1

ENZIMAS
Ing. Omar Brizuela
CTEDRA DE BIOTECNOLOGA
2014
2
QU SON LAS ENZIMAS ?
EN ESTADO PURO SON PROTENAS.
CATALIZADORES DE LAS REACCIONES BIOQUMICAS.
CADA PASO DE UNA VA METABLICA EST
CATALIZADO POR UNA ENZIMA.
LAS CLULAS REGULAN LA CANTIDAD Y LA
ACTIVIDAD DE SUS ENZIMAS.
3
Inhibicin por retroalimentacin
4
Inhibicin por retroalimentacin
5
Enzimas
Hacen posibles las reacciones,
disminuyendo la cantidad de
energa de activacin que se
necesita.
Controlan la velocidad a la que
ocurre la reaccin, para que la
energa se libere lentamente.
Permiten que las reacciones
ocurran a unas temperaturas
que no hagan dao al
organismo.
Cuntas enzimas habr en un
organismo?
6
Enzimas y sustratos
La sustancia sobre la cual acta una enzima se conoce como sustrato.
El sustrato se convierte en uno o ms productos nuevos.
Las enzimas son reutilizables y cada una puede catalizar de 100 a
30,000,000 de reacciones por minuto.
Pero, una enzima particular acta solo sobre un sustrato especfico.
Cada enzima particular puede controlar solo un tipo de reaccin.
7
SITIO ACTIVO
8
Enzimas y coenzimas
Una enzima recibe el nombre del sustrato
sobre el cual acta.
A una parte del nombre del sustrato
se le aade el sufijo asa. Cul
ser el sustrato de una proteasa?
En algunas reacciones, pequeas
molculas, llamadas coenzimas, se unen a
las enzimas para controlar las reacciones.
Las coenzimas no son protenas
pero no sufren cambios durante las
reacciones.
Algunas vitaminas son coenzimas.
B1, B2, B6, K.
Una reaccin no ocurrir si la
coenzima no est presente.
9
Los modelos de enzimas
La forma y la estructura de una enzima determinan la reaccin que
puede catalizar.
La enzima se une al sustrato (S) mediante un rea especial, el sitio
activo, para formar un complejo enzima-sustrato o E-S.
En el sitio activo, la enzima y el sustrato se ajustan perfectamente.
10
B - Modelo del ajuste
inducido.
A - Modelo de la llave y la
cerradura.
Los modelos de enzimas
11
Las enzimas son clasificadas por la Comisin de
Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica.
Cada enzima puede definirse perfectamente de tres
maneras diferentes: por un nombre sistemtico, por
una denominacin trivial y/o por un nmero de la
Comisin de Enzimas (EC).
O sea la enzima - amilasa (nombre trivial) tiene el
nombre sistemtico: -1,4 glucan 4
glucanohidrolasa y el nmero EC 3.2.1.1.
Clasificacin de Enzimas
12
Significado de la Codificacin por nmeros:
De izquierda a derecha definen:
Tipo de reaccin general en que interviene la
enzima.
Sub clase Indica el producto dador.
Sub subclase Indica el producto aceptor.
Indica el sustrato el sustrato especfico.
13
1. Oxidoreductasas
1.1 Acta sobre la funcin alcohol de los sustratos
1.1.1 Requiere NAD+ NADP+ como aceptor de
hidrgeno.
1.1.1.1 El sustrato especfico es el alcohol etlico.
Ejemplo:
Reaccin: CH
3
CH
2
OH + NAD
+
CH
3
CHO + NADH + H
+
Nombre Sistemtico: Alcohol NAD oxidoreductasa
(1.1.1.1.)
Nombre Trivial: Alcohol deshidrogenasa
14
1. Oxidorreductasas
2. Transferasas
3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas
6. Ligasas
Clases de Enzimas:
15
ENZYME es un lugar donde se rene
informacin relativa a la nomenclatura de las
enzimas.
Se basa principalmente en las recomendaciones
deI Comit de Nomenclatura de la Unin
Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular
(IUBMB) y se describe cada tipo de enzima
caracterizada por un nmero asignado por la
Comisin de Enzimas (EC).
ENZYME se puede acceder desde el server de
ExPASy.
ENZYME
Base de datos para nomenclatura de Enzimas
16
1. Oxidoreductasas
No. Clase Tipo de reaccin
que catalizan
Ejemplo
1
Oxidorreductasas De xido reduccin
(transferencia de e-)
Deshidrogenasas
Peroxidasa
Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
Reduccin: ganancia de electrones (hidrgeno o prdida de
oxgeno)
Oxidacin: prdida de electrones (hidrgeno o ganancia de
oxgeno).
La Oxidacin y la Reduccin son reacciones acopladas (REDOX)
17
Si una molcula se reduce, tiene que haber otra que se oxide.
1. Oxidoreductasas
( Reacciones de oxido-reduccin).
18
2. Transferasas
No. Clase Tipo de reaccin que
catalizan
Ejemplo
1 Oxidorreductasas De xido reduccin (transferencia de
e-)
Deshidrogenasas
Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas
19
2. Transferasas
(Transferencia de grupos funcionales)
grupos aldehdos
grupos acilos
grupos glucosilos
grupos fosfatos (kinasas)
Ejemplos:
Succinato Deshidrogenasa
Citocromo c oxidasa.
20
No. Clase Tipo de reaccin que
catalizan
Ejemplo
1 Oxidorreductasas De xido reduccin (transferencia de e-)
Deshidrogenasas
Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas
3 Hidrolasas
Hidrlisis, con transferencia
de grupos funcionales del
agua
Pirofosfatasa
Tripsina
Aldolasa
3. Hidrolasas
21
Transforman polmeros en monmeros.
Actan sobre:
3. Hidrolasas
(Reacciones de hidrlisis)
enlace ster
enlace glucosdico
enlace peptdico
enlace C-N
22
No. Clase Tipo de reaccin que
catalizan
Ejemplo
1 Oxidorreductasas De xido reduccin (transferencia de e-)
Deshidrogenasas
Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas
3 Hidrolasas Hidrlisis, con transferencia de grupos
funcionales del agua
Pirofosfatasa
Tripsina
Aldolasa
4 Liasas Lisis de un sustrato,
generando un doble enlace, o
Adicin de un sustrato a un
doble enlace de un segundo
sustrato
(Sintasas)
Descarboxilasa
pirvica
4. Liasas
23
4. Liasas
(Adicin a los dobles enlaces)
Entre C y C
Entre C y O
Entre C y N 24
No. Clase Tipo de reaccin que
catalizan
Ejemplo
1 Oxidorreductasas De xido reduccin (transferencia de e-)
Deshidrogenasas
Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas
3 Hidrolasas Hidrlisis, con transferencia de grupos
funcionales del agua
Pirofosfatasa
Tripsina
Aldolasa
4 Liasas Lisis de un substrato, generando un
doble enlace, o
Adicin de un substrato a un doble
enlace de un 2o. substrato
(Sintasa)
(Sintasas)
Descarboxilasa
pirvica
5 Isomerasas Transferencia de grupos en
el interior de las molculas
para dar formas ismeras
Mutasas
Epimerasas
Racemasas
5. Isomerasas
25
5. Isomerasas
(Reacciones de isomerizacin)
26
No. Clase Tipo de reaccin que
catalizan
Ejemplo
1 Oxidorreductasas De xido reduccin (transferencia de e-)
Deshidrogenasas
Peroxidasa Oxidasas
Oxigenasas
Reductasas
2 Transferasas Transferencia de grupos Kinasas
Transaminasas
3 Hidrolasas Hidrlisis, con transferencia de grupos
funcionales del agua
Pirofosfatasa
Tripsina
Aldolasa
4 Liasas Lisis de un substrato, generando un
doble enlace, o
Adicin de un substrato a un doble
enlace de un 2o. substrato
(Sintasa)
(Sintasas)
Descarboxilasa pirvica
5 Isomerasas
Transferencia de grupos en el
interior de las molculas para
dar formas ismeras
Mutasas
Epimerasas
Racemasas
6 Ligasas Formacin de enlaces C-C,
C-S, C-O y C-N. Mediante
reacciones de condensacin,
acopladas a la ruptura del ATP
Sintetasas
6. Ligasas
27
6. Ligasas
(Formacin de enlaces, con aporte de ATP)
Entre C y O
Entre C y S
Entre C y N
Entre C y C
28
PROPIEDADES GENERALES
AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIN
De 10
6
to 10
12
veces con respecto a la reaccin sin enzima.
An ms rpido que los catalizadores qumicos.
CONDICIONES DE REACCIN
Temperatura 25-40
o
C (algunas hasta 75
o
C)
pH neutro (5-9), la mayora 6.5 7.5
Presin atmosfrica normal
CAPACIDAD DE REGULACIN
Por concentracin de sustrato
Por concentracin de enzima
Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)
Por inhibidores no competitivos (modificacin covalente de la enzima)
Por regulacin alostrica
ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIN
Interaccin estereoespecfica con el sustrato
No hay productos colaterales 29
CINTICA ENZIMTICA
30
CULES SON LOS MECANISMOS DE LA ACCIN
ENZIMTICA ?
SUBSTRATO: COMPUESTO CUYA TRANSFORMACIN
QUMICA ES CATALIZADA POR LA ENZIMA.
+
+
SUBSTRATO SUBSTRATO
ENZIMA ENZIMA
PRODUCTOS PRODUCTOS
ENZIMA ENZIMA
COMPLEJO
ENZIMA-SUSTRATO
31
Naturaleza de las Reacciones Enzima-Sustrato
Apoenzima: componente proteico termolbil
de la enzima.
Cofactor, coenzima o grupo prosttico:
cocatalizadores que actan conjuntamente
con la apoenzima para catalizar una
reaccin.
Holoenzima: conjunto de porcin proteica y
coenzima.
32 33
34 35
CMO SE EXPLICA LA CATLISIS ?
N
I
V
E
L

E
N
E
R
G

A
REACCIONANTE REACCIONANTE
COMPLEJO COMPLEJO
ACTIVADO ACTIVADO
PRODUCTOS PRODUCTOS
ENERGA DE
ACTIVACIN
ENERGA
LIBERADA
COMPLEJO COMPLEJO
ACTIVADO ACTIVADO PRODUCTOS PRODUCTOS
ESPONT ESPONT NEA DE MAGNITUD NEA DE MAGNITUD
DESCONOCIDA Y DESCONOCIDA Y E E
SE AFLOJA EL ENLACE ENTRE LAS DOS SE AFLOJA EL ENLACE ENTRE LAS DOS
PARTES DE LA MOL PARTES DE LA MOL CULA ORIGINAL CULA ORIGINAL
(POR UN CATALIZADOR) Y (POR UN CATALIZADOR) Y E E
SE ROMPE EL ENLACE EN FORMA SE ROMPE EL ENLACE EN FORMA
ESPONT ESPONT NEA Y NEA Y E E
REACCIONANTE REACCIONANTE
36
CARACTERSTICAS DE LAS PROTENAS
DESNATURALIZACIN Y PRECIPITACIN POR
SALES Y DISOLVENTES.
TIENEN DIMENSIONES COLOIDALES.
SON CONJUGADAS Y SENCILLAS.
EXTRACELULARES E INTRACELULARES.
37
pH: la actividad enzimtica es ptima en un determinado rango.
Otras causas de modificacin de la velocidad por accin del pH son
por protonacin o desprotonacin, reacciones laterales del sustrato,
etc.
Temperatura: son curvas del tipo asimtricas. El ptimo puede
estar a 40 50C.
La desnaturalizacin trmica irreversible a menudo ocurre por
procesos polimoleculares tales como agregacin o precipitacin.
Tambin puede inactivarse por cambios conformacionales o
covalentes.
Baja Temperatura: puede aumentar o disminuir la actividad
enzimtica. Esto se debe a que puede haber ruptura de las
membranas celulares liberando enzimas y sustratos. Otra causa es
que parte del agua se congela y parte queda lquida y se produce un
efecto de concentracin y a mayor concentracin mayor velocidad.
Los factores que afectan la actividad
enzimtica
38
Los factores que afectan la actividad
enzimtica
pH
(puede llegar a la
desnaturalizacin)
(Ej: pepsina)
39
ACCIN DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS
ENZIMAS
Rango de
Actividad
Cantidad de
formas ionizadas
Acido Glutmico Lisina
40
Los factores que afectan la actividad
enzimtica
La temperatura (desnaturalizacin) (Ej: albmina)
41
Actividad del agua (a
w
): es el agua disponible para las reacciones.
A mayor a
w
mayor actividad enzimtica. Algunas trabajan an con muy
bajo a
w
.
Iones: todos los aniones tienen el mismo tipo de efecto que es la
variacin de la fuerza inica.
Los cationes son activadores de la enzima.
Si se aumenta la concentracin de algunos iones puede aumentar o
disminuir la actividad de la enzima. Un in puede bloquear los sitios
activos o unirse al sustrato en sus puntos de reaccin.
Pueden actuar como quelantes quitando grupos disponibles a la
reaccin.
Los cationes activantes son los alcalinos y alcalinotrreos (Na, Ca, Mg,
Cs). Hay que tener cuidado con la inactivacin por metales pesados (Fe,
Pb, etc.).
Solubilizacin: (salting in) o precipitacin (salting out) por
concentracin salina: hay concentraciones que favorecen la
solubilizacin, pero a altas concentraciones el efecto se puede revertir e
insolubilizarse la enzima por efecto de las sales pues los iones compiten
con la enzima por el agua o sea bajan el a
w
.
Los factores que afectan la actividad
enzimtica
42
Inactivacin por efectos de corte: se pueden desnaturalizar por
bombeo, homogeneizacin, mezclado. Se cree que la inactivacin se
debe a una combinacin del esfuerzo cortante con fenmenos de
interfase por la presencia de aire, principalmente.
Inactivacin por efectos de la presin: solo se produce a presiones
muy altas.
Inactivacin por efectos de interfase: en interfases como espumas,
agua y aceite, etc., puede destruirse la estructura terciaria y an la
secundaria.
Concentracin de Sustrato: influencia la velocidad de la reaccin
hasta un cierto punto a partir del cual la velocidad ya no aumentar.
Presencia de Inhibidores: un modulador es una sustancia que puede
combinarse con las enzimas para alterar sus actividades catalticas.
Un inhibidor es un modulador que disminuye la actividad enzimtica.
Este puede disminuir la velocidad de reaccin en forma competitiva, no
competitiva o parcialmente competitiva, dependiendo de su estructura
qumica y de los sitios sobre los que acte. Algunos lo hacen en forma
reversible y otros en forma irreversible.
Los factores que afectan la actividad
enzimtica
Unidad internacional de
actividad enzimtica (U).
Cantidad de enzima requerida para liberar
un micromol de producto por minuto bajo
las condiciones de ensayo.
Hay mucha heterogeneidad en el reporte de
la actividad enzimtica (hidrlisis de
almidn, de tirosina, etc.)
44
CINTICA ENZIMTICA
45
ALTA
ESPECIFICIDAD
DE REACCIN
INTERACCIN
ESTEREO
ESPECFICA
CON SU
SUSTRATO
46
Los Sustratos
se acercan a la Enzima
(sitio Activo)
Enzima
Substratos
HO-
H-
47
Los reactivos
interaccionan
con la enzima
(sitio activo)
48
Cambia la
configuracin de la
enzima
49
La unin del sustrato produce un cambio conformacional de la
enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomrica.
Substrato
de glucosa
Sitio de
enlace
50
Se realiza la
reaccin
cataltica
51
52 53
Leonor Michaelis y Maud Menten (1913)
Tiempo
C
o
n
c
e
n
t
.
54
ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN
V
o =
V
max
[S]
K
m
+ [S]
Utilizando la
nomenclatura
para diseo de
reactores
55 56
Cintica enzimtica en funcin de la
concentracin de sustrato
Primer orden
Orden Cero
57
Catalasa H
2
O
2
25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbnicoa HCO
3
-
9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
K
m
de algunas enzimas
ENZIMA SUSTRATO K
m
(mM)
58
La K
M
es un parmetro de
Actividad Enzimtica
La K
M
es inversamente proporcional con la
actividad de la enzima.
Valor de K
M
grande, baja actividad (baja
afinidad).
Valor de K
M
pequeo, alta actividad (alta
afinidad).
59
V
max
?
K
M
?
PARMETROS DE
MICHAELIS-MENTEN
GRFICA DE LANGMUIR
Minimiza los errores experimentales.
0 =
0 =
Pend =
61
GRFICO DE LINEWEAVER-BURK
Pendiente = K
m
/V
max
Intercepcin eje y = 1/V
max
62
Pend
A bajas
concentraciones de
Sustrato da mucho
error en la
determinacin de Km 63
Grfica de Eadie-Hofstee
Vo
[S]
V max
K
M
Vo
V
max
Desventaja: que r
A
aparece en ambos
ejes siendo una
variable dependiente.
Pend = - K
M
64
Cuando:
V
o
= Vmax Todos los sitios activos estn
ocupados y no hay molculas de E libre.
K
M
= [S] Si V=
K
M
representa la cantidad de sustrato
necesaria para fijarse a la mitad de la Enzima
disponible y producir la mitad de la Vmax.
Vmax
2
65
Inhibidores
Reactivos qumicos especficos que pueden
inhibir a la mayor parte de las enzimas.
INHIBIDORES INHIBIDORES
Irreversibles
Reversibles
66
Inhibidor Irreversible
Inhibicin permanente
Unin irreversible por medio de enlaces covalentes.
Modificaciones qumicas de los sitios activos.
Modificada la enzima, est siempre inhibida.
Para distinguirlo de los reversibles se someten a
dilisis y si no se separan enzima e inhibidor, ste es
permanente.
67
La unin del inhibidor y la enzima es
reversible.
Al quitar el inhibidor del medio, se recupera
la actividad.
Hay 3 tipos de Inhibicin:
Competitiva
No Competitiva
Parcialmente Competitiva
Inhibidor Reversible
68
Antibiticos
Insecticidas
Herbicidas
Venenos
Diferentes Medicamentos
Dolor
Inflamacin
Infecciones virales
Cncer
Inhibicin
enzimtica
69
Inhibicin Competitiva
70
Cintica de la Inhibicin Competitiva
E + S ES
E + I EI
ES E + P
r
P
= k
5
. C
ES
El balance de Enzima da:
C
Eo
= C
E
+ C
ES
+ C
EI
k
1
k
2
k
3
k
4
k
5
S
ES
S E
K
k
k
C
C C
= =
1
2 .
I
EI
I E
K
k
k
C
C C
= =
3
4 .
MI S
S
P
K C
C V
r
+
=
. max
) 1 ( .
I
I
S MI
K
C
K K + =
Siendo:
V
max
no cambia
K
M
cambia
M MI K K >
La veloc. de
reaccin es
ms lenta
Como:
71
Se puede combatir con un
exceso de sustrato.
72
V
max
igual
K
M
diferente
NO INHIBIDA
CON INHIBIDOR
COMPETITIVO
73 74
Malonato Deshidrogenasa del cido succnico
Sulfas Infecciones microbianas
Antihipertensores Captopril y Enalopril
Alopurinol Controla la gota
Fluoruracilo Cncer (ej. de la piel)
Inhibidores Competitivos
75
El inhibidor NO se une al sitio activo
Inhibicin No Competitiva
NO se puede revertir con un exceso de sustrato
76
Cintica de la Inhibicin NO Competitiva
E + S ES
E + I EI
EI + S EIS
ES + I ESI
ES E + P
k
1
k
2
k
3
k
4
k
5
Siendo:
V
max
cambia
K
M
no cambia
k
6
k
9
k
7
k
8
IS S K
k
k
K
k
k
= = =
5
6
1
2
SI I K
k
k
K
k
k
= = =
7
8
3
4
S S
S
P
K C
C V
r
I
+
=
. max ,
I
I
I
K
C
V
V
+
=
1
max
max ,
77
V
max
diferente
K
M
igual
NO INHIBIDA
CON INHIBIDOR
NO COMPETITIVO
78
79 80
Cinticas de Inhibicin
Competitivo
V
max
igual
K
M
diferente
No competitivo
V
max
diferente
K
M
igual
No inhibitor
1
V
1/[S]
0
Sin inhibidor
81
TECNOLOGIA UTILIZANDO TECNOLOGIA UTILIZANDO
ENZIMAS ENZIMAS
82
La tecnologa de enzimas involucra la
produccin, aislamiento, purificacin, uso
en forma soluble o la inmovilizacin de las
enzimas para su utilizacin en gran
variedad de bioreactores.
83
La utilizacin de sistemas enzimticos
libres de clulas, presenta ventajas y
desventajas respecto de los procesos
fermentativos.
En fermentacin, el uso de
microorganismos como catalizadores
puede presentar las siguientes
limitaciones:
84
1. Una alta proporcin del sustrato ser
utilizada para convertirse en biomasa
2. Pueden ocurrir reacciones secundarias
intiles
3. Las condiciones para el crecimiento de los
microorganismos pueden ser diferentes de
las requeridas para la formacin del
producto
4. El aislamiento y purificacin del producto
deseado, a partir de la mezcla de
fermentacin, puede ser dificultoso.