Trabajo Practico N

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HPLC
Reconocimiento de las partes del equipo.
Puesta en marcha y cuantificacin por estndar externo.
Objetivos.
Reconocer las partes y las principales caractersticas de un HPLC.
Conocer y aplicar las etapas previas necesarias para la puesta en marcha de un sistema
cromatogrfico.
Aplicar el mtodo de cuantificacin por estndar externo para la determinacin de un
determinado analito en una muestra incgnita.

Resultados y anlisis.
Descripcin de los equipos analizados:
Agilent serie 1100 Waters Alliance2695




Esquema general de un HPLC.

Muy eficiente en el campo de la
Investigacin, gran sensibilidad.
Sistema modular.
Configuracin tpica:
Mdulo de disolvente: para 4 solventes,
mezclas automticas.
Bomba.
Inyector automtico.
Columna: compartimento termostatizado.
Detector: UV (multi-) longitud de onda
variable. Puedo realizar barridos.
Detector de Fluorescencia
Software.

Loop de 2 - 100 ul.
Administracin integrada de eluyentes y
muestras para garantizar un
funcionamiento constante en cualquier
sistema y una alta reproducibilidad.
Permite eliminar la formacin de vapor
en disolventes voltiles.
Desgasificador de vaco asegura un
rendimiento de primera clase sin el uso
de helio. Posee un filtro con sello de oro.
Flujo de disolvente estable.
Sistema de informacin en lnea.
Posibilidad de elaborar, guardar,
modificar, y ejecutar: mtodos. Un
mtodo contiene un conjunto completo
de parmetros: el programa de
inyeccin, separacin y deteccin.
Brazo mecnico lleva la muestra hasta el
sistema de inyeccin.


Uso Industrial.
Configuracin. Diseo Compacto:
Desgasificador, Bomba, Sistema de inyeccin, y
columna, se encuentran en un solo mdulo
Detector: Matriz de Fotodiodos y
Fluorescencia.
No destruye la muestra.
Cinco carruseles de muestras individuales
que pueden acomodar hasta 120 viales de
muestra. (+++)
Un portador hace girar los carruseles a la
estacin de inyeccin.
Puede llevar a cabo de 1 a 99 inyecciones
por muestra vial, y se puede compensar la
profundidad de la aguja para muestras de
volmenes pequeos.
Medio ambiente de la muestra puede ser
de temperatura controlada.
Datos se guardan en Biblioteca, que
permite realizar comparaciones, mejorando
la sensibilidad.
No es posible la Derivatizacin, (no se
puede programar el inyector).
Loop de 2 - 100 ul.
Elaboracin de Mtodos y ejecucin de
mtodos anteriormente usados




Incluir la curva de calibracin para el analito evaluado, el Lmite de deteccin y el
Lmite de cuantificacin utilizando la corrida del estndar ms diluido.
Calcular la concentracin del analito de inters en la muestra incgnita.

a. Datos de las corridas:


MUESTRA
TIEMPO
(MIN) AREA MASA ANCHO AREA % SIMETRIA
TC 5.084 20227.1 2019.9 0.1669 100 0.71
1/10 5.062 2425.1 293.7 0.1376 100 0.737
1/20 5.064 1212.9 146.7 0.1378 100 0.736
1/30 5.059 623.2 75.3 0.138 100 0.736
1/50 5.061 502 60.7 0.1379 100 0.736
1/100 5.055 262.7 31.7 0.138 100 0.735


b. Curva de Calibracin.














Diluciones rea Concentracin ug/ml
TC 20227.10 235.00
1 10 2425.10 23.50
1 20 1212.90 11.75
1 40 623.20 5.88
1 50 502.00 4.70
1 100 262.70 2.35
y = 85.407x + 178

Muestra
rea.
808.50
Concentracin del
analito, en la
muestra incgnita.
7.38 ug/ml



Clculo de los lmites de deteccin.


Analito
h (cm)
Ruido
h (cm)
Concentracin
ug/ml Dilucin
8.4 1.93 235.00 50000
LD: 3h Ruido * (235.00 ug/ml /50000)/ h Analito= 0.0032
LQ: 10h Ruido * (235.00 ug/ml /50000)/ h Analito= 0.0108
Lmite de deteccin. Es la menor cantidad o concentracin de un analito cuya seal puede ser
distinguida de la del ruido.
Lmite de cuantificacin: Corresponde a la cantidad o concentracin del analito a partir de la
cual es confiable realizar determinaciones cuantitativas.

y = 85.407x + 178
R = 0.9997
0.00
5000.00
10000.00
15000.00
20000.00
25000.00
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00

r
e
a

Concentracin g/mL
Curva de calibracin