ( 95% de confianza 2,63
1 75
1 .50
1 25
-4
E
u
1 ,00
0 ,7 5
0,50
0,25
0,00
SR(2=0,095
O
Figura 6.55.- Evoluciones de
3 45
t (ti)
los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (2S 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2(2-6.
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.65.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 3.
Condiciones experimentales: T31 0 (2, CN=257 p.p.m de amonio, N=
variable (21 0 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
Parmetro
V alores de los parametros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
0,402 0,401 0.400 4,2.1 0~
3899,3
0,01 8 0,01 8 0,01 8 ,5.i04
0,051 0,051 0,051 5,2.1 0~
0 , 0 3 6 0 , 0 3 6 0 , 0 3 6 7. 2. 10 ~
0 , 11 0 , 11 0 , 11 6. 3 . 10 ~
- 0,076 - 1 ,23.1 02
de Student ( 95%confianza 2.1 01
F de Fisctier ( 95%de confianza2,66
1 ,75
1 ,50
1 ,25
E
u
1 ,00
0,75
0,50
0,25
0,00
Figura 6.56.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MC(2-6..
3 46
SRC=0,005
t (ti)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.66.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 4.
Condiciones experimentales: T=3 40 (2, (2r~e2S7 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
Parmetro
V alores de los parametros
t Student F Fiseber
Mx pt Mm
0,54 0,53 0,52 3,2.l0~
3 9 11, 2
0,01 73 0,01 72 0,01 71 2,7.1 0~
0,05 0,05 0,05 4, 3 . 10 ~
0 , 0 3 59 0 , 0 3 59 0 , 0 3 59 5, 3 . l 0 ~
0,103 0,10 0 , 10 1 4, 3 . l 0 ~
- 0,0604 - 9 , 23 . l 0 ~
de Student (95% confianza> 2,01
E de Fisetier ( 95%de confianza 2,66
1
u.
SR(2=0,011
Figura 6.5 7.-
t(b)
Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4 (34 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2C-6..
3 47
1 ,25
Modelo Cinlico de Clula
Tabla 6.67.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 6.
Condiciones experimentales: T280 (2, (2N=1 30 p.p.m de amonio, N
variable (21 0 r.p.m. inicial) al modelo MC(2-6.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseher
0,801 0,800 2,2.l0~
1 399,3
0.0271 0,0270 2,5.l0~
0,042 0,042 3,2.l0~
0,054 0.054 0,054 2,.1 0~
0 . 0 79 0 . 0 79 0 , 0 79 9 , 3 . l 0 ~
0 , 0 3 6 0 , 0 3 5 0 , 0 3 4 7, 23 . 10 2
de Student (95% confianza 2,086
E de Fischer ( 95%de confianza 2,60
1 flO
-4
u
0.75
0.50
025
ono
SRC=0,894
Figura 6.5 8.-
Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (280(2 y 1 30 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2(2-6..
t (ti)
3 48
M odelo Cintico de Clula
Tabla 6.68.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento
Condiciones experimentales: T~28
0 (2, (2N475
p.p.m de amonio,
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fischer
Mix
O
Opt Mm
0,532 0,531 0 , 53 0 3 , 2. I 0 ~
61 1 .2
0,01 7 0,01 7 0,01 7 2,7.1 0~
1(3 0,055 0,05 0,05 4,3.1 O~
0,03595 0,0359 0,3585 5 ,3 .1 0~
0 , 10 0 , 10 0 , 10 4, 3 . 10 ~
- 0 , 0 60 4 - 9,23.1 0~
de Student ( 95% confianza> 2,080
E de Eisctier (95% de confianza 2,49
1 3
1 ,50
1 ,25
n
e
1 ,00
0,75
0,50
0,25
0,00
SR(2=0,93
Figura 6.5 9.- Evoluciones
experimento n~
de los componentes
7 (280(2 y 475 p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste del
de amonio inicial) al modelo M(2(2-6.
3 49
o
n 7.
t(h)
Modelo Cintico nc Clula
6.2.4. Discriminacin entre Modelos Cinticos
En el apanado anterior se han mostrado los ajustes de los datos experimentales a los
diferentes modelos propuestos para el crecimiento de la bacteria Xanthomonas campestris, a
continuacin se va a tratar de seleccionar el modelo de acuerdo a los criterios antes
comentados.
6.2.4.1 . Criterios Estadsticos
Entre los dos esquemas de reaccin simplificados propuestos, que corresponden a los
modelos MCC-l y MCC-2, se ha observado que el primero no permite obtener una
reproduccin de las velocidades de produccin de los diferentes componentes clave de los
distintos experimentos realizados, por lo cual el citado modelo ha sido descartado segn un
criterio estadstico, considerando que el valor de SRC es significativamente alto, lo que se
traduce en una mala reproduccin de los datos experimentales de todos los experimentos
ajustados con el MCC- 1 -
Para MCC-2. se plantearon diferentes posibilidades en funcin de las ecuaciones
cinticas probadas en rl, r
3 y r5. La velocidad r2, en todos los modelos ha sido potencial 1 ,
pues, como ya se vi, parece ser la nica cintica con la que se obtienen parmetros con
valores estadsticos aceptables.
As pues, se realiz el ajuste con distintas suposiciones en las cinticas de estas
reacciones, tal como se ha indicado en el apanado anterior. Se han propuesto as cuatro
modelos, cuyas velocidades de produccin corresponden a la indicada para la simplificacin
2 (MCC-2), pero variando las cinticas de las velocidades de reaccin y efectuando diversas
combinaciones entre ellas < MCC-3, MCC-4, MCC-5 y MCC). Como se ha podido
apreciar, estos cuatro modelos permiten, para todos los experimentos, obtener unos
parmetros con valores estadsticos significativamente buenos. En todos los casos, los
valores estadsticos de los parmetros obtenidos superan los valores tericos de F dc Fischer
y de t de Student, obtenindose en todos los casos unos intervalos de confianza muy
estrechos. Por otro lado, los valores de SRC (suma de residuos al cuadrado) parecen ser
3 S0
Modelo Cintico de Clula
indicativos de las buenas reproducciones que se han obtenido en todos los ajustes; no
obstante, puesto que este valor es una forma de medir la reproducibilidad de los datos
experimentales, se muestran en la Tabla 6.69 los distintos valores de SRC obtenidos en cada
uno de los experimentos, para los cuatro modelos, con el fin de analizar si este puede ser un
criterio de discriminacin entre ellos.
Tabla 6. 69.- Valores de SRC (suma de residuos al cuadrado) obtenidos en los ajustes a
diferentes modelos de clula para cada uno de los experimentos realizados.
Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento
n1 n
02 n~3 n04 n06 n~7
MCC-3 0,088 0,060 0,008 0,030 0,075 0,750
MCC-4 0,091 0,055 0,005 0,061 0,520 0,950
MCC-5 0,150 0,102 0,010 0,120 0,960 1,200
MCC-6 0,110 0,095 0,005 0,01 1 0,894 0,930
Se puede observar que los valores ms bajos de SRC, indicativos de un mejor
ajuste, se obtienen para los modelos MCC-3 y MCC-4, cumplindose esto para todos los
experimentos, lo que podra suponer un criterio aceptable para discriminar respecto a los
otros dos modelos propuestos (MCC-5 y MCC-6). Estos ltimos dan buen resultado desde
un punto de vista estadstico, y adems, permiten obtener una buena reproduccin de los
datos experimentales, no obstante segn el criterio de discriminacin por el valor de SRC se
podran descartar respecto a los otros dos.
En comparacin al modelo MCC-3, que tiene 4 parmetros, los modelos MCC-5 (5
parmetros) y MCC-6 (6 parmetros) ajustan peor, esto es, se obtienen valores de la suma
de residuos al cuadrado (SRC) ms altos a pesar de tener un mayor nmero de parmetros,
lo cual permite un mejor ajuste debido a que, desde un punto de vista matemtico se le
proporciona al sistema un mayor grado de libertad, lo que debera permitir una mejora en el
ajuste, es decir valores menores de SRC.
3 5
Modelo Cintico de Clula
Por otro lado, el modelo MCC-4 que posee Y parmetros, no presenta valores de
SRC significativamente inferiores a los obtenidos con MCC-3, a pasar de que sera de
esperar un mejor ajuste debido a que este modelo dispone de ms grados de libertad. Los
valores de la suma de residuos al cuadrado, presentados en la Tabla 6.69, son muy
semejantes entre ambos modelos, solo se obtiene un valor inferior de SRC respecto al
modelo MCC-3 para el experimento n
06, en el resto, son superiores a los presentados por el
MCC-3.
En vista de esto, se podra discernir entre ambos modelos decantndonos por el
MCC-3, no obstante y dado la similitud en los valores de suma de residuos al cuadrado se
van a comparar los cuatro modelos mediante criterios fsicos, por si estos pudieran aportar
datos para llegar a una conclusin ms clara.
Como se coment al principio de este captulo, un criterio fsico de discriminacin es
la evolucin de los parmetros con las variables estudiadas
Es necesario comentar que el experimento realizado con 65 p.p.m.de amonio inicial,
no ha sido considerado como experimento comparativo con los dems. A pesar de obtener
valores estadsticos aceptables para este experimento, la reproduccin de los distintos
componentes del sistema no ha sido buena, observndose valores de SRC significativamente
elevados. Esto, como ya ha sido comentado a lo largo de la exposicin de este apartado
parece ser debido a que la estequiometra supuesta no sera la adecuada en el caso de
concentraciones tan bajas de sustrato nitrogenado. Al principio de este captulo, se pudo
observar que, al efectuar el balance de nitrgeno para los componentes del sistema en este
experimento, faltaba nitrgeno, es decir la cantidad de nitrgeno que se adicionaba al
medio, era inferior a la encontrada en los componentes. Todo esto parece indicar que la
composicin del microorganismo cambia ligeramente con la composicin del medio. Por lo
que, a ciertas concentraciones de sustrato nitrogenado, la suposicin efectuada para el
modelo propuesto puede no ser adecuada en ciertos casos. Ms adelante se volver a
comentar este aspecto y se realizar un cambio de estequiometra para verificar lo que se
acaba de comentar.
3 52
Modelo Cintico de Clula
6.2.4.2.- Discriminacin por Criterios Fsicos: variacin de los parmetros con las
variables
En este apartado se comparan las distintas tendencias que presentan los parmetros
en funcin de las variables: temperatura y concentracin inicial de nitrgeno. Se van a
analizar las tendencias para cada una de los parmetros en los modelos que han sido
finalmente considerados: MCC-3 y MCC-4, aunque tambin se incluyen los otros dos
modelos MCC-5 y MCC-6.
Variacin de parmetros del MC(2-3 con la temperatura
Como ya ha sido expuesto, este modelo consta de cuatro parmetros, debido a las
cinticas potenciales supuestas en este caso. En las Figura 6.60 se muestran las evoluciones
de los parmetros correspondientes a cada una de las velocidades de reaccin.
La lnea continua es la curva real obtenida del valor de los parmetros, la
discontinua indica la tendencia de la funcin matemtica a la que podra ser ajustada a la
vista de dicha evolucin.
Como se aprecia en la Figura 6.60, el parmetro k
1 , correspondiente a la reaccin r1
(protenas), muestra una tendencia descendente con la temperatura. Los parmetros
correspondientes a las reacciones de velocidad de cidos nucleicos (Y y k5) muestran una
tendencia ms o menos constante con la temperatura, Figuras 6.Ob y 6.60c. Aunque parece
que hay una cierta tendencia descendente (lnea continua), no son valores significativamente
distintos, por lo que se podra considerar que el valor es constante con la temperatura.
Finalmente el parmetro k2, correspondiente a la velocidad de reaccin de los
aminocidos no formadores de bases (r2), muestra una tendencia con un mximo, lo cual
podra ser ajustado a una funcin tipo Ratkowsky, como ya se ha visto en captulos
anteriores.
3 53
Modelo Cintico de Clula
V ariacin de parmetros del MC(2-4con la temperatura
En cuanto a la evolucin de parmetros con esta variable, para el modelo MCC-4. se
aprecia que la tendencia presentada por los parmetros de la reaccin r[ es distinta. El
parmetro k
1 , que es el parmetro del numerador presenta un valor constante con la
temperatura, mientras que el parmetro del denominador K1 , presenta una tendencia
pasando por un mximo, como se indica en la Figura 6.61 a.
Los parmetros correspondientes a las ecuaciones cinticas r3 y y5 presentan
tendencias similares con la variable en ambos casos, tal como indica la Figura 6.61 b y
6.61 c; se puede asumir que tanto los parmetros del numerador como del denominador de la
ecuacin cintica correspondiente no varan con [a temperatura.
Por ltimo, el parmetro k=correspondiente a la reaccin r2, muestra una tendencia
similar al caso observado en el modelo MCC-3, tal como indica la Figura 6.61 d.
Variacin de parmetros del MCC-5 con la temperatura
En este modelo se consider la velocidad de reaccin para r1 como una cintica
hiperblica, es decir con dos parmetros, cuya evolucin se muestra en la Figura 6.62a. En
ella se aprecia que, al igual que en el caso anterior, el parmetro del numerador (k1 ) presenta
una tendencia constante con la temperatura, mientras que el del denominador pasa por un
mximo (K). Los parmetros correspondientes a r3 y r5 tienen tendencias constantes con la
variable, como indican las Figuras 6.62b y 6.62c.
El parmetro k2 correspondiente a la reaccin r2 no muestra la tendencia hiperblica
observada en el modelo MCC-3 y MCC4. En este modelo, el parmetro k2 no parece tener
una tendencia clara con la temperatura, lo que podra ser un criterio de discriminacin de
este modelo MCC-5, frente a los dos anteriores.
3 54
Modelo Cintico de Clula
Variacin de parmetros del M(2(2-6 con la temperatura
En este modelo se consider la velocidad de reaccin para r
1 como una cintica
potencial tipo 1. Como se aprecia en la Figura 6.63, el parmetro k1, muestra una tendencia
similar a una hiprbola invertida. Funcin muy diferente a la obtenida en los modelos
anteriores y poco explicable
Los parmetros correspondientes a u y r5 tienen tendencias constantes con la
variable, como indica la Figura 6.63b y 6.63c, al igual que ha sido observado en el resto de
los modelos, con independencia de que las cinticas fresen potenciales o hiperblicas.
El parmetro k2, correspondiente a la reaccin u no muestra la tendencia hiperblica
observada en el modelo MCC-3 y MCC-4. La curva es algo ms suave a lo visto en estos
dos modelos comentados, tal como se aprecia en la Figura 6.63b.
De nuevo puede afirmarse que los modelos MCC-5 y MCC-6 no aportan nada sobre
el MCC-3, ya que [a variacin dc parmetros con la temperatura es ms razonable en [os
modelos MCC-3 y MCC-4.
3 55
Modelo Cintico de Clula
0 6 -i
a
:61
o 1
0
v i.
06
1 ________________________
:4 26
1
~
3 6161
~1
II 60
TOTIV CntIta

.
S O II 60
[oircnt ira
(03 <
O
420-j
630.]
0101
6. -
0.10-
0440.
1
o :6 SO lo
1.011,criC
c -
Figura 6.60.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-3 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad r~ ti) parmetro para la velocidad r
3
c) parmetro para la velocidad y5 d) parmetro para la velocidad r2
-0
Ienhientllra
3 56
Modelo Cinticode Clula
26 28 30 32 34
Tenperatra
36 28 31 1
renpera wa
Figura 6.61 .- Variacin de
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad r
1
c) parmetro para la velocidad r5
los parmetros del modelo cintico de clula MCC-4 con la
b) parmetro para la velocidad r3
d) parmetro para la velocidad r2
u
.--...
-
~1 ~~~>-
//Y a
4
0,12
ojo
0,08
2 0,08-
11,04-
0.02-
0.00-
0.1 2
0.1 0
O .08
o .i
.04
0.02
090
24
020
0.1 1 1
ti

32 34
E
0.1 0-
0,05
0.00-
Tenvedira
j
0.03 -
23 1 6 S O 30 32 34
TeripcriC ir a
3 57
;tIodeio Cintico de Clula
14.: J o
26 j
5
25
4.140.]
0.456
0,454
.025
4.4> 0
1 4>
a
- ~ 4>
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54 4
CflpOriCiiriI
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24 :8 34
si 28 44
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0.015-
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1,
4.06 0-
44425 -
-a--O
~-61
~0 2
2-.. o
24 28 14 2 44
Icnpert ura
Figura 6.62.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MC(2-5 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad ~L ti) parmetro para la velocidad r
3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
3 58
-
-A &
54
iJ
03 6
3 0-
4=1 1 -
44=4-
t
0
>4.25
11
2-8
42 34
62 64
.4>
4- 4---
4.
~1
-. 4>
>4.-sn -
26 28 30 33 34
Tcnpetittra
24 26 28 30 32 34
1 cnpcitta
0. Co
4401 5-
4.050 -
1
k
A
24
28 28 30 32 34
Tenperaira
Figura 6.63.- Variacin dc los parmetros del modelo cintico de clula MCC-6 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad r
1
c) parmetro para la velocidad r5
b) parmetro para la velocidad r3
d ) parmetro para la velocidad r2
Modelo Cinticode Clula
0
0.8
0?
0.6
.5
~:731
0.2-]
0.!
0.0
006-
o
004
3 0
000
0.00,
lenvenhira
E 0.04
. k
- A 4
--A -. .
A
u .--.
0.02
4400
1
0.025
3 59
Xh)cleo <jintico (le (lula
Variacin de parmetros del MCC-3 con la Concentracin Inicial de Amonio
En cuanto a la evolucin de parmetros con esta variable, para el modelo MCC-3, se
aprecia que la tendencia presentada por todos es similar.
En la Figura 6.64 se muestra que, para todos los parmetros de este modelo, no hay
una tendencia, el valor es constante. Es decir, su valor no varia con la concentracin de
amonio inicial, por lo que se concluye que la concentracin de amonio inicial no influye en
la variacin de los parmetros del modelo, tal como caba esperar.
Variacin de parmetros del MCC-4 con la Concentracin Inicial de Amonio
En este caso se puede asumir que la tendencia de los parmetros con la variacin de
la concentracin inicial de amonio es constante, al igual que en el caso anterior.
En la Figura 6.65, aparecen representados [os parmetros en funcin de esta variable
para cada una de las velocidades de reaccin.
Variacin de parmetros del M(2C-5 con la Concentracin Inicial de Amonio
En este caso, [a tendencia de los parmetros con la variacin de la concentracin
inicial de amonio es tambin constante, al igual que en los dos casos anteriores. No
obstante, si observamos la Figura 6.66, los parmetros k; y k
5, Figuras 6.66b y 6.66c
respectivamente, muestran cierta tendencia hacia un mnimo con la concentracin de
amonio de 257 p.p.m.
Variacin de parmetros del MC(2-6 con la Concentracin Inicial de Amonio
Como se aprecia en la Figura 6.67, la tendencia de todos los parmetros del modelo
es constante, es decir, el valor de los parmetros no cambia significativamente con la
concentracin inicial de amonio, al igual que en los casos anteriores.
3 60
Modelo Cintico de Clula
40 24> 0 300 404 400
CM(P.P.m)
. 6,
b
=040 300
C~(pp.m)
44> 0 400
[r,7
4>..
c
_________ 4
00 =00 300 400 600
C<ppno)
rn4
d
1 0
=00 304>
no)
400 500
Figura 6.64.-
Variacin de los parmetros del
concentracin inicial de amonio.
a) parmetro para la velocidad r
1
c) parmetro para la velocidad r5
modelo cintico de clula MCC-3 con la
b ) parmetro para
d ) parmetro para
la velocidad r3
la velocidad r2
~ . . .
.--~ L____ -
a
4<-
08.-
.4 4
.4
4.3-
41-
0.4
:1
45.
II
0.2
4,1
4-4
II O
0.4
4.6
0.4
1
0.4
0.3
02 -
0.
0.4
0,
0.20
4.45
0-lo
0.05
0-.,
3 6]
Modelo Cintico de Clula
6 6
ti - Ajo
a
4
1 i-~- -~
---~ - A
<i~1 .9- - 1
:4444 44>44 4444 440
4>
A K
b
4444
. 61
140 144>
Q j(P pno>
604
- 2
e
tuis
4 4 4
4 - 0 4 >
< <4
4>.->
< 44> 76
4,4)50
--4>
240 =00 -4> 44> 6<44>
4? 9pm>
~6. -
de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-4 con la
concentracin inicial de amonto.
a) parmetro para la velocidad r
1 b) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
--4
A -
1 1
44
Figura 6.65.- Variacin
3 62
4> 35
a
4.14>
~
~
<0
4.140
404> 40
4.50
415
304>
C>4ppm)
400 4030
4>
4.3,
b
4 4 3 4
4
4=44
0.35
0,44>
44.45
441 .
4 40 200 44>0 4410 400,
< --4
9.03,
446
e
0.5
3--
4> -;
0.2
0.4
0.0
400 200
442
3110
C~<p.p.m)
400 500
- E 4>,
d
230 400 4303 500
modelo cintico de clula M(2C-5 con la
b ) parmetro
d ) parmetro
para la velocidad r
3
para la velocidad r2
C%(P.P.J30)
Figura 6.66.- Variacin de tos parmetros del
concentracin inicial de amonio.
a) parmetro para la velocidad r1
c) parmetro para la velocidad r5
0=4
<0
Modelo Cintico de Clula
e-
1
1
1 0.4
4440
3 63
3 leUdo (ztco de Clula
4--
~~~~~2-
4-
114>4 44>>>

y
_ a -
ti
< 5
A-
4444
4<> =41<>
4=41
~ A
A
4444> 4=4 $ 4144
-.
Liii
c
.,--.4<
A
--A -
~
- A
0 --~
454--
44 2450
44,1
--1
lOO -400 6<34=
,
.418
41.410
-c
4>2
d

44.44=
240 300 400 444
p no~
Figura 6.67.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-6 con la
concentracin inicial de amomo.
a) parmetro para [a velocidad rj b) parmetros pata la velocidad r
3
c) parmetros para la velocidad r5 d) parmetro para la velocidad r2
3 64
.7
-I-.k>
a
40
.5
46
Modelo Cintico ce Clula
Al aplicar, por tanto, los diferentes criterios de discriminacin sobre los cuatro
modelos considerados, se concluye que los modelos MCC-3 y el MCC-4 parecen ser los que
mejor resultado permiten obtener.
A pesar de que todos los modelos presentan una tendencia aceptable de los
parmetros con las variables, hay que destacar que el MCC-6 presenta el parmetro
correspondiente a r
2 con una tendencia con la temperatura que no parece muy clara. El
MCC-~5, en la variacin de parmetros con el amonio presenta mnimos para r3 y r5, lo cual
no parece ser muy lgico.
Por tanto, la evolucin de parmetros de los modelos MCC-5 y MCC-6 no parece
aportar ninguna ventaja que permita considerar que estos modelos mejoran la reproduccin
de los datos experimentales respecto a los otros dos modelos planteados.
Hay que recordar que ambos modelos poseen un nmero ms elevado de parmetros
que el MCC-3, en cambio los valores de SRC eran mayores y, como se acaba de ver, la
evolucin de parmetros de estos modelos con las variables no es indicativa de que se
mejore el resultado obtenido con MCC-3 y MCC-4.
En cuanto al MCC-3 y MCC-4, presentan una evolucin razonable de todos sus
parmetros con la temperatura y con el amonio. Por ello resulta ms dificil discriminar entre
ambos. No obstante, y como ya se coment anteriormente, a pesar de que MCC-3 es el
modelo que presenta menor nmero de parmetros es con el que se obtienen menores
valores de SRC. Si bien este no es un criterio de discriminacin muy claro, se va a utilizar
para elegir el MCC-3 frente a los dems, debido a que es el modelo en el que el nmero de
parmetros es menor (4 parmetros), lo cual simplifica mucho el problema, aspecto
fundamental en ingeniera.
Por tanto, y debido a que se ha optado por el MCC-3, se pueden plantear ahora
parmetros como funciones de la temperatura para este modelo. Las funciones se pueden
obtener por observacin de la forma de las curvas de la Figura 6.62; tanto k3 como
presentaban una tendencia constante con la variable, mientras que r2 parece responder a una
funcin tipo Ratkowsky, y r1 una variacin lineal descendente, de la siguiente forma:
3 65
Modelo Cintico le Clula
k
1(T) = C1 ~2 ~ [6.42]
k3 (T) = C3 [6.43]
k3 (T) C5 [6.44]
r- (T) =1 C,(T- T ,,03 ,)[l-exp(C ,.(T- T,ica))i)~ [6.45]
En cuanto al amonio, dada la tendencia constante de los parmetros como indica la
Figura 6.65, no ha sido necesario plantear funciones de los parmetros en relacin a esta
variable.
6.2.5.- Mejora de las Deficiencias Observadas en el Modelo Cintico de Clula
A lo largo del apartado anterior se han ido exponiendo los resultados obtenidos al
aplicar diferentes modelos para la descripcin del crecimiento de Xanthornonas can-ipestris.
Se ha decidido discriminar el MCC-3 frente al resto de los modelos planteados, los cuales
tambin permitan obtener buenos resultados en la reproduccin de los datos
experime nta les
Tambin se coment que el experimento llevado a cabo con una concentracin
inicial de amonio de 65 p.p.m.(experimento n
0 5) no permita una adecuada reproduccin de
los datos experimentales con ninguno de los modelos planteados. Por otro lado, el
experimento realizado con 475 p.p.m. de amonio inicial se consigue con una reproduccin
aceptable, si bien no tan buena como la obtenida para el resto de experimentos realizados.
Por tanto, en este apartado se comentarn las deficiencias encontradas de la
aplicacin de los modelos cinticos de clula, y cmo es posible realizar una mejora de estas
deficiencias. Estas mejoras han sido comprobadas para los dos modelos que han
proporcionado mejores resultados, esto es el MCC-4 y el MCC3.
3 66
Modelo Cintico de Clula
Mejora del ajuste del experimento n
0 5 (280 C y 65 p.p.m. de amonio inicial)
La principal deficiencia del modelo cintico de clula planteado es la encontrada
para el experimento realizado con 65 p.p.m. de amonio inicial. Como se indic al principio
de este captulo, al realizar el balance de nitrgeno con la estequiometra supuesta, no se
poda cerrar el balance de este compuesto. Es decir, se encontr mayor concentracin de
nitrgeno en forma de componentes de la biomasa (DNA, RNA y protenas) que la aadida
como amonio en el medio de cultivo. Se puede pensar que la estequiometra considerada no
sea la adecuada para este caso.
Es sabido que la composicin de los microorganismos cambia con la composicin
del medio, de forma que la bacteria con concentraciones muy bajas de amonio puede estar
produciendo componentes con diferente composicin que cuando la concentracin de
amonio es ms elevada.
Este cambio en la
para la formacin de
correspondiente al grupo
nitrgeno (ci del grupo amino del carbono a y con otrols nitrgeno/s en [a cadena lateral).
composicin se reflejar en el tipo (y proporcin) de aminocidos
protenas. Existen aminocidos con un solo nitrgeno (el
amino del carbono a) y otros aminocidos que poseen ms de un
Es evidente que el microorganismo debe consumir ms amonio cuando tenga que
producir aminocidos con ms de un nitrgeno que cuando el aminocido posea solo uno.
Ante un cambio en la composicin del medio, fundamentalmente en a fuente nitrogenada,
el microorganismo formar aminocidos de un tipo y de otro, pero no en la misma
proporcin. Debido a que no ha sido posible el anlisis de dicha proporcin entre los
diferentes aminocidos que constituyen la biomasa, pues se escapa al alcance de este
trabajo, se ha realizado una suposicin con el fin de verificar si este hecho puede explicar
[os resuLtados encontrados.
La suposicin efectuada es que los aminocidos formados
protenas, en el experimento realizado con 65 p.p.m de
mayoritariamente aminocidos con un slo nitrgeno, por lo que
para los aminocidos formadores de bases dada por la ecuacin [6.1
la siguiente expresin:
para la produccin de
amonio inicial, son
la relacin de filiacin
5] viene dada ahora por
3 67
Modelo Cintico de Clula
0,83 3 C< ~ H~ O~ NH
4
t]NAD +0,]4CoASH+ATPrt
7
C5[1 ~5O,5NS0J4 -4i NADIJ, W )+0.I4CoA 2.491-1,0 ADP~ [6. 46]
En cuanto a las ecuaciones diferenciales para las velocidades de produccin de cada
uno de los componentes del sistema, la nica que se ve modificada por el cambio efectuado
en la estequlometria es la expresin dada por la ecuacin [6.26], correspondiente a la
velocidad de consumo de amonio, quedando ahora de la siguiente forma:
dC = 18 (6 3 [6.47]
)2,75
de - /70,5 /03 ,5 - 491/6 486,4
El cambio en la estequometra ha sido realizado en los dos modelos que daban
mejores resultados, esto es para el MCC-3 y el MCC-4.
Al efectuar el ajuste en mltiple respuesta con este cambio y considerando las
cinticas planteadas para MCC-3, se obtienen los parmetros que aparecen en la Tabla 6.70,
donde puede observarse que los valores estadsticos superan los valores tericos de t de
Student y F de Fischer con un 95 % de confianza. Adems se obtienen valores de dichos
parmetros superiores a los obtenidos con la estequiometria anterior. En la Figura 6.68 se
muestra la reproduccin de los datos experimentales con el MCC-3, modificado para este
caso, observndose la clara mejora en la reproduccin de los datos experimentales si se
compara con lo observado anteriormente en la Figura 6.38.
Para el MCC-4, se obtienen resultados similares. En la Tabla 6.71 se muestran los
valores de los parmetros as como las estadsticas obtenidas del ajuste al modelo,
observndose que se superan en todos los casos los valores tericos de t de Student y de la F
de Fischer. En la Figura 6.69 se muestra la buena reproduccin de los datos experimentales
con el MCC-4 modificado en comparacin a lo observado, para este mismo modelo en la
Figura 6.45.
3 68
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.70.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n
0 2.
Condiciones experimentales: T=280 C, CN=65 p.p.m de amonio, N variable
(21 0 r.p.m. inicial), al MCC-3
Valores de los parmetros
t Student F Fischer
0,59 0,58 7,1 .1 02
243 0 0 , 158 0 , 155 7, 1. 10 ~
0,25 0,24 9,8.10~
0,05 0,049 7,3.1 0~
de Student ( 95% confianza) 2,080
E de Fischer ( 95% de confianza 2,49
8
SRC= 0,025
Figura 6.68.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3,
con cambio en laestequlometra de los componentes.
3 69
t(h)
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.71 .- Parmetros calculados por ajuste de los
Condiciones experimentales: 1=280 C, CN=S
(21 0 r.p.m. inicial), al MCC-4.
datos del experimento n
0 2.
p.p.m de amonio, N variable
Parmetro
Valores de los parmetros
t Student F Fiseber
Mx pt Mm
0,089 0,088 0,088 y , i . i o ~
443 0
0 , 0 14 0 , 0 13 0 . 0 12 5, 3 . l O ~
0 , 0 8 3 0 , 0 8 2 0 , 0 8 1 9 , 1. l 0 ~
0,052 0,052 0,052 8 , 5. l 0 ~
0 , 171 0 , 17 0 , 169 6, 2. l 0 ~
0 , 0 9 5 0 , 0 9 5 0 , 0 9 5 9 , 1. 1 o ~
0 . 0 13 0 , 0 13 0 . 0 13 6. 23 . 10 ~
de Student ( 9 5% confianzar 2,080
F de Fiseher ( 95%de confianza 2,49
SRC~ 0,01 2
o OtO ~
20
Figura 6.69.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento it 5 (28 ~Cy 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4
con cambio en la estequiometra de los componentes.
3 70
1 25
1 ,00
J
.4
Anunio
A RNA
y DNA
O Pruteina
non~a
.s u
0,75-~
030-
-4
1.
o
0,25-
0,00
0 0
30
t (h)
r
40
~~1
50 60
Modelo Cintico de Clula
eMejora del ajuste del experimento n
0 7 (28~ C y 475 p.p.m. de amonio inicial)
Como ya ha sido expuesto anteriormente, para el experimento realizado con una
concentracin inicial de amonio de 475 p.p.m., se obtenan valores estadsticos
significativamente buenos de los parmetros y una aceptable reproduccin de los datos
experimentales con los modelos MCC-3 y MCC-4, esto es, los que parece que mejor
describen el crecimiento de la bacteria. No obstante, si comparamos las reproducciones
obtenidas por ajuste a los citados modelos con las obtenidas para el resto de experimentos,
se puede observar que la reproduccin de los datos experimentales de este experimento es
significativamente peor.
Una explicacin a lo observado, podra ser el efecto txico del amonio para el
crecimiento del microorganismo a partir de cierta concentracin. En la literatura aparecen
referencias sobre el efecto txico de este compuesto en el crecimiento de microorganismos
(Cid y col., 1 996).
La inhibicin del crecimiento del microorganismo por la presencia de alguna
sustancia que puede ser sustrato o producto- en cierta cantidad, ha sido considerada por
muchos autores, pero la expresin ms comn de inhibicin por sustrato, es la propuesta por
Wayman y Tseng (1 976). Estos autores consideran que existe una concentracin crtica del
sustrato (Cs~), por debajo de la cual no produce inhibicin del crecimiento, empleando la
expresin:
dC~ _ p
14C5
ch Q :. 678 = [6. 48 ]
dC~ Fji_.c 1
tt LK-c? 8 k/ (C~ Csc))jCx :. C~ =C~ [6.49]
Para el caso concreto del experimento realizado a 475 p.p.m. se ha tomado el
trmino de inhibicin de la ecuacin [6.49] y se ha incluido en la expresin dada por la
ecuacin [6.30] correspondiente al trmino de aminocidos no formadores de bases, es decir
aquellos que formarn parte de las protenas, las cuales formarn parte a su vez de la propia
biomasa, quedando la expresin siguiente:
3 71
Modelo Cintico de Ctu/a
(p < ip~~~ )k
1 ~
67.-Vc ) [6.50]
tt
La concentracin de sustrato nitrogenado crtica (CNG), no se conoce en este caso,
pero para comprobar este efecto inhibitorio se ha supuesto que este valor es de 350 p.p.m
de amonio.
Se ha realizado el ajuste de los datos experimentales con el modelo MCC-3 teniendo
en cuenta esta modificacin. Los parmetros obtenidos se muestran en la Tabla 6.72, donde
se observa, adems, el valor del nuevo parmetro considerado. k
1 que es la constante de
inhibicin por amonio. Los valores estadsticos de los parmetros superan los valores
tericos de t de Student y F de Fischer. En la Figura 6,70 se muestra la reproduccin de las
velocidades de los componentes del sistema. Si se compara con la Figura 6.40,
correspondiente al ajuste de este mismo experimento con el MCCI, se observa la clara
mejora obtenida al considerar el trmino de inhibicin.
Para el ajuste con el modelo MCC-4, los valores de los parmetros obtenidos se
muestran en la Tabla 6.73, Los valores estadsticos de los parmetros superan los tericos
de la t de Student y de la E de Fisclier. La Figura 6.71 muestra de nuevo la clara mejora en
la reproduccin de los datos experimentales al incluir el trmino de inhibicin por sustrato,
al comparar con la Figura 6.47 correspondiente al ajuste realizado con este mismo modelo
(MCC-4) sin considerar la inhibicin por sustrato. Adems se consigue un significativo
descenso del valor de SRC.
La tendencia de los nuevos parmetros obtenidos al considerar el trmino de
inhibicin en fimcin de la variable concentracin de amonio inicial se muestran en las
Figuras 6.64 y 6.65, donde aparece representado este valor indicado por un punto. Ambas
Figuras corresponden a la tendencia de los parmetros obtenidos por ajuste de los
experimentos realizados con diferentes concentraciones iniciales de amonio, al MCC-3 y al
IvICC-4, y como se puede comprobar, dicha tendencia no cambia cuando se incluye este
nuevo trmino al modelo para el experimento realizado con 475 p.p.m..
3 72
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.72.- Parmetros calculados por ajuste de los datos
Condiciones experimentales: T28
0 C, C,e475
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3 con
del experimento n0 7.
p.p.n de amonio, N
trmino de Inhibicin.
Parmetro
Valores de los parametros
t Student F Fiseher
Mix pt Mm
0,53 0,52 0,51 2,1 .1 0~
4635,3
0,1 54 0,1 5 0,1 47 8,2.1 0~
0,22 0,19 0,16 5,2.102
0,055 0,05 0,045 9,3.102
0,081 0,08 0,079
de Student ( 95% confianza 2,080
E de Fischer ( 95% de confianza 2,49
1 ,75
1 ,50
1,25
1~
u
1 ,00
0,75
0,50
0,25
0,00
SRC=0,05
50
obtenidos por ajuste del
inicial) al modelo MCC4,
3 73
t (b)
Figura 6.70.- Evoluciones de los componentes del sistema
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio
con trmino de inhibicin.
Modelo Cintico de Clula
Tabla 6.73.- Parmetros calculados por ajuste de los datos
Condiciones experimentales: T28
0 C, CN475
variable (21 0 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4 con
d e l experimento n0 7.
p.p.m de amonio, N=
trmino de inhibicin.
Parmetro
Valores de los parametros
t Student F Fiseher
Mx pt Mm
0,1 22 0,1 21 0,1 2 5,.104
5 63 5 ,3
K
1 0 , 10 2 0 , 10 1 0,1 0 7,1 .1 0~
0,022 0,020 0,01 8 3 ,1 .l0~
0,045 0 . 0 45 0,045 5 ,2.l0~
0 , 0 8 0 , 0 8 0 , 0 8 9,2.1 0~
0,082 0,078 0,074 3 ,1 .l0~
- 0,05 - 9,23 .l0~
0,067 0,067 0 , 0 67 9,5io~
de Student ( 95%conflanzat 2,93
E de Eischer ( 95%de confianza 2,54
1 .75
1 ,50
1 ,25
o
u
1 ,00
0,75
0.50
0,25
0,00
SRC=0,042
50
obtenidos por ajuste del
inicial) al modelo MCC4,
t (h )
Figura 6.71.- Evoluciones de los componentes del sistema
experimento n
0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio
con trmino de inhibicin.
3 74
Modelo Cinticode Clula
A lo largo de este captulo se ha ido desarrollando el planteamiento y ajuste a datos
experimentales de un Modelo Cintico de Clula para la descripcin del crecimiento del
microorganismo objeto de estudio, esto es la bacteria Xanthomonas campestris. De la
aplicacin de toda la metodologa desarrollada en este captulo, se ha llegado a dos modelos
que son capaces de describir adecuadamente el crecimiento del microorganismo, no
observndose, en principio, diferencias significativas entre ambos.
Se va ahora a unir este modelo de clula, con la parte correspondiente a la produccin
del polisacrido. Concretamente se ha elegido el MCC-3 para realizar la ltima etapa de este
trabajo de investigacin. De acuerdo a los criterios de discriminacin indicados anteriormente.
Es necesario ahora unir este modelo de clula -el cual permite predecir cambios en la
composicin del medio considerando el metabolismo del nitrgeno estructurado en la
biomasa (DNA, RNA y protenas)- con el modelo cintico metablico, el cual aport
resultados muy buenos para la parte correspondiente a produccin del polisacrido, tal como
se vi en el Captulo 5 de la presente Memoria.
Por tanto, en el prximo Captulo se abordar el planteamiento de un modelo
Qumicamente Estructurado para la Produccin de Xantano, el cual ser realizado como
suma de los dos modelos comentados: el Modelo Cintico de Clula y el Modelo Cintico
Metablico.
3 75
7.- MODELO CINrico
QUMICAMENTE ESTRUCTURADO
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
7.- MODELO CINTICO QUMICAMENTE ESTRUCTURADO
Los Modelos Qumicamente Estructurados describen el metabolismo como una red de
reacciones, empleando para ello esquemas simplificados de reaccin, de la misma manera que
en los modelos metablicos y en los modelos de clula ya descritos anteriormente.
Un modelo de este tipo se puede plantear mediante la unin de modelos metablicos
en los que se describe la produccin de un producto de inters considerando estructuracin del
sustrato carbonado, dentro de la red simplificada de rutas metablicas-, con modelos cinticos
de clula- que describen el crecimiento del microorganismo considerando la estructuracin del
sustrato nitrogenado, dentro de la red simplificada del metabolismo del microorganismo
productor-.
Los modelos ms complejos vistos hasta ahora han sido los modelos de clula, con los
que poda realizarse una buena descripcin del crecimiento del microorganismo teniendo en
cuenta la evolucin de una serie de componentes intracelulares que constituyen la biomasa del
mismo. En la literatura existe escasa informacin sobre este tipo de modelos, solo se han
realizado intentos por describir el crecimiento utilizando estos modelos sobre sistemas muy
conocidos como Escherichia coli o Bacillus subtillis y, en ningn caso, sobre
microorganismos de inters industrial.
3 77
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Por esta razn, es necesaria la propuesta de los modelos qumicamente estructurados, es
decir, que consideren por un lado los principios del modelo de clula, pero adems los del
modelo metablico tratando de hacer posible la descripcin de una produccin de inters
industrial y. con ello, utilizar la informacin en el cambio de escala del proceso.
A pesar de las grandes ventajas que pueden ofrecer los modelos qumicamente
estructurados, no existe en la literatura ningn precedente en la lnea indicada. La modelizacin
ms compleja vista hasta ahora se ha quedado al nivel de modelos de clula, donde tampoco
existen muchos trabajos. y donde se realiza nicamente, como ya se ha comentado, la
estimacin de parmetros sin ajuste de datos experimentales.
En el captulo 5 de la presente memoria se aplic un modelo cintico metablico para
la descripcin de la produccin de xantano. En este modelo se estructur el metabolismo del
sustrato carbonado, sin diferenciar partes de la biomasa, ya que sta era descrita mediante la
ecuacin logstica, es decir, se consideraba no estructurada. Como ya fue comentado, los
resultados obtenidos con este modelo fueron significativamente buenos para la descripcin de
los componentes del sistema, como xantano, fuente carbonada (sacarosa) y oxigeno disuelto.
Adems se plante un modelo en funcin de una de las variables estudiada, esto es [a
temperatura. Las ecuaciones para las velocidades de produccin, las ecuaciones cinticas para
este modelo, junto con el valor de los parmetros obtenidos se muestran en la Tabla 7.1 .
Por otro lado, en el captulo anterior se plante un modelo ms complejo para el
crecimiento del microorganismo, dado que su descripcin haba sido realizada hasta ahora solo
de forma no estructurada. Se trata ahora de estructurar el metabolismo del sustrato nitrogenado
para la descripcin de la parte correspondiente al crecimiento del microorganismo, unindolo,
en este caso, con el metabolismo correspondiente a a produccin. Del planteamiento y
posterior aplicacin del modelo cintico de clula, se obtuvo un modelo cuyos parmetros
pudieron ser puestos en funcin de la variable temperatura, pero adems no variaban con
relacin al nitrgeno inicial puesto en el experimento; con lo que este modelo permite la
prediccin de cambios en el sistema frente a cambios en la composicin del medio de cultivo,
algo sin precedentes en la literatura, como ya se ha explicado. Las velocidades de produccin
de los componentes del sistema junto con las ecuaciones cinticas de este modelo cintico
vienen dadas por las ecuaciones de la Tabla 7.2.
3 78
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Tabla 7.1. Ecuaciones correspondientes al Modelo Cintico Metablico planteado para la
descripcin de la produccin de xantano.
MODELO CINTICO METABLICO
Para la biomasa:
dC~ ~ ~
di
Cx
+
[7.!]
4.
Velocidades
de
Produccin
Ecuaciones
Cinticas
Para el azcar:
1C~
di
5,94 dCp
~180L 923 ,2 di
1 <j
1 2 K
4C0,
Cx ji 3.5818
1 dC~
Yv~ d~
Para el producto:
dC1 . 923 ,2
di +
1 + 4 L~
8+4
7A 7? !
<(7 ) 1 094- (7 -1 9,45 )1 1 - exp< l,3 99 . IT - 3 4,24))1 1 2 [7.1 0]
Parmetros
< (7) = 2,91 3+ 2,0487 [7.1 1 ]
con la {0597~ < 7 -24,3 5)1! - expi0,205 (7 - 3 7,16)fl [7.1 21
Temperatura = L340+ (6 ,/ . 1 0)T [7.1 3]
Para la evolucin de oxigeno disuelto:
dr
923 ,2 di +
l~
+ Co
2
1 k4C0,
r 12 K,, + C0,
y y
rp
E $~
~y +I< LCIV .(cc0,)~ 1
>ox
Cx
C 1
Y u NN
l+4Y;p j
Y
3 ~~8~4 4 7 P)
C
ti 3 ,581 1 + 4 Yrp
A ~3 ,58+ 4 ~ Li TPP
Co,
+
Li TPP~3 4
ji
[7.2]
[731
dCx
di
[7 .4 ]
[7.5 ]
[7 .6]
[7 .7 ]
[7.8]
[7 .9]
3 79
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Tabla 7.2. Ecuaciones correspondientes al Modelo Cintico Metablico planteado para la
descripcin de la produccin de xantano.
MODELO CINTICO de C L ULA
Velocidades
de
Produccin
Pa ra La bioma sa :
RNA
DNA
Protenas intracelulares
dCA. RNA dCD4tA
+ +
di tt <It tt
di
dc/~j4.\ ,.j
=y.
dr
dCPPJ=y
1 ~ dC~~
tt di
Pa ra el a monio:
dC~~4 . =1 81 1 ,4 1$ 1 2
dt 13 6,5 1 0 3 ,5
,..,
2 7 5 ~)
4 7 8,6 4 91 ,;
Ecuaciones
Cinticas
Parmetros
con la
Temperatura
C.C
=<3 C,~
r3 =Ic~ C~ C<
=k2 CN
k~(T) 1 ,4 90 ,0 3 67
kg 1 ) = 0 ,1 50
k~(T)=0 .1 98
k,(7 7 ) = ( 0 ,0 4 1 iT - 21)/I - ev xp(O,3 52 (T- 3 50 8)4 <
[7.14]
[7.1 5]
[7.16]
[7.1 7]
[7.1 8]
[7 .1 9]
[7.20]
[7.21]
[7.22]
[7.23]
[7.24]
[7.25]
[7.26]
3 80
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
7.1 .- PLANTEAMIENTO DEL MODELO
Se trata ahora de plantear un Modelo Qumicamente Estructurado (MQE) que, como ya
se ha indicado, se va hacer como suma de un modelo cintico metablico y de un modelo
cintico de clula.
Se realizar, por tanto, la unin de los dos modelos de este tipo que ya han sido
aplicados en el presente trabajo. Al unir ambos modelos, la parte correspondiente a biomasa del
modelo metablico (ecuacin [7.1 ]) queda ahora desglosada en las expresiones del modelo
cintico de clula (ecuaciones [7.1 4] a [7.1 7]). Adems, es necesario cambiar el trmino
correspondiente al rendimiento de azcar en biomasa(Yxs) de la ecuacin [7.2], que debe ser
ahora desglosado en los trminos correspondientes al azcar que va a parar a biomasa, de
acuerdo a las relaciones estequiomtricas entre el azcar y los componentes del sistema, vistas
en el captulo anterior (ecuaciones [6.1 5] a [6.1 9]), los cambios se destacan en negrita:
dC
8 5,94 dCl, 1 kjC0 [ (1 + ~
dr 1 80 < 92 3 ,2 dr 1 2 Ki+ C0 , . Cx .[I~3 .58j3 s8+ ~. Y,~JJJ
0 ,93 3 < ,> 0,5< )-.- 1,08< ) J,12.( [7.27]
13 6,5 103 ,5 491,87 486,7
De esta forma, el modelo qumicamente estructurado propuesto para la produccin de
xantano consta de 7 respuestas: las correspondientes a la biomasa, es decir, DNA, RNA,
protenas intracelulares, la correspondiente al nitrgeno y las de la parte de produccin, es decir
xantano, sustrato carbonado y oxgeno disuelto. Incorporando las ecuaciones cinticas
propuestas en anteriores captulos, el modelo propuesto consta de 1 8 parmetros, tal como ha
sido indicado en las tablas anteriores.
En este caso, no se va a realizar el clculo de los parmetros por ajuste de datos
experimentales debido a que este modelo cintico es, en realidad, la suma de los dos
modelos citados, cuyos valores de parmetros ya haban sido obtenidos por ajuste de datos
experimentales. Por otro lado, el abordaje matemtico de un modelo de este tipo, con tan
elevado nmero de parmetros, sera muy complejo.
3 81
;Vfodelo Cintico Oi hnicamenre Esuz cturado
Por tanto, se van a emplear los parmetros obtenidos de cada uno de los modelos,
con el fin de observar si el Modelo Cintico Qumicamente Estructurado planteado es capaz
de reproducir los resultados experimentales de cada uno de los experimentos llevados a cabo
en este trabajo. En la Tabla 7.3 aparecen las ecuaciones con el valor de los parmetros del
modelo en funcin de la temperatura.
Tabla 7.3.- Valor de los parmetros en funcin de la temperatura empleados
Qumicamente Estructurado.
para el Modelo
kIT,) 0,94 (T -19,45) [1- exp(1 ,3 99 < T -3 4,24 j}2 [7.28]
kYT} = 2,9 13 + 2,048 T [7.29]
y
0~ IYD = 0,597. iT -24,3 5)11- exp< 0 205 < 7 - 3 7,16)< [7.30]
Y,\% (T) = 0,3 404(6,1 10
3 )T [7.31]
Ic~(T) = 1,49 0,03 67 [7.32]
kjT) = 0,150 [7.33]
< (7 ) = 0,198 [7.34]
k,(T)={ 0 ,0 4 1 (T- 2 1 )fI- exp(0 .3 52 (T- 3 S,O8))] [7.35]
3 82
Modelo Cintico Quimicamente Estructurado
7.2.- APLICACION DEL MODELO CON DATOS EXPERIMENTALES
Para aplicar este modelo, se ha realizado la reproduccin de los datos experimento a
experimento, empleando los parmetros indicados, y se han comparado tanto con los
resultados experimentales como con a reproduccin obtenida por el modelo metablico,
con el fin de observar qu mejoras puede aportar el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado.
En las Figuras 7. 1 y 7.2 se muestran los resultados de las reproducciones con ambos
modelos para el experimento u
0 1 , llevado a cabo a 250 C y con 257 p.p.m. de amonio
inicial. En la Figura 7.1 se comparan estos resultados para la evolucin de la biomasa y de
amonio. Se puede apreciar que el MQE (lnea continua) predice una concentracin de
biomasa en la fase estacionaria algo inferior a la obtenida con el MMET. Adems, se
observa la clara mejoria que introduce el MQE en la reproduccin de la evolucin de
amonio. En la Figura 7.2 aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de
formacin de xantano, de consumo de azcar y evolucin de oxgeno disuelto. En la citada
figura se puede ver que el MQE predice una concentracin de xantano inferior a la que
predice el MMET, con lo que se explica la menor velocidad de consumo de azcar y
oxgeno con este modelo en comparacin con el modelo metablico. Estas diferencias son
seguramente debidas a la inferior cantidad de biomasa que predice el MQE.
En las Figuras 7.3 y 7.4 se muestran estos mismos resultados para el experimento
u0 2, realizado a 280 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.3 se observa
que MQE (lnea continua), de nuevo, predice una concentracin de biomasa en la fase
estacionaria de crecimiento algo inferior a la obtenida con el MMET, no siendo as durante
la fase exponencial. Adems se observa la mejor reproduccin de la evolucin de amonio
introducida por el MQE. En la Figura 7.4 aparece la reproduccin con ambos modelos de la
velocidad de formacin de xantano, de consumo de azcar y la evolucin de oxgeno
disuelto. El MQE predice tambin en este caso una concentracin de xantano ms baja que
la que se obtiene con el MIPvIIET y, en consecuencia, una menor velocidad de consumo de
azcar y oxgeno.
3 83
Modelo Cintico Quiniicamente Estructurado
Las Figuras 7.5 y 7.6 muestran las reproducciones de los datos experimentales obtenidas
con ambos modelos comentados, para el experimento n
0 3. llevado a cabo a 3I~ C y con
257 p.p.m. de amonio inicial. Los resultados obtenidos para la biomasa y la evolucin de
amonio aparecen en la Figura 7.5. En este caso las diferencias entre ambas velocidades de
formacin de biomasa no son muy significativas, si bien es ligeramente mayor la
concentracin de la biomasa que predice el MMET. Adems, se observa la clara mejora
que introduce el MQE en la reproduccin de la evolucin de amonio. En la Figura 7.6
aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de formacin de xantano, de
consumo de azcar y evolucin de oxigeno disuelto. En la citada figura se puede ver que la
evolucin de los componentes citados es muy similar, siendo ligeramente inferior la
velocidad de formacin de xantano en el MQE.
En las Figuras 7.7 y 7.8 se muestran estos mismos resultados con el experimento n0
4, llevado a cabo a 3 40 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.7 se puede
ver que no hay diferencias significativas en la evolucin de biomasa que predicen ambos
modelos; sin embargo, hay cierta diferencia, como se ha ido viendo, en la reproduccin de
la evolucin de amonio introducida por el MQE. En la Figura 7.8 aparece La reproduccin
con ambos modelos de la velocidad de formacin de xantano, de consumo de azcar y la
evolucin de oxgeno disuelto. Se puede apreciar que apenas hay diferencias en la evolucin
de estos componentes en los dos modelos que se estn comparando.
En las Figuras 7.9 y 7.1 0 se muestran las reproducciones de los datos experimentales
para el experimento n0 5, realizado a 280 C y con 65 p.p.m. de amonio inicial. Hay que
destacar que, en este caso, se emplea el cambio de estcquiometra para el amonio (ecuacin
[6.47]), que ya fue visto en el capitulo anterior. En la Figura 7.9 se observa que la biomasa
obtenida con el MQE es significativamente menor que la obtenida con e] MMET. En la
Figura 7.1 0 aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de formacin de
xantano, de consumo de azcar yla evolucin de oxigeno disuelto, observndose que
tambin la produccin de xantano es menor en el caso del MQE que en el MMET, lo que de
nuevo parece relacionado con la infraestmacin de biomasa.
3 84
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
En las Figuras 7.1 1 y 7.1 2 se muestran las reproducciones de los datos
experimentales para el experimento o 6, llevado a cabo a 280 C y con 1 30 p.p.ni. de
amonio inicial. En la Figura 7.1 1 se observa que apenas hay diferencia entre la evolucin
de biomasa obtenida por el MQE y la obtenida con el MMiET, si bien, en este caso, la
concentracin de biomasa en la fase estacionaria de crecimiento obtenida con el MQE es
mayor que con el modelo metablico. En la Figura 7.1 2 aparece la reproduccin con ambos
modelos de la velocidad de formacin de xantano, de consumo de azcar y la evolucin de
oxgeno disuelto, observndose que no hay diferencias destacables.
En las Figuras 7.1 3 y 7.1 4 se muestran estos mismos resultados para el
experimento n
0 7, llevado a cabo a 280 C y con 475 p.p.m. de amonio inicial. En este
caso, el ajuste es realizado con el MCC-3 modificado, es decir, el que tiene en cuenta el
trmino de inhibicin del crecimiento con esta concentracin de sustrato nitrogenado. En la
Figura 7.1 3 se observa que MQE (lnea continua) predice una concentracin de biomasa en
la fase estacionaria de crecimiento algo inferior a la obtenida con el MMIET. Adems se
observa, de nuevo, la mejor reproduccin de la evolucin de amonio con el MQE. En la
Figura 7.1 4 se ha representado la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de
formacin de xantano, de consumo de azcar y la evolucin de oxgeno disuelto. El MQE
predice tambin en este caso una concentracin de xantano ms baja a la que se obtiene con
el MJvIET y, en consecuencia, una menor velocidad de consumo de azcar y oxgeno.
Si bien las diferencias en las reproducciones de los datos de cada uno de los
experimentos no son muy significativas, se observa que el modelo qumicamente
estructurado predice, salvo en el experimento n0 6, una menor concentracin del
polisacrido. Esto parece ser debido a que la biomasa que predice el MQE es tambin
inferior a la que predice el MIEMy a la obtenida experimentalmente. Como ya se ha visto, la
curva de evolucin de biomasa obtenida con el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado es, en casi todos los experimentos, inferior a la obtenida con el Modelo
Cintico Metablico. Esta pequefla diferencia en la biomasa es la que provoca, por tanto, la
diferencia en la prediccin de algunos otros componentes (xantano y azcar) en la parte
correspondiente a la produccin.
3 85
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
Figura 7.1-
.4
ti.
=9
5
Figura 7.2-
1 ,0
0,5
Ox)
60
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
25
2.0
1 5
1 .0 t
05
0~O
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado (lnea continua).
t(h)
40
O lO 20 30 40 50 60
(h)
3 86
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
~0
5
.4
=9
z
u
Figura 7.3-
(5.
a
0,6
0,4
0,2
0,0
60
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 2 (28 0C y 257 p.p.ni. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
2,5
2,0
o
lo ~
u
0 ,5
0,0
t (h)
Figura 7.4.-
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 2 (28 0C y 257 p.p.ni. de amonio
inicial) entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo
Cintico Qumicamente Estructurado (lnea continua).
1 ,2
1,0
0
30
t (h )
0 10 20 30 40 50 60
3 87
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
9
=9
u
=9
u
Figura 7.5-
-4
(1
-4
=9
5
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio de]
experimento n
0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
2,5
2,0
x
1 ,0
u
0,5
0,0
03
Figura 7.6.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Quimicamente Estructurado (lnea continua).
3 88
t(b)
45
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
1 ,5
0,5
O.
Figura 7.7-
(5-
5
Figura 7.8.-
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n~ 4 (34
0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
2,5
2,0
I,5~
t.
lo
1
0,5
0,0
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.ni. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado (lnea continua).
3 89
5
.4
=9
5
O lO 20 30 40
t(h)
t (h)
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.0
.5
O
5
u
1.0
0.5
0.0
o I0
20 30
40 50 60
t (h )
Figura 7.9.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 6 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
(5-
u
2,5
z0
5;
t
toQ =
cts
Q O
Figura 7.1 0.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 5 (28 0C y 65 p.p.n. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado (lnea continua).
390

c~

I~ U u
a
tu e
t (h)
Modelo Cintico Qum icam ente E structurado
2,0
1.5
5
=9
6<
1,0
0.5
0,0
60
Figura 7.1 1 .- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 6 (28 0C y 1 30 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
(5.
.4
=9
u
2,5
2,0
1 ,5
o
u
1 ,0
0,5
0,0
Figura 7.1 2.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 6 (28 0C y 1 30 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (linea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado (lneacontinua).
t(h)
t(h)
391
2,0
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado

5
.4
4
u
Figura 7.13-
40
35
30
4
rs
25
20
I5
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 7 (28 0C y 475 p.p.ni. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico ([inea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado <lnea continua).
lo.
O
2,5
24
E5
o
CF
cts
00
Figura 7.1 4.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 7 (28 oc y 475 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado (lnea continua).
0 lO 20 30 40
t (h )
O lO 20 30 40 50
L (h>
3 92
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
7.2.1. Meiora del Modelo Qumicamente Estructurado
En vista de los resultados obtenidos con el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado, se puede concluir que los resultados obtenidos son, como caba esperar muy
semejantes a los obtenidos con el Modelo Cintico Metablico. No obstante, en todos los
experimentos con la excepcin del experimento realizado a 1 30 p.p.m, se observa que el
? vIQE predice una concentracin de biomasa algo inferior a la experimental, y tambin
inferior a la que predice el modelo metablico. Esta diferencia en la biomasa se refleja en la
evolucin de xantano y azcar, de forma que la concentracin de xantano tambin es
inferior en el MQE y por tanto tambin es menor el consumo de azcar y de oxgeno
disuelto.
La diferencia de la concentracin de biomasa con el MQE respecto a la experimental
ya fue observada en el capitulo anterior. Esto puede ser debido a que este modelo considera
la biomasa como la suma de tres componentes intracelulares, es decir la suma de la
concentracin de DNA, de RNA y de protena intracelular en cada momento de la
fermentacin, y puede ser que haya otro componente que tenga un peso apreciable en dicha
biomasa.
Puede ser que el microorganismo, segn las condiciones en las que se realice el
proceso. acumule otro compuesto intracelularmente, probablemente hidratos de carbono, los
cuales no han sido analizados experimentalmente. De esta forma, segn Las condiciones a
las que se haya realizado la fermentacin, la diferencia entre la biomasa terica (suma de
DNA, RNA y protenas intracelulares) y la experimental puede ser mayor o menor.
Por ello, se ha pensado en realizar ajustes con el Modelo Qumicamente Estructurado
de los datos experimentales, incluyendo un nuevo trmino en la ecuacin correspondiente a
la evolucin de biomasa, que corresponder al componente intracelular que se acumula
(hidratos de carbono), en la ecuacin correspondiente a biomasa. As la velocidad de
produccin de biomasa viene dada ahora de la siguiente forma:
cIC~ dCP~PJA +dCDNA +dCppj Q% ~. [7.36]
dt dt dt tt +kHc
393
VIoc/ele Cintico Qumicamente Estructurado
Ya se ha comentado la gran dificultad, desde un punto de vista matemtico, de realizar
ajustes en mltiple respuesta con un modelo con un nmero tan elevado de parmetros. Por
ello, los ajustes han sido realizados fijando el valor de los parmetros ya calculados de la forma
explicada, y dejando flotar nicamente este parmetro correspondiente a hidratos de carbono
(kHc).
En la Tabla 7.4 se muestran los valores obtenidos del parmetro kHc por ajuste en
mltiple respuesta con el modelo MQE para cada uno de los experimentos realizados en este
trabajo.
Tabla 7.4.- Valor del parmetro kuc obtenido por ajuste del MQE a los datos de los
experimentos llevados a cabo en este trabajo. ________________
Panmetro t Student
Experimento Max. Opt. Mm Obt. Teor
4.2. 0
4 T o TTif5,1 .i0~ 2.9
2 3 0 2 .1 0 3 .01 1 0 Tbi0t5IO~ 2,92
3 1 .5 1 .1 0
771 71 01
TIbio 1 ,49.1 0~ 4.2.1 O~ 2.73
4 l,52.Iff ?,51.lO~ 6,1.10 3 .2 5
5 2,7.I0~ 2,71 .1 0 2,71 .1 0 5,1 W 2,70
6 2,8.1 0~ 2,8.1 0~ 2,8.1 0~ 7,2.1 0~ 2,92
7 3.21 .1 0 3.2.1 0 3 ,1 9.1 0 2.2.1 0~ 2,9
En las Figuras 7.1 5 a 7.28 se muestran los resultados obtenidos de la reproduccin
de los datos experimentales con el Modelo Qumicamente Estructurado teniendo en cuenta
el trmino de hidratos de carbono en la evolucin de biomasa. Al igual que en el caso
anterior, se muestran los resultados obtenidos con este modelo, indicados con lnea
continua, y su comparacin con el modelo cintico metablico, indicado por lnea
discontinua. Como puede observarse en las citadas figuras se obtiene una si~flcativa
mejora en la reproduccin de los datos experimentales, especialmente en aquellos
experimentos donde la diferencia entre la biomasa terica y la experimental era ms
significativa.
Por tanto, se concluye que al incluir el trmino de hidratos de carbono como otro
componente ms de la biomasa se mejora significativamente la reproduccin de los datos
experimentales con el Modelo Qumicamente Estructurado.
3 94
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2,0
1,5
u
-4
=9
6<
1 ,0
0,5
0,0
60
t (h )
Figura 7.15-
(3 .
4
.59
u
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 1 (25 C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
2.5
2.0
1.5;
t.
1 .0 .s
0.5
0.0
O lO 20 30 40 50 60
t (ti)
Figura 7.1 6.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el termino de hidratos de carbono (lnea
continua).
r
O lO 20 30 40 50
395
Viodelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.0
y
5
.4
Figura 7.17-
LO
0,5
0.0
60
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 2 (28 0C y 257 p.p.mn. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
(5.
=9
cf
2,5
2,0
1<
o
IOy
0,5
0,0
tQ,)
Figura 7.1 8.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 2 (28 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
t(h)
0 lO 20 30 40 50 60
3 96
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
5
.4
.59
.5
40
Figura 7.1 9- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
1
4
.59
u
2,5
2,0
l,5
o
CF
0,5
0,0
40
t(ti)
Figura 7.20.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.n. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
O lO 20 30
t (h )
-y-
0 1 0 20 30
3 97
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.5
5
.59
.4
0,5
0.0
ci.
.4
.59
u
2.5
2,0
I,59
o
4
1 ,0 ~
u
0,5
0,0
Figura 7.22.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n
0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
398
2,0
t (l )
Figura 7.21- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
(lii
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
30
T
40 50 60
Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 5 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado conel trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
4Q4
30-
u
20
J
lO-,
o
1 > 10 20 30 40 50
2,5
2 ,0
LS;
ao
60
jo,)
Figura 7.24. - Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 5 (28 C y 65 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
2,5
2.0-
.5
1 .0-
u
0.0

- r~4f~.~ .- n9mp mp 3
o lo 20
Figura 7.23-
a;;
a ;,
4 u 4
4
u.
U

u
4 4 5
4
4 AA
.. e
0
a
A
nfl..-& .A........A-- - -
399
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
lo
20 30
t(h)
40 50
Figura 7.25- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 6 (28 0C y 1 30 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
40
35
(Y
-4
=9
cf
30
25
20
5.
lo
5
2 ,5
2,0
1,5
o
u
0,5
0 0,0
0 10 20 30 40 50 60
Figura 7.26.- Comparacin de la reproducciv~tle la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
2,5
2.0
cf
tt
=9
6<
1 ,0
u

U.U
-< l
0.SJ
0,0
1~
o
60
4 0 0
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
5
=9
6<
Figura 7.27- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n
0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado conel tnnino de hidratos de carbono (lnea continua).
2,5
2,0
ti
(Y
u
A
0
A.
0
AA A
-r Q O
0 10 20 30 40 50 60
o,)
Figura 7.28.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontnua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
2.5
O lO 20 30 40
t(h)
401
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
En vista de la importante mejora en los resultados al incluir el componente de
hidratos de carbono en el modelo, es necesario ahora observar si el parmetro
correspondiente a este componente tiene tendencia con las variables, para llegar de esta
manera a un Modelo Qumicamente Estructurado definitivo.
En la Figura 7.29, se muestra la tendencia del parmetro kHc con la temperatura
(lnea continua); la lnea discontinua indica la forma de la curva (funcin) a la que podra
ser ajustada la evolucin de este parmetro, esto es una funcin lineal descendente.
En la Figura 730 aparece representada la evolucin del parmetro kHc con respecto a
la concentracin inicial de amonio. Como se puede apreciar, se puede asumir, que la
tendencia es a un valor ms o menos constante, como indica la lnea discontinua.
Por tanto, el Modelo Qumicamente Estructurado viene dado por las ecuaciones
[7.15] a [7.1 7] para DNA, RNA, protenas intracelulares, respectivamente. Para la parte
correspondiente a la produccin, las ecuaciones [7.2] a [7.4] expresan la evolucin de
sacarosa, xantano y oxgeno disuelto. Finalmente la biomasa vendr dada por la ecuacin
[7.35~, donde, a su vez, el parmetro kHc viene, en funcin de la temperatura, por la
siguiente ecuacin:
kuc(T) ~ [7. 3 6]
402
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
5
4
o
3
1
o
24
Tenperaura
7. 29 . - Variacin del parmetro kHc del
Estructurado con la Temperatura.
3
c
o
z
1
2
It
O
loo 200
300
Modelo Cintico Qumicamente
400 500
S(Ppm)
7. 3 0 . - Variacin del parmetro kHc del Modelo
Estructurado con la concentracin inicial de amonio.
Cintico Qumicamente
1
e--Kl.
u
Figura
1 1
26 28 30 32 34
u
u
e
-J
Figura
403
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
7.3.- SIMULACIN CON EL MODELO CINTICO QUMICAMENTE
ESTRUCTURADO
Una vez planteado el modelo MQE definitivo, con los valores de los parmetros en
funcin de la temperatura, se puede emplear para realizar simulacin de distintas
operaciones. Como ya se ha comentado a lo largo de esta Memoria, las simulaciones
permiten estudiar la influencia de ciertos factores sobre el sistema considerado sin
necesidad de realizar la experimentacin oportuna para ello.
La forma ms adecuada de realizar simulaciones es teniendo en cuenta la influencia
de las variables en los parmetros del modelo cintico planteado. Esto ha sido posible para
los experimentos realizados a diferentes temperaturas. Para los experimentos llevados a
cabo con diferentes concentraciones iniciales de nitrgeno, no fue necesario tal
planteamiento, pues presentaban una tendencia constante con la concentracin de nitrgeno
inicial, debido a que las expresiones de las ecuaciones cinticas ya incluyen el trmino de la
concentracin de nitrgeno en dichas ecuaciones.
Esto ltimo no haba sido conseguido hasta ahora, es decir, ni con el modelo cintico
no estructurado ni con el modelo cintico metablico se pudo obtener relacin de
parmetros con la variable concentracin inicial de amonio. La razn de ello es que el
sustrato nitrogenado era abordado, en ambos casos, de forma no estructurada, por lo que
estos modelos no eran capaces de predecir la influencia de cambios en la composicin del
medio, como, por ejemplo, de la concentracin inicial de amonio sobre la produccin del
polisacrido.
El modelo qumicamente estructurado es capaz de predecir lo mismo que se haba
visto para el modelo cintico metablico (ver captulo 5 de esta Memoria), pero introduce la
posibilidad de predecir la influencia de cambios en la composicin del medio, en la
produccin de xantano, aspecto sin precedente alguno. Por ello, nicamente se presenta en
este capitulo la principal mejora en la prediccin que introduce el Modelo Qumicamente
Estructurado planteado.
404
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
Se han realizado, por tanto, simulaciones variando la composicin del medio,
concretamente en lo que respecta a la concentracin de nitrgeno inicial. Han sido probadas
4 concentraciones iniciales: 70 p.p.m., 200 p.p.m., 250 p.p.m y 350 p.p.m., no se han
realizado simulaciones con concentraciones ms elevadas debido al posible efecto
inhibitorio de amonio a partir de cierta concentracin crtica, que se ha estimado en el
mayor de los valores anteriores.
En la Figura 7.31 se muestra la evolucin de la biomasa y de amonio con las
diferentes concentraciones iniciales de amonio. Se observa que cuanto mayor es la
concentracin de amonio mayor es la concentracin de biomasa alcanzada, y que, por tanto
la concentracin de sustrato nitrogenado influye notablemente en la velocidad de formacin
de biomasa.
Aunque solo se muestra la evolucin de biomasa, no hay que olvidar que sta es, en
realidad, la suma de componentes intracelulares: DNA, RNA, protenas intracelulares e
hidratos de carbono, cuyas evoluciones con el tiempo de fermentacin pueden ser predichas
con este modelo.
La Figura 7.32 muestra la influencia de la concentracin inicial de amonio en la
produccin del polisacrido y en el consumo de azcar. Se observa que existe un mximo en
la produccin, de forma que la concentracin en la que la velocidad de formacin de
xantano es mayor es con la concentracin de 200 p.p.m, con concentraciones superiores o
inferiores a sta la velocidad de produccin del polisacrido es menor. Es decir, el modelo
qumicamente estructurado permite predecir un mximo en la produccin del polisacrido
dependiendo de la concentracin inicial de amonio, aspecto observado experimentalmente.
En la Figura 7.33 se muestra la evolucin de oxgeno disuelto para estas mismas
condiciones. Como ya se ha visto, la concentracin de oxgeno disuelto en cada momento
est fndamentalmente relacionada con la concentracin del polisacrido, esto es, cuanto
mayor sea la concentracin de xantano, mayor ser la viscosidad y, como consecuencia,
menor la velocidad de transporte y concentracin de oxgeno disuelto.
405
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
2.5
2,
4
4
=9
4
1,5
o
0,5
o.,
Simulacin con el modelo MQE
concentracin inicial de amonio
consumo de amonio.
para observar la Influencia de la
sobre la evolucin de biomasa y
Clave Ce..,
C.c 70pprfl
ZC,.c200ppm C,
3 C,.
0.25 0ppm Cp
4C, .r 350 ppm
Figura 7.32.- Simulacin con el modelo MQE para observar la influencia de la
concentracin inicial de amonio sobre la evolucin de azcar y
produccin de xantano.
406
Figura 7.31.-
t (h )

45
40
35
30
~25-
c~J,. -
220-
00
cf 5-
lo
5
o
2
1~
4
3
2.
20 40
t(h) 60
80
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
25
20
5
Y
5
o
lOO
Figura 7.33.- Simulacin con el modelo MQE para observar la influencia de la
concentracin inicial de amonio sobre la evolucin de oxgeno disuelto
y kLa v.
Por tanto, se puede concluir que el modelo qumicamente estructurado permite una
adecuada prediccin del proceso de produccin de xantano. De la misma manera que ya
fue vista para el modelo cintico metablico, el MQE permite una adecuada reproduccin
de la evolucin del consumo de azcar, produccin de xantano y de la evolucin del
oxgeno disuelto Se obtiene una significativa mejora en la prediccin de la evolucin del
sustrato nitrogenado, gracias a la estructuracin de este compuesto en el crecimiento del
microorganismo.
Parece necesario, por tanto, estructurar el metabolismo, tanto del sustrato carbonado
(en el modelo cintico metablico) y como del sustrato nitrogenado (modelo cintico de
clula), tanto en la parte correspondiente al crecimiento como en la produccin del
producto de inters industrial, con el fin de predecir la influencia de cienos cambios que,
de otra forma, no seria posible llevar a cabo.
2,5
t (h)
407
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
La principal mejora que incluye el modelo cintico qumicamente estructurado es
que al describir de forma ms adecuada el crecimiento tambin lo har para la
produccin. As, por ejemplo, la variacin de la concentracin inicial de amonio se ver
reflejada tanto en el crecimiento como en la produccin del polisacrido. La influencia de
esta variable en la produccin aparece en la Figura 7.34. En ella se puede observar el
mximo en la produccin que predice el MQE, con la variacin de la concentracin de
amonio en el medio.
La citada Figura representa la comparacin entre la concentracin de xantano
alcanzada a las 50 horas de fermentacin que predice el MQE empleando parmetros
particulares (lnea 1 ), es decir los obtenidos para cada experimento, y su comparacin con
la prediccin del mismo modelo pero con parmetros generales, es decir el modelo en
funcin de temperatura (lnea 2). En la Figura, tambin aparece (indicada por puntos) la
concentracin de xantano experimental obtenida con las diferentes concentraciones de
nitrgeno a las 50 horas de fermentacin.
Para los tres casos se observa un mximo en la produccin entre la concentracin de
amonio de 200 y 250 p.p.m.. La principal diferencia entre ellas estriba en que la
reproduccin del polisacrido con los parmetros particulares proporciona concentraciones
de xantano inferiores a los valores experimentales, mientras que con la reproduccin con
los datos particulares se consiguen concentraciones de xantano mayores que la
experimental, si bien hay que comentar que no son diferencias muy significativas, de
apenas 1 -1 ,5 g/L de diferencia.
408
Modelo Cintico Qumicamente Estructurado
1 6
14
12
lo-.
ti
6
4
2
o- ~
50 lOO 150 200 250 300 350 400 450 500
C~
4 (p.p.nv)
Figura 7.34.- Prediccin con el MQE de la concentracin de xantano alcanzada a las 50
horas de fermentacin con diferentes concentraciones iniciales de amonio.
Por tanto, el Modelo Qumicamente Estructurado consigue la descripcin
adecuada de los componentes del sistema objeto de estudio y permite predecir la influencia
en el proceso de variables como la temperatura y la concentracin inicial de la fuente
nitrogenada, algo que sin duda puede abrir el camino de facilitar la laboriosa tarea del
cambio de escala en los procesos llevados a cabo por microorganismos, e incluso el diseo
de los medios de produccin.
&a t&WT pa a TnoSpa rtCWfl
2 Siwu]a o T t*n~s ga 1eI~
409
8.- RESUMEN YCONCLUSIONES
Resumen y Conclusiones
8.- RESUMEN Y CONCLUSIONES
8.1 - RESUMEN
En el presente trabajo de investigacin se ha llevado a cabo el desarrollo de modelos
cinticos de diferente grado de complejidad para observar su capacidad de describir la
influencia de ciertas variables en un sistema microbiano, con el fin de obtener un modelo
predictivo tanto de la evolucin del sistema en s, como de su respuesta a perturbaciones en
las condiciones de operacin del proceso. Para ello, se ha aplicado la metodologa empleada
por la Ingeniera Quimica en el campo del desarrollo y aplicacin de los modelos cinticos
de redes complejas de reacciones.
E l sistema microbiano elegido en este trabajo, para realizar el desarrollo y aplicacin
de los modelos cinticos, ha sido la Produccin de Xantano. La eleccin de este sistema de
produccin se debe a que es un proceso bien conocido, desde el punto de vista metablico y
microbiolgico, y ha sido ampliamente estudiado por el equipo de investigacin en el que se
ha realizado el presente trabajo. El xantano es un biopolisacrido que se obtiene mediante
fermentacin sumergida de sustratos carbonados en presencia de la bacteria aerobia
Xanthomonas campestris y otra serie de nutrientes esenciales para el crecimiento del
microorganismo. El citado polisacrido es ampliamente utilizado en diferentes tipos de
industrias (farmacutica, alimentaria, textil, etc.) debido a la propiedad que presentan sus
4) 1
Resumen y Conclusiones
disoluciones, una elevada viscosidad en un amplio intervalo de condiciones, incluso con
una baja concentracin de polisacrido.
El fenmeno de transferencia de oxgeno cobra especial importancia en este sistema
ya que la bacteria es aerobia estricta, es decir precisa del mismo para subsistir y para llevar a
cabo la produccin. La viscosidad generada en el caldo durante la fermentacin, por la
propia produccin del polisacrido, dificulta enormemente la transferencia de oxgeno al
microorganismo (Gmez, 1 995).
En trabajos previos se optimaron las condiciones de operacin necesarias para IJevar
a cabo la produccin del polisacrido (preparacin del inculo, temperatura, perfil de
agitacin, etc.), as como la composicin del medio a emplear en el proceso (Santos, 1 993).
Asimismo, se ha observado la influencia de las citadas condiciones de operacin en las
propiedades del producto obtenido (reologa de sus disoluciones, peso molecular y
contenidos en acetato y piruvato) (Casas y Col.. 1 999).
En este trabajo se han propuesto, como se ha comentado anteriormente, modelos
cinticos de diferente grado de complejidad. El primer modelo propuesto es un modelo no
estructurado-no segregado (MNE), es decir, la poblacin microbiana se ha considerado
como un componente o reactante ms del sistema, que se denomma biomasa sin tener en
cuenta las reacciones que se producen en su interior tanto para el crecimiento del
microorganismo coito para la sntesis del producto de inters. En este modelo se tienen en
cuenta observaciones experimentales tales como que el sustrato nitrogenado es el limitante
del crecimiento y que el xantano es un producto parcialmente asociado al proceso de
crecimiento.
El siguiente paso en la complicacin del modelo es el planteamiento de un Modelo
Cintico Metablico, es decir, la poblacin microbiana se sigue considerando de la misma
forma que en el caso del modelo no estructurado y no se tienen en cuenta las reacciones que
se dan en el interior del microorganismo para la reproduccin del mismo; sin embargo, las
reacciones que tienen lugar para la obtencin del producto se han considerado, mediante un
esquema de reacciones con estequiometra definida. Se ha propuesto un esquema de
reaccin simplificado, empleando herramientas de Ingeniera Qumica, como el lumping o
agrupamiento de compuestos similares en un nico compuesto tipo y la suposicin de estado
412
Resumen y Conclusiones
pseudoestacionario para componentes como el ATP y los cofactores. Se proponen
relaciones estequiomtricas simplificadas considerando que el sustrato carbonado se emplea
para la sntesis de xantano y para el mantenimiento del microorganismo en estado viable,
principalmente
Las reacciones que tienen lugar dentro de los microorganismos para que se produzca
el crecimiento o reproduccin de los mismos, se han considerado aisladamente, proponiendo
un Modelo Cintico de Clula; es decir, se ha desarrollado un modelo en el que no se tiene
en cuenta la parte correspondiente a la produccin de xantano, sino nicamente la parte
correspondiente al crecimiento, considerando la biomasa microbiana constituida por
componentes intracelulares como son protenas y cidos nucleicos (RNA y DNA),
proponiendo un esquema de reaccin simplificado. Se considera adems que parte de las
protenas que produce el microorganismo van a ser secretadas al medio, esto es son
protenas extracelulares.
El ltimo de los modelos que se ha desarrollado es del tipo denominado
Qumicamente Estructurado, ya que considera tanto las reacciones intracelulares que dan
lugar al crecimiento como aquellas que tienen como resultado la produccin del compuesto
de inters. Por lo tanto, este modelo est formado por la unin del modelo de clula para la
descripcin del crecimiento y del modelo metablico para la descripcin de la produccin.
La aplicacin de los citados modelos se ha llevado a cabo mediante ajuste estadstico
de datos, obtenidos experimentalmente en diferentes condiciones, al modelo cintico
planteado en cada caso, por lo que ha sido necesario tanto el desarrollo de programas de
clculo oportunos, como la obtencin de los datos experimentales.
Los programas de clculo aplicados han sido realizados en FORTRAN 77,
emplendose siempre el algoritmo de regresin no lineal de Marquardt (1 963) tanto en
simple como en mltiple respuesta, acoplado a algoritmos de integracin (Runge-Kutta y
Simpson), ya que en todos los casos se ha utilizado el mtodo integral para llevar a cabo el
clculo de los parmetros cinticos de los diferentes modelos propuestos.
El trabajo experimental se ha realizado en un bio-reactor comercial de 1 ,5 L de
volumen til tipo tanque agitado y aireado. Las condiciones de operacin empleadas han
413
Resumen y Conclusiones
sido las optimadas previamente, como ya se ha comentado: un caudal de aire de 1 L/Lmin:
un pH inicial de 7, no siendo controlado durante la fermentacin; perfil de agitacin con una
velocidad dc 21 0 r.p.m., variable a lo largo del tiempo (Santos 1 993, Garca-Ochoa y col.,
1 997). Como fuente de carbono se ha empleado sacarosa en concentracin de 40 g/L y el
medio de produccin usado ha sido el propuesto por Garca-Ochoa y col. (1 992) como
ptimo para La produccin de xantano. Las variables estudiadas en el trabajo experimental
han sido la temperatura (25. 28, 31 y 34 oc) y la concentracin del nutriente
nitrogenado (amonio: 65, 1 30, 257 y 475 p.p.m.) en el medio de produccin, ya que en
estudios previos se ha observado que ambas variables influyen en la evolucin del sistema,
incluso con la presencia de un mximo en la produccin de xantano.
El Modelo Cintico No Estructurado propuesto est formado por un sistema de
ecuaciones diferenciales con cuatro componentes clave o respuestas (biomasa, sustrato
carbonado, producto y oxgeno disuelto) y siete parmetros (ecuaciones [4.1 3] a [4.1 8]).
Se llev a cabo el ajuste de Los datos experimento a experimento con este modelo,
obtenindose valores de los parmetros para cada uno de dichos experimentos. Los citados
valores son capaces de describir de forma satisfactoria la evolucin de la biomasa, el
sustrato carbonado y el producto en todos los casos, pero la descripcin de la evolucin de
oxigeno disuelto y la prediccin del consumo del sustrato nitrogenado obtenidos no son
aceptables. La simplicidad de este modelo hace que presente varias deficiencias, ya que con
l no es posible tener en cuenta las influencias en la produccin de xantano ni del oxigeno
disuelto, ni de la cantidad de sustrato nitrogenado suministrado al sistema y, adems, los
parmetros obtenidos mediante este modelo no son relacionables con la temperatura. Por
tanto, este modelo sencillo parece til nicamente para la descripcin de experimentos
aislados.
El Modelo Cintico Metablico desarrollado pretende subsanar las deficiencias
observadas en el Modelo No Estructurado. Para ello, ha sido necesario el planteamiento de
un esquema de reaccin simplificado del metabolismo del sustrato carbonado considerando
las rutas metablicas por las que transcurre el proceso. Es decir, en este modelo se realiza la
estructuracin del metabolismo del sustrato carbonado en una serie de reacciones, el sustrato
nitrogenado no se estructura y, al igual que en el modelo anterior, no es considerado como
respuesta en el esquema de reaccin. El modelo consta de relaciones estequiomtricas
414
Resumen y Conclusiones
definidas que consideran la produccin de xantano (ecuacin [5.1 ]), el catabolismo total de
la glucosa (ecuacin [5.5]), la fosforilacin oxidativa (ecuacin [5.6]) y la energa necesaria
para el mantenimiento del microorganismo en estado viable (ecuacin [5.7]). Para
compuestos como ATP y Cofactores se realiza la suposicin de estado pseudoestacionario,
ya que no han sido medidos.
El modelo metablico es capaz de describir la evolucin de todos los componentes
ajustados (biomasa, sustrato carbonado, xantano y oxgeno disuelto) de forma satisfactoria;
sin embargo, la prediccin de la evolucin del sustrato nitrogenado no es buena, debido a
que se emplean las mismas ecuaciones para la descripcin del crecimiento que en el modelo
anterior, como ya se ha comentado. En cuanto a la influencia de las variables en los
parmetros, con este modelo ha sido posible proponer expresiones en funcin de la
temperatura de los parmetros presentes en la parte que se haba desarrollado. Asimismo,
este modelo es capaz de predecir la influencia en la produccin y en el consumo del sustrato
carbonado de cambios en la transferencia de oxgeno (variaciones en la agitacin o en el
caudal de aire suministrado) en el sistema, ya que en las citadas relaciones estequiomtricas
aparece el oxgeno como un reactante ms y ste est incluido en las ecuaciones cinticas
propuestas. ya que se considera como nutriente limitante del proceso. La influencia de la
concentracin inicial de sustrato nitrogenado en la produccin no se puede tener en cuenta
con este modelo ya que describe el crecimiento de forma muy simplificada.
Para el planteamiento del Modelo Cintico de Clula fue necesario el desarrollo de
metodologa debido a que en la literatura no se encontraron antecedentes de modelos de este
tipo para el sistema de produccin de xantano; y aunque existen para otros sistemas, los
parmetros no se calculan por ajuste de datos experimentales.
En primer lugar, para la aplicacin de modelos cinticos de clula, es necesario el
anlisis de componentes intracelulares, para lo que fue preciso el desarrollo de mtodos
de anlisis de los citados componentes. Este fue un punto esencial en la realizacin del
presente trabajo, debido a la dificultad de realizar el anlisis de estos compuestos por las
tcnicas bioqumicas convencionales, al menos para bacterias. El mtodo adoptado en este
trabajo para tal anlisis fue la Citometria de Flujo. Esta tcnica de fluorescencia est
siendo empleada cada vez ms en Microbiologa debido a la gran cantidad de informacin
que permite obtener sobre un cultivo microbiano (parmetros estructurales y funcionales),
415
Resumen y Conclusiones
con una elevada precisin y rapidez. En este sentido, es necesario realizar un especial
esfuerzo para la conversin de los datos obtenidos por esta tcnica (datos cualitativos o
semicuantitativos) en datos cuantitativos (necesarios para la aplicacin de los modelos
cinticos), obteniendo curvas patrn, empleando otra tcnica de fluorescencia para el
calibrado: Espectrofluorimetria. En el presente trabajo se ha desarrollado un procedimiento
para el anlisis cuantitativo de protenas intracelulares, RNA y DNA, mediante tincin con
fluorforos especficos (Isotiocianato de Fluorescena e loduro de Propidio) y su posterior
anlisis en el citmetro de flujo.
Una vez obtenidos datos experimentales de la evolucin de los componentes
intracelulares, es necesaria la aplicacin de un mtodo para la propuesta de modelos
cinticos de este tipo. Primero debe hacerse una propuesta de un esquema de reaccin
simplificado del metabolismo microbiano (Figura 6.1 ). En este esquema se propone que el
sustrato nitrogenado va a ser empleado por el microorganismo para la formacin de
aminocidos no formadores de bases, es decir los que formarn proteinas, dentro de stas
hay que distinguir aquellas que constituyen la propia biomasa (protena intracelular) y
aquellas que sern secretadas al exterior (protena extracelular). Adems, el sustrato
nitrogenado ser empleado para la formacin de aminocidos formadores de bases, es decir,
aquellos que evolucionarn hacia RNA y DNA.
A partir del esquema anterior se han realizado diferentes simplificaciones empleando
a hiptesis de estado pseudoestacionario para diferentes compuestos, como aminocidos
formadores de bases o para RNA mensajero, obtenindose dos esquemas de reaccin
simplificados (MCC-1 y MCC-2).
Una vez planteados los posibles esquemas de reaccin, es necesario conocer qu tipo
de ecuaciones cinticas son las ms apropiadas en cada caso. El mtodo empleado para
determinar qu expresiones cinticas pueden ser utilizadas ha sido el mtodo de las
velocidades de reaccin (Garca-Ochoa y Romero, 1993), en el que se pueden aislar las
citadas expresiones cinticas siempre que el nmero de componentes clave del sistema
coincida con el nmero de relaciones independientes, es decir, que la matriz de los
coeficientes estequiomtricos sea cuadrada. En todos los casos, se probaron ecuaciones
tanto tipo potencial de primer y segundo orden como tipo hiperblico o Monod. Los
resultados de aplicar el mtodo de velocidades de reaccin sobre las dos simplificaciones
416
Resumen y Conclusiones
propuestas llevaron a plantear una cintica de primer orden para la velocidad de reaccin de
aminocidos formadores de bases, y cinticas de segundo orden e hiperblicas para el resto
de las velocidades de reaccin.
La combinacin de los dos esquemas de reaccin junto con las diferentes
posibilidades de las ecuaciones cinticas lleva a plantear hasta ocho modelos cinticos
distintos, as que se hace necesario emplear criterios de discriminacin entre ellos. Se han
utilizado criterios estadsticos y fsicos (Garca-Ochoa y col., 1 989a y 1 990a). Los primeros
criterios aplicados fueron los estadsticos con el fin de observar la bondad del ajuste. Los
valores de la t de Student de cada uno de los parmetros obtenidos, as como la F de Fischer
y el valor de la suma de residuos al cuadrado (SRC) obtenido del ajuste de los experimentos
con cada modelo, permiti discriminar cuatro de los ocho modelos propuestos. A
continuacin se aplicaron criterios fisicos, como el estudio de la evolucin del valor de los
parmetros obtenidos con las variables estudiadas. Aunque todos presentaban tendencias
claras, hay dos modelos que parecen dar un mejor resultado, concretamente tino de ellos
cuyos parmetros pueden ser puestos en funcin de la temperatura de acuerdo a las
expresiones dadas por las ecuaciones [6.42] a [6.45].
El modelo propuesto es capaz de reproducir los datos de componentes intracelulares
obtenidos experimentalmente, en las diferentes condiciones, de forma plenamente
satisfactoria. No obstante, hay dos experimentos en los que los resultados deben ser
mejorable, para el experimento realizado con 65 p.p.m. de amonio inicial y el realizado con
475 p.p.m. de este compuesto. En ambos casos, los resultados obtenidos no son tan buenos
como en el resto de experimentos. Por ello, se introdujeron cambios en cada caso con el fin
de superar las deficiencias presentadas. En el caso del experimento con mayor cantidad de
amonio (475 p.p.m.) se observa un efecto de inhibicin por este sustrato, por lo que se
incluy un trmino capaz de predecirlo en el modelo planteado para tener en cuenta tal
efecto, y con ello mejorar la reproduccin de los datos experimentales (ecuacin [6.50]).
Para el experimento realizado con la concentracin ms baja de amonio (65 p.p.m.), fue
necesario cambiar la estequiometria en la produccin de protenas, pues al realizar el
balance de nitrgeno se haba observado que faltaba nitrgeno, lo que hizo suponer que
el microorganismo estara produciendo componentes con otra composicin en
nitrgeno (ecuacin [6.47]).
4/7
Resumeny Conclusiones
Este modelo cintico de clula presenta una evolucin coherente de los parmetros
con las variables estudiadas. Con la concentracin de nitrgeno, la tendencia de todos los
parmetros es a un valor constante, con la temperatura pueden ser ajustados a diferentes
funciones, por tanto se puede obtener un modelo de clula en funcin de la temperatura.
Una vez obtenido el modelo de clula, se desarroll el Modelo Qumicamente
Estructurado, en el se que unen los ltimos dos modelos comentados: modelo metablico
y modelo de clula. En este modelo, tanto el sustrato carbonado como el nitrogenado se
estructuran en las diferentes etapas del metabolismo del microorganismo objeto de estudio.
A] hacer la comparacin de las reproducciones de los datos experimentales obtenidas a
partir de el modelo qumicamente estructurado con el modelo metablico, se observa que el
primero predice menos concentracin de biomasa y de xantano. Para mejorar estos
resultados se incluy un trmino de hidratos de carbono en la biomasa (ecuacin [7.35]),
con ello se consigue tanto la mejora en la reproduccin de biomasa como de xantano y, en
consecuencia, de consumo de sacarosa y de oxgeno disuelto.
El modelo final, Modelo Qumicamente Estructurado, es capaz de predecir la
influencia de las mismas variables que el modelo cintico metablico pero con la clara
mejora de la influencia de la concentracin inicial de sustrato nitrogenado, amonio.
Con ello, es posible tener un modelo cintico que explique la influencia, tanto en
crecimiento como en produccin, de variables como la temperatura o cambios en la
composicin del medio, sobre la evolucin de los principales componentes del sistema, algo
sin precedentes en la literatura.
4/8
Resumen y Conclusiones
8.2.- CONCLUSIONES
El Modelo Cintico No Estructurado es capaz de predecir la evolucin del
sistema en experimentos aislados. El experimento realizado en las condiciones
ptimas (T~ 28
0C; CNO,257 g/L; N~2lO r.p.m., variable) se puede describir
con el siguiente conjunto de ecuaciones:
dCx = 043 5 ~ cw,[ Cx FCo+607Ci
di 6,073
dCN _ 1 dC
It 6,07 It
dcx 1 J (7y
di 0 ,1 3 9 di
dCP=
0o147.c .c
di ~ X
dCo2 k(C~ Co~~ ~ ji 2,02.1< c~
1 .1 .- El Modelo No Estructurado es capaz de describir adecuadamente la
evolucin del sustrato carbonado, del producto y de la biomasa en cada
experimento. Sin embargo, no es capaz de describir adecuadamente la
evolucin del oxgeno disuelto, ni la evolucin del sustrato nitrogenado
durante el proceso.
1 .2- Los parmetros obtenidos con el Modelo No Estructurado para
diversos experimentos no son relacionables con la temperatura, ni con
ninguna otra variable.
1 .3.- El Modelo No Estructurado no es capaz de predecir la influencia en la
evolucin de los componentes del sistema (sustrato carbonado, xantano,
biomasa) de cambios en variables que afectan a la velocidad de transferencia
de oxgeno, como la agitacin y el caudal de aire suministrados.
419
Resumen y Conclusiones
2.- El Modelo Cintico Metablico es capaz de predecir razonablemente bien la
evolucin de los componentes del sistema y est formado por el siguiente
conjunto de ecuaciones diferenciales:
CNjJ.CX1
C~
0 +Y~\ C~0 )
dC 5,94
r180.{~
di 923 ,2
1
y
Us
dC~
It
dC~
dr
dC~ 923 ,2
It
1
12
k4 C~>,
K4 +C< 2,,
CY.[13 58Q3 58t47 j}]}
l+4Y,~
3 ,58
7$
dC0,
It
0,3 dC~
923 ,2 de
r,=k
0,5
~ k~~, ~ 9
~ 3 ,58+4.Y~>j
1 k< C0 (6 1+tYrp
C~ 413 58.1
12 K4 C02 yy 3 ~58+4.Y1~~))
- y
ox
dCx
di
C
? =1,2
~ATPP
2.1 .- El modelo metablico predice de forma adecuada la evolucin de la
biomasa, el sustrato carbonado, el producto y el oxgeno disuelto en todos los
experimentos realizados. Sin embargo, no es capaz de predecir la evolucin
de la concentracin del sustrato nitrogenado en los diferentes experimentos.
2.2,- Los parmetros obtenidos del ajuste al modelo metablico de
experimentos realizados a diferentes temperaturas son relacionables,
habindose obtenido las siguientes expresiones de los mismos en funcin de
la citada variable:
dC~ k,<
420
Resumen y Conclusiones
k< 7)={ 0,94 (T- 1945) f1-exp(/,3 99(T-3 4,24))]}
2
k < T) = 2,913 +2,0481
Y,~>< (T) = (0,597. (T -24,3 5)11 - exp(0 205- (T -3 7,16))]
Y~ftT) =0,3 40+(6,1.]0< T
2.3.- El modelo metablico es capaz de predecir de forma adecuada la
influencia de la temperatura en el consumo de sustrato, produccin de
xantano y evolucin del oxigeno disuelto en el sistema. En la Figura 8.1 se
muestra la influencia de esta variable sobre la produccin del polisacrido
que predice el modelo a las 60 horas de fermentacin. Se observa un mximo
aproximadamente a 280C, coincidente con el observado experimentalmente
(Santos, 1 993; Garca-Ochoa y col., 1 997).
3 0-
20
lo-
o.
Figura 8.1.- Evolucin de la concentracin de xantano alcanzada a las 60
horas de fermentacin con diferentes temperaturas de operacin.
2.4.- El modelo metablico es capaz de predecir la influencia de cambios
en las variables que afectan a la transferencia de oxigeno (agitacin y caudal
de aire) en la evolucin del sustrato carbonado y del producto. A modo de
ejemplo se muestra en la Figura 8.2 (a, b y c) la evolucin de la
concentracin de xantano alcanzada a las 60 h de fermentacin con diferentes
valores de porcentaje de saturacin del oxgeno disuelto, de kLav y con
diferentes caudales de oxgeno, respectivamente.
25 3 0 3 5
421
30
> 0.4
lo
10
a
lO YO
l ~(h )
c
00 03 [0 lO 20
0<LiJ nin>
Figura 8.2.- Evolucin de la concentracin de xantano alcanzada a las 60 horas de
fermentacin con diferentes condiciones que afectan a la
concentracin de oxgeno disuelto en el caldo.
a) Variacin del %de oxigeno disuelto
b) Variacin de kLav
c) Variacin del caudal
Resumen y Conclusiones
b
422
Resumen y Conclusiones
3.- La citometria de flujo es una tcnica excelente para el seguimiento y anlisis de
componentes intracelulares, tales como DNA, RNA y protenas, durante una
fermentacin.
3.1 .- Se puede afirmar que no es adecuado realizar anlisis de componentes
intracelulares mediante tcnicas bioqumicas convencionales con bacterias
dada la escasa reproducibilidad de los ensayos. Esto se debe a tres aspectos
fundamentales:
a) La etapa de rotura de las clulas es crtica, pues no es posible saber si
se rompen todas las clulas cuyo componente intracelular se analiza.
Los datos vendrn siempre referidos a la cantidad de biomasa que se
emplea, por lo que ser la primera frente de error.
b) La etapa de extraccin y purificacin del componente tambin es
delicada, debido a las sucesivas centrifugaciones que se deben
realizar para el anlisis. Durante estas operaciones se puede perder
parte del componente intracelular.
c) La labilidad de algunos componentes provoca que cuando se rompe la
clula, y su contenido forma parte del homogeneizado, algunos de los
componentes se degradan con suma facilidad, como por ejemplo es el
caso del RNA.
3,2.- La espectrofluorimetria permite obtener buenos resultados cuantitativos
de la concentracin de los componentes intracelulares. La espectro-
fluorimetria es una tcnica de fluorescencia que emplea fluorforos
especficos para cada componente (isotiocianato de fluorescena para
protenas y ioduro de propidio para cidos nucleicos). Para diferenciar entre
ambos es necesario digerir con RiNAasa para analizar DNA y con DNAasa
para el anlisis de RNA.
423
Resumen y Conclusiones
a) El protocolo de preparacin de las muestras en esta tcnica no incluye
la rotura celular y, por tanto, tampoco la extraccin de los
componentes. con lo que la espectrofluorimetra permite solventar los
problemas encontrados con las tcnicas bioqumicas convencionales.
b) La espectrofluorimetra permite la obtencin de curvas de calibrado
para relacionar la concentracin del componente y la intensidad de
fluorescencia a una cierta longitud de onda que presenta el
componente a analizar. En este trabajo, para Xanrhomonas
campestris, se han determinado las siguientes:
C,%
0 (g L) = 1,93 10 LP
T ED (Xex%5364 xernL623)
C~Jg/L)rz3 ,68.104 ,rpE ED (xexc=494~ xeIflI=520)
C%
1(g/L) = 3 ,46 ~1< . FD (xexc=494; xenh=52o)
3.3.- La citometra de flujo es una tcnica muy adecuada para el anlisis de
componentes intracelulares durante un proceso con microorganismos. ya que:
a) El protocolo de preparacin de las muestras es idntico al realizado
para el anlisis por espectrofluorimetria.
b) Se pueden obtener datos cuantitativos mediante citometra de flujo
gracias a las curvas de calibrado para cada componente, obtenidas
con el apoyo de la espectrofluorimetra. En este trabajo, para
Xanthomonas campestris. se han obtenido las siguientes:
Cm
0 (g / L) = (0,25 IP5,95) ED NC (Xe~c%536; > 5=623)
C\RV] (g L) = 0,11 ED NC (Xex~=494; xern=520)
La gran cantidad de parmetros analizables por citometria de flujo hacen de
esta tcnica una herramienta muy importante para obtener informacin
cuantitativa, rpida y fiable de la concentracin de componentes
intracelulares, como son: viabilidad celular, tamao y complejidad de las
clulas, pH intracelular, actividad metablica, contaje del nmero de clulas,
entre otras.
424
Resumen y Conclusiones
4.- En el Captulo 6 de la presente Memoria se ha propuesto un mtodo para
desarrollar un modelo cintico de clula basado en las siguientes etapas:
a) Proponer un esquema simplificado de reaccin utilizando lumping de
especies qumicas y la observacin de la evolucin de los componentes
del sistema.
b) Utilizar el mtodo de las velocidades de reaccin para probar distintas
ecuaciones cinticas para las reacciones que figuran en el esquema de
reaccion.
c) Ajustar los datos experimentales por una regresin en multi-respuesta y
aplicar criterios de discriminacin entre modelos, de carcter estadstico y
fisico.
El mtodo de las velocidades de reaccin permite la individualizacin (simple
respuesta) de las reacciones correspondientes a cada componente, facilitando
mucho el desarrollo de modelos complejos para microorganismos. Permite tambin
obtener parmetros iniciales, para cada una de las ecuaciones cinticas planteadas,
facilitando as el ajuste posterior en mltiple respuesta.
t- El Modelo Cintico de Clula desarrollado es capaz de predecir la evolucin
de los componentes intracelulares del microorganismo, esto es del DNA, RNA y de
las protenas intracelulares, que constituyen la biomasa. Est formado por el
siguiente conjunto de ecuaciones diferenciales:
dC~ = dCp~ + ICDNI
It It It It
ICR\0
4
It
dCDNA
di
dCPR ICPRE
It It
dC
NII4 ~ = 18(1,4. 2,75 2,75 )
It 136,5 103,5 478,6 491,7
425
Resumen> Conclusiones
Siendo:
rJ=lqC\ C ~
/ ?4. C C
.2 .5 Y
(m =k C~
5.1 .- El modelo de clula predice de forma adecuada la evolucin de la los
componentes que constituyen la biomasa, siendo capaz de predecir la
evolucin de la concentracin del sustrato nitrogenado en los diferentes
experimentos ajustados de forma satisfactoria.
52.- Los parmetros obtenidos del ajuste al modelo de clula de
experimentos realizados a diferentes temperaturas son relacionables con
dicha variable, habindose obtenido las siguientes expresiones:
1c
1(T) = 1,49 0,03 61
k3 < T) = 0,150
k5(T) =0,1 98
-y
kJTt {0,041 (T- 21)11- expj0,3 52 (7 - 3 5,08))J
El modelo de clula es capaz, por tanto, de predecir la influencia de la
temperatura en la evolucin de los componentes intracelulares.
5.3.- Los parmetros obtenidos del ajuste al modelo de clula de
experimentos realizados a diferentes concentraciones de nitrgeno presentan
un valor constante con esta variable. Esto era previsible dadas las cinticas en
funcin de la concentracin de amonio que se pueden observar en Las
ecuaciones del modelo. El amonio presenta un efecto inhibitorio para el
crecimiento en concentracin inicial de 475 p.p.m., por lo que se debe de
introducir un trmino de inhibicin en el modelo propuesto para describir el
sistema bajo esta situacin, de forma:
426
Resumeny Conclusiones
=(r
1 CPRE )k1 (CN C~9
It
El modelo de clula es capaz, por tanto, de predecir la influencia de la
concentracin de amonio en la evolucin de los componentes intracelulares.
6.- El Modelo Cintico Qumicamente Estructurado es capaz de predecir la
evolucin de los componentes del sistema, tanto los correspondientes al crecimiento
como a la produccin del polisacrido. Se ha obtenido por unin de los dos modelos
anteriores, donde se han realizado diversas modificaciones, quedando el modelo
completo formado por las siguientes ecuaciones:
dC~ _ tICRVA tICDAOA dCppj
+- +
Ir It di dt
dCRV
=
It
ICDV
=
It
tIC _ IC
PRI
It r, -
It
dC
/% it
2,75 2,75 )
It 13 6,5 103 ,5 478,6 491,7
F Vil
IC~180J 5,94 ICp _ 1 k4C0, C 3 58 ( 14Ym
It b 923 ,2 Ir 12 K4C02 [ 3 ,58+4Y~~ )jJ
0,93 3 ( )0,5( )1,08( )1,12(
13 6,5 103 ,5 491,87 486,7
It K4 CQy3 ,58+4Y~~~)
ICx
IC0, _ 0,3 dC~ ~o,s1c4C0 .Q +k~a< (C *CQ ~--
dr 923 ,2 Ir + CQ ~ It
k~C
K O2CI 141% ,
~ C 3 ,584.YTPJ
0,
1 k4C0, ~13 S8( 14Yrp
2 = 12K4C0, 37 . ~ 3 ,584Y4~
427
Res unen y Conclusiones
= ~ 2
y, ~3 4
41p1>
Siendo:
r
1=k,C C ~
r3 =k3 C ,~,
r2m =k, C
N
y el valor de los parmetros:
k1< T) = 1,49 0,03 67
k, (7 ) = 0,150
< (7 ) = 0,198
k,1~(T) = 0,001080,00003 T
k2 ( TH( 0 , 0 41 ( 7 - 2 1 )[1 - exp( 0 , 3 52 ( T- 3 5, 0 8))]
k( T~ / 0 , 9 4 ( 7 - 1 9 , 45) [1 -exp( / , 3 9 9 ( 7 - 3 4, 2 4))f f
kYT) = 2 , 9 1 3 2 , 0 487
>l w ( T) = ( 0 , 59 7( 7 - 2 4, 3 5)1 1 - exp( 0 , 2 0 5 ( 7 - 3 7, 1 6 ))]}2
6. 1. - E l modelo qumicamente estructurado predice de forma adecuada la
evolucin de los componentes intracelulares: DNA, RNA y protenas en
todos los experimentos realizados. Esto es evidente pues este modelo incluye
las expresiones del modelo de clula, con lo que tambin ser capaz de
predecir la influencia de la temperatura y de la concentracin de amonio en la
evolucin de estos componentes.
En la parte correspondiente a la produccin, y dado que se han tomado las
expresiones del modelo cintico metablico, el modelo qumicamente
estructurado, predice adecuadamente en el consumo de sustrato, produccin
de xantano y evolucin del oxgeno disuelto en el sistema.
428
Resumen y Conclusiones
Con este modelo se considera la evolucin de otro componente intracelular
no considerado en el modelo cintico de clula. Este componente se ha
denominado hidratos de carbono, y el parmetro de la reaccin de formacin
de este compuesto, kHG, puede ser expresado tambin en funcin de la
temperatura.
6.2.- El modelo qumicamente estructurado predice de forma adecuada la
evolucin del sustrato carbonado, el producto y el oxigeno disuelto en todos
los experimentos realizados, siendo capaz de predecir la influencia de
cambios en las variables que afectan a la transferencia de oxgeno (agitacin,
kLav y caudal de aire) en la evolucin del sustrato carbonado y del producto.
Lo mismo que ocurre con el modelo metablico (ver Figura 8.2).
6.3.- El modelo qumicamente estructurado tambin toma en consideracin la
influencia de cambios en la composicin del medio, como por ejemplo en la
concentracin de nitrgeno, sobre la produccin del polisacrido. Se puede
observar un mximo de produccin en tomo a las 200 y 250 p.p.m. de
concentracin inicial de amonio indicado en la Figura 8.3. Esta figura est
realizada tomando la concentracin de xantano alcanzada a las 60 horas de
fermentacin. Esta influencia, de nuevo, fue detectada experimentalmente en
un trabajo previo (Santos, 1 993; Garca-Ochoa y col., 1 997).
3 0-
25
20
5
o
y
o.
O 00 200 3 00 400
9. ~~,pm>
Figura 8.3.- Evolucin de la concentracin de xantano alcanzada a las 60 horas
de fermentacin con diferentes concentraciones iniciales de amonio.
429
9.- NOMENCLATURA
Nomenclatura
9.- NOMENCLATURA
A : Absorbancia (u.a.).
Compartimento en los modelos de Bijkerk y Hall (1 977)
(1 991 a y 1 991 b).
B : Constante de Blackman (1 905).
Compartimento del modelo de Bijkerk y Hall (1 977).
C : Concentracin(kg/m
3).
Vector de compuestos en el estudio estequiomtrico
Concentracin del compuesto j (mol j/L) (kgj/mfl.
Parmetros de la ecuacin de Ratkowsky y col. (1 983).
, C
2
C2,
Cm
CM i F
d
D
y de Nielsen y col.
Parmetros del modelo de Matsumura y col. (1 981 ).
Parmetro del modelo de Wayman y Tseng (1 976) (kg~/m
3).
Concentracin de oxigeno en el momento en que se inicia la aireacin (04).
Citometra de Flujo.
Dimetro de la hifa (m).
Compartimento del modelo de Ramkrishna y col. (1 967).
43 1
Nomenclatura
e : Nmero total de elementos hifales por volumen de reactor (U).
E : Enzima de la ruta
F : Parmetro estadstico, F de Fischer.
ED : Factor de Dilucin.
O : Compartimento de los modelos de Ramkrisna y col. (1 967); Harder y Rels
(1 982) yNielsenycol.(1 991 ay 1 991 b).
IF : Intensidad de Fluorescencia (unidad arbitraria).
K : Parmetro del modelo de Hinshelwood (1 946), (m
3/kg~).
Compartimento del modelo de Williams (1 967) y del modelo de Harder y
Rels (1 982).
Parmetro del modelo reolgico de Casson (> 42~ ~2m~)
Parmetro representativo de la inhibicin en el modelo cintico de clula
(m.W kgj).
: Parmetro representativo de la inhibicin por sustrato en el modelo de
Wayman y Tseng (1 976), (m31 1 kgj)
Constante cintica de la reaccin i (unidades dependientes de la funcin
composicin (h) o ( m31 1 kgj ).
Constante de saturacin de la expresin de Monod debido al compuesto
limitantej (kg i/m3).
Constante cintica de la reaccin i (It) (m~hkg).
1 < ,, : Constante de saturacin del compuesto j en la reaccin i (kg i/mt.
kLav Coeficiente volumtrico de transporte de oxgeno (< ) (~-~)
k
0, ,k02 Factores preexponenciales en la ecuacin de Esener y col. (1 983).
Factores preexponenciales en la ecuacin de Shu y Yang (1 991 ).
Parmetro ecuacin de Monod (1 949,1 950) (kg5/m
3).
1 hgu : Unidad de crecimiento hifal referida a la longitud de la hifa (mlpuntas).
M : Masa media del elemento hifal (g).
migu Unidad de crecimiento hifal referida a la masa de la hifa (glpuntas).
Consumo de oxgeno debido al mantenimiento celular (kmol O=Ikg~h).
Consumo de sustrato carbonado debido al mantenimiento (kgs/kgx.h).
43 2
Nomenclatura
N : Velocidad de agitacin (r.p.m.).
n : Constante de la ecuacin de Luedeking-Piret (1 959) referido a la produccin
asociada al crecimiento (kgp/kgx).
Nmero medio de puntas del elemento hifal.
NA : Velocidad de transferencia de oxgeno (mol 0
2h).
NC : Nmero de Clulas.
Nmero de componentes clave.
Pl : Controlador proporcional-integral.
PID : Controlador proporcional-integral-diferencial
Q : Caudal (cm
3/min) (m/h).
Velocidad especfica de formacin del compuesto i (modelo de Pons y col,
1 989).
q02 : Consumo de oxgeno debido a los microorganismos (kmol O
2/kg~h).
1 : Parmetro estadstico, coeficiente de correlacin lineal.
Re : Nmero de Reynols (pNT
2/~f).
5 : Sustrato.
Sc : Nmero de Schmidt(,u/p DL)
SRC : Suma de los residuos al cuadrado.
Tiempo (h).
Parmetro estadstico, t de Student.
T : Temperatura (0C).
tlat : Tiempo de latencia (h).
Parmetros del modelo de Ratkowsky y col.(1 983) (0C).
V : Volumen (L).
Caudal de aire aportado al fermentador, (IN/l/min) (m3/m3/h).
We : Nmero de Weber (pN2T3/a)
433
Ao,nenclatu, a
YE : Extracto de levadura.
Y,j : Rendimiento macroscpico del compuestoj en el compuesto i (kgj/kg i).
Y
0= : Consumo de oxgeno debido al crecimiento de la biomasa (kg~/kmol 0=).
: Rendimiento macroscpico del sustrato. 5. respecto al producto sintetizado,
P , (kg ~ / kg 5) .
Rendimiento macroscpico del sustrato, 5, respecto a la biomasa
sintetizada, X. (kg~/kgj.
Letras Griegas
u : Parmetro de la ecuacin de Luedeking-Piret modificada, relativo al
consumo de sustrato debido al mantenimiento y a la produccin no
asociada al crecimiento (kg~/kg~ h).
3 : Parmetro de la ecuacin de Luedeking-Piret modificada, relativa al
consumo de sustrato debido al crecimiento del microorganismo y a la
produccin asociada al mismo (kg5/kg~).
Y Coeficiente estequiomtrico del compuesto i.
A : Incremento.
2. : Longitud de onda.
Velocidad especfica de crecimiento (It).
Viscosidad relativa al modelo de Casson (Pas).
Viscosidad efectiva relativa al modelo de Ostwald-deWaele (Pas)
Velocidad especfica mxima de crecimiento ( m
3 kgsh).
p : Densidad del lquido (kg/mt.
a . Tensin superficial (Km ).
-y
Tensin tangencial (Nm2) (kg/ms).
Tensin crtica de flujo (Km2) (kg/ms2).
43 4
Vomenclauua
Subndices
b
c
O
cnt
DNA
ef
exp
g
m
max
mm
>4
N,A
N,DNA:
N,RNA:
N,T
O ,
P
P R
PRE
P R I
P R T
Referido a biomasa.
Referido a catabolismo (modelo de Pons y col., 1 989).
Condiciones iniciales.
Referido al valor crtico.
Referido al DNA.
Eficaz o medio.
Experimental.
Referido a glucosa (modelo de Pons y col., 1 989).
Referido a condiciones mximas.
Referido a mantenimiento (modelo de Pons y col., 1 989).
Referido al valor o a las condiciones mximas.
Referido al valor mnimo.
Referido al sustrato nitrogenado, amonio.
Referido al nitrgeno en amonio.
Referido al nitrgeno en DNA.
Referido al nitrgeno en RNA.
Referido al nitrgeno total.
Referido al oxgeno.
Referido al producto, xantano.
Referido a Proteinas.
Referido a protena extracelular.
Referido a protena intracelular.
Referido a protena total.
435
jVomencaturo
Referido a los cofactores < modelo de Pons y col., 1 989).
Referido al RNA.
Referido al sustrato carbonado, sacarosa.
Referido al valor terico.
Referido a la biomasa.
Referido a xantano (modelo de Pons y col., 1 989).
Superindices
A
CN4F
E
*
Referido a absorbancia.
Referido a Citometra de Flujo.
Referido a Fluorimetra.
Valor de saturacion.
R
RNA:
s
Teor
x
436
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