Monografía Cultivo de Protoplastos 2014I

Cultivo de Protoplastos 2014
UNIVERSIDAD NACIONAL UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA AGRARIA LA MOLINA
Facultad de Ciencias
Departamento de Biologa
Curso:
CULTIVOS DE CLULS
! TE"IDOS VE#ETLES
Tema:
Culti$o de %rotoplastos:
Aislamiento, cultivo e importancia en
el mejoramiento vegetal.
Profesora:
Dra. Antonietta Gutirrez Rosati

-8 de mayo del 2014-
0
TABLA DE CONTENIDO
I. GLOSARIO........................................................................................................... 10
II. I!ROD"##I$.................................................................................................. 10
III. D%&II#I$...................................................................................................... 11
I'. #ARA#!%R(S!I#AS D% LOS )RO!O)LAS!OS....................................................12
'. AISLA*I%!O D% )RO!O)LAS!OS......................................................................12
1. *todo *e+,ni+o............................................................................................ 12
2. *todo enzim,ti+o.......................................................................................... 1-
'I. )"RI&I#A#I$ D% LOS )RO!O)LAS!OS...........................................................1.
1. Remo+i/n de de0ris y enzimas........................................................................1.
2. La elimina+i/n de 1roto1lastos rotos...............................................................1.
-. )rue0as de 2ia0ilidad de 1roto1lastos y de la 3orma+i/n de 1ared.................1.
4. 'ia0ilidad de 1roto1lastos...............................................................................1.
'II. !4#I#AS D% #"L!I'O )ARA )RO!O)LAS!OS AISLADOS................................20
1. *edio de +ulti2o................................................................................................. 20
2. Re5uladores........................................................................................................ 20
-. &uentes +ar0onadas........................................................................................... 21
4. Sistemas e61erimentales 1ara el +ulti2o de 1roto1lastos aislados.....................21
7. Densidad de 1roto1lastos y +re+imiento del 1roto1lasto en el medio de +ulti2o21
8. A2an+es inno2ati2os 1ara los +ulti2os de 1roto1lastos.......................................22
%stimula+ion el+tri+a de los 1roto1lastos..........................................................22
Su1lementa+i/n del medio de +ulti2o +on sur3a+tantes9 anti0i/ti+os y 1oliamidas
22
'III. !RAS&OR*A#I$ G%4!I#A #O )RO!O)LAS!OS.......................................2-
1. !rans3orma+i/n mediada 1or A5ro0a+terium.....................................................2-
2. !rans3orma+i/n 1or medio :u;mi+o 1oli+ati/ni+o................................................2-
-. !rans3orma+i/n 1or medio-ele+tro1ora+i/n........................................................24
4. Soni<+a+i/n9 li1osoma9 mi+ro-inye++i/n9 o1to1ora+i/n9 y trans3orma+i/n 1or
medio-laser............................................................................................................... 24
I=. A)LI#A#I$ D% LA &"SI$ D% )RO!O)LAS!OS..............................................27
=. A'A#%S % LA I'%S!IGA#I$ D% )RO!O)LAS!OS D% )LA!AS....................2.
1. Ra+ionaliza+i/n de la re5enera+i/n....................................................................2.
2. A2an+es en la 3usi/n y 3ra5menta+i/n de 1roto1lastos.......................................-2
-. #ara+teriza+i/n de >;0ridos som,ti+os...............................................................-2
1
#onstitu+i/n +romos/mi+a y esta0lidad.............................................................-2
#ri0ado de 5enoma9 +ito1lasmoma9 trans+ri1toma y 1roteoma.........................-2
4. 'aloriza+i/n a5r;+ola........................................................................................... -2
=I. ?I?LIOGRA&(A.................................................................................................. --
2
I. GLOSARIO
Protoplasto: #om1onentes 2i2os de las +lulas 2e5etales :ue est,n
rodeados s/lo 1or la mem0rana 1lasm,ti+a9 +onstituyen las +lulas desnudas
de una 1lanta.
Sspe!s"o!es #ellares: +lulas li0res y a5re5ados +elulares distri0uidos
en un medio en mo2imiento.
C$llas %el mes&'lo: son +lulas de 1arn:uima9 entre la e1idermis del >az
y el en2s9 :ue 1oseen una 5ran +antidad de +loro1lastos9 relati2amente
desor5anizados y +on mu+>os es1a+ios de aire entre las +lulas9 lo +ual
3a+ilita el inter+am0io de 5ases.
Nrse #ells@ +lulas :ue ayudan a estimular al +re+imiento a 1roto1lastos
aislados de inters. %stos 1ueden ser de la misma o de di3erente es1e+ie
Protoplast(to(pla!t s)stems: Sistema 1ara el esta0le+imiento del +ulti2o e
indu++i/n de la re5enera+i/n de la 1lanta a 1artir de 1roto1lastos aislados.
Pol"*ala#tro!asa: %nzima >idrolasa9 endo o e6o5lu+anasa9 :ue ini+ia el
+orte >idrol;ti+o 1or el e6tremo no redu+tor del 1ol;mero de 1e+tina.
Pe#t"!a: #onAunto +om1leAo de 1ol;meros rami<+ados del ti1o de los
+ar0o>idratos. La 1e+tina no solo est, 1resente en la 1ared +elular 1rimaria9
sino tam0in en la l,mina media entre las +lulas de la 1lanta9 donde ayuda a
las +lulas a mantenerse Auntas.
De+r"s: #lulas no di5eridas durante el 1ro+eso de aislamiento de
1roto1lastos o 1roto1lastos rotos. *aterial de dese+>o durante la 1uri<+a+i/n.
Osmot"#m: %sta0ilizador o re5ulador osm/ti+o del medio.
L)mp,oprep: *edio de 5radiente de densidad re+omendado 1ara el
aislamiento de +lulas mononu+leares mediante la e61lota+i/n de las
di3eren+ias en la densidad +elular.
II. INTROD-CCI.N
"na di3eren+ia 3undamental entre las +lulas de 1lantas y animales es la 1resen+ia
de una 1ared +elular en 1lantas. %sta9 a 1esar de Au5ar un 1a1el +la2e en los
1ro+esos rela+ionados +on la estru+tura y 3un+i/n de la 1lanta9 es un o0st,+ulo
im1ortante en la e61lota+i/n de la trans3eren+ia dire+ta de AD a las +lulas
indi2iduales y la 1rodu++i/n de >;0ridos som,ti+os 1or 3usi/n +elular B#om1ton et
al.9 2000CD es de+ir9 la 1ared +elular +onstituye un serio im1edimento en los
1ro5ramas de meAoramiento de +ulti2os a tra2s de la >i0rida+i/n B!omar and
Dantu9 2008C.
A3ortunadamente9 la 1ared +elular se 1uede retirar tem1oralmente de +lulas de la
1lanta sin una 1rdida si5ni<+ati2a de 2ia0ilidad. Las +lulas 2e5etales a las +uales
se les >a :uitado la 1ared +elular son llamadas protoplastos. Los 1roto1lastos son
3
al5o Eni+o en +ulti2o de +lulas 2e5etales ya :ue e6isten +omo +lulas se1aradas y
sin +ontinuidad +ito1lasm,ti+a +on las +lulas 2e+inas B#om1ton et al.9 2000C.
Los 1roto1lastos de 1lanta 1rimero se aislaron 1or Fler+Ger en 18.2 1or +orte de las
es+alas de 0ul0o de +e0olla +on un +u+>illo <no en una solu+i/n H1lasmolyzin5I9 lo
:ue result/ en la li0era+i/n de 1roto1lastos +uando las +lulas 3ueron +ortadas a
tra2s de la 1ared B?>oAJani y Razdan9 1.8-C. %l rendimiento de 1roto1lastos 3ue
0aAo y el 1ro+edimiento se limita0a a +lulas muy 2a+uoladas9 +lulas no-
meristem,ti+as. %l aislamiento de 1roto1lastos se >izo m,s am1liamente 1ra+ti+ado
en la d+ada de 1.80 +on la e6tra++i/n y 1uri<+a+i/n de las enzimas :ue 1odr;an
ser utilizadas 1ara de5radar la 1ared +elular de la 1lanta. #o+Gin5 B1.80C des+u0ri/
:ue los 1roto1lastos inta+tos 3,+ilmente 1odr;an ser o0tenidos mediante la
in+u0a+i/n de los teAidos 2e5etales en una solu+i/n +on+entrada de +elulasa
1re1arada a 1artir del >on5o Myrothecium verruatria B#om1ton et al.9 2000C.
%l aislamiento de 1roto1lastos es a>ora de rutina en una am1lia 5ama de es1e+iesD
los 1roto1lastos 2ia0les son 1oten+ialmente toti1otentes. )or lo tanto9 +uando se les
da los est;mulos :u;mi+os y 3;si+os +orre+tos9 +ada uno es +a1az9 te/ri+amente9 de la
re5enera+i/n de una nue2a 1ared y de someterse a la di2isi/n mit/ti+a 1ara
1rodu+ir +lulas >iAas de la :ue las 1lantas 3rtiles se 1ueden re5enerar mediante el
1ro+eso de +ulti2o de teAidos BDa2ey et al.9 2004C. o s/lo los 1roto1lastos aislados9
1ero su 1rodu+to de 3usi/n9 un >;0rido som,ti+o9 tam0in se 1ueden re5enerar en
1lantas enteras. Asimismo 1ueden +a1tar AD e6tranAero9 a tra2s de su mem0rana
1lasm,ti+a desnuda9 0aAo tratamientos es1e+;<+os. )ro1or+ionan adem,s un
sistema e61erimental 1ara una am1lia 5ama de estudios 0io:u;mi+os y mole+ulares
:ue 2an desde las in2esti5a+iones en las 1ro1iedades de +re+imiento de las +lulas
indi2iduales >asta el trans1orte de mem0rana B!omar and Dantu9 2008C. Sistemas
de 1roto1lastos-a-1lanta B)roto1last-to-1lant systemsC est,n dis1oni0les 1ara
mu+>as es1e+ies +on una e6tensa literaturaD sin em0ar5o9 los 1ro+edimientos
0,si+os 1ara su aislamiento >an su3rido 1o+os +am0ios desde la 1rimera 2ez :ue
3ueron re1ortados BDa2ey et al.9 2004C.
%s as; :ue la 1resente mono5ra3;a tiene +omo o0Aeti2o 5eneral re2isar los as1e+tos
+la2e a+er+a del +ulti2o de 1roto1lastos9 in+luyendo desde su de<ni+i/n9
aislamiento9 1uri<+a+i/n9 +ulti2o9 >asta sus a1li+a+iones en el meAoramiento
5enti+o 2e5etal. Se mantendr, una 2isi/n 5lo0al del tema9 de manera :ue 1ueda
ser Etil 1ara di2ersos ti1os de 1lantasD aun:ue tam0in se e61ondr,n +asos
es1e+;<+os de inters :ue ser2ir,n 1ara ilustrar el uso de 1roto1lastos a+tualmente.
III. DE/INICI.N
Los 1roto1lastos son +lulas de 1lantas9 >on5os o 0a+terias en las :ue la 1ared
+elular se >a eliminado9 1ero la mem0rana 1lasm,ti+a est, inta+ta. Sin em0ar5o9
esta re2isi/n de literatura se +entrar, es1e+;<+amente en los 1roto1lastos de ori5en
2e5etal.
%l 1roto1lasto 2e5etal aislado es una sola +lula9 limitada 1or el 1lasmalema y9
+uando re+in se 3orma9 +ontiene todos los +om1onentes de las +lulas normales9 a
4
1esar de ser se1arado +om1letamente de su 1ared +elular. Desde un 1unto de 2ista
<siol/5i+o9 sin em0ar5o9 los 1roto1lastos no 1ueden +onsiderarse sim1lemente
+omo una +lula :ue +are+e de 1ared9 ya :ue la me+,ni+a del aislamiento9 Aunto +on
3a+tores am0ientales9 sin duda inKuyen en su meta0olismo y sus+itan +am0ios
ultraestru+turales sutiles. La ausen+ia de una 1ared +elular 3un+ional 1uede a3e+tar
a la 1ermea0ilidad de la mem0rana +elular y dar lu5ar a una 3u5a 5eneral de solutos
del 1roto1lasto. %l 1roto1lasma es tam0in en un estado transitorio ya :ue la
mayor;a de 1roto1lastos9 inde1endientemente de su entorno inmediato9 ini+iar, la
s;ntesis de una nue2a 1ared +elular al5unas >oras des1us de la li0era+i/n9 y9
<nalmente9 2ol2er, a ser una +lula +on 1ared BSmit> L. 1.M8C.
De0ido a la ausen+ia de la 1ared +elular9 los 1roto1lastos son ade+uados 1ara
di2ersas y di3erentes mani1ula+iones 5enti+as :ue no ser;an 1osi0les +on 1lantas o
+lulas inta+tas. Los 1roto1lastos sir2en adem,s +omo >erramientas e61erimentales
Eni+as 1ara mu+>as in2esti5a+iones <siol/5i+as9 0io3;si+as y 0io:u;mi+as BSza0ados9
L. 1..1C.
I0. CARACTER1STICAS DE LOS PROTOPLASTOS
Las +ara+ter;sti+as es1e+;<+as de los 1roto1lastos de1enden de su ori5en de
e6tra++i/n9 ya sea la es1e+ie o +lula es1e+ializadaD y el resultado o0tenido des1us
de ser +ulti2ado9 del mtodo usado. %n mu+>os +asos B%e+G>aut et al9 201-C9 de
a+uerdo a la es1e+ie9 se +ontrola el ti1o de resultado 1ara un <n es1e+ial +omo
re5enera+i/n9 meAoramiento de 1lantas9 et+. %n el si5uiente +uadro se men+ionan
al5unas +ara+ter;sti+as :ue se de0en tomar en +onsidera+i/n 1ara el 1ro1/sito del
estudio a realizar.
PROTOPLASTO CARACTER1STICA
2es&'lo #ontienen +loro1lastos 2erdes y en luz
muestran a+ti2idad 3otosintti+a
Sspe!s"o!es #ellares #ontienen 5ranos de almid/n
Se 1ueden usar 1ara aislamiento de
nE+leos +elulares9 as; +omo +romosomas
mit/ti+os y mei/ti+os.
Alero!a %e sem"llas %e a3e!a Se+retan amilasa y RAsa en 1resen+ia
de ,+ido 5i0erli+o
N&%los %e ra4#es %e le*m"!osas )ueden redu+ir el a+etileno
L"+res %l +>o:ue osm/ti+o o+asiona +am0ios en
el 1atr/n de RA y s;ntesis de 1rote;nas
B1rote;nas de +>o:ue osm/ti+oC.
&a+ilidad de aislar y 1uri<+ar or5,nulos.
5
&uente@ )roto1lastos. Aislamiento9 +ulti2o y re5enera+i/n de 1lantas BSza0ados9 L.
1..1C
0. AISLA2IENTO DE PROTOPLASTOS
Antes de entrar en los detalles so0re el +ulti2o de 1roto1lastos9 es im1ortante aislar
lo m,s sua2emente y m,s r,1idamente 1osi0le los 1roto1lastos 2ia0les y no
lesionados. Los dos mtodos 1ara el aislamiento de 1roto1lastos son@ mtodo
me+,ni+o y mtodo enzim,ti+o.
a& '(todo 'ec)nico
%l mtodo me+,ni+o tiene9 ante todo9 un inters >ist/ri+o9 ya :ue su rendimiento es
0aAo9 su 1ro+edimiento tedioso y su a1li+a0ilidad limitada BSza0ados9 L. 1..1C.
Fler+Ger B1.82C 3ue el 1rimero en aislar 1roto1lastos a 1artir de teAidos de 0ul0os de
+e0olla. Las +a1as 3ueron sumer5idas en sa+arosa al 1.0 * >asta :ue el 1roto1lasto
se +ontrai5a de su 1ared +elular9 y lue5o el teAido 1lasmolisado 3ue +ortado +on un
+u+>illo a<lado tan del5ado :ue solamente las 1aredes +elulares sean +ortadas sin
daNar los 1roto1lastos. %stos <nalmente son li0erados mediante el resta0le+imiento
de su ni2el osm/ti+o +uando se +olo+an en una solu+i/n >i1ot/ni+a B0aAa
+on+entra+i/n de sa+arosaC B!omar and Dantu9 2008C.
Figura 1 Tejido cortado en la lnea punteada (A), algunas clulas liberan protoplastos completos y el resto de
clulas producen protoplastos rotos muertos como se muestra en (B) marcado con asteriscos.
*& '(todo en+im)tico
%ste mtodo im1li+a el uso de enzimas 1ara disol2er la 1ared +elular 1ara la
li0era+i/n de 1roto1lastos. Se lle2aron a +a0o estudios ini+iales so0re el aislamiento
de 1roto1lastos de +lulas de le2adura mediante la di5esti/n de la 1ared +elular
utilizando los Au5os 5,stri+os o0tenidos del +ara+ol9 Halix poneatia. Sin em0ar5o9 el
+rdito de desarrollo de la t+ni+a de aislamiento de 1roto1lastos de alto
rendimiento a 1artir de 1roto1lastos de 1lantas su1eriores es de #o+Gin5 B1.80C. Se
em1le/ una 1re1ara+i/n +ruda de +elulasa a 1artir del >on5o Myrotheaum
verrucaria 1ara disol2er la 1ared +elular y li0erar los 1roto1lastos a 1artir de ra;+es
de tomate. Des1us este mtodo +on las modi<+a+iones ade+uadas y utilizando
6
enzimas 1uri<+adas >a sido utilizado am1liamente 1or otro 5ru1o de tra0aAadores
B!omar and Dantu9 2008C.
Los 1rin+i1ales 3a+tores :ue se de0en +onsiderar 1ara el 6ito de este mtodo son@
%l ti1o de enzimas :ue se usar,n
La +om1osi+i/n del medio en :ue ellas a+tuar,n
*aterial de ori5en de los 1roto1lastos.
a) %nzimas 1ara el aislamiento de 1roto1lastos
Lay dos en3o:ues 0,si+os 1ara el aislamiento enzim,ti+o de 1roto1lastos@ BaC el
tratamiento de un teAido 2e5etal +on una mez+la de 1e+tinasa y +elulasa as; al
mismo tiem1o se se1aran las +lulas y de5radan sus 1aredes B)oten+ia y #o+Gin59
1.M0CD y B0C el mtodo se+uen+ial Ben dos 1asosC :ue im1li+a la 1rodu++i/n de
+lulas aisladas9 a 1artir del +allo o teAido mediante el uso de 1e+tinasa B!omar and
Dantu9 2008C9 las +uales a su 2ez se +on2ierten en 1roto1lastos 1or un tratamiento
+on +elulasa :ue di5iere la 1ared +elular Ba5ata y !aGe0e9 1.M0D +itado 1or Smit>9
1.M8C.
Las enzimas utilizadas 1ara el aislamiento de 1roto1lastos son e6tra+tos +rudos de
ori5en 3En5i+o. Las 1e+tinasas son ri+as en a+ti2idad 1oli5ala+turonidasa mientras
:ue las +elulasas +ontienen >emi+elulosa9 O -194- 5lu+anasa9 :uitinasa9 li1asa9
nu+leasas y 1e+tinasa BSmit>9 1.M8C. )ara utilizar las 1re1ara+iones enzim,ti+as
+omer+iales B!a0la 1C en al5unos teAidos9 se a+onseAa eliminar las sales :ue
+ontienenD esto se 1uede >a+er <ltr,ndolas +on una +olumna de ?io5el o de
Se1>ade6 G27 o G70 BSza0ados9 L. 1..1C.
7
Tabla 1 Enimas !ue se utilian para el aislamiento de protoplastos (Fuente" #abados, $. 1%%1)
b) %l medio de in+u0a+i/n
Dado :ue la elimina+i/n de la 1ared +elular resulta en la 1rdida de 1resi/n de la
+lula9 los 1roto1lastos son aislados y mantenidos en un medio >i1ert/ni+o
1lasmol;ti+o 1ro1or+ionado 1or una sal inor5,ni+a e:uili0rada o una solu+i/n de
azE+ar monosa+,rido BSmit>9 1.M8C.
As;9 el material de in+u0a+i/n :ue se utiliza 1ara el aislamiento de 1roto1lastos
+onsta de los si5uientes elementos@ enzimas disueltas en una solu+i/n :ue
+onten5a al5unas sales B+omo #a#l
-
9 FL
2
)O49 *5#l
2
C9 un medio de +ulti2o9 un
amorti5uador Bsolu+i/n tam1/nC9 y un esta0ilizador o re5ulador osm/ti+o. %l +al+io
B1 a 10m*C es un in5rediente esen+ial y el ion 3os3ato B0.7 a 2.0 m*C es 0en<+o
1ara +onser2ar la 2ia0ilidad de los 1roto1lastos.
A menudo la solu+i/n +ontiene +omo amorti5uadores B0uPerC 3os3ato o *%S Q,+ido
2B-mor3olinoC-etanosul3/ni+oR a una +on+entra+i/n de - m*. Los esta0ilizadores
osm/ti+os m,s +omunes son el manitol9 el sor0itol9 la 5lu+osa y la sa+arosa
BSza0ados9 L. 1..1C. %l manitol9 1or eAem1lo9 no es trans1ortado 3,+ilmente a tra2s
de la mem0rana 1lasm,ti+a y9 1or tanto9 1ro1or+iona un entorno osm/ti+o esta0le
1ara los 1roto1lastos BSmit>9 1.M8C. Generalmente9 el 1oten+ial osm/ti+o se aAusta
de tal manera :ue las +lulas sean le2emente 1lasmolizadas durante la di5esti/n de
la 1ared. La osmolaridad /1tima 2ar;a de 0.- a 0.M *. "n 1L ,+ido en el ran5o de
7.0-8.0 es el /1timo.
+C Fuentes para la obtencin de protoplastos
8
%n teor;a9 es 1osi0le aislar 1roto1lastos de +ual:uier ti1o de 1lanta9 /r5ano o teAido9
1ero las 3uentes :ue se usan +orrientemente son mes/<lo 3oliar y teAidos +ulti2ados
in vitro +omo +lulas en sus1ensi/n9 +allos9 y ,1i+es de 1l,ntulas 5eneradas in vitro
B&i5ura 2C BRuesinG9 1.80D 'asil et al.9 1.80SD e6tra;do de Sza0ados9 L. 1..1C. Se
utilizan en la 3ase de +re+imiento9 ya :ue la +om1osi+i/n de la 1ared +elular 1rimaria
2ar;a a 1rodu+tos se+undarios9 tales +omo li5nina9 mientras m,s maduro es el
+ulti2oD >a+indolo menos sus+e1ti0le a la de5rada+i/n +om1leta de +elulasa
BSmit>9 1.M8C.
El mes&'lo #omo fe!te %e protoplastos. %l estado <siol/5i+o del teAido 3oliar
inKuye sustan+ialmente en el rendimiento y 2ia0ilidad de los 1roto1lastos. )ara
li0erar 1roto1lastos de 0uena +alidad9 las 1lantas se de0en +ulti2ar en +ondi+iones
+ontroladas Bin2ernadero9 +,mara de +re+imientoC9 donde se 1uedan o1timizar la
luz9 la tem1eratura9 la 3ertilidad del suelo y la >umedad. "sualmente se utiliza una
luz de 109000 a -09000 lu6 y un 3oto1eriodo de 18 / 18 >. %s esen+ial +ontar +on un
0uen suministro de a5ua y +on 3ertiliza+i/n re5ular BSza0ados9 L. 1..1C.
Al5unas 2e+es los 1roto1lastos aislados resultan m,s esta0les si las 1lantas se
+onser2an 1re2iamente en la os+uridad durante al5unos d;as. %n +iertos +asos9 1ara
meAorar la 2ia0ilidad de los 1roto1lastos aislados9 es a+onseAa0le el 1retratamiento
del teAido 3oliar en un medio +on >ormonas de +re+imiento9 en di3erentes
+ondi+iones de luz y tem1eratura BSza0ados9 L. 1..1C.
Las sspe!s"o!es #ellares #omo fe!te %e protoplastos. De0ido a :ue las
sus1ensiones son >etero5neas y a menudo est,n +om1uestas de a5re5ados de
di3erentes tamaNos y de +lulas li0res9 no todas las +lulas est,n en +ondi+iones
/1timas 1ara la li0era+i/n de 1roto1lastosD la li0era+i/n en este +aso de1ende
tam0in de las +ondi+iones de +re+imiento de las +lulas +ulti2adas.
Se >a en+ontrado :ue +uando se +ulti2an 1roto1lastos deri2ados de sus1ensiones9
el 6ito de1ende +laramente de la +alidad de la sus1ensi/n +elular :ue se >a
utilizado. Los 1roto1lastos de sus1ensiones +elulares :ue est,n en +re+imiento
lo5ar;tmi+o +omienzan a di2idirse muy r,1idamente9 mientras :ue los deri2ados de
sus1ensiones m,s 2ieAas T1or eAem1lo9 en la 3ase de e61ansi/n +elularT re5eneran
la 1ared +elular y se di2iden +on menor 3re+uen+ia B)otryGus et al.9 1.M.0D !eJes et
al.9 1.84C.
Los 1roto1lastos se de0er;an aislar de a5re5ados de +lulas de ti1o meristmi+oD en
estas +lulas en a+ti2a di2isi/n9 el rendimiento 1uede ele2arse a +asi el 100U
mediante la mani1ula+i/n del 1er;odo de su0+ulti2o y de la tasa de dilu+i/n. Antes
del aislamiento de los 1roto1lastos la sus1ensi/n +elular de0er;a su0+ulti2arse +on
una 3re+uen+ia de 1 a 4 d;as B)otryGus et al.9 1.M.09 +itado 1or Sza0ados9 L. 1..1C.
)or eAem1lo en el +enteno9 *a et al. B200-C utiliz/ un +allo de +re+imiento r,1ido9
dis5re5a0le ini+iado a 1artir de inKores+en+ias inmaduras 1ara esta0le+er
sus1ensiones de +lulas em0rio5ni+as +omo una 3uente de 1roto1lastos
9
toti1otentes. De manera similar9 en otras mono+otiled/neas tales +omo 1l,tano9
sus1ensiones de +lulas 3ueron el material 3uente 1re3erida de0ido a su toti1oten+ia9
ya :ue los de la >oAa de mes/<lo y +allos eran re+al+itrantes en +ulti2o BDa2ey et al.9
2004C.
)or otra 1arte9 tam0in se >a en+ontrado :ue los 1roto1lastos de las 5ram;neas son
e6tremadamente re+al+itrantes al +ulti2oD +on la Eni+a e6+e1+i/n de los 1roto1lastos
1ro2enientes de tallos de ma;z B)otryGus et al.9 1.MMC9 no se >an 1odido +ulti2ar
e6itosamente 1roto1lastos de +ereales aislados de 1lantas enteras. Los resultados
ne5ati2os de numerosos e61erimentos >an lle2ado a la +on+lusi/n de :ue las
+lulas di3eren+iadas de los +ereales de0en >a0er 1erdido el 1oten+ial de di2isi/n y
la toti1oten+ialidad B)otryGus9 1.80CD en +am0io9 los 1roto1lastos aislados de
sus1ensiones +elulares em0rio5ni+as se >an +ulti2ado +on 6ito BSza0ados9 L.
1..1CD es1e+ialmente en el +aso del arroz B!an5 et al.9 2001D +itado 1or Da2ey et al.9
2004C.
!ras el in3orme de :ue las +lulas 5uardianas son una 3uente Eni+a de 1roto1lastos
toti1otentes en la remola+>a azu+arera BLall et al.9 1..8C9 otros in2esti5adores >an
realizado e61erimentos. )or eAem1lo9 )andey et al. B2002C in3ormaron de los
1ro+edimientos 1ara aislar 1roto1lastos de +lulas 5uardianas de A. thaliana 1ara su
uso en estudios <siol/5i+os. Otras +lulas es1e+ializadas de la :ue >an sido
1re1arados 1roto1lastos in+luyen las del teAido +entral de n/dulos de la ra;z de !icia
"aba9 donde las +lulas in3e+tadas +on 0a+teroides de #hi$obium se 1rodu+en Aunto
+on las +lulas no in3e+tadas B)eiter et al.9 200-C. %l aislamiento in2olu+ra la
dise++i/n de n/dulos lue5o la di5esti/n de la 1ared en solu+i/n >i1ert/ni+a9 la
li0era+i/n de 1roto1lastos en solu+i/n li5eramente >i1ot/ni+a9 y la se1ara+i/n de las
3ra++iones de 1roto1lastos 1or +entri3u5a+i/n iso1;+ni+a en 5radiente de densidad.
!ales 1roto1lastos son Etiles en las in2esti5a+iones <siol/5i+as de trans1orte de la
mem0rana 1lasm,ti+a. BDa2ey et al.9 2004C.
d) %s:uema de a1li+a+i/n 1ara aislamiento de 1roto1lastos
"n es:uema de a1li+a+i/n 5eneral 1ara la 1rodu++i/n de 1roto1lastos9 utilizando el
1ro+edimiento de mi6ed-enzyme9 se muestra en la <5ura 2. )ara :ue las enzimas
5anen a++eso a los teAidos de la 1lanta9 +omo en el +aso de la >oAa de em1alizada y
+lulas meso3;li+as9 la e1idermis in3erior de0e ser remo2ida mediante des+ama+i/n
o di5esti/n 1ar+ial +on +utinasa. #iertos ti1os de >oAas9 en 1arti+ular de los +ereales9
de0en ser +ortadas antes de la in+u0a+i/n de la enzima9 ya :ue la e1idermis no
1uede ser 3,+ilmente remo2ida. La mayor;a de los teAidos de las 1lantas y /r5anos
Bra;+es9 n/dulos de las ra;+es9 +ole/1tilo9 e1idermis de la >oAa9 1talos9 la
5ermina+i/n de los 5ranos de 1olen9 la 1la+enta de 3rutas9 ttradas y
mi+ros1oro+itosC 1rodu+ir,n 1roto1lastos des1us de un aAuste ade+uado de la
mez+la de enzimas y 1lasmolyti+um. )or eAem1lo9 la 1ared ttrada 1olen +onsta de
+alosa y as; s/lo una enzima ri+a en O -19- - 5lu+anasa Benzima del Au5o di5esti2o
del +ara+olC li0erar, 1roto1lastos.
10
Des1us de la in+u0a+i/n de la enzima9 los 1roto1lastos es3ri+os B&i5ura -C de0en
se1ararse de los dese+>os +elulares9 su01roto1lastos y 2a+uolas. Su01roto1lastos se
3orman durante 1lasm/lisis tem1rana +uando la 1roto1lastos se di2ide en dos o m,s
su0unidades9 al5unos de los +uales ser,n anu+leados y 1or lo tanto no 2ia0les. La
se1ara+i/n se 1uede +onse5uir 3,+ilmente en una 2ariedad de maneras@ re1etida
resus1ensi/n y +entri3u5a+i/n de 1roto1lastos en un medio de la2adoD de Kota+i/n
de 1roto1lastos en una solu+i/n de sa+arosa >i1ert/ni+a B&i5ura -CD 1aso de la
mez+la de in+u0a+i/n a tra2s de un tamiz de nylon de tamaNo de 1oro ade+uado
:ue 1ermite s/lo 1roto1lastos 1ara 1asar a tra2s D o 1or el uso de un sistema de
dos 3ases9 tal +omo de6trano - )%G B1olietilen5li+olC9 :ue se 0asa en una di3eren+ia
de densidad entre los 1roto1lastos y +lulas BFanai y %dJards 9 1.M-D re3erido en
Smit>9 1.M8C.
#on5elar los 1roto1lastos9 re+o5erlos des1us del la2ado y e6aminarlos en el
mi+ros+o1io ele+tr/ni+o o tratarlos +on a0rillantadores Kuores+entes :ue se unen
es1e+;<+amente a la +elulosa9 re2ela la ausen+ia total de <0ras de +elulosa en la
su1er<+ie de la 1lasmalema.
Figura & Es!uema de aplicaci'n general para el aislamiento, el la(ado y el recuento de protoplastos de
mes')ilo de la *oja. $os protoplastos aislados a partir de callos o suspensiones de clulas se manejan de la
misma manera. Fuente #mit*, 1%+,
11
12
Figura - (a) Protoplastos de mesfilo recin aislados (40 micras diam.) en medio l!"ido (Petunia hybrida). (#) $os
protoplastos (60 micras diam.) li#eradas por las cl"las c"lti%adas. &l n'cleo en posicin central est( rodeada por
cordones citoplasm(ticos (Parthenocissus tricuspidata). (c) )"sin ind"cida por nitrato de sodio entre "n
protoplasto del mesfilo (m)* !"e contiene cloroplastos* + "n protoplasto incoloro (c) aislado a partir de "na
s"spensin de cl"las. $os plastidios son %istos entrando en el citoplasma del protoplasto incoloro. (d)
,icrofoto-rafa electrnica de "n protoplasto mesfilo recin aislada (n . n'cleo/ c0 . cloroplasto/ c% . %ac"ola
central* p . plasmalema). (e) $a captacin de Rhizobium (1) en %esc"las en el citoplasma de "n protoplasto (p .
plasmalema). (,icroscopio electrnico proporcionadas por el 2r. ,1 2a%e+.)
13
0I. P-RI/ICACI.N DE LOS PROTOPLASTOS
%l 6ito del +ulti2o de 1roto1lastos re:uiere una 1o0la+i/n 1ura de 1roto1lastos
inta+tos y 2ia0les +on un alto rendimiento. As; los 1roto1lastos de0en ser 1uri<+ados
retirando el material no di5erido Bde0risC9 1roto1lastos re2entados y enzimas.
,& -emoci.n de de*ris / en+imas
Los de0ris 1ueden ser retirados de la sus1ensi/n de 1roto1lastos mediante el
<ltrado de la 1re1ara+i/n a tra2s de una malla de a+ero o ylone de 100V de
tamaNo de 1oro. Las enzimas se eliminan 1or +entri3u5a+i/n de la sus1ensi/n de
1roto1lastos a 800 r1m durante 7 minutos. Los 1roto1lastos se sedimentan en el
3ondo del tu0o de +entr;3u5a mientras :ue el so0renadante se elimina +on la ayuda
de una 1i1eta. Los 1roto1lastos se resus1enden en un medio de la2ado :ue
+ontiene s/lo un osmoti+um u osmoti+um +on medio nutriti2o o +loruro de +al+io
>idratado. La sus1ensi/n se +entri3u5a de nue2o 1ara resol2er los 1roto1lastos y el
medio de la2ado se de+anta. Las >uellas de la enzima se eliminan 1or la2ado de los
1roto1lastos dos o tres 2e+es +on el medio.
*& La eliminaci.n de protoplastos rotos
Los 1roto1lastos inta+tos se se1aran de los 1roto1lastos rotos mediante la
sus1ensi/n de la 1re1ara+i/n de 1roto1lastos en solu+i/n de sa+arosa al 20-40 U y
la +entri3u5a+i/n a -70 r1m durante tres minutos. )roto1lastos inta+tos se a+umulan
en la 1arte su1erior de la solu+i/n de sa+arosa y se retiran +uidadosamente +on una
1i1eta BGre5ory y #o+Gin59 1.87D ener5;a y #o+Gin59 1.M0D %2ans et al9 1.M2C.
S+>enG y Lilder0randt B1.M1C utilizaron solu+i/n de &i+oll mientras LarGin B1.M8C
utiliz/ 0uPer de densidad 1ara la 1uri<+a+i/n de 1roto1lastos. %n este mtodo de
097--90 2olEmenes de 1re1ara+i/n de 1roto1lastos 0ruto des1us de la <ltra+i/n a
tra2s de tela muselina estril se +olo+an so0re Iym1>o1re1 en el tu0o de +entr;3u5a
y se +entri3u5a a 70-200 5 durante a1ro6imadamente 10 minutos. Los 1roto1lastos
se :uedan +omo un anillo entre la solu+i/n de enzima y Iym1>o1re1D y los dese+>os
se asientan en la 1arte in3erior B<5. 4C. Los 1roto1lastos se eliminan de la inter3ase
+on una 1i1eta 1asteur.
c& %rue*as de $ia*ilidad de protoplastos / de la
0ormaci.n de pared
)ara un 1e:ueNo 2olumen de la sus1ensi/n de 1roto1lastos aNadir un 2olumen i5ual
de solu+i/n +al+oKuor al 091 U9 in+u0ar durante 7 minutos y lue5o o0ser2ar 0aAo el
mi+ros+o1io Kuores+ente. La 1ared ser, Kuores+ente y 1roto1lastos se5uir,n siendo
os+uros.
d& Via*ilidad de protoplastos
Dia+etato de Kuores+e;na B&DAC de solu+i/n en a+etona B7 m5WlC se aNade a la
sus1ensi/n de 1roto1lastos 1ara dar una +on+entra+i/n <nal de 0901 U. Des1us de
7 minutos a tem1eratura am0iente9 los 1roto1lastos se e6aminaron usando un
14
mi+ros+o1io Kuores+ente. Solamente los 1roto1lastos 2ia0les 1ueden ser 2istos
B!omar and Dantu9 2008C.
Figura . Formaci'n de anillo de puri)icaci'n de protoplastos y el material de desec*o (roto o clulas intactas)
se asientan en el )ondo. Fuente Tomar and /antu, &00,
15
0II. T5CNICAS DE C-LTI0O PARA PROTOPLASTOS
AISLADOS
1. *edio de +ulti2o
)ara 1oder 1lantear medios de +ulti2o e<+ientes 1ara 1roto1lastos9 lo 1rimero
:ue se de0e tener en +uenta es la 1resion osmoti+a. )or lo 5eneral9 los
1roto1lastos +omienzan a re5enerar la 1ared +elular en minutos9 1ero este
1ro+eso re:uiere +uidados en la 1resi/n osm/ti+a >asta :ue la 1ared +elular
1rimaria 1ueda +ontrarrestar la 1resi/n de tur5en+ia eAer+ida so0re el
+ito1lasma. )or otro lado9 se >a +om1ro0ado :ue la 1resi/n osm/ti+a tam0in
inKuye en la mitosis. %sta Eltima se mantiene +uando se diluye el medio de
+ulti2o +on una solu+i/n de +om1osi+i/n similar 1ero +on menos 1resi/n
osm/ti+a.
)roto1lastos de una misma es1e+ie 1ero de di3erentes teAidos y de di3erentes
es1e+ies tendr,n re:uerimientos nutri+ionales di3erentes. %n +onse+uen+ia9 los
medios de +ulti2o a lar5o 1lazo se determinaran em1;ri+amente. "ni2ersalmente9
y +omo >emos desarrollado en las 1ra+ti+as9 el medio de +ulti2o 0ase es del *S
B*uras>i5e y SGo559 1.82C y ?7 BGam0or5 et al9 1.88C9 +on la adi+ion de un
azE+ar al+o>olizado osm/ti+o9 5eneralmente :ue no sea meta0oliza0le9 +omo el
manitol9 o m,s solu0le +omo el sor0itol. Idealmente9 el medio de0e ser sim1le y
de<nido 1ara ser re1rodu+ido en otros la0oratorios9 sin em0ar5o9 esto no
siem1re se +um1le9 +omo en el +aso del +ulti2o de +o+onut-milG BFao y
*i+>ayluG9 1.M7C usado 1ara sem0rar 1roto1lastos a 0aAas densidades
2. Re5uladores
La au6ina y +ito:uinina son esen+iales 1ara sostener el +re+imiento del
1roto1lasto9 +on al5unas e6+e1+iones +omo en Dau+us +arota y Ara0ido1sis
t>aliana9 en la :ue solo la au6ina es re:uerida. %n +ontraste9 los re5uladores
men+ionados 1ueden ser 1erAudi+iales 1ara el +re+imiento de +;tri+os.
Los re:uerimientos 1ara el +re+imiento de 1roto1lastos +am0ian +ontinuamente
durante la siem0ra9 ne+esitando la modi<+a+i/n de la +om1osi+i/n del medio9 y
1or lo 5eneral re:uiere una redu++i/n de@ au6ina9 deri2ados de la 3enil-urea y
0rasinosteroides9 :ue son similares estru+turalmente a los esteroides animales y
:ue 1ueden 1romo2er la di2isi/n de las +lulas deri2adas de 1roto1lastos. Se >a
mostrado e2iden+ia :ue la +i+lo<lin inmuno<linas 1ueden tener un rol im1ortante
en el +re+imiento a+ti2o de las +lulas der2idadas de 1roto1lastos y en 1lantas
inta+tas9 1arti+ularmente en la 1o+a tem1rana de la 3orma+i/n de la Kor. )ara
3uturas in2esti5a+iones9 se re:uiere in2esti5ar el rol a ni2el <siol/5i+o de estas
1rote;nas u0i+uas9 ya :ue no se tiene +lara del todo su 3un+i/n
-. &uentes +ar0onadas.
La su+rosa y la 5lu+osa suelen ser las o1+iones de 3uentes +ar0onadas en la
mayor;a de medios de +ulti2o. A 1esar de ello9 la su+rosa 1uede ser +am0iada
1or maltosa 1ara 1romo2er la re5enera+i/n del 0rote de +lulas deri2adas de
1roto1lastos en +ereales.
4. Sistemas e61erimentales 1ara el +ulti2o de 1roto1lastos aislados
16
La mayor;a de los sistemas e61erimentales est,n 0asados en medios li:uidos9
semi-solidos o la +om0ina+i/n de am0os. Dis1ensar sus1ensiones de 1roto1lasto
en 1la+as )etri es la o1+i/n mas sim1le9 ya :ue el medio 1uede ser 3,+ilmente
reem1lazado 1ara 5raduar la osmolaridad y 1or tanto9 mantener el +re+imiento
del 1roto1lasto. Sus1ensiones de 5otas de 1roto1lastos son Etiles +uando >ay un
numero redu+ido de 1roto1lastos dis1oni0les9 mientras :ue las t+ni+as de
dro1let-array >an 3a+ilitado las +om0ina+iones de +on+entra+iones de los
re5uladores de +re+imiento.
Los 1roto1lastos aislados 1ueden resistir estar em0e0idos en medios
semis/lidos. %stos em1lean9 1or lo 5eneral9 a5ar +omo a5ente de so1orte9 sin
em0ar5o9 se re+ono+e :ue la a5arosa tiene m,s e<+ien+ia +omo a5ente de
so1orte 1or su neutralidad. %stos medios9 +onteniendo a los 1roto1lastos9
1ueden ser dis1ensados +omo +a1as o 5otas9 +on el 1osterior in+remento de 270
ul en 2olumen en 1la+as 1etri. Se++ionar las +a1as en se+tores9 se5uidas de
0an>os de estos o de 5otas en medio li:uido de la misma +om1osi+i/n9
1romue2e el +re+imiento 1roto1lasm,ti+o. %se mtodo tam0in se em1lea 1ara
+am0iar la osmolaridad.
%l al5inato tam0in se 1uede usar 1ara solidi<+ar el medio9 e61onindolo a iones
+al+io9 +on la sal2edad de :ue las +olonias de0en ser li0eradas 1or la
des1olimeriza+i/n del al5inato +on tratamiento de +itrato de sodio 1ara remo2er
los iones de +al+io. Sus1ender 1roto1lastos en una +a1a del5ada de li:uido
semis/lido ayuda a estimular la 3orma+i/n de +olonias9 1arti+ularmente +uando
un 1a1el <ltro se +olo+a en el limite de la 3ase semis/lida-li:uida. Di+>o 1a1el
<ltro 1uede ser reem1lazado +on <ltro 1ara mem0ranas 0a+terianas B1oros de
0.2 AmC 1ara 1rodu+ir un e3e+to similar9 1or eAem1lo9 en el arrozD 1a1el +elo3an9
1ara 1roto1lastos de mus5o en )>ys+omitrella 1atensD malla de nylon tanto 1ara
medios li:uidos +omo semis/lidos. La remo+i/n de +ual:uiera de estos
materiales 3a+ilita la trans3eren+ia de las nue2as +lulas en un nue2o medio.
%6iste un nue2o mtodo :ue +om0ina el aislamiento de 1roto1lastos +on su
indu++i/n dentro de un +ulti2o in2olu+rando la sus1ensi/n de +lulas en 5el de
a5inato +on estron+io se5uido del 2ertido de la mez+la en solu+i/n de +loruro de
estron+io +onteniendo enzimas di5esti2as de mem0rana +elular. %n este sentido9
el aislamiento del 1roto1lasto y la solidi<+a+i/n del 5el 1ro+eden
simult,neamente y se estima :ue la 2ia0ilidad de estos 1roto1lastos sea mayor
:ue en los mtodos +on2en+ionales9 sin em0ar5o9 se de0e +om1ro0ar su
5eneralidad.
7. Densidad de 1roto1lastos y +re+imiento del 1roto1lasto en el medio de
+ulti2o
La densidad <nal de los 1roto1lastos en el medio es +ru+ial 1ara ma6imizar la
re5enera+i/n de la 1ared +elular y9 1or ende9 la 3orma+i/n de las +lulas >iAas.
Generalmente9 la densidad o1tima esta entre los ran5os de 7610X4 Y 10X8.
17
%n el +aso de :ue >u0iera una densidad e6+esi2a los nutrientes se a+a0ar;an
r,1idamente y las +lulas no 1odr;an sostener una di2isi/n +elular +ontinua. %n
la +ontra 1arte9 si >ay un una +antidad de ino+ulo insu<+iente9 las +lulas no
1odr;an sostener la di2isi/n +elular9 de0ido a :ue >a0r;a una 3alta de 3a+tores
estimuladores del +re+imiento Be6+retadas de +elula a +elulaC in+luyendo
amino,+idos9 este 1ro+eso lle2a 1or nom0re medio +ondi+ionante o nurse
+ulture. )re2iamente se 1uede tratar el medio de +ulti2o 1ara :ue 1ueda
3omentar el +re+imiento a+ti2o de los nue2os 1roto1lastos aislados mediante el
+ulti2o de +lulas en3ermeras :ue 1ueden ser de di3erente o de la misma es1e+ie
de los 1roto1lastos aislados9 +omo 1or eAem1lo9 Lolium multiKorum 1uede
estimular a las +lulas em0rionarias del arroz. A:uellas +lulas :ue >an sido
tratadas +on rayos = 1ara in>i0ir la di2isi/n +elular 1ueden 1rodu+ir ese e3e+to
en las otros 1roto1lastos9 a+tuando tam0in +omo nurse +ells. %stas +lulas
re1aradoras o indu+toras 1ueden ser usadas en el mismo medio o en
mem0ranas.
8. A2an+es inno2ati2os 1ara los +ulti2os de 1roto1lastos.
!odos estos a2an+es tienen +omo o0Aeti2o ma6imizar el +re+imiento +elular y la
di3eren+ia+i/n9 1arti+ularmente en +lulas en las :ue >a >a0ido mani1ula+i/n
5enti+a. Sin em0ar5o9 +a0e resaltar :ue no e6isten 1arametros 3;si+os ni en
+uanto a la +om1osi+i/n del +ulti2o9 1or lo :ue los 1roto+olos de0en ser
determinados em1;ri+amente. %6isten al5unos a2an+es ya +om1ro0ados 1ara
teAidos animales :ue >an sido +om1ro0ados9 +on e<+ien+ia9 1ara 1lantas9 tales
+omo son el tratamiento el+tri+o de +lulas y la mani1ula+i/n del am0iente
5aseoso.
%stimula+ion el+tri+a de los 1roto1lastos
Al5unas +lulas dete+tan 5radientes de 2oltaAe y densidades de +orriente de
menos de 0.7 u'W mX-1 y 7 nAW+ m X-2 res1e+ti2amente9 +on +orrientes
el+tri+as d0iles de 1rolo5anda dura+i/n durante la estimula+i/n del
+re+imiento9 re5enerando /r5anos y re1arando +lulas en el +aso de los
animales. Se5En los autores de esta estimula+i/n9 en las 1lantas no solo ayuda a
1lantas +om1letos9 sino tam0in a los 1roto1lastos9 +omo 1or eAem1lo a
Medicago sativa. %stas +orrientes el+tri+as no solo alteran la 1olaridad de la
+elula9 sino tam0in el sistema de trans1orte de au6inas. )ara otros 1ro1/sitos9
se utilizan altos 2oltaAes en +ortos tiem1os B270-2000'9 10-70 usC 1ara
ele+tro1orar AD en 1roto1lastos aislados.
Los e3e+tos el+tri+os son inKuen+iados 1or mu+>as 2aria0les9 entre las mas
im1ortantes tenemos al 2oltaAe9 la dura+i/n a la :ue se e61one a 2oltaAe al
1roto1lasto y el tamaNo del 1roto1lasto. La e3e+ti2idad de este tratamiento >a
sido +om1ro0ada en es1e+ies madera0les9 las +uales a+elaran la mitosis Bya :ue
los im1ulsos el+tri+os estimulan la s;ntesis de ADC >asta en 10 dias mas :ue
en 1roto1lastos no tratados. %ste tratamiento se da9 de 1re3eren+ia en el estado
de +allo9 el +ual9 lue5o estimulara a la re5enera+i/n del 0rote. %stas 1lantas
re5eneradas son9 in+luso9 mas 2i5orosas :ue las +ontrol.
Su1lementa+i/n del medio de +ulti2o +on sur3a+tantes9 anti0i/ti+os y
1oliamidas
18
"n nue2o mtodo :ue 1romete in+rementar la di2isi/n mit/ti+a es el uso de
sur3a+tantes no i/ni+os9 es1e+ialmente de 1luroni+os. Se su5iere9 en el +aso del
)luroni+o R &-889 adem,s de 1romo2er la mitosis9 eAer+e la di3eren+ia+i/n9
1romo2iendo la toma de nutrientes9 re5uladores del +re+imiento y o6;5eno.
Al5unos anti0i/ti+os estimulan la di2isi/n de +lulas deri2adas de 1roto1lastos.
)or eAem1lo9 la +e3alos1orina9 +e3ota6ima 1romue2en en Passi%ora edulis9
+uando se le a5re5a 270 ulWmL. %n am0os +asos el modo de a++i/n es
des+ono+ido9 1ero se sos1e+>a :ue la +e3ota6ima 1odr;a ser meta0olizada 1ara
3ormar 1arte de +om1onentes re5uladores del +re+imiento.
Las 1oliaminas re5ulan la re1li+a+i/n9 trans+ri1+i/n y tradu++i/n del ADD son
tratados +omo una nue2a +lase de re5uladores en 1lantas y son una reser2a de
+ar0ono y nitr/5eno en los +ulti2os de teAidos. %n el +aso de la a2ena9 a+tua
+omo un estimulante de s;ntesis de AD y en almendra9 la ar5inin5a estimula la
di2isi/n de 1roto1lastos.
!odos estos a2an+es tienen +omo o0Aeti2o ma6imizar el +re+imiento +elular y la
di3eren+ia+i/n9 1arti+ularmente en +lulas en las :ue >a >a0ido mani1ula+i/n
5enti+a. Sin em0ar5o9 +a0e resaltar :ue no e6isten 1ar,metros 3;si+os ni en
+uanto a la +om1osi+i/n del +ulti2o9 1or lo :ue los 1roto+olos de0en ser
determinados em1;ri+amente. %6isten al5unos a2an+es ya +om1ro0ados 1ara
teAidos animales :ue >an sido +om1ro0ados9 +on e<+ien+ia9 1ara 1lantas9 tales
+omo son el tratamiento el+tri+o de +lulas y la mani1ula+i/n del am0iente
5aseoso.
0III. TRANS/OR2ACI.N GEN5TICA CON
PROTOPLASTOS
La trans3orma+i/n 5enti+a de +lulas indi2iduales >a sido al+anzada a tra2s del
+o-+ulti2o de 1roto1lastos +on A5ro0a+terium tume3a+iens o 1or trans3eren+ia
dire+ata de AD usando :u;mi+os 1oli+ati/ni+os9 ele+tro1ora+i/n9 li1osomas9
mi+roinye++i/n9 o soni<+a+i/n BSaJa>el y #o2e 1..2D &is> y DandeGar9 1..-C. La
trans3orma+i/n de 1roto1lastos de 1lantas usando :u;mi+os 1oli+ati/ni+os yWo
ele+tro1ora+i/n >a sido re1ortada muy a menudo.
1. Tra!sforma#"&! me%"a%a por A*ro+a#ter"m
19
)ara la trans3eren+ia del 5en A5ro0a+terium-mediado9 los 1roto1lastos son
aislados y +ulti2ados 1or 2 a - d;as 1re2io al +o-+ulti2o +on +lulas
A5ro0a+terium. Los 1roto1lastos son mez+lados +on A5ro0a+terium a una tasa de
10X4 a 20X8 +lulas de 1lantas +ontra 10X8 a 10X8 +lulas 0a+terianas 1or
mililitro e in+u0adas Auntas 1or 24 a -0 >oras. Des1us de la +o-+ulti2a+i/n9 los
anti0i/ti+os :ue in>i0en el +re+imiento de las 0a+terias son aNadidos al medio
+ulti2o. A Las 1lantas tratadas se les 1ermite +re+er a un estado multi+elular
antes de la adi+i/n sele+ti2a de anti0i/ti+os BGanami+ina9 >i5romi+ina9 et+.C :ue
in>i0en el +re+imiento de +lulas no trans3ormadas. Las +lulas trans3ormadas
:ue +re+en en un medio sele+ti2o son +a1a+es de re5enerar 1lantas +on el 5en
introdu+ido. La 3re+uen+ia de trans3orma+i/n usualmente Ku+tEa entre 0.28 a
17.-U. el uso de A5ro0a+terium 1ara trans3ormar los 1roto1lastos de 1lanta >a
1erdido el 3a2or en aNos re+ientes 1or:ue no todas las es1e+ies9 en es1e+ial
+ereales y 1astos9 son sensi0les a la trans3orma+i/n 1or medio-A5ro0a+terium y
a 2e+es es di3;+il in>i0ir el +re+imiento de A5ro0a+terium :ue si5ue en el +o-
+ulti2o. Adi+ionalmente9 el uso de sistemas de +ulti2os re5enerati2os m,s
sim1les >a eliminado la ne+esidad de usar 1roto1lastos 1ara trans3orma+i/n .
2. Tra!sforma#"&! por me%"o 64m"#o pol"#at"&!"#o
%l :u;mi+o 1oli+ati/ni+o usado m,s +omEnmente 1ara trans3orma+i/n de AD es
el 1olietilen 5li+ol B)%GC. La sido utilizado 1ara trans3ormar 1roto1lastos 1ara una
5ran 2ariedad de es1e+ies de 1lantas. La 3re+uen+ia de trans3orma+iones 2ar;a
desde 0.8610X8 >asta 8610X-- de1endiendo en la es1e+ie de 1lanta.
)ara trans3ormar +lulas de 1lantas utilizando )%G9 los 1roto1lastos son aislados
y aAustados a la densidad +elular a1ro1iada antes de aNadir AD trans3ormador y
)%G. %sta me6+la es in+u0ada 1or 10 a -0 minutos antes de dilu+i/n +on medio
+ulti2o. #on al5unas es1e+ies es 0ene<+ioso someter a los 1roto1lastos a un
tratamiento de +>o:ues trmi+os B-47Z#C 1re2io a la adi+i/n de AD. o se sa0e
+om1letamente +omo el )%G 1romue2e la a0osor+i/n de AD. Se 1iensa :ue la
+ar5a 1oli+ati/ni+a de )%G intera+tEa ne5ati2amente +on la +ar5a de AD 1ara
3ormar una +ar5a 1ositi2a +om1leAa :ue enlaza +on el 1lasmalemma ani/ni+o. La
a0sor+i/n de AD en las +lulas o+urre a tra2s de endo+itosis o a0sor+i/n
a+ti2a. La trans3orma+i/n 1or medio-)%G es un mtodo 1o1ular 1ara trans3ormar
1roto1lastos de 1lantas 1or:ue tiene 0aAa to6i+idad +elular9 1romue2e altas tasas
de trans3orma+i/n9 in+rementa la 1ermea0ilidad de la mem0rana9 1rote5e el
AD +ontra la de5rada+i/n 1or nu+leolisis9 es inde1endiente de la estru+tura del
AD Bsu1er enrollado9 +ir+ular9 o linearC9 1ermite la inte5ra+i/n de AD en el
5enoma del >us1ed sin un 1ortador9 y no tiene un ran5o limitado de >us1edes.
La 0romidio >e6ademetrina B)oli0renoC a+tEa de manera similar al )%G en +uanto
a :ue 1romue2e la trans3eren+ia de 5enes a tra2s de la intera++i/n +on la
1lasmalemma ani/ni+a 1ara desarrollar re5iones de +ar5a 1ositi2a :ue
rea++ionen +on la +ar5a ne5ati2a de AD. %l medio-1oli0rene :ue diri5e la
a0sor+i/n de AD es un mtodo 1rometedor 1ara la trans3orma+i/n de
1roto1lastos de 1lantas 1or:ue tiene 0aAa to6i+idad +elular9 1romue2e altas tasas
de trans3orma+i/n9 y no est, limitado 1or el tamaNo o estru+tura del AD.
7. Tra!sforma#"&! por me%"o(ele#tropora#"&!
20
%n la ele+tro1ora+i/n9 un 1ulso el+tri+o es utilizado 1ara indu+ir la a0sor+i/n de
AD 1or los 1roto1lastos de 1lantas9 es a tra2s de esta a0sor+i/n de AD :ue
o+urre a tra2s de los 1oros en la mem0rana 5enerada en res1uesta al 1ulso
el+tri+o. %n 5eneral9 el AD trans3orma0le es mez+lado +on un 1roto1lastos de
una 1lanta antes de uno o m,s 1ulsos el+tri+os de 200 a 1000 'W+m y 18 a 1000
V& de +a1a+itan+ia. )ulsos +ortos Bt;1i+amente mi+rose5undosC son t;1i+amente
menos letales a los 1roto1lastos :ue los 1ulsos lar5os Bmilise5undosC. Los
1ar,metros /1timos de ele+tro1ora+i/n 2ar;an y de0en ser 1ro0ados 1ara nue2as
es1e+ies.
Las 3re+uen+ias de trans3orma+i/n y la 2ia0ilidad +elular son 5eneralmente
menores 1ara ele+tro1ora+i/n :ue 1ara los mtodos :u;mi+os de 1oli+ationes
1ero 1ueden ser meAorados al aNadir )%G B4 a 8UC al medio-ele+tro1ora+i/n.
!rans3orma+iones esta0les utilizando ele+tro1ora+i/n +on o sin )%G >an sido
o0tenidas en 1roto1lastos de mu+>as es1e+ies de 1lantas. La ele+tro1ora+i/n es
un medio r,1ido y e<+iente 1ara entre5ar AD a +lulas de 1lantas y
1roto1lastos9 y no est, limitado al tamaNo o estru+utra del AD trans3ormado9 y
no tiene un l;mite de ran5o de >us1ed. Sin em0ar5o9 la ele+tro1ora+i/n es a
menudo letal 1ara los 1roto1lastos9 resultando en 0aAa 2aria0iliad.
4. So!"'#a#"&!8 l"posoma8 m"#ro("!)e##"&!8 optopora#"&!8 )
tra!sforma#"&! por me%"o(laser
Otros mtodos 1ara in+or1orar AD e6tranAero en 1roto1lastos de 1lantas se
muestran +onsidera0lemente 1rometedores. Durante la soni<+a+i/n9 los
1roto1lastos mez+lados +on AD y dado los 1ulsos s/ni+os B700 a .00 mse+ a
0.87 a 1.8 'W+mC :ue interrum1en la mem0rana +elular y 1ermiten al AD entrar
en las +lulas a tra2s de los 1oros y +reados en res1uesta a los 1ulsos
el+tri+os. Los li1osomas son 3os3ol;1idos >idro5enerados en los +uales el AD o
AR es en+a1sulado y en2iado dire+tamente >a+ia las +lulas de 1lantas a tra2s
de endo+itosis o a0sor+i/n. La mi+ro inye++i/n utiliza una <na a5uAa +a1ilar 1ara
introdu+ir el AD9 +romosomas9 o nE+leos dire+tamente en las +lulas de 1lantas
en una manera :ue 1reser2a la inte5ridad +elular y 2ia0ilidad. La o1to1ora+i/n
tra0aAa de manera similar a la mi+ro-inye++i/n. "n mi+ro-rayo l,ser B-77 nmC
1uede ser utilizado 1ara 1er3orar a5uAeros en la 1ared +elular y mem0rana y la
di3eren+ia entre el 1oten+ial osm/ti+o del interior y e6terior de las +lulas
tratadas osm/ti+amente 3a+ilita el mo2imiento de 1l,smidos de AD a tra2s de
las a1erturas en la mem0rana. %l 0ene<+io de la o1to1ora+i/n so0re la mi+ro-
inye++i/n es :ue los a5uAeros >e+>os 1or el l,ser son m,s 1e:ueNos y 1oseen
menor ries5o a la su1er2i2en+ia de la +lula. Los l,seres no 1ueden ser utilizados
1ara +ortar9 1artir9 y mo2er 3ra5mentos 5randes de AD +romos/mi+o entre las
+lulas. Las tiAeras de l,ser >an sido utilizadas 1ara >a+er +ortes es1e+;<+os en
+romosomas 1ara e6tir1ar 5randes 3ra5mentos de AD +elular. Las 1inzas l,ser
>an sido desarrolladas 1ara remo2er 3ra5mentos de AD desde +lulas y
em1almar las 1iezas de +romosomas remanentes. %sta te+nolo5;a tiene el
1oten+ial 1ara a1li+a+iones de trans3orma+i/n de 1roto1lastos de 1lantas desde
:ue las tiAeras y las 1inzas 1udieron ser utilizadas 1ara insertar 5randes
3ra5mentos de AD en re5iones es1e+;<+as de +romosomas de 1lantas.
I9. APLICACI.N DE LA /-SI.N DE
PROTOPLASTOS
21
La >i0rida+i/n som,ti+a >a 1ermitido 1rodu+ir >;0ridos :ue no se >a0;an 1odido
o0tener 1or +ruzamientos se6uales9 in+rementado as; el KuAo de 5enes en los
+ulti2os. "n 5ran nEmero de tra0aAos >an des+rito la 5enera+i/n de 1lantas Eni+as a
tra2s del 1ro+eso de >i0rida+i/n som,ti+a 1or 3usi/n de 1roto1lastos. La 1o0la+i/n
de +lulas resultantes de estos 1ro+esos de 3usi/n 2a a ser una mez+la de
1roto1lastos 1arentales9 >omo+ariontes y >etero+ariontes +on dos o m,s nE+leos.
La 3usi/n de +lulas som,ti+as 1uede a1li+arse 1ara@
1C La su1era+i/n de la in+om1ati0ilidad en +ru+es interes1e+;<+os
2C "n meAor a1ro2e+>amiento de la 2aria+i/n intraes1e+;<+a y e6traes1e+;<+a en
+ru+es interes1e+;<+os +om1ati0les9 al ser los >;0ridos som,ti+os distintos y
su1eriores a los se6uales9 1osi0lemente 1or la +om0ina+i/n de 5enomas
e6tranu+leares B*oreno9 1.84C
-C La o0ten+i/n de >;0ridos +ito1lasm,ti+os o +;0ridos9 al trans3erirse 5enes
e6tra+romos/mi+os9 :ue +on<eren +ara+ter;sti+as es1e+iales al >;0rido BeA.
androesterilidad +ito1l,smi+aC.
%n un ini+io se es1era0a la o0ten+i/n de >;0ridos simtri+os9 1ero la e61erien+ia
mostr/ :ue di3;+ilmente 1ueden lo5rarse. De0indose diri5ir enton+es >a+ia la
intro5resi/n de 1o+os 5enes sil2estres en las es1e+ies +ulti2adas mediante
>i0rida+i/n asimtri+a o +i0rida+i/n9 manteniendo las +ara+ter;sti+as 5enerales del
+ulti2o.
"no de los 3a+tores :ue di<+ulta la o0ten+i/n de >;0ridos simtri+os es la 1ro5resi2a
1rdida de +romosomas de uno de los 1arentales9 :ue normalmente o+urre durante
la re5enera+i/n. Si 0ien la 3usi/n de 1roto1lastos 1ermite sortear las 0arreras
1re+i5/ti+as9 si5uen e6istiendo 0arreras 5en/mi+as :ue resultan en la elimina+i/n
es1ontanea de +romosomas durante las di2isiones +elulares. %l me+anismo :ue
determina la elimina+i/n de +romosomas no est, 0ien +om1rendido9 1ero
5eneralmente se retienen los +romosomas del 1arental :ue tiene un +i+lo +elular
m,s +orto. "no de los 3a+tores :ue 1uede 1rodu+ir in+om1ati0ilidad 5en/mi+a es el
estado de di3eren+ia+i/n de los ti1os +elulares in2olu+rados en la 3usi/n. )or
eAem1lo9 +uando se 3usionan +lulas en 3ase de +re+imiento a+ti2o +on +lulas del
mes/<lo9 :ue no se di2iden9 5eneralmente se 1ierden los +romosomas de estas
Eltimas.
Aun:ue la 3usi/n de 1roto1lastos >a sido utilizada +on 6ito 1ara sol2entar
1ro0lemas de in+om1ati0ilidad entre es1e+ies +on los :ue tro1eza0a la meAora
5enti+a tradi+ional9 y >a 1ermitido o0tener >;0ridos som,ti+os interes1e+;<+os e
inter5enri+os9 +on es1e+iales +om0ina+iones 5enti+as nu+leares y +ito1l,smi+as9
:uiz, la a1li+a+i/n m,s interesante de la 3usi/n som,ti+a sea la trans3eren+ia de
una +antidad limitada de in3orma+i/n 5enti+a de una es1e+ie a otra9 de 3orma 1o+o
+ontrolada. As;9 mediante tratamientos 3;si+o-:u;mi+os es 1osi0le ina+ti2ar o destruir
total o 1ar+ialmente los nE+leos de las +lulas 1arentales9 +on lo :ue solo una 1arte
des+ono+ida de la in3orma+i/n 5enti+a 2a a ser trans3erida al >;0rido9 :ue suele ser
22
estril. %n determinados +asos es 1osi0le mediante su+esi2as retro3usiones eliminar
+asi todo el 5enoma de uno de los 1arentales BeA. el >;0rido resistente a atrazina
entre Solanum ni5rum y Ly+o1ersi+on es+ulentumD [ain et al.9 1.88C. Otro +aso
modelo de +i0rida+i/n es el ?rassi+a-Ra1>anus B)elletier et al.9 1.8-C@ el
>etero+arionte +ontiene el nE+leo de ?rassi+a na1us9 los +loro1lastos resistentes a
atrazina de ?rassi+a +am1estris y las mito+ondrias de Ra1>anus sati2a :ue
+on<eren androesterilidad.
!a0la. %Aem1los de >;0ridos som,ti+os :ue e6>i0en al5En +ar,+ter de inters
a5ron/mi+o
1. CITR-S
Se >a realizado una +onsidera0le +antidad de in2esti5a+i/n 0,si+a y a1li+ada en
Citrus9 un +ulti2o de 5ran im1ortan+ia +omer+ial mundial. La >i0rida+i/n se6ual es
o0sta+ulizada 1or 1oliem0ron;a9 esterilidad 1olen Y o2ulo9 in+om1ati0ilidades
se6uales y de inAerto9 Au2entud e6tendida. BGuo and Den59 2001C.
"na +ara+ter;sti+a resaltante de #itrus es@ &a+ilidad 1ara 1rodu+ir L;0ridos
som,ti+os interes1e+;<+os e inter5enri+os. La 5ran +antidad de 2ariedades de
+;tri+os sil2estres +ulti2ados re1resenta una aEn no e61lorada reser2a de 5enes 1ara
5enerar nue2as 1lantas9 1or >i0rida+i/n som,ti+a y +i0rida+i/n. %ntre al5unos
eAem1los tenemos@
Se re1ort/ la 1rodu++i/n de >;0ridos +ito1lasm,ti+os in2olu+rando
1roto1lastos irradiados de 'alen+ia sJeet oran5e BCitrus sinensisC y 1or
1roto1lastos tratados +on iodo-a+etato de *ur+ott tan5or BC. reticulata x C.
23
sinensisC. InAertos in 2itro 3ueron ne+esarios 1ara mantener la re5enera+i/n
de meristemos. BLiu and Den59 2000C
)roto1lastos ele+tro3usionados de +lulas sus1endidas de ?onnaza na2el
oran5e BC. sinensisC +on 1roto1lastos del mes/<lo de Red ?lus> 5ra1e3ruit BC.
paradisiC sin semillas 1ara 5enerar 1lantas tetra1loides y di1loides. BGuo et
al.9 2000C Al5unos de los tetra1loides mostraron Kora+i/n 1re+oz. Guo et al.
1ro1one :ue los >;0ridos som,ti+os 1ueden ser e6+elentes donadores de
1olen 1ara la meAora de +ulti2ares de 1omelo BtoronAasC mediante la
5enera+i/n de >;0ridos tri1loides sin semilla.
Otras +om0ina+iones interes1e+;<+as in+luyen Lamlin sJeet oran5e BC.
sinensisC +on rou5> lemon BC. jambhiriC9
2. BRASSICA
Li0rida+i/n som,ti+a en ?rassi+a+eae@
L;0ridos som,ti+os entre &rassica napus y &.rapa. Se re1ort/ :ue la 3uente
del material 1arental inKuy/ en las +ara+ter;sti+as resultantes de los >;0ridos
som,ti+os. %n este sentido9 se 1re<ri/ ?. ra1a de #>ina en +om1ara+i/n +on
5ermo1lasma de otros lu5ares del mundo 1ara la trans3eren+ia de 5enes 1ara
el rendimiento en &. napus. B\ian et al.9200-C
%n estudios rela+ionados9 1roto1lastos 3usionados de >oAa de Moricandia
arvensis B2n ] 28C +on 1roto1lastos de >i1o+otilo de &. oleracea B2n ] 18C
1ara 5enerar nue2os >;0ridos B2n ] 48C :ue 3ueron +on<rmados 1or el
an,lisis +on RA)D Brandom am1li<ed 1olymor1>i+ DAC. Se o0tu2o a 1artir de
ADs de +loro1lastos y mito+ondrias de M. arvensis9 +on la anatom;a de las
>oAas tienen una +ara+ter;sti+a #- Y #49 ras5o intermedio t;1i+o de M.
arvensis BIs>iGaJa et al.9 200-C. !ales >;0ridos som,ti+os ser,n material de
siem0ra Etil 1ara introdu+ir el ras5o #--#4 en +ulti2os de 0rasi+as. Se >an
re1ortado otras +om0ina+iones inter5enri+as.
)or eAem1lo9 >;0ridos som,ti+os 3rtiles 1rodu+idos entre &. napus y 'inapsis
arvensis Bmostaza sil2estreC +on el <n de enri:ue+er el a+er2o 5enti+o de
semillas oleosas. Simtri+os y asimtri+os >;0ridos se identi<+aron 1or
an,lisis de RA)D y +ontenido de AD nu+lear9 +on una meAora de la
resisten+ia a en3ermedades a (eptosphaeria maculans, estan 1resentes en los
>;0ridos de '. arvensis. "na 2ez m,s9 este nue2o material tiene el 1oten+ial
no s/lo +omo un 1uente 1ara introdu+ir ras5os a5ron/mi+amente Etiles en los
+ulti2os de ?rassi+a9 sino tam0in en la o0ten+i/n de nue2as 2ariedades
resistentes a las en3ermedades9 +omo el +ar0un+o sintom,ti+o. BLu et al.9
2002C
24
7. SOLANACEAS
%s1e+ies de Solanum9 en es1e+ial la 1a1a B'olanum tuberosumC9 >an sido
+ara+terizadas e6tensamente en 1ro5ramas de >i0rida+i/n som,ti+a 1ara am1liar el
a+er2o 5enti+o y 1ara aumentar la di2ersidad 5enti+a a dis1osi+i/n de los
+riadores de este im1ortante +ulti2o tu0erosa.
De >e+>o9 la 1a1a re1resenta uno de los 1rimeros +ulti2os a5r;+olas :ue se +ulti2an
in 2itro y e61lotados 1ara 5enerar >;0ridos som,ti+os9 +on una +ontri0u+i/n
si5ni<+ati2a en este +am1o de in2esti5a+i/n durante un 1er;odo e6tenso +omo
resultado una e6+elente la0or. Lassanein et al. B1..8C utilizaron +;0ridos +on el
5enoma de '. nigrum y el +ito1lasma de '. tuberosum, 1ara estudiar las
intera++iones nu+leo W +loro1lastos9 mientras [ansGy et al. B1...C e2aluaron los
1rodu+tos de 3usi/n de es1e+ies de Solanum di1loides 1or su resisten+ia al
es+ara0aAo de la 1atata.
4. CEREALES
Se >a intentado >i0rida+i/n inter5enri+a en los +ereales9 +on >;0ridos som,ti+os
5enerados entre el arroz B)ry$a sativaC y +e0ada BHordeum vulgareD. FisaGa et al9
1..8C9 y el arroz +on *i$ania lati"olia BLiu et al9 1....C. %s de desta+ar :ue s/lo una
1lanta >;0rida asimtri+a 3ue 5enerada en estos e61erimentos9 entre O. sati2a y ^.
lati3olia.
Al menos otros tres estudios >an a1ro2e+>ado al tri5o B+riticum aestivumC +omo
so+io9 5enerando material >;0rido som,ti+o +on Haynaldia villosa B^>ou et al.9
2001C9 resistente al 3r;o9 la se:u;a9 y tolerante a la en3ermedad ?romus inermis
B=ian5 et al.9 1...C9 y Agropyron elongatum B=ia et al.9 1...C.
25
9. A0ANCES EN LA IN0ESTIGACI.N DE
PROTOPLASTOS DE PLANTAS
%ntre las mu+>as t+ni+as en las :ue se utilizan los 1roto1lastos9 tenemos a la
3usi/n de 1roto1lastos a 1artir de es1e+ies di3erentes9 1or lo +ual9 1ro1or+iona
una >erramienta 1ara la re1rodu++i/n 1r,+ti+a y e2ita la >i0ridiza+i/n se6ual
rela+ionados +on 0arreras 1re+i5oti+as o 1ost+i5/ti+as. Se 1uede +rear di3erentes
ti1os de >etero+ariontes y >omo+ariontes9 as; +omo >;0ridos allo1l,smi+os
B+;0ridosC.
La re5enera+i/n es9 a menudo9 el :ue 1ro2o+a el e3e+to +uello de 0otella a este
1ro+eso de >i0rida+i/n som,ti+aD 1or ello9 >a o0li5ado a los in2esti5adores a
0us+ar mtodos inno2adores +omo estimula+i/n el+tri+a9 sur3a+tantes no
i/ni+os y 1ortadores arti<+iales de 5as.
Los a2an+es des+ritos en esta re2isi/n se >an determinado a 1artir de los
1ro0lemas o0ser2ados en +ada e61erimento9 desde el medio de +ulti2o9 >asta los
aditi2os y 3orma+i/n de es1e+ies no 0en<+as 1ara el desarrollo de 1roto1lastos.
#omo se men+iona anteriormente en las t+ni+as9 al5unos 1ar,metros son
im1ortantes 1ara la o0ten+i/n del resultado 1ro1uesto e im1edir el +re+imiento
de +ontaminantes B0a+terias u >on5osC. %s as;9 :ue en esta re2isi/n se
1ro1or+iona una 2isi/n 5eneral de la e2olu+i/n y las ideas m,s inno2adoras en el
tema9 as; +omo se analiza +r;ti+amente los lo5ros re+ientes 1ara en3o+arlos de
manera multidis+i1linaria y meAorar su a1li+a+i/n.
1. Ra+ionaliza+i/n de la re5enera+i/n
%n los Eltimos 10 aNos se >an do+umentado di3erentes a2an+es so0re el +ulti2o
de 1roto1lastos9 +omo se o0ser2a en la !a0la 29 el ti1o de material de los
donantes >a sido de+isi2o 1ara el 6ito de la re5enera+i/n. )or eAem1lo9 las
+lulas en sus1ensi/n +ontienen m,s mito+ondrias :ue las +lulas del mes/<lo9
es 1or eso9 :ue las 1lantas mono+otiled/neas re1resentan el material donador
m,s ade+uado.
La 2aria0ilidad de estos 1roto1lastos9 dentro de un mismo 5enoti1o9 1uede
de0erse no s/lo a la 2aria+i/n soma+lonal9 sino tam0in a los di3erentes
antio6idantes y +on+entra+iones <to:u;mi+asD esta 2aria+i/n de0er;a usarse 1ara
re5enerar 1roto1lastos en +ulti2os re+al+itrantesD sin em0ar5o9 son 1o+os los
es3uerzos 1ara 1romo2er la 2aria0ilidad9 es m,s9 se realizan 1re tratamientos
:ue redu+en el uso de <to>ormonas.
Los estudios re+ientes >an +ontri0uido a una meAor +om1rensi/n de la
im1ortan+ia de los sistemas de +ulti2o9 +omo lo demuestra la 0aAa 3orma+i/n de
+olonias en el medio l;:uido9 :ue es +ausada 1or la 1o+a airea+i/n9 luz y
li0era+i/n de +om1uestos t/6i+os. "n a2an+e en este +am1o se en+uentra en las
mem0ranas semi1ermea0les :ue meAoran el 1aso del o6;5eno o los +anales
mi+roKu;di+os de 1olidimetilsilo6ano +on mi+rotu0os 1ara el suministro de medio
+ontinuoD 1ero9 un >allaz5o 5eneral de meAor e<+ien+ia son las Ha5arose or
al5inate em0eddedI Bin+rusta+iones de a5arosa o al5inatoC9 as; tam0in9 las
1erlas9 dis+os9 +a1as del5adas o e6tra del5adas :ue 1ermiten el 3,+il re3res+o de
los +ulti2os y redu+e al m;nimo los 1osi0les e3e+tos ne5ati2os >a+ia el desarrollo
de las mi+ro+olonias y +ontamina+i/n mi+ro0iana.
26
Otro 1unto a tener en +uenta9 son los su1lementos adi+ionados a los medios
ori5inales9 tales +omo en &eta vulgaris, el aumento dr,sti+o de la e<+ien+ia en
las +lulas del mes/<lo des1us de la adi+i/n de 100 n* <tosul3o:uina9 un
3a+tor de +re+imiento 1e1t;di+o9 :ue tiene 1ro1iedades antio6idantes 1ero9
1osi0lemente9 tam0in 5enera un e3e+to de nurse +ells.
%l suministro de e6tra+tos ri+os en 1rote;nas ara0ino5ala+tanos e6/5enos meAor/
si5ni<+ati2amente la or5ano5nesis de los 1roto1lastos deri2ados de +allos9
asimismo9 los oli5osa+,ridos deri2ados de 5ala+to5lu+omananos son mol+ulas
de seNaliza+i/n de elon5a+i/n y di3eren+ia+i/n en la +lula 2e5etal9 los +uales
inKuen+iaron 1ositi2amente la 2ia0ilidad y re5enera+i/n.
De0ido a :ue las 1oliaminas est,n in2olu+radas en el +re+imiento9 desarrollo y
res1uestas al estrsD y el aislamiento in+rementa los ni2eles de 1utres+ina9
mayormente9 en 1roto1lastos no toti1otentes9 esto +onlle2a a una rela+i/n entre
los ni2eles de 1oliaminas intra+elulares y meta0olismo +on la toti1oten+ia
+elular. %s 1or eso :ue RaGosy-!i+an et al. B200MC 1ro1onen es1ermidina 1ara
estimular la mitosis y redu+ir el im1a+to del estrs. %l 1er<l mElti1le de los
ni2eles >ormonales interno durante las di3erentes 3ases de re5enera+i/n +on
>erramientas +romato5r,<+as BL#-LR*S y L#- *S W *SC 1ermitir, +om1ararlos
5enoti1os re+al+itrantes y re5enerati2os9 1ara administrar >ormonas e6/5enas
en el momento ade+uado y 1ara +ontrolar su meta0olismo de +er+a. Adem,s9 se
>a+en es3uerzos im1ortantes en la a+tualidad 1ara esta0le+er 0ioensayos de alto
rendimiento 1ara des+u0rir nue2as mol+ulas +on a+ti2idad 1oten+ial de
+ito:uinina9 +omo se eAem1li<+a 1or *otte et al. B 201- C 1ara la adenina 3enilo.
%stos 1odr;an +ontri0uir a or5ano5nesis en los +ulti2os donde +ito:uininas
tradi+ionales no >an indu+ido la 3orma+i/n de s>oots.
!a0la2@ A2an+es en la re5enera+i/n de 1roto1lastos en di3erentes 1lantas en el
1eriodo 2004-201-.
27
La 3orma+i/n de 1roto1lastos re+al+itrantes es dada 1or el estrs o6idati2o :ue se
5enera en las eta1as de aislamiento y +ulti2o de las +lulas. %n Arabidopsis9 los
estudios >an +om1ro0ado :ue la adi+i/n de as+or0ato 1uede ayudar a disminuir el
daNoD sin em0ar5o9 este estrs o6idati2o y auz_6inas tam0in a+tEan +omo a5ente
+om1lementario en el +re+imiento y di3eren+ia+i/n9 +omo se muestra en el +aso de
,icotiana tabacum9
28
2. A2an+es en la 3usi/n y 3ra5menta+i/n de 1roto1lastos
-. #ara+teriza+i/n de >;0ridos som,ti+os
#onstitu+i/n +romos/mi+a y esta0lidad
#ri0ado de 5enoma9 +ito1lasmoma9 trans+ri1toma y 1roteoma
4. 'aloriza+i/n a5r;+ola
La 2aria+i/n 5en/mi+a es de 5ran inters en la a5ri+ultura o +ulti2os industriales
1ara la +alidad de la 1lanta y la meAora del rendimiento. La toleran+ia a la sal9 la
meAora de +alidad9 esterilidad mas+ulina +ito1lasm,ti+a B#*SC..
29
)i-"ra53 ,odelo -eneral
prop"esto para la
re-eneracin de
protoplastos*
representando el
par(metro !"e cond"ce a
desdiferenciacin*
crecimiento o in0i#idores
e ind"ctores de
diferenciacin.
9I. CONCL-SIONES
Las 1lantas +on +ara+ter;sti+as meAoradas >an sido o0tenidas a tra2s de
2aria+iones soma+lonales e >idrata+i/n som,ti+a. De0ido al ran5o limitado de
>us1edes de A5ro0a+terium9 la trans3orma+i/n dire+ta de 5enes utilizando
1roto1lastos 1uede ser utilizada 1ara insertar 5enes 0ene<+iosos en +ulti2os9
es1e+ialmente en +ereales y 1astos9 :ue no son sensi0les a trans3orma+iones 1or
medios-A5ro0a+terium. %stos mtodos 1ueden ser utilizados 1ara +rear 1lantas +on
+ara+ter;sti+as a5ron/mi+as y >orti+ulturales meAoradas as; +omo tam0in de mayor
resisten+ia +ontra inse+tos y en3ermedades 1ara el uso de +riaderos 1ara desarrollar
+ulti2os meAorados.
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Solanum tu0erosum 1lastome. )>yton@ Ann Rei ?ot 1..8D-M@18MY M..
30
Hu ?, Andersen '&, 2ixelius C, Hansen (,. )rodu+tion o3 3ertile inter5eneri+
somati+ >y0rids 0etJeen ?rassi+a na1us and Sina1sis ar2ensis 3or t>e
enri+>ment o3 t>e ra1eseed 5ene 1ool. )lant #ell Re1 2002aD 21@14MY72.
4isa6a H, 4isa6a M, 4anno A, 4ameya +. Inter5eneri+ somati+ >y0ridization o3
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?ian =, (iu #, Meng /. Geneti+ ePe+ts on 0iomass yield in inters1e+i<+ >y0rids
0etJeen ?rassi+a na1us and ?.ra1a. %u1>yti+a 200-D 1-4@.Y 17.
>iang F,, >ia <M, *hou AF, Chen HM, Huang @, *hai >(. Asymmetri+ somati+
>y0ridization 0etJeen J>eat B!riti+um aesti2umC and ?romus inermis. A+ta
?ot Sin 1...D41@478Y 82.
31

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