FUNDACIN UNIVERSIDAD DE AMRICA

INGENIERA QUMICA
BIOPROCESOS


II PRCTICA DE LABORATORIO

CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN UN CULTIVO BATCH

1. OBJETIVOS

Realizar el montaje para la preparacin de una fermentacin de etanol a partir de
levadura comercial
Observar el crecimiento de un microorganismo a travs del incremento de biomasa
Determinar el comportamiento de la concentracin de la biomasa en funcin del
tiempo durante la fermentacin para la produccin de etanol


2. MARCO TERICO

En general, el proceso de fermentacin implica el empleo de microorganismos para llevar
a cabo transformaciones de compuestos orgnicos catalizados por enzimas provenientes
de la levadura, stas actan sobre sustancias polimricas para convertirlas en otras de
menor peso molecular (degradarlas) con desprendimiento de CO
2
, agua y calor.

La fermentacin alcohlica de define como el proceso bioqumico por el cual las levaduras
transforman los azcares del mosto en etanol y CO
2
. Para que la fermentacin se realice
de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en condiciones anaerobias.

Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la produccin de etanol.
Saccharomyces cerevisiae es la levadura ms comnmente utilizada. S. cerevisiae crece
en hbitats ricos en azcares tales como frutas, flores y cortezas de rboles. Dentro de
los usos industriales ms importantes est la produccin de alcohol etlico a partir de
materiales que contienen carbohidratos; este proceso es usado en cerveceras,
destileras, panadera y vinatera.

El punto de partida de cualquier fermentacin es un recipiente limpio que ha sido
esterilizado con el medio de cultivo estril (nutrientes). Posteriormente, el fermentador se
inocula con el microorganismo adecuado. El tamao del inoculo generalmente es del
orden del 1-10% del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporcin puede existir
un perodo de latencia excesivamente prolongado, lo que prolongar el perodo de
fermentacin. Para evitar estos problemas, el proceso de fermentacin se lleva a cabo en
cuatro etapas:

I. Preservacin del inoculo
II. Multiplicacin del inoculo
III. Cultivo de pre-fermentacin
IV. Fermentacin de produccin

Etapa I: Preservacin del inoculo

La preservacin de las cepas de produccin a lo largo de un perodo largo de tiempo es
un requisito bsico para una fermentacin prctica. El objetivo no es la mera


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supervivencia de las cepas. Los microorganismos pueden ser mantenidos viables
fcilmente a travs de un perodo de transferencia, pero lo que debe ser preservado es su
capacidad de formar el producto de inters.

El objetivo de la preservacin busca mantener las cepas durante tanto tiempo como sea
posible sin divisin celular. Las cepas maestras no deberan ser cultivadas ms que una
vez cada dos aos controlando los niveles de actividad con cada uso. Dependiendo de la
cepa, deben ser llevados a cabo peridicamente programas de seleccin. Las cepas de
trabajo derivan de las cepas maestras. Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en
relacin a su pureza y su capacidad de formar productos para posteriormente ser
almacenadas hasta su uso.

Etapa II: Crecimiento del inoculo

El cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo lquido en
agitacin o en medio slido si se requiere la formacin de esporas. Las condiciones
utilizadas en el cultivo inicial (composicin del medio, temperatura de incubacin, pH, etc.)
dependern del proceso especfico.

Etapa III: Pre-cultivo en fermentador

A fin de obtener suficiente inoculo para el fermentador de produccin, deben realizarse
pre-cultivos en fermentadores ms pequeos. Si un fermentador de produccin se inicia
con poco inoculo, el crecimiento se retrasa y la velocidad de formacin del producto
puede ser insatisfactoria. La concentracin ptima del inoculo para el fermentador de
produccin determina el nmero de etapas del pre cultivo que son necesarias. En general
se requieren las siguientes concentraciones de inoculo:

Organismo
Proporcin en volumen
del inoculo (%)
Actinomicetos 5-10
Otras bacterias 0,1-3
Hongos 5-10

A veces el medio de cultivo de produccin se utiliza en la ltima etapa de formacin del
inoculo a fin de inducir la formacin del producto.

Etapa IV: Fermentacin de produccin

Dependiendo de la fermentacin se utilizan bio-reactores de distinto tamao y
configuracin.

2.1 Factores que influyen en la fermentacin alcohlica

Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente en el
transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las
levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentacin. Los ms relevantes son
los siguientes:

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2.1.1 Temperatura: A mayor temperatura la fermentacin transcurre ms rpidamente,
sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y ms cantidad de
compuestos secundarios. Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima de
desarrollo. Por encima de 35C la actividad disminuye rpidamente y mueren a antes de
45C.

2.1.2 Oxigeno: Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras
mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxgeno disuelto en el mosto.

2.1.3 Nutrientes: Los azcares son fuente de energa para las levaduras.


3. MATERIALES

3.1 Equipos

Bao termostatado o estufa
Balanza analtica
Agitador orbital o Shaker

3.2 Reactivos

Levadura Saccharomyces cerevisiae, fresca o liofilizada (25 g)
Glucosa (20 g). Puede ser reemplazada por miel, panela raspada o melaza
Sulfato de amonio (fuente de N) o Urea
Fosfato de potasio (fuente de fosforo)
Harina de trigo o de soya
Solucin HCl para ajustar pH (1 N y 0,1 N)

3.3 Materiales (por grupo)

Termmetro
4 vasos de precipitado de 250 ml
1 probeta de 250 ml
1 Erlenmeyer de 250 ml
1 pipeta graduada de 10 ml
1 esptula
1 agitador de vidrio

Nota: Por parte del estudiante traer la levadura comercial (fresca o liofilizada) y la harina
de trigo o de soya

4. METODOLOGIA

a) Para preparar el inoculo de fermentacin, se debe adicionar una relacin de 50 g/L
de levadura comercial a un Erlenmeyer de 100 ml, (ya preparado con la siguiente
composicin sulfato de amonio o urea (2g/L), fosfato de sodio (1 g/l) y glucosa (10
g/l) con un pH de 4,5). Una vez pesada la levadura y adicionada en el Erlenmeyer,
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disolver con la ayuda de un agitador de vidrio y colocar en un agitar orbital o
shaker a 150 rpm por un tiempo de 40 min.

b) Rotule y marque 3 vasos de precipitado de 100 ml

c) Aada a cada uno de los vasos las siguientes sustancias, en orden

Sustancia Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3
Harina (g) 25 25 25
Glucosa (g) 3 3 3
Agua (ml) 22,5 15 0

d) Una vez pasen los 40 minutos de agitacin del inoculo de fermentacin, retire del
shaker y adicione a cada vaso de precipitado el siguiente volumen de inoculo

Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3
Volumen de
inoculo (ml)
7,5 15 30

e) Mezcle con ayuda del agitador de vidrio muy bien la solucin resultante

f) Pese cada una de las muestras preparadas

g) Vierta el contenido de cada uno de los vasos en tres probetas de 100 ml diferentes
(mrquelas antes de usar)

h) Mida el volumen ocupado por cada muestra

i) Coloque las probetas en un bao de Mara a 30 C

j) Lea y registre las alturas de las muestras en la probeta a tiempo cero (apenas
coloca en el bao de Mara) y a intervalos de 2-5 min, durante 30 min

5. Datos

Realizar el seguimiento del incremento del volumen de fermentacin en el tiempo,
registrando el volumen observado. Una vez finalice los 30 min, volver a pesar y registrar el
peso final.

Tiempo (min) Volumen (cm
3
)
0
2
4
6
8
10
12
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16
18
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6. RESULTADOS ESPERADOS

6.1 Discuta los resultados obtenidos con la variacin de la biomasa

6.2 Realice un diagrama de proceso de la fermentacin etanlica a gran escala.

6.2 Explique en qu consiste un sistema de fermentacin tipo: batch, continua, por lote
alimentado, por lecho empacado (inmovilizacin de clulas).

6.3 Consulte tericamente cual es el rendimiento Y
P/S
de una fermentacin etanlica.

6.4 Qu significa la inhibicin por producto y por sustrato en un proceso de fermentacin