Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae en jugo de uvas Falcn Ortiz Valeria, Gmez Ilescas Ameyalli, Gaona Gamboa Magda Abril, Lpez Oropeza Sofa Grecia, Moncada Garca Andrea Irais
INTRODUCCIN La fermentacin alcohlica es una de las etapas principales utilizadas en la industria para obtener bebidas alcohlicas (Vincent, 2006). La fermentacin implica el empleo de microorganismos para llevar a cabo transformaciones de la materia orgnica catalizadas por enzimas, comnmente se realiza por la levadura Saccharomyces cerevisiae, que es la levadura corriente del pan o la cerveza, quien convierte un 90% del azcar en cantidades equimoleculares de alcohol y CO2 (Vzquez, 2007). La fermentacin a grandes rasgos se compone de la gluclisis ms las reacciones que generan NAD+ transfiriendo electrones del NADH al piruvato o derivados del piruvato. El NAD+ puede, entonces, emplearse de nuevo para oxidar azcares mediante la gluclisis, que rinde dos molculas de ATP por cada fosforilacin a nivel de sustrato (Campbell & Reec, 2007). La Fermentacin alcohlica se define como el proceso bioqumico anaerbico por el cual las levaduras transforman piruvato en Etanol, CO2 y energa. (Wang, 1979) El oxgeno es el desencadenante inicial de la fermentacin, ya que las levaduras lo van a necesitar en su fase de crecimiento.El primer paso libere dixido de carbono del piruvato, que se convierte en el compuesto de dos carbonos acetaldehdo; en el segundo paso, el acetaldehdo es reducido por el NADH a etanol, esto regenera la provisin de NAD+, necesaria para que contine la gluclisis (Campbell & Reec,, 2007). La fermentacin alcohlica es un proceso exotrmico, es decir, se desprende energa en forma de calor. Es necesario controlar este aumento de temperatura ya que si ste ascendiera demasiado (25 - 30) las levaduras comenzarn a morir detenindose el proceso fermentativo. Otro producto resultante de la fermentacin es el anhdrido carbnico (CO2) en estado gaseoso, lo que provoca el burbujeo, la ebullicin y el aroma caracterstico de una fermentacin (Vzquez, 2007). Uso de la fermentacin alcohlica El empleo principal de los procesos de fermentacin por parte del ser humano ha ido dirigido, desde muy antiguo, a la produccin de etanol destinado a la elaboracin de bebidas alcohlicas como el vino, la cerveza, la sidra, etc. Dentro de los estudios de biotecnologa se ha intentado emplear el etanol resultante de la fermentacin alcohlica de los desechos agrcolas (biomasa) en la obtencin debido a combustibles empleados en los motores de vehculos. Los usos del etanol en la industria son amplios y van desde la elaboracin de productos cosmticos, productos de limpieza, etc. No obstante el empleo de la fermentacin alcohlica tiene un xito potencial en el tratamiento de los residuos de la industria alimenticia. (Vzquez, 2007).
OBJETIVOS Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin realizada por la levadura de Saccharomyces cerevisiae. Comprobar la produccin de fermentacin alcohlica a travs de la la concentracin de azcares reductores, la produccin de alcohol de las muestras y el pH de las mismas.
HIPTESIS La Fermentacin alcohlica y produccin de alcochol por S. cerevisiae en el macerado de uva, podr corroborarse por medio de la disminucin de azcares reductores en solucin, el aumento del pH y la medicin de los grados de alcohol.
MATERIAL Y MTODO
Se inici macerando dos kilos de uvas moradas utilizando un procesador de alimentos, hasta obtener litro y medio de jugo; este se verti en dos frascos de aluminio, uno de un litro (no se llen hasta el tope) y otro de medio litro (con 250 mL de jugo de uva), y se colocaron en una autoclave para esterilizar a 120 C durante 15 minutos. Despus, en la botella de 500 mL se sembr el inculo de Saccharomyces cerevisiae utilizando una asa; se dej incubar a 30 C durante una semana. Y la botella de 1000 mL se almacen a 4 C. Una semana despus se llev a cabo la inoculacin e incubacin. Primero se esteriliz el garrafn en donde se vertieron los 500 mL del inculo cultivado anteriormente y adems se le agreg el jugo de uva de la botella de 1000 mL, se agit manualmente para homogeneizar y se guardaron 5 mL de esta mezcla. El jugo restante fue incubado a 29 C mantenindolo lejos de la luz y dejando liberar un poco de gas cada tercer y agitando dos o tres veces al da (oxigenacin). Se tomaron 10 mL de la botella de 750 mL antes de inocularlo y de la botella de 250 mL se tomaron 10 mL de inculo y se pasaron a tubos de centrfuga. Se centrifugaron a 600 rpm durante 7 minutos. Se determin el pH de las muestras inicial y final por duplicado. Se prepar una solucin de DNS al 0.5% y una solucin de glucosa estndar con 2.0 mg/ml. Se marcaron 10 tubos de ensaye donde se depositaron las soluciones como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Datos para la preparacin de las soluciones utilizadas en la curva de calibracin. Con base a una solucin de glucosa con concentracin conocida (2.0 mg/mL) se prepararon 6 tubos para realizar la curva de calibracin (Tubos 1-6). Con el fin de determinar la concentracin de glucosa en las muestras se realizaron dos soluciones por duplicado con las muestras del macerado, inicial y final (Tubos 7-10).
En seguida se agitaron los tubos en vortex durante un tiempo entre 30 y 60 segundos aproximadamente, despus de lo cual los tubos tapados fueron incubados durante 5 minutos a bao Mara a una temperatura de 87.9C. all sacar los tubos se les agregaron 5 ml de agua destilada. y se agit nuevamente en vortex para homogeneizar. Finalmente se pas una pequea muestra de cada tubo al espectrofotmetro a 540 nm.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Determinacin de la concentracin de azcares. Para conocer la concentracin de azcares presentes en las muestras se realizaron diluciones a partir de una solucin estndar de glucosa 2.0 mg/ml y se utiliz DNS como indicador colorimtrico de azcares reductores en solucin. En la (Tabla 2) pueden observarse los valores de absorbancia obtenidos en las diluciones. Para cada dilucin se realizaron 5 replicados, de los cuales se obtuvieron resultados poco homogneos.
Tabla. 2. Datos de absorbancia (nm) obtenidas para las curvas de calibracin. Los tubos (1-5) equivalen a las diluciones establecidas (Tubos 2-6, Tabla 1) y las diferentes replicaciones (Eq.1 - Eq. 5). A pesar de partir de la misma concentracin de glucosa, las replicaciones no muestran resultados iguales.
Con los datos obtenidos para la absorbancia y utilizando la frmula [C1V1=C2V2] se calcul la concentracin de glucosa presente en cada dilucin. Los resultados de la absorbancia y la concentracin se graficaron (Grfico 1) para obtener la curva de calibracin.
Grfico 1. Curvas de concentracin de glucosa. Se realizaron 5 curvas de calibracin (Eq. 1, 2, 3, 4, 5), una por cada equipo de laboratorio. Eq.2 es la curva ms cercana a la tendencia lineal y se utiliz en los anlisis posteriores. Se muestra la ecuacin y la regresin lineal (Lineal Eq. 2) para la curva Eq.2, con una R 2 =0.9971. Se puede observar la diferencia entre las rplicas, y en especial Eq.2 con R2= 0.9971, muestra una mayor tendencia lineal. Al ser necesaria dicha relacin para determinar la concentracin de las muestras, se utiliz la ecuacin de la curva para calcular las concentraciones (Tabla 3) a partir de la absorbancia obtenida previamente.
Tabla 3. Concentracin de azcar obtenida en el macerado libre de levadura (Jugo) y en el macerado que contena el inculo de levadura (Inculo).
Determinacin de pH Con el fin de observar las diferencias en el pH durante el proceso de fermentacin, se realiz una medicin previa a la incubacin y una segunda medicin, posterior al proceso de incubacin.
Tabla 4. Determinacin del pH de las muestras. Se hicieron dos mediciones de pH: al inicio del tratamiento (Ti), antes de mezclar Inculo y Jugo en un solo contenedor, y despus del tratamiento (Tf), con ambas muestras en un solo contenedor.
Determinacin del grado de alcohol.
Para la determinacin del grado de alcohol de las muestras, se utiliz un alcoholmetro. Debido a un mal uso del instrumento, se hizo una medicin errnea, tomando el volumen desplazado por el alcoholmetro al ser introducido a la muestra:
Inculo = 85 mL desplazados
Posteriormente, se realizaron diluciones de una muestra de Tequila, con un grado de alcohol conocido (32), en cada dilucin se tomaba el volumen desplazado ( no se muestran los datos). Obteniendo al final una dilucin 1/16 con 75 mL de volumen desplazado y 5 de alcohol. Haciendo la conversin, el volumen desplazado en la muestra final corresponde Inculo = 85 mL desplazados = 5.6 alcohol Es importante sealar, que para los clculos se utilizaron las mediciones realizadas con el alcoholmetro de 0-20 ya que haba una variacin entre ste y el alcoholmetro 0-10. posteriormente, se realiz la medicin de alcohol en agua, como control. El resultado (1 alcohol) se utiliz para ajustar el observado en la muestra, con un resultado final:
Inculo = 85 mL desplazados = 4.6 alcohol
DISCUSIN
Para obtener la curva de calibracin y conocer las concentraciones de glucosa presentes en las muestras de inculo y jugo, se realiz la prueba de determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS, este mtodo implica una reaccin colorimtrica y una reaccin tipo redox entre el DNS y los azcares de las muestras. La oxidacin del azcar ocurre en el hidroxilo libre del carbono 1, mientras que el cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS) se reduce en el NO2 del lugar 3 o 5.
A pesar de que cada una de las rplicas se realiz partiendo de una misma solucin, al graficar los resultados (Grfico 1) se observaron variaciones entre los equipos, estas diferencias pudieron haber ocurrido por el error humano durante el pipeteo o la medicin errnea de los volmenes empleados. Debido a esta heterogeneidad en los resultados y a que fue la curva en la que ms puede apreciarse una tendencia lineal se eligi la curva con mejores resultados (Equipo 2) para obtener la concentracin de las muestras.
Las concentraciones de glucosa que se obtuvieron para el inculo y el jugo segn la curva de calibracin fueron de 0.68 y 3.95 respectivamente, lo que era de esperarse ya que en el jugo (donde no se inocul levadura) los azcares no se haban degradado o empleado en ninguna ruta metablica por lo cual su concentracin deba ser mucho ms alta, mientras que en la muestra donde se permiti proliferar la levadura, la concentracin de glucosa es menor. Al inicio y al final del experimento se registraron los datos de pH, obteniendo un aumento en el pH del inculo de 3.39 a 4.38, esto puede deberse a la presencia de etanol como producto de la actividad metablica de S. cerevisiae, ya que el etanol puro es neutro, un aumento en el pH supone un aumento en la cantidad de alcohol de la muestra con respecto al inicio del la inoculacin. Se encontraron problemas tcnicos al determinar el grado de alcohol de las muestras, ya que el mtodo empleado en un principio no fue el adecuado, ambos alcoholmetros difieren en los resultados y no se realizaron ajustes de temperatura. Por ello, los grados de alcohol no pueden tomarse como datos enteramente confiables.
Un problema que ocurri con frecuencia en el grupo fue que el proceso de fermentacin se detuvo, esto debe muy probablemente a que la concentracin de glucosa y fructosa en los preparados era diferente, en general, los azcares fermentables ms usados para S. cerevisiae son la glucosa y la fructosa, pero existe un empleo preferencial de la glucosa sobre la fructosa, y se ha llegado a explicar que el proceso de fermentacin se detiene cuando el azcar disponible es en su mayora fructosa, adems los azcares son consumidos primordialmente durante la fase estacionaria, conforme avanza el proceso, el nitrgeno se reduce gradualmente y dada su importancia, el metabolismo celular baja, al mismo tiempo que se acumula alcohol, haciendo txico el ambiente, y difcil la asimilacin de fructosa, parando la fermentacin, esto a niveles industriales representa un problema cifrado en millones de dlares anuales.
CONCLUSIONES
Se logr la obtencin del alcohol como metabolito primario de la fermentacin realizada por la levadura ms comnmente usada en la industria, Saccharomyces cerevisiae, en el mosto o jugo de uva que realiza la degradacin de glucosa como parte de su metabolismo para la obtencin de energa, generando como producto de desecho el alcohol. Se evalu el grado de fermentacin alcohlica a travs de la medicin de los grados de alcohol con ayuda del alcoholmetro, y la presencia de azcares reductores usando DNS, as como tambin se pudieron observar las preferencias de la levadura por la glucosa y las limitaciones que esta tiene en cuanto a las concentraciones de oxgeno para la degradacin de fructosa. Otro de los indicadores para corroborar la accin de la levadura fueron los cambios en el pH asociados con la produccin del mismo alcohol y la degradacin de la glucosa.
BIBLIOGRAFA - Campbell, N., & Reec, J., . (2007). Biologa. Mdica Panamericana. Madrid. Espaa. - Dumont, A., Raynal, C., Raginel. F., Ortiz-Julien, A., Surez, C. y Heras, J. M.Ed. Lallemand. (2008). La capacidad de las bacterias enolgicas para consumir fructosa. - Owen P. Ward. (1991). Biotecnologa de la fermentacin: principios, procesos y productos Ed. Acribia. - Vzquez, H.J., .(2007)."Fermentacin alcohlica: Una opcin para la produccin de energa renovable a partir de desechos agrcolas" INGENIERA Investigacin y Tecnologa VIII. 4 - Vela-Vicent, M., Blanco-lvarez, et. Al. (2006) Qumica industrial orgnica. - Wang, D.,Cooney, et. Al. (1979). Fermentation and enzyme technology Ed. Wiley John & Sons, Inc.