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ANAEROBIOS
Rivas
ORIGEN Y DEFINICION
La presencia de una atmsfera terrestre rica en O
2
ha
permitido que los seres vivos hayan evolucionado
desarrollando un metabolismo aerbico, el cual se
caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtencin
de energa. A nivel bacteriano las bacterias anaerobias
precedieron largamente a las aerbicas y sin duda
predominaron largamente en un mundo vivo que
comenzaba a desarrollarse.
Los anaerobios generalmente poseen un metabolismo
de tipo fermentativo en el cual sustancias orgnicas son
los aceptores finales de electrones. Las formas
vegetativas mueren cuando son expuestos al O
2
molecular libre en la atmsfera, aunque el grado de
resistencia bajo estas condiciones es variable
(AEROTOLERANCIA); Los esporos bacterianos no son
afectados por tratarse de formas biolgicas
metablicamente inertes y con muy escasa proporcin de
agua en su composicin.
En consecuencia una definicin simple de las
bacterias anaerobias sera: anaerobios son aquellos
grmenes que slo pueden desarrollarse en ausencia de
cantidades significativas de Oxgeno (O
2
) y bajo
condiciones de potenciales REDOX (Eh) muy reducidos.
En el mundo microbiano existen especies capaces de
alternar con sistemas metablicos diferentes para crecer
y multiplicarse en muy diferentes condiciones de
aerobiosis, total, reducida o ausente. Son grmenes
facultativos. Otros solamente subsisten en rangos
estrictos de gases tales como el O
2
y el CO
2
(microaerfilos). Los anaerobios son poseedores de
sistemas enzimticos que solamente funcionan en
ausencia de O
2
por tanto son estrictos en cuanto a sus
exigencias de Medio Ambiente.
De ahora en ms el trmino Anaerobios se aplicar
solamente para este tipo de grmenes.
El conocimiento de estas bacterias es poco y
relativamente reciente ya que para poder lograr
condiciones de anaerobiosis en el Laboratorio se
necesitaban, hasta los aos 60, equipos costosos y
tcnicas bacteriolgicas muy dificultosas. A partir de la
introduccin de sistemas simples para producir
anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo el
conocimiento de los anaerobios se desarrolla
intensamente. Aun as, no hay un gran nmero de
Microbilogos que se dediquen al Tema, la taxonoma
est en permanente revisin e infinidad de aspectos se
mantienen oscuros.
MORFOLOGIA Y TINCION
Como en casi toda la bacteriologa, la morfologa de
los anaerobios se basa en la tincin de Gram. Un
problema adicional se plantea por la tendencia a tornarse
Gramnegativos, sea por la poca estabilidad frente a la
decoloracin (se prefiere el uso de alcohol a la mezcla
alcohol-acetona) lo que los convierte en Graminestables
al examen directo de los materiales, sea porque existe
una variacin tintorial en los cultivos bacteriolgicos.
Dos aspectos a tener en cuenta en la tincin de Gram
son:
a. efectuar la decoloracin solamente
con alcohol etlico prescindiendo de la acetona,
y
b. prolongar el tiempo de contacto con
Lugol hasta 1 minuto.
La morfologa celular, sobre las bases del Gram,
permite distinguir formas variadas que incluyen toda la
gama: Cocos Gram positivos, cocos Gram negativos,
diplococos, estreptococos; bacilos Gram negativos,
cocobacilos, fusiformes, bacilos rectos o curvos; bacilos
Gram positivos, esporulados o no esporulados,
espiroquetas, etc.
EL METABOLISMO DE LOS ANAEROBIOS
OXIGENO SENSIBILIDAD
Los anaerobios estrictos crecen y se multiplican en
ausencia total de Oxgeno molecular (O
2
) logrando
obtener energa libre y sintetizar todos sus componentes
estructurales sin la ayuda del O
2
. Todos sabemos que la
va anaerobia posee un menor rendimiento energtico y
est sujeta a potenciales REDOX bajos (algunas enzimas
solamente operan en estas condiciones) y sin la presencia
de elementos que interfieran el flujo normal de
electrones.
Si bien el O
2
es potencialmente txico para cualquier
forma de vida, los anaerobios son intolerantes al mismo
aunque en diferentes grados. Existe un espectro que va
desde los extremadamente intolerantes (aerointolerantes)
hasta los aerotolerantes moderados los cuales pueden
sobrevivir a la presencia de O
2
durante breves perodos.
Varias son las causas de la Oxgeno toxicidad. En 1er
lugar el Oxgeno es un poderoso oxidante, es decir, un
vido receptor de electrones, por lo tanto su presencia en
solucin es incompatible con potenciales REDOX bajos.
En esta situacin el flujo de electrones se ve interferido
por un receptor extrao al usual de los grmenes
provocando shunts letales. En segundo lugar el Oxgeno
puede interactuar directamente con enzimas o cofactores
causando inactivaciones irreversibles. En tercer lugar y
aparentemente, la causa ms importante de la Ox.
toxicidad se atribuye a la produccin de sustancias
txicas derivadas de la reduccin parcial de la molcula
O
2
. Simplificando se pueden dar las siguientes
reacciones qumicas:
2
O
2
+4H +4e- --> H
2
O (reduccin completa)
O
2
+2H +2e- --> H
2
O
2
(reduccin parcial)
O
2
+e- --> O
2
.-
La formacin de Perxidos de Hidrgeno (H
2
O
2
)
puede ser catalizada por varias enzimas y su letalidad
para las bacterias est fehacientemente comprobada. Por
otra parte el anin Superxido (O
2
.-) es altamente txico
por su participacin en la produccin de hidroxilos libres
(HO.-) agentes letales para los microorganismos.
Aquellos anaerobios aerotolerantes poseen enzimas
como Catalasas y peroxidasas que descomponen los
H
2
O
2
en H
2
O +O; otros poseen Superxido-dismutasas
(SOD) que actan eliminando los O
2
.-; ms aun las SOD
han sido postuladas como factores de virulencia en los
anaerobios ya que estas enzimas permitiran la sobrevida
de las bacterias en tejidos oxigenados hasta que el
consumo de Oxgeno crear el ambiente adecuado para
la multiplicacin y desarrollo.
POTENCIALES REDOX
El potencial de Oxido Reduccin (Eh) de una pareja
REDOX es la medida en VOLTIOS de la tendencia
espontnea a donar o recibir electrones por parte de uno
de los integrantes de la pareja (flujo de electrones). Una
pareja REDOX posee una forma reducida (dador de
electrones) y una forma oxidante (receptor de electrones)
Reductor <--->oxidante +electrones. En consecuencia
cuanto menor sea la cantidad de formas oxidantes menor
o ms bajo ser el potencial REDOX. La presencia de O
2
en los cultivos o en el medio natural debe ser eliminada
imprescindiblemente del microclima de desarrollo (O
2
atmosfrico y en solucin. An mas el descenso de los
Eh debe afirmarse con la presencia en el medio de
sustancias reductoras que superen en gran nmero a las
oxidantes.
FLORA NORMAL ANAEROBIA
El hombre conjuntamente con los animales
(mamferos, aves, peces) es hospedero en sus epitelios,
mucosas y aparatos de un gran nmero de Especies y de
un gran nmero de individuos anaerbicos. Estos son
miembros de una FLORA NORMAL beneficiosa y hasta
en algunos casos esencial para la vida. El conocimiento
de esta flora normal es importante desde varios ngulos.
Si pensamos que muchas infecciones anaerbicas se
desarrollan en la vecindad de las superficies mucosas en
las cuales estos grmenes predominan como flora
autctona, el conocimiento de la misma se presenta de
gran utilidad para sospechar quienes estaran
involucrados en los procesos infecciosos. Esta
informacin ayuda al Clnico para establecer una
antibioticoterapia emprica racional y al microbilogo
para seleccionar los Medios de Cultivo ms apropiados
al aislamiento e identificacin bacterianos.
La TABLA 1 muestra el predominio de las especies
ms comunes como flora normal humana segn
diferentes localizaciones.
3
TABLA 1
Piel V.R.S.(#) Boca Intestino Genitales
externos
Uretra Vagina
Bacilos Gram
(+) esporulados
Clostridia 0 0 1 3-4 0 1 1
Bacilos Gram
(+) no esporulados
Actinomyces
Bifidobact.
Eubacterium
Lactobac. (*)
Propionibact.
0
0
1
0
3-4
2
0
1
0
2
2
2
2
2
1
1
1
3-4
2
1
0
0
d
0
d
0
0
d
1
0
0
2
1
3-4
2
Bacilos Gram
(-) no esporulados
Bacteroides
Fusobact.
0
0
2
2
3-4
3-4
2
2
2
2
2
2
2
1
Cocos G (+) 2 2 3-4 3-4 2 1 2
Cocos G (-) 0 2 3-4 2 0 d 2
(#) Vas Respiratorias Superiores; incluye vas nasales, nasofaringe, orofaringe y amgdalas.
(*) Incluye anaerobios, facultativos y microaerfilos.
(d =desconocido) (0 =no encontrados o raros) (1 =hallazgo irregular) (2 =habitualmente presentes) (3-4 presentes
en gran nmero).
ESPOROS
Algunas especies de anaerobios (bacilos Gram
positivos del Gnero Clostridium) poseen la capacidad
de esporular, esto es, producir esporos. Se trata de
estructuras biolgicas genticamente iguales a su
antecesor vegetativo, metablicamente inactivos y
altamente resistentes a condiciones medioambientales
adversas (Temperatura, humedad, radiaciones UV,
agentes qumicos).
La germinacin de los esporos conduce a la forma
vegetativa de la bacteria y puede suceder, en algunos
casos luego de varios aos. La resistencia de los esporos
a altas temperaturas -120C hasta 15 minutos-
desecacin, falta de nutrientes, presencia de sustancias
qumicas antispticas, radiaciones. La resistencia al calor
se explica por los escasos porcentajes de H
2
O en su
constitucin (proceso de desecacin paulatino del esporo
en la maduracin) y la presencia de Calcio y cido
dipicolnico como agentes quelantes, mientras que la
resistencia a los otros agentes fsico/qumicos estara
dada por lo menos en parte por la presencia de protenas
de superficie ricas en cistena.
Esta propiedad de esporular le confiere a las especies
que la poseen una singular resistencia frente los agentes
fsicos y qumicos habitualmente usados para la
desinfeccin y una permanencia prolongada en el medio
ambiente. Sin duda la ubicuidad y la peligrosidad de
estos grmenes son resaltables y su permanencia en la
ecologa microbiana est por dems asegurada.
El proceso de esporulacin comienza durante la fase
de desarrollo estacionario luego de la falta de ciertos
nutrientes, una vez que se inicia el proceso este es
irreversible y una enorme cantidad de cambios
metablicos comienzan dentro de la clula con la
produccin y almacenamiento de enzimas y protenas
distintas a las de la forma vegetativa, que luego formarn
parte del esporo.
El factor desencadenante est constituido por la
carencia de fuentes de Carbono y Nitrgeno,
concretamente la falta de concentraciones adecuadas de
trifosfato de guanosina (GPT) intracelulares inicia la
esporulacin y se sabe que todas las deficiencias
nutricionales que conducen a una disminucin del pool
4
de GPT desencadenan la esporulacin. Dos tipos de
carencias son conocidas como responsables de la
disminucin del GPT:
1. Disminucin del precursor purnico P-
ribosil-PP, que ocurre cuando hay carencias de
Carbono.
2. La carencia de aminocidos la cual se
relaciona con el aumento de nucletidos fosforilados
de guanina, ppGpp y pppGpp.
La germinacin de los esporos comprende 3 etapas:
a. ACTIVACIN:
La activacin es esencial para el proceso de la
germinacin y un esporo activado germina en forma
irreversible. Activan los esporos el calor y algunos
estmulos qumicos.
b. GERMINACION:
Esta etapa comienza cuando los esporos activados
son estimulados por variados elementos nutritivos y no
nutritivos (l-alanina, el ms comn,) glucosa, otros
aminocidos.
Cambios morfolgicos y fisiolgicos muy
interesantes se producen cuando finaliza el estado
latente; el esporo se hincha, pierde su refringencia,
pierde su resistencia a los agentes fsico-qumicos y
comienza a observarse actividad metablica.
c. CRECIMIENTO:
En esta etapa se produce la sntesis proteica y de los
componentes estructurales de la futura forma vegetativa.
La membrana del 'core' del esporo se ir convirtiendo en
pared celular y la actividad proteica se ir intensificando.
En este momento toda esta actividad puede anularse o
interferirse por Antibiticos, o carencias de nutrientes.
Por su especial constitucin los esporos no se tien
con el Gram aunque existen tcnicas especiales que
permiten ponerlos en evidencia. Si se tie una bacteria
esporulando mostrar el esporo en su interior (debemos
recordar que cuando el esporo finaliza su maduracin la
forma vegetativa se desintegra) como una imagen en
negativo -ausencia de colorante-.
La ubicacin de los esporos dentro de los bacilos as
como su tamao contribuyen a la identificacin
bacteriana. De esta manera podemos distinguir a los
esporulados segn:
Ubicacin: esporos medianos, subterminales,
terminales.
Tamao : con deformacin o no del cuerpo
bacteriano.
FACTORES DE VIRULENCIA
Se pueden separar en 2 categoras segn su
importancia. Por un lado existen las poderosas toxinas
producidas por los Clostridios; por otro, una serie de
estructuras y sustancias de mucho menor poder patgeno
que se observan en varias especies de no esporulados. Se
conocen los lipopolisacridos de superficie en varias
especies de Fusobacterium, Veillonella y Bacteroides.
Estas sustancias tienen una actividad "endotoxina"
similar a las de los bacilos Gramnegativos facultativos.
Su actividad es algo menos potente pero se ha
demostrado su capacidad (en Bacteroides) de participar
en la produccin de abscesos y de causar
hipercoagulabilidad. El polisacrido capsular de los
Bacteroides del grupo fragilis es otro factor de
virulencia importante, ya que se comporta en forma
similar a las Cpsulas de otras bacterias, es decir, le
confiere al germen "la lanza y el escudo" en cuanto
favorece su poder invasivo y dificulta la accin defensiva
de los leucocitos polinucleares. Aun ms, est claramente
demostrada su participacin en la formacin de abscesos
causados por Bacteroides.
Diversas enzimas de los anaerobios deben
considerarse como factores de virulencia: colagenasa,
hialuronidasa, DNAsa, elastasa, heparinasa, son las
principales. Tambin deben incluirse aquellas enzimas
que protegen contra la accin letal del O
2
tales como
Catalasa y Superxidodismutasa en cuanto permiten la
sobrevida del germen en ambiente no apropiado hasta
que se presenten las condiciones favorables. Estos
factores de virulencia no deben considerarse como
"toxinas".
LAS TOXINAS
Corresponde a las potentes exotoxinas producidas
por los Clostridios las cuales sern analizadas con estos
microorganismos.
GENETICA DE INTERES EN LOS
ANAEROBIOS
Elementos extra cromosmicos: Plsmidos.
Los Plsmidos estn ampliamente difundidos entre
los anaerobios especialmente a nivel de especies de
Clostridium y Bacteroides. Un muy buen porcentaje de
estos elementos no han demostrado funciones
especficas. Entre los Plsmidos funcionalmente
conocidos encontramos:
a. Plsmidos que codifican la producin
de Bacteriocinas.
Similares a las Colicinas estas
sustancias las poseen especies de Clostridium y
Bacteroides.
b. Plsmidos toxignicos.
Ampliamente distribuidos entre las
especies de Clostridium productoras de
exotoxinas (toxignicas). La correlacin
fehaciente entre plsmido y produccin de
toxina no se ha podido establecer en muchos
casos. El caso con ms evidencias de la relacin
plsmido-toxina para Clostridium tetanii donde
puede afirmarse que la produccin gentica de
toxina tetnica est codificada por un Plsmido.
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c. Plsmidos que codifican la resistencia
a los ATB.
Existen evidencias de que entre
diferentes especies de Clostridium, Bacteroides
y Cocos anaerobios existen plsmidos de
diferente tamao que codifican la resistencia a
Macrlidos (Clindamicina, Eritromicina)
Tetraciclinas y Cloramfenicol.
RECOLECCION DE MUESTRAS
Teniendo en cuenta que los anaerobios pueden causar
o contribuir a la infeccin de cualquier tipo y en
cualquier lugar del organismo, parece claro que se debe
procurar siempre una muestra libre de contaminacin
con Flora Normal para tener resultados verdaderamente
positivos. Las muestras siguientes habitualmente estn
contaminadas con anaerobios de la Flora Normal y por
lo tanto no deben ser cultivadas en anaerobiosis.
Exudados de garganta, nasofarngeos, bucales.
Esputo tosido o aspirado va oral/nasal.
Contenido gstrico e intestinal (salvo excepciones).
Materias fecales (salvo excepciones).
Orina obtenida por sonda o espontneamente.
Exudados vaginales y cervicales.
Una recoleccin de muestra adecuada debe evitar
siempre la ms mnima contaminacin con flora normal
(donde en algunos casos la proporcin de individuos
anaerobios es de 1000 a 1 por aerobio). Los mtodos de
recoleccin ms adecuados se pueden resumir de la
siguiente manera:
LUGAR Procedimiento
PULMON Puncin Transtraqueal (PTT)
percutnea.
Puncin Pulmonar Transparietal
(PPTP).
Lavado Bronquial con Cepillo
Protegido.
PLEURA Toracocentesis.
TRACTO
URINARIO
Puncin Suprapbica (PSP) percutnea.
ABCESOS Aspiracin con aguja y jeringa en abs.
cerrados. Igual en abiertos; evitar
hisopados de material al aire, puncionar
lateralmente.
GENITAL
FEMENINO
Obtencin por culdocentesis previa
desifeccin vaginal con yodoforos.
Cepillo protegido de uso bronquial.
TRACTO
SINUSAL
Aspiracin con jeringas y catter
plstico previa desinfeccin, curetajes,
biopsias.
EL POR QUE DE LA INUTILIDAD DE
ALGUNAS MUESTRAS
La expectoracin no sirve porque el esputo se
contamina con la flora anaerobia normal de la faringe y
la boca en su pasaje al exterior; igualmente pasa con el
esputo obtenido por fibroscopa o los aspirados
nasotraqueales ya que el tubo arrastra en su introduccin
flora normal en su extremo distal.
La orina emitida espontneamente o con sonda se
contamina por la colonizacin natural de la porcin
distal de la uretra y el meato o por la colonizacin de la
sonda. Si existen catteres suprapbicos o renales
pueden utilizarse para tomar la muestra con resultados
aceptables.
La endometritis presenta serias dificultades. En estos
casos los anaerobios casi constantemente estn
involucrados en la etiologa de estas infecciones y estos
grmenes como siempre sucede son los mismos de la
flora normal (vaginal o cervical). Como la mayora de las
endometritis suceden al nacimiento o a los abortos se
encuentran en el endometrio cantidades significativas de
anaerobios.
TRANSPORTE DE MUESTRAS
Otro factor crucial para el xito en el aislamiento de
anaerobios es el transporte de muestras. Se debe proteger
a los microorganismos de los efectos del O
2
durante el
tiempo que transcurre entre la extraccin y la siembra
anaerbica. El primer y ms efectivo sistema es "correr"
ya que en ninguna otra ocasin como esta el envo
inmediato al Laboratorio es tan fundamental. Las
muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte
que asegure la anaerobiosis. Existen tubos,
comercialmente disponibles en los que se ha sustituido
de aire por otro gas ("Tubos gaseados") y que contienen
un indicador de anaerobiosis. En casos de extraccin de
material con aguja y jeringa, si la demora no supera los
30 minutos puede enviarse el material en la misma
jeringa expulsando el aire residual y obturando la aguja
con un tapn de goma.
Existen para perodos prolongados tubos con medios
de transporte adecuados o bolsas plsticas con sistemas
de anaerobiosis qumica. Los lquidos purulentos espesos
(Abscesos, Empiemas) se comportan como medios de
transporte 'per se' por su propia constitucin y hemos
podido recuperar anaerobios hasta 24-48 despus de
realizada la extraccin.

METODOS DE CULTIVO
Los cultivos incluyen el uso de J arras anaerbicas,
bolsas plsticas, el mtodo PRAS de Hungate y la
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Cmara de anaerobiosis o "cmara de guantes". Los dos
ltimos mtodos son muy caros, requieren equipamiento
complejo, son lentos y se usan para estudios de Flora
Normal y en laboratorios altamente especializados.
Desde el punto de vista prctico las Jarras pequeas y los
sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los
ms sofisticados y son aceptables para los estudios de
anaerobios de inters mdico. Con estos sistemas son
posibles los cultivos en medios slidos para la obtencin
de aislamientos que permitan la identificacin bacteriana.
El uso de medios lquidos en forma exclusiva no es
recomendable (salvo para hemocultivos) ya que la
mayora de las infecciones por anaerobios son
polimicrobianas incluyendo facultativos o
microaerfilos.
Medios lquidos (slo para hemocultivos)
Existen varios medios comercialmente disponibles.
Algunos contienen (SPS) sodiumpolyanetol sulfonate el
cual estimula el desarrollo de los anaerobios, aunque al
parecer sera inhibidor para Peptococcus anaerobius.
Se trata de frascos de 100 ml, al vaco, con el agregado
de CO
2
, una base nutritiva (digerido trptico de soja o
peptonas) y un agente reductor (thiol o thioglicolato). El
por-centjae de sangre a inocular es del 5 al 10 % v/v. Los
frascos se examinan diariamente buscando turbidez,
hemlisis o gas; se consideran negativos definitivamente
a los 10 das de incubacin previos subcultivo final.
Jarras de Anaerobiosis
Existen varias marcas comerciales de jarras con
performance aceptable para generar atmsfera de
anaerobiosis. El fundamento del sistema ms utilizado
(Gas Pak)- se basa en:
1. La generacin de H
2
y CO
2
por medio
de una reaccin qumica cuyos sustratos se
encuentran separados en un sobre al cual se le
agrega agua, desencadenando la reaccin.
2. La combinacin del H
2
y el O del aire
para formar agua generan la anaerobiosis, esta
reaccin se cataliza utilizando granallas de Zinc
recubiertas de Paladio las cuales se encuentran
depositadas en una canastilla dentro de la jarra.
Una tirilla de papel impregnada en Azul de
metileno (azul en presencia de O
2
, incoloro en
ausencia) introducida en la J arra es el indicador
de Anaerobiosis.
Sobres de Anaerobiosis
El sistema BioBag consiste en una bolsa plstica
transparente, gas impermeable, una ampolla de indicador
de anaerobiosis (resarzurina) y una ampolla generadora
de anaerobiosis. Una o 2 placas de Petri pueden
introducirse antes de sellar la bolsa mediante un sellador
plstico por calor. Luego se rompen las ampollas de
indicador y generador. Los grmenes crecen y se
mantienen viables por lo menos una semana. Este
sistema tiene las ventajas de su economa y practicidad,
adems de poder observar directamente si existe
crecimiento sin abrir el Sistema; tambin se puede
utilizar para los sistemas de identificacin tipo API-20A.
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS
La antibioticoterapia de las infecciones por
anaerobios es habitualmente emprica ya que los cultivos
y el aislamiento son lentos y dificultosos. Por otra parte,
las pruebas de sensibilidad realizadas en los laboratorios
Clnicos no dan resultados confiables. De manera pues,
que nos debemos guiar por las pruebas realizadas en los
laboratorios de Referencia Internacionales que aportan
datos sobre sensibilidad que permiten predecir con un
nivel razonable de seguridad cuales son los Antibiticos
de eleccin para cada germen. Las pruebas de
sensibilidad se realizan de forma similar a las de
grmenes aerobios. Existe una prueba de dilucin en
Caldo que permite establecer CMI y CMB; el Test de
Dilucin en Agar (muy til para realizar estudios de
varias Cepas) en donde el Antibitico se incorpora al
Agar en diluciones sucesivas en placas de Petri.
IDENTIFICACION DE LOS ANAEROBIOS
Los anaerobios se presentan corrientemente en
cultivos mixtos con otras especies sea anaerobias,
micoraerfilas o facultativas. El primer paso es pues, la
observacin de las colonias y su correspondiente Gram
para establecer distintas especies las cuales sern
subcultivadas para establecer aerotolerancia "aire, CO
2
y
anaerobiosis". Informacin complementaria puede
obtenerse observando las placas de Petri bajo luz UV
para determinar la fluorescencia de las colonias. En las
placas de Subcultivos (con medios ricos, selectivos y/o
diferenciales) segn la sospecha de Gnero pueden
agregarse Discos de Vancomicina 5 g, Kanamicina
1000 g, Coilistin 10 g , SPS y NO
3
, los cuales aportan
datos para la identificacin preliminar. En el diagrama
siguiente se esquematizan los pasos a seguir:
Cultivo en placa
Registrar:
! Morfologa de colonias
! Pigmento
! Hemlisis
! Fluorescencia
! Susceptibilidad a:
Vancomicina
Kanamicina
Colistin
SPS
! Actividad lipasa
! Actividad lecitinasa
Realizar:
! Gram
! Indol
! Catalasa
!
Test de NO
3
7
La mayora de los Laboratorios deben conformarse
con la realizacin de los Tests de Identificacin
preliminares. La identificacin final queda reservada
para los laboratorios de Referencia y comprende:
Estudios de fermentacin de azcares y estudio de los
productos finales del metabolismo los cuales pueden
agruparse en:
cidos grasos voltiles y alcoholes.
Metabolitos no voltiles.
cido frmico.
Produccin de Hidrgeno.
Estos estudios se realizan utilizando la Cromatografa
Gas-lquida.
ANAEROBIOS NO ESPORULADOS DE
INTERES MEDICO
Bacilos Gram negativos
Bacteroides
fragilis
vulgatus
ovatus
thetaiotamicron
distasonis
ureolyticus
gracilis
Estas especies del gnero Bacteroides
(fundamentalmente fragilis, de alta proporcin en flora
intestinal) se asocian con infecciones anaerobias
subdiafragmticas y genitales (por su vecindad con la
porcin final del aparato digestivo y regin perineal), y
con las sepsis al punto de partida de estas infecciones.
Todos los miembros del gnero son resistentes a
Penicilinas (por Betalactamasas) y Cefalosporinas -con
alguna excepcin-. La morfologa es de coco-bacilos
pleomrficos, pequeos, Gramnegativos. En los cultivos
se presentan como colonias pequeas, bajas, brillantes.
El desarrollo se estimula por la adicin de Bilis a los
medios, lo cual permite el aislamiento selectivo para
estos grmenes. Poseen antgenos proteicos y
lipopolisacardicos pero lo caracterstico es la Cpsula.
Su poder patgeno radica en la actividad endotoxina
smil de sus Ag. de membrana y del polisacrido
capsular. Existen descripciones de cepas productoras de
enterotoxinas capaces de dar enfermedades diarreicas en
el hombre y animales.
Prevotella
melaninognica
buccae
oris
bivia
corporis
dentcola
intermedia
Estos bacilos de similares caractersticas a los
Bacteroides se ha reclasificado, ya que anteriormente se
agrupaban como Bacteroides y subespecies de los
mismos. Las cepas con produccin de pigmento negro a
marrn en los medios de cultivo son fcilmente
identificables y son miembros de flora normal de boca y
vas respiratorias superiores y partes blandas
subyacentes. Algunas cepas (menos del 20 %) son
productoras de penicilinasas, pero en general son
sensibles a este antibitico.
La Prevotella bivia prevalece en flora vaginal y
produce vaginosis e infecciones de origen obsttrico.
Porphiromonas
asacaroltica
gingivalis
endodontalis
Flora normal de boca y encas (gingivalis y
endodontalis) y flora intestinal (asacaroltica) producen
infecciones relacionadas con su habitat. Su morfologa
vara desde los cocobacilos hasta formas alargadas. Las
colonias son convexas, lisas y pigmentan con el tiempo,
algunas veces se observa beta hemlisis. La vitamina K
estimula el desarrollo de estos grmenes.
Fusobacterium
mortiferum
nucleatum
necrophorum
Miembros de flora normal de bucofaringe
(nucleatum) y flora intestinal su morfologa es
caracterstica; bacilos largos con extremos acintados o
filamentos delgados. Algunos (necrophorum) pueden ser
ms abultados en su sector medio. Producen alfa y beta
hemlisis en los cultivos y las colonias son translcidas
de forma varias a veces irregulares. Fusobacterium
nucleatum es el ms comn en infecciones del aparato
respiratorio, mientras que necrophorum se lo asla de
infecciones subdiafragmticas. Son habitualmente
sensibles a las Penicilinas y su poder patgeno se
establece por la presencia de lipasa y leucotoxinas.
Bacilos Gram positivos
Actinomyces
israelii
naeslundii
bovis
odontolyticus
viscosus
Se trata de bacilos Gram positivos largos y
ramificados, delgados y delicados, bajo ciertas
circunstancias, frotis o cultivos pueden fragmentarse
simulando bacilos del tipo difteroides.
De variada aerotolerancia, israelii (el patgeno de
inters mdico ms importante) y bovis son los menos
8
tolerantes al Oxgeno; aunque las cinco especies crecen
mejor en presencia de CO
2
, las otras especies deben
considerarse facultativos.
Miembro de flora normal bucal (Actimomyces
israelii) se relaciona con una entidad Clnica conocida
como Actinomicosis la cual tiene varias manifestaciones
clnicas que veremos ms adelante.
El poder patgeno no est determinado con claridad;
las infecciones se ven favorecidas por un traumatismo o
por alguna otra disminucin de las barreras defensivas
locales.
ACTINOMICOSIS CERVICOFACIAL
Constituye aproximadamente el 50% de los casos de
actinomicosis. Secundario a caries o enfermedades
odonto-periodontales el germen atraviesa (por
traumatismo) la mucosa bucal intacta conduciendo en su
forma tpica a un proceso inflamatorio de regin maxilar
inferior con compromiso seo (osteomielitis maxilar). Si
la enfermedad progresa se abre una fstula al exterior
evacundose el pus al exterior. El diagnstico etiolgico
se realiza evidenciando la presencia de "grnulos de
azufre", material granulomatoso con colonias de
microorganismos y filamentos ramificados al Gram.
ACTINOMICOSIS TORACICA
Por aspiracin del agente o por extensin de lesiones
crvicofaciales puede producirse enfermedad pulmonar
de tipo subagudo, febril, con tos y expectoracin
purulenta. La progresin de la enfermedad conduce a
cavitacin pulmonar, con fistulizacin al exterior a travs
de la pared torcica pudiendo interesar costillas y
vrtebras.
ACTINOMICOSIS ABDOMINAL
Como consecuencia de una perforacin intestinal, la
enfermedad se desarrolla lentamente generando signos y
sntomas segn el rgano abdominal afectado. Es posible
la extensin vertebral y la fistulizacin al exterior.
ACTIMOMICOSIS GENITAL
Se ha descrito infeccin en mujeres que utilizan
dispositivos intrauterinos con sintomatologa escasa y sin
presencia de grnulos.
Principales caractersticas bioqumicas de
Actinomyces israelii.
Req. de Oxgeno: Anaerobio
Eubacterium
lentun
nodatum
timidum
brachy
De lento desarrollo en cultivos y aerotolerancia muy
amplia, estos pequeos bacilos tienen su hbitat en boca
y vas respiratorias superiores, E. lentum forma parte de
la flora intestinal. Las infecciones estn relacionadas con
la vecindad de su hbitat produciendo infecciones
odontolgicas, de cabeza y cuello, y aparato genital
femenino.
Propionobacterium
acnes
granulosum
Integrantes de flora normal de piel,
fundamentalmente, de escaso poder patgeno se los asla
como contaminantes de hemocultivos y procesos de piel.
P. acnes deben su nombre al relacionarlo con el Acn.
Bacilos, a veces ramificados, pueden confundirse con
Actinomyces, a veces pleomrficos y cortos se los
confunde con Difteroides.
Lactobacillus
Mltiples especies asociadas con la flora normal de
boca y en gran cantidad en flora vaginal, poseen un
poder patgeno mnimo; se trata de bacilos largos, Gram
positivos netos, de bordes paralelos y extremos
rectangulares.
Mobiluncus
mulieris
curtisii
Estas especies de bacilos Grampositivos inestables,
eran conocidos como Bacilos Anaerobios curvos que se
aslan de vaginitis inespecfica; de lento crecimiento son
difciles de cultivar y su participacin en infecciones se
puede sospechar por una buena microscopa.
Bifidobacterium
Miembros de flora normal de boca y
tractogastrointestinal, hay varias especies; de escaso
poder patgeno deben su nombre a la morfologa del
Gramque les de su nombre.
Cocos Gram positivos
Peptoestreptococos
anaerobius
magnus
asaccharoliticus
tetradius
prevotti
A pesar del nombre del Gnero la morfologa de
estos grmenes incluye formas en pares, ttradas,
racimos, y cadenas. Un estudio microscpico cuidadoso
muestra a estos cocos con tamao irregular y alguna
decoloracin parcial, lo que permite diferenciarlos de sus
similares aerobios. Forman parte de la flora de la boca,
intestino y genitales. Se encuentran involucrados en
infecciones pleuropulmonares, abscesos, infecciones
ginecolgicas, sinusitis. Casi constantemente son
9
sensibles a los betalactmicos.
Cocos Gram Negativos
Veillonella parvula
Pequeos cocos Gramnegativos en diplos o cadenas
cortas y racimos, miembros de flora bucal intestinal y
genital, se asla de materiales Clnicos, pero es dudoso y
desconocido su poder patgeno.
BACILOS GRAM POSTIVOS ESPORULADOS
Los Clostridium son bacilos Gram positivos,
esporulados, anaerobios estrictos, salvo alguna especie
con mayor aerotolerancia. Los patgenos son
productores de poderosas exotoxinas las cuales por s
mismas provocan todos los sntomas y signos de las
infecciones. Dentro del Gnero podemos separar 4
grandes grupos.
1. Clostridios histotxicos
(especies ms comunes) Clostridium
perfringens
septicum
histoliticum
novyi
sordelli
fallax
bifermentans
Dentro de este grupo la especie ms importante es
perfringens, (80 a 90%) por lo que nos referiremos
fundamentalmente a esta especie.
Este grupo de grmenes causa infecciones muy
severas caracterizada por una mionecrosis, infeccin
clsicamente conocida como gangrena gaseosa;
(debemos tener en cuenta que la presencia de gas en
infecciones de partes blandas no siempre significa
mionecrosis. Todos estos clostridios producen
exotoxinas de diferente potencia que veremos ms
adelante.
El clostridio ms frecuente (C. perfringens) posee
cinco tipos diferentes, del A al E, los cuales producen 4
tipos de toxinas letales clasificadas como: alfa, beta,
epsiln y theta. El tipo ms comn de inters mdico es
el tipo A que produce la alfatoxina y algunas otras toxina
de menor poder (omega, kappa, micrn). C. perfringens
tipo A se halla como flora normal del hombre y los
animales aunque en estos no es frecuente causa de
enfermedad. Lo contrario sucede con los otros tipos de
clostridios.
Morfologa y tincin
Bacilo netamente Grampositivo corto y grueso de
bordes redondeados, con formas hasta cocoides. De los
frotis directos de muestras clnicas destacamos que no se
observan esporos y que la clulas que componen un
frotis de material clnico se encuentran ausentes (debido
a la intensa citlisis txica). Cuando en cultivos vemos
formas esporulando, los esporos medianos o
subterminales no deforman el soma vegetativo.
Fisiologa y cultivo
Anaerobio aerotolerante, de fcil recuperacin, de
crecimiento rpido en Agar sangre, es el nico inmvil
de los clostridios patgenos, no esporula en medios
comunes, desarrolla en pH variable y temperaturas de 20
a 50 grados. En 24 horas de incubacin produce colonias
de 2 a 4 mm con formas lisas a rugosas. Se puede ver
una hemlisis doble, una estrecha betahemlisis
producida por la alfa toxina y una zona ms amplia de
hemlisis incompleta producida por la toxina omega.
Desarrolla abundantemente en medios con glucosa y
carne picada o medios con leche, produciendo abundante
gas e intensa fermentacin (ferment. lactosa -
>acidificacin ->coagulacin de la casena ->rotura del
cogulo por la produccin de gas). La produccin de
alfa-toxina se puede realizar colocando suero humano en
presencia de un sobrenadante de cultivo el cual produce
una opalescencia clara del mismo (Reaccin de Nagler),
o alternativamente sembrando Agar con yema de huevo
el cual se torna opalescente. La adicin de la antitoxina
especfica se usa como contraprueba, sea en placas o en
la prueba del suero. La siembra directa de materiales en
Agar yema de huevo (media placa con antoxina) permite
determinar en pocas horas la presencia de C. perfringens
en muestras clnicas. La opalescencia del suero y la yema
de huevo se deben a que la alfa-toxina es qumicamente
una lecitinasa.
Estructura antignica - Toxinas
C. perfringens del tipo A produce por lo menos 12
sustancias de naturaleza proteica de poder antignico, 4
de ellas toxinas, de las cuales la alfa es la ms poderosa.
Esta toxina se define como dermonecrtica-letal y
hemoltica. Qumicamente es una lecitinasa C - o
fosfolipasa C- que degrada la lecitina. La activacin de la
toxina es dependiente de los iones Ca++y Mg++. De
alto poder antignico, los Ac. antitoxina son los nicos
que pueden neutralizar el efecto de la misma. La alfa-
toxina acta sobre lipoprotenas que contienen lecitina en
la membrana celular y en las mitocondrias. La accin
necrtica tisular es evidente, no as las acciones a nivel
sistmico. Otras sustancias antignicas de menor poder
txico son importantes auxiliares en la diseminacin de
la enfermedad.
Clostridium septicum
Flora normal intestinal de hombre y animales, mvil
pertrico, es productor de alfa-toxina y se encuentra
asociado en el 10% de los casos de mionecrosis o sepsis
de origen endgeno.
Clostridium histoliticum
Flora normal del hombre y los animales,
aerotolerante productor de alfa-toxina y beta-toxina.
Esta ltima es una protena con actividad enzimtica
(colagenasa) que destruye las fibras del colgeno.
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Clostridium novyi
Existen tres tipos A B y C. Se trata de bacilos
grandes, mviles pertricos con esporas subterminales.
2. Clostridios enterotoxignicos
C.perfringens tipo A. --> Intoxicacin alimentaria
Este germen productor de una enterotoxina (detallada
en otro Captulo) produce una intoxicacin alimentaria
de tipo leve. Los sntomas de la enfermedad dependen de
la accin de la enterotoxina sobre la mucosa intestinal, la
misma es producida cuando alimentos contaminados con
esporos son calentados para su coccin y la germinacin
y posterior multiplicacin acumula toxinas.
C. prefringens tipo C. --> Enteritis necrotizante
Se trata de una enfermedad mucho ms severa que la
anterior, pudiendo ser letal. Los sntomas de la
enfermedad son ocasionados por la beta-toxina
producida por estos grmenes.
C. difficile --> Enterocolitis seudomembranosa
Se trata de una especie anaerobia estricta, miembro
de flora normal intestinal humana, y se han descrito seis
serogrupos en relacin con su toxicidad. C. difficile
produce 2 toxinas: una toxina B citotxica y una toxina
A, enterotoxina potente; ambas son las determinantes de
la enfermedad. En ciertas circunstancias el origen de la
enfermedad es endgeno y su causa es, por una intensa
antibiticoterapia, en especial con Clindamicina. Al
parecer los ATB al eliminar la flora normal permitiran
un hiperdesarrollo de C. difficile.
3. Clostridium tetani
TETANOS
C. tetani es el agente productor del Ttanos,
descubierto en 1889 por Kitasato.
Morfologa
Bacilo Gram positivo, delgado, de 3 a 8 m de
longitud, mvil pertrico, posee tendencia al Gram
negativo en cultivos viejos y materiales clnicos, con
esporos terminales que deforman el soma bacteriano
dndole una forma caracterstica de raqueta o palillo de
tambor.
Cultivos
Anaerobio obligado, algo exigente, temperatura
ptima de crecimiento a 37C, pH ptimo 7.4. Las
exigencias nutritivas son cubiertas por el agregado de
sangre o carne cocida, produce una betahemlisis dbil,
no fermenta hidratos de carbono. Los esporos resisten 20
minutos a la ebullicin y una esterilizacin segura
requiere auto-clave (121C, 15 min.)
Antgenos
Posee antgenos H flagelares (10 tipos), O somticos
y en los esporos.
Poder patgeno
Todos los sntomas de la enfermedad son atribuibles
a la produccin de una poderosa toxina:
ttanoespasmina. La toxina, intracelular y liberada por
autlisis, es una protena TERMOLABIL que se
inactiva por calentamiento -60C durante 20 minutos- o
por formaldehdo, esta propiedad es de extraordinaria
importancia ya que si bien la toxina pierde su poder
patgeno, no pierde su poder antignico transformndose
en toxoide, el cual confiere una excelente inmunidad a
los sujetos inoculados. Qumicamente es una cadena
polipeptdica de pm 150 kdalton, que posee tres
subunidades A, B y C. Al momento de su liberacin
existe un clivaje, al parecer por las proteasas bacterianas,
quedando dos subunidades A y BC unidas por un puente
disulfuro.
La toxina tetnica es una de las toxinas ms
poderosas que existen, en especial para el hombre y los
animales.
Mecanismo de accin de la toxina tetnica
Con exclusivo sitio de accin a nivel de Sistema
Nervioso (regiones A y BC con afinidad para receptores
ganglisidos) es capaz de actuar a distancia por el
siguiente mecanismo. Una vez fijada al receptor celular
la toxina ingresa a la clula por endocitosis y se mueve
por va retrgrada a travs de los axones.
Entonces la toxina interfiere la transmisin sinptica
inhibiendo la liberacin de neurotrasmisores
inhibitorios tales como la Glicina, de las neuronas
inhibitorias. Los efectos estmulo-inhibicin de las
neuronas motoras son desbalanceados causando una
rigidez muscular. Esta se manifiesta en los msculos ms
fuertes: maseteros (trismus) flexores de extremidades
superiores y extensores de extremidades inferiores y
tronco (opsittonos).
La contaminacin
Los esporos de C. tetani se hallan ampliamente
distribuidos en el suelo y medio ambiente, las formas
vegetativas son flora normal de hombre y animales,
especialmente equinos. Una herida contaminada con
esporos de C. tetani es la puerta de entrada del germen.
Estas heridas deben poseer un contexto especial de
necrosis o de sustancias necrotizantes (bajos Eh.); en
general se trata de heridas punzantes, cuerpos extraos
como astillas, espinas, etc. Existe una forma muy temida
de ttanos que es el ttanos neonatal, provocado por el
corte del cordn umbilical con instrumentos contamin-
dos.
La Clnica
Luego de un perodo de incubacin variable 4 a 10
das se desarrolla la enfermedad que puede ser
localizada, con espasmos musculares de msculos
adyacentes a la herida o, con mayor frecuencia,
generalizada. Los sntomas son todos aquellos
provocados por la contraccin espstica muscular con
afectacin de los msculos respiratorios, alteraciones
cardiovasculares y muerte.
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El Diagnstico
El diagnstico es Clnico ya que es muy difcil el
aislamiento bacteriolgico; apenas unos pocos grmenes
que produzcan nfimas cantidades de toxina son
suficientes para desencadenar el proceso.
La inmunidad y la prevencin
La enfermedad no confiere inmunidad ya que la
cantidad de toxina que desencadena los sntomas no es lo
suficientemente grande como para activar el Sistema
Inmunitario.
La prevencin se logra con la inmunizacin activa de
toda la poblacin a partir de los 3 meses de edad
utilizando el Toxoide tetnico. Confiere una proteccin
del 100% en inmunocompetentes y es inadmisible no
estar correctamente inmunizado. La inmunizacin pasiva
con gamma globulinas hiperinmunes de donantes se
utiliza como coadyuvante en la enfermedad y como
proteccin pasiva en sujetos no vacunados con heridas
tetangenas.

4. Clostridium Botulinum
BOTULISMO
La enfermedad del botulismo data desde 1870 para
describir una intoxicacin alimentaria mortal por
ingestin de salchichas (latn, botulus =salchicha). En
realidad mltiples alimentos conservados pueden
provocar la intoxicacin. En la poca actual el empleo de
autoclaves y mtodos modernos de esterilizacin hacen
que los productos comerciales enlatados hayan perdido
el protagonismo quedando el riesgo reducido a la
manufactura casera de enlatado de carnes, pescados y
vegetales. Aun as la coccin de los enlatados destruye la
toxina botulnica por lo cual slo existe riesgo en
aquellos alimentos a consumirse directo de la lata sin
previa coccin.
Morfologa
El C. botulinum es un bacilo Grampostivo recto,
con extremos redondeados, mvil pertrico, produce
esporos resitentes al calor, subterminales que deforman
algo el soma bacteriano.
Cultivos
Anaerobio estricto, desarrolla en medios con sangre,
produciendo colonias betahemolticas, bastante exigente
en cuanto a requerimientos nutritivos, fermentan la
glucosa. Los esporos son muy resistentes al calor, a las
radiaciones y a los agentes qumicos.
Estructura antignica
De composicin compleja y bastante indefinida no
existen antgenos en las clulas vegetativas que resulten
de importancia.
Segn el tipo de exotoxina producida se han descrito
8 tipos serolgicos A al G. Tienen importancia
epidemiolgica ya que, excepto los tipos C y D, el resto
produce un solo tipo de toxina.
El poder patgeno
La patogencidad est dada exclusivamente por la
exotoxina que habitualmente es producida fuera del
organismo, al punto que ms que una infeccin se
debera considerar como intoxicacin o envenenamiento.
La toxina botulnica y su mecanismo de accin
La toxina se genera incubando los grmenes entre 25
a 38C a un pH de aproximadamente 7. Si bien es
considerada una exotoxina, se libera cuando se produce
la lisis de la bacteria. Su dosis letal es tan poderosa que
un g (milsima de mg) contiene 200.000 dosis letales
para un ratn de 20 gr y se acepta que apenas unos
gramos seran capaces de eliminar toda la humanidad.
De naturaleza proteica, al igual que la tetnica, se trata
de una cadena polipeptdca de 150kda con tres regiones
A, B, y C de baja toxicidad, que cuando son clivadas se
forman dos cadenas, una pesada y una liviana unidas por
puentes disulfuro y con marcada actividad txica.
Existen 8 tipos de toxina antignicamente distintos,
genticamente dirigidos por bacterifagos. La toxina
botulnica es ingerida y sortea la barrera digestiva
aparentemente protegida por otras protenas con las
cuales forma complejos, ms aun, de hecho las proteasas
digestivas activan la toxina. A diferencia de la toxina
tetnica, la toxina botulnica afecta las terminaciones
nerviosas perifricas. Una vez que atraves la barrera
intestinal, llega va hematgena a las uniones
neuromusculares, provocando un bloqueo presinptico
de la liberacin de acetilcolina. La interrupcin de la
estimulacin nerviosa provoca una parlisis flccida
irreversible conduciendo a la muerte por parlisis de los
msculos respiratorios.
Tipos de intoxicacin botulnica
Existen 4 formas de botulismo.
a. Botulismo alimentario. Forma clsica
letal por ingestin de la toxina producida en
alimentos conservados mal esterilizados.
b. Botulismo infantil. Se trata de la
ingestin de esporos por los lactantes (clsico
chupete con miel) con multiplicacin de los
Clostridios en el intestino con produccin de
toxina en la luz intestinal y posterior absorcin.
c. Botulismo de las heridas. Forma muy
rara a partir de heridas infectadas.
d. Botulismo no determinado. En
mayores de un ao que padecen la enfermedad
sin hallarse ningn vehculo aparente.
La Clnica
Con un perodo de incubacin corto (12 a 24 hs),
dependiendo de la cantidad de toxina ingerida, se
producen los signos toxo-dependientes: debilidad,
lasitud, visin borrosa y doble, disfagia y disfona. Con
el progreso de la enfermedad otros grupos musculares
son afectados entre ellos los respiratorios.
El diagnstico
Es fundamentalmente Clnico, pudiendo confirmarse
12
la intoxicacin con el estudio de los alimentos o restos de
alimentos ingeridos para buscar toxina botulnica.
La prevencin
La prevencin de esta enfermedad pasa por evitar la
fabricacin y consumo de alimentos "en forma Casera" si
no existe seguridad de la perfecta esterilizacin. En
cuanto a alimentos de origen comercial las severas
normas bromatolgicas hacen casi imposible la
contaminacin; si no existe esa certeza deber siempre
calentar los alimentos a la ebullicin durante unos
minutos. Respecto al botulismo del lactante se evitarn
los alimentos posiblemente contaminados.