ANALISIS INSTRUMENTAL

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

INTRODUCCION
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de
una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. En cromatografa lquida,
la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija.
La cromatografa lquida clsica! se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual est
rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se "ace fluir la fase mvil a
travs de la columna por efecto de la gravedad. #on el objeto de aumentar la eficiencia en las
separaciones, el tama$o de las partculas de fase fija se fue disminuyendo "asta el tama$o de los
micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil.
%e esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin &'(L#), que requiere de
instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
%ependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la
cromatografa lquida de alta resolucin puede ser*
+. #romatografa de adsorcin.
La fase fija es un slido y se utiliza casi e,clusivamente slice &slica) y en muc"a menor medida
al-mina.
.. #romatografa de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos qumicamente a
un soporte slido de slica. /e la subdivide encromatografa en fase normal y fase reversa.
En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar &como por ejemplo agua o trietilenglicol) y
los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido qumicamente es un "idrocarburo
aliftico y se emplean fases mviles polares. En este caso, las sustancias ms polares eluyen
primero.
0. #romatografa inica.
/e utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio inico para separar y determinar iones.
1. #romatografa de e,clusin por tama$o.
La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de
poros y llevan a cabo un fraccionamiento realcionado con el tama$o molecular. Las molculas de
tama$o mayor son e,cludas y eluyen primero, mientras que las ms peque$as que penetran en
los poros son retenidas ms tiempo.
INSTRUMENTAL
2n equipo para cromatografa lquida de alta resolucin puede representarse por el siguiente
esquema*
La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. #uando se trata de una
mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una
proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de mezclado. #uando durante toda la
separacin se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal
realizar un gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para mejorar la
eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de solvente tambin son realizados en
forma automatica por las bombas.
La bomba enva al solvente a travs de ca$os de dimetro peque$o, generalmente de acero
ino,idable, "acia la vlvula inyectora. Esta consiste en una vlvula de seis vas que permite introducir
en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se
HPLC 1
BOMBA
VALVULA
INYECTORA
COLUMNA DETECTOR
REGISTRADOR
INTEGRADOR
FASE
MOVIL
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector. Este
produce una se$al elctrica proporcional a la cantidad de materia y esa se$al es enviada al
registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo &cromatograma) del tipo*
3dealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la
muestra original. El integrador calcula adems el 4rea correspondiente a cada pico, la cual es
proporcional a la cantidad de sustancia.
%ado que los detectores de '(L# son no destructivos, es posible recuperar los productos
que salen de l. %e esta manera, dependiendo del tama$o del loop de inyeccin y de la columna, y
del tipo de bomba, es posible realizar adems de separaciones analticas, cromatografas
preparativas.
PARMETROS RELEVANTES
Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones cromatogrficas por '(L# son
idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa.
En '(L#, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la resolucin del
cromatograma, se cambia la composicin de la fase mvil a lo largo de la separacin utilizando
mezclas de entre dos y cuatro solventes.
ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA
/on idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa.
En lo que respecta a la optimizacin de las condiciones e,perimentales, en este caso es
posible realizar ensayos preliminares orientativos utilizando cromatografa en capa delgada con la
misma fase fija que contiene la columna.
(or otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas presiones, es
imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan obstruir los ca$os y la formacin de
burbujas que puedan deteriorar el relleno de las columnas y que produzcan inestabilidad en la se$al
del detector.
(ara evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran con
membranas de 5,16 a 5,.. 7m. (ara evitar la formacin de burbujas, los equipos de '(L# cuentan
con desgasadores de solvente por vaco o por burbujeo con 'e y, en el caso de no contar con los
HPLC 2
5 + . 0 1 6 8
Tiempo (min.
mismos, se deben desgasar los solventes por medio de ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de
utilizarlos como fase mvil.
PARTE EXPERIMENTAL
Objetivos
9ealizar curvas de calibracin para distintos analitos.
#uantificar el contenido de los mismos en muestras sintticas y comerciales.
Materiaes a e!"ear
Equipo para '(L# marca :"ermo /eparations compuesto por una bomba binaria modelo /pectra
/ystem (.555, una vlvula inyectora 9eodyne provista de un loop de inyeccin de +5 7l, un
detector de absorcin 2;<visible de longitud de onda variable modelo /pectra +55 y un integrador
registrador modelo %atajet.
#olumna analtica marca =lltec" econosp"ere #+> &fase reversa unida quimicamente formada por
cadenas de "idrocarburo lineal de +> tomos de carbono) de +65 mm de longitud por 1,8 mm de
dimetro interno.
?uffer fosfato 5,5.6 @A p'B0A calidad '(L#.
@etanol calidad '(L#.
(atrones de aspartamo, cafena y cido benzoico en agua, de diferentes concentraciones.
@uestra incgnita sinttica que contiene los tres analitos.
@uestras comerciales que contengan uno o varios de los analitos mencionados &Cmejor los tresD).
Ej.* gaseosas lig"t &con aspartamo), gaseosas cola, edulcorantes a base de aspartamo
&equalsEeet
F
), etc. :odas las gaseosas tienen benzoato como conservante.
jeringas de +mL.
Geringa de 6 ml con soporte para membranas de 5,16 5,.. micrones. Hiltros de nylon de 5,16
5,.. micrones.
Pro#e$i!ie%to
#uando se desarrolla una tcnica analtica por '(L#, normalmente se elige en primer lugar
una fase fija adecuada y una fase mvil con una composicin tal que sea compatible con la fase fija,
que disuelva los componentes a analizar y que permita una buena separacin. Luego se optimizan las
condiciones de flujo de solvente, cantidad de muestra a inyectar y, en el caso de un detector de
absorcin como el que se emplear en este caso, se determinar laIs longitudIes de onda de
deteccin.
(ara el anlisis de la mezcla de aspartamo, cido benzoico y cafena se utilizar una columna
de fase reversa #+> y, como fase mvil, una mezcla formada por 16J de metanol y 66J de buffer
fosfato &acuoso) 5,5.6@ de p'B0. /e inyectarn +5 7l de cada solucin.
K ?uscar en bibliografa los valores de pLa para los tres compuestos y, en base al estado de
ionizacin de los mismos al p' de trabajo, predecir el orden de elucin.
= continuacin se presentan los espectros de absorcin de soluciones cidas &p'B.) de
aspartamo &+>,M mgIL)A cido benzoico &8,66 mgIL) y cafena &M,>0 mgIL).
HPLC !
H
2
N
N
OCH
!
O
O
CO
2
H
H
"#p"$%"mo
CO
2
H
&'i(o )en*oi'o
N
N
N
N
O
O
CH
!
H
!
C
CH
!
'"+e,n"
:eniendo en cuenta los espectros, elegir la longitud de onda a utilizar en el anlisis.
C&rva $e Caibra#i'% ( a%)isis $e !&estras
+. 2na vez elegidas las condiciones, se realizar la curva de calibracin para cada analito
inyectando + mL de cada solucin patrn mezcla de modo de saturar y limpiar el loop del
inyector. =justar los valores de velocidad de papel y atenuacin adecuados en el integrador y
registrar los cromatogramas. Nraficar luego el rea de pico en funcin de la concentracin y
verificar que se est trabajando dentro del mbito lineal. 3dealmente cada punto de la curva
de calibracin se realizar por triplicado.
.. 9ealizar el anlisis cromatogrfico de la muestra sinttica y de las muestras comerciales. La
muestra sinttica no requiere tratamiento previo mientras que las comerciales deben
desgasarse al vaco &especialmente las de bebidas gaseosas) y filtrarse antes de ser
inyectadas. El filtrado se lleva a cabo con una jeringa de 6 ml unida a un soporte conteniendo
un filtro de nylon de 5,16 5,.. micronesA se descarta el primer ml de filtrado y luego se
recoge el lquido en un recipiente limpio.
0. /i fuera necesario, diluir la muestra para obtener valores dentro del intervalo de calibracin.
(ara el caso de muestras slidas, preparar soluciones de concentracin adecuada y verificar
que el material se disuelva por completo.
1. (ara uno de los patrones mezcla utilizados en la curva de calibracin, realizar variaciones en
la longitud de onda del detector. %iscutir la longitud de onda de trabajo.
6. (or -ltimo, realizar variaciones en el flujo de anlisis.
A%)isis $e os res&ta$os
- 2na vez obtenidas las curvas de calibracin, comparar la sensibilidad del mtodo para la
determinacin de cada compuesto en las condiciones de trabajo. 9elacionar la misma con los
espectros de absorcin y proponer mejoras en las condiciones e,perimentales para "acer ms
eficiente el anlisis.
- 3nformar las concentraciones de las muestras<problema con su error. #omparar con los valores
informados en literatura y con los declarados por los fabricantes de las muestras comerciales.
- (roponer un mtodo para evaluar el lmite de deteccin.
- %iscutir la necesidad de utilizar otros mtodos &estndar interno, agregado patrn) para realizar la
cuantificacin.
- #alcular los parmetros cromatogrficos de relevancia y realizar los grficos de ;an %eemter.
HPLC .
C&estio%ario
+.< #ual&es) es&son) los criterios de elucin para cada una de las siguientes cromatografas*
a.< lquida con columna con fase estacionaria inversa
b.< inica con columna de intercambio aninico.
..< Los parabenos se utilizan en la industria cosmtica como conservantes. /u frmula
general es dada en la figura +, donde 9 es un grupo alqulico. 2n fabricante de columnas de fase
reversa #+> recomienda las siguientes condiciones de uso* Hase mvil* 15I85 =cetonitriloIagua,
buffer fosfato p' M.5 con los resultados observados en la Higura +.
i.< #uando se intent "acer un cambio en la fase mvil usando 15I85 =cetonitriloIagua,
buffer p' 1.5 se obtuvo el cromatograma de la figura .. Ou efecto tiene en la corrida una
disminucin del p'.
ii.< #omo reducira el tiempo de la corrida si tiene la posibilidad de aplicar un gradiente de
solventes.
0.< El cido etidrnico se utiliza para el tratamiento de osteoporosis. #on el fin determinar
dic"o cido en una tableta que contiene como e,cipiente Pa#l, se utiliza un equipo de
cromatografa lquida con una columna de intercambio aninico y un detector
conductimtrico. 2tilizando como fase mvil cido ntrico +,6 m@ se observa que el pico
correspondiente al cido se superpone con el de #loruro. Oue cambios realizara para
separarlos. =cido etridrnico, pL+*+,0A pL.* .,6ApL0* M,5 pL1* ++,5
cido etidrnico
HPLC /
*I*LIOGRAF+A
Neneral de cromatografa*
- =nlisis 3nstrumental!. /Qoog y Leary.
- R(rincipios de =nlisis 3nstrumentalR, /Qoog, 'oller, Pieman.
- @todos 3nstrumentales de =nlisis!. Sillard, @erritt y otros.
- #romatografa lquida de alta presin!. '. @. @cPair y ?. Esquivel. @onografa cientfica de la
TE=.
%eterminacin de cafena, aspartamo y benzoato por '(L#*
- L. 'elric" &Editor). Tfficial @et"ods of t"e =ssociation of Tfficial =nalytical #"emistry &=T=#
Tfficial @et"ods of =nalysis), +6 t". Ed., ;ol. ., pg. M6. &+UU5).
- @. H. %elaney, L. @. (asQo, %. @. @auro, %. /. Nsell, (. #. Lorologos, G. @oraEsQi, L. G.
LroliQoEsQi, H. ;. Sarren Gr. J. Chem Ed., ,-, 8+> &+U>6).
- G. E. %iPunzio. J. Chem Ed., ,-, 118 &+U>6).
- =. P. /tro"l. J. Chem Ed., ,-, 11M &+U>6).
- ;. L. @c%evitt, =. 9odrguez, L. 9. Silliams. J. Chem Ed., ./, 8.6 &+UU>).
HPLC 0