Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 51
Bioqumica Clnica Actualizacin
Conceptos actuales del metabolismo del glutatin Utilizacin de los istopos estables para la evaluacin de su homeostasis Mara Martnez Sarrasague 1 *, Domingo Andrs Barrado 1 *, Marcela Zubillaga 2 *, Alfredo Hager 2 *, Toms De Paoli 2 *, J os Boccio 2 * 1. Bioqumico. 2. Dr. de la UBA. * Ctedra de Fsica, Laboratorio de Istopos Estables. Facultad de Farmacia y Bioqu- mica. Universidad de Buenos Aires. Argen- tina. ** Ctedra de Radioistopos. Facultad de Far- macia y Bioqumica. Universidad de Bue- nos Aires. Argentina. Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana Incorporada al Chemical Abstract Service. Cdigo bibliogrfico: ABCLDL. ISSN 0 3 2 5 - 2 9 5 7 Resumen El glutatin (GSH) juega un papel fundamental en la proteccin celular con- tra la injuria oxidativa. Los cambios de la concentracin de GSH en sangre podran dar una medida del stress oxidativo in vivo. El GSH disminuye con el envejecimiento, el ejercicio violento y tambin en ciertas patologas como diabetes, fibrosis qustica, SIDA, cirrosis, infecciones, malnutricin proteica y tratamientos quimioterpicos, entre otros. El rol del GSH en diferentes funciones fisiolgicas y en diversas patologas puede estudiarse empleando molculas etiquetadas con istopos estables, como por ejemplo con 13 C. La cintica del 13 CO 2 , generado a partir de un 13 C-sustrato, constituye una he- rramienta til en el estudio de rutas metablicas. La 13 C-oxatiazolidina car- boxilato (OTC) permite evaluar el balance del glutatin en diferentes condi- ciones patolgicas y fisiolgicas, determinando el estado redox en cada situacin. En este trabajo se discuten aspectos bsicos del metabolismo del glutatin y su vinculacin con determinadas patologas en el hombre; tam- bin se analiza la utilizacin de los istopos estables como una herramien- ta no invasiva para evaluar el balance de glutatin en seres humanos. Palabras clave: glutatin * metabolismo * stress oxidativo * patologas * istopos estables * 13 C-oxatiazolidina carboxilato Summary CURRENT CONCEPTS ON GLUTATHI ONE METABOLI SM. USEFULNESS OF STABLE I SOTOPES OF I TS HOMEOSTASI S Glutathione (GSH) plays an important role against free radicals, its blood concentration showing a strong correlation with in vivo oxidative stress. GSH concentration decreases with aging, strong fitness and oxidative stress among other pathologies like diabetes, cystic fibrosis, AIDS, cirrhosis, infec- tions, protein malnutrition and chemotherapy treatments. The GSH perfor- mance in different physiological functions and diverse pathologies can be Homenaje a la trayectoria del Prof. Dr. Ricardo Anbal Margni Introduccin Desde el punto de vista qu mico el glutatin (GSH) es el compuesto de bajo peso molecular con grupo sulfhidrilo (-SH) ms importante en plantas y anima- les. Se trata de un tripptido formado por los amino- cidos: cido glutmico, glicina y ciste na (Glu-Gly-Cys). En la Figura 2 se muestra el metabolismo bsico del GSH (1). La s ntesis ocurre en dos etapas y depende de la dis- ponibilidad de sustratos y de los mecanismos regulato- rios. El paso de regulacin en la s ntesis ocurre a nivel de l a enzi ma gamma-gl utami l ci stei ni l si ntetasa (GCS), donde el GSH ejerce el feed backnegativo(2). El GSH est sujeto a un constante recambio en el organismo; h gado, riones, pulmones, corazn, intes- tinos y msculos son los principales rganos responsa- bles de su homeostasis. La captacin de cada rgano o tejido depende de la actividad de la enzima gamma glutamil transpeptidasa ( GT o GGT) localizada en la membrana celular (3). En la Tabla I se indican los lugares del organismo donde el GSH se encuentra en mayor concentracin. Dentro de las clulas el GSH se encuentra princi- palmente en mitocondrias, ret culo endoplsmico y ncleo y es aqu donde se observa un aumento de su concentracin en la apoptosis o muerte celular pro- gramada (4). Adems de las mencionadas en la Figura 2, pueden existir otras vas metablicas para el GSH; por ejemplo, para la eliminacin de compuestos txicos generalmen- te se forman tioteres con el GSH y se obtienen produc- tos conjugados con el glutatin a travs de una unin con azufre. El derivado azufrado luego pierde glutmi- co y glicina, y conserva la cistena. Posteriormente, la acetilacin de la cistena origina los llamados compues- tos mercaptoricos que aparecen en orina. Este proce- so explica porqu la cistena es el aminocido limitante para la sntesis del GSH, ya que a diferencia de lo que Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 54 46 Mart nez Sarrasague M y col . studied using labeled molecules with stable isotopes, for instance using 13 C. The kinetic of the 13 CO 2 , generated from a 13 C-substrate, constitutes a useful tool for the studies of meta- bolic routes. The carboxilato 13 C-oxatiazolidina (OTC) enables the evaluation of the glutat- hione balance in different pathological and physiological conditions, determining the redox state in each situation. In this work, different basic aspects of glutathione metabolism are discussed, as well as its relationship with different pathologies. The usefulness of stable iso- topes is also analyzed as a non invasive tool for determining glutathione balance in human beings. Key words: glutathione * metabolism * oxidative stress * pathologies * stable isotopes * 1 3 C-oxothiazolidine carboxylate Figura 1. El glutatin reducido se conoce qumicamente como N- (N-L-gamma-glutamil-L-cisteinil) glicina, su frmula molecular es C 10 H 17 N 3 O 6 S y su peso molecular 307.33 g/mol. El glutatin oxi- dado es el L-gamma-glutamil-L-cisteinil-glicina disulfuro (GSSG), y su frmula molecular es C 20 H 32 N 6 O 12 S 2 . Cristalino 10 mM Concentracin ms elevada del organismo para proteger de la foto-radiacin Hgado 5 - 7 mM Principal rgano relacionado con la sntesis del GSH. La excrecin biliar alcanza una concentracin de 10 mM Rin 3 mM Donde ms GSH plasmtico se consume Corazn 2 mM Msculo 1 - 2 mM Su concentracin vara segn el tipo de fibra muscular Glbulos rojos 2 mM Plasma 0.05 mM Concentracin correspondiente a GSH libre; existe, adems, una fraccin unida a protenas Tabla I. Concentracin de GSH en el organismo. CH 2 SH H 2 NCHCH 2 CH 2 CNHCH COOH O O
CNHCH 2 COOH
ocurre con los otros dos aminocidos, no se recupera y
su concentracin intracelular es muy baja (1). Como proveedor de ciste na existe la N-acetil ciste - na (NAC), un precursor del aminocido, que se pue- de suministrar por v a oral o intravenosa a fin de au- mentar los niveles de ciste na cuando se necesita tener elevadas las concentraciones del GSH para favorecer los procesos de detoxificacin. Otro precursor de la ciste na es un anlogo de la 5-oxoprolina, la oxotiazo- lidina carboxilato (OTZ, OTC o Procys), que puede aumentar los niveles intracelulares de GSH, especial- mente en circunstancias de stressoxidativo (5-7). En la Tabla I I se resumen las principales funciones del GSH en el organismo. Para realizarlas, el grupo -SH nucleo- f lico del GSH se conjuga con el grupo electrof lico de las toxinas, tanto en forma directa como a travs de reacciones catalizadas por las enzimas glutatin trans- ferasa (GST) y glutatin peroxidasa (GP ox ). El stressoxidativo se define como el desbalance en- tre oxidantes y antioxidantes a favor de los primeros, stressque potencialmente puede causar dao, lo cual est relacionado con diversas patolog as humanas. Adems, es sabido que el dao oxidativo puede ocu- rrir por aumento de la produccin de especies activas del ox geno, ms conocidas como ROS (reactiveoxygen species). Los ROS pueden ser radicales libres (super- xido, hidroxilo, peroxilo, alcohoxilo, hidroperoxilo) o no (perxido de hidrgeno, cido hipocloroso, ox - geno singulete, peroxinitrito). Si los ROS tienen una concentracin muy elevada y no alcanzan el ltimo es- labn de la reduccin del O 2 , el agua, se produce la oxidacin de molculas biolgicas; los ROS afectan a las prote nas, hidratos de carbono, ADN, l pidos, en- zimas de transporte y mecanismos celulares de trans- cripcin (8-10). El stress oxidativo puede ser causado por toxicidad de drogas, isquemia, metstasis, enfermedades cardio- vasculares, neurodegenerativas, diabetes, radiaciones y procesos inflamatorios mediados por citoquinas, entre otros (9)(11-14). En la Tabla I I I se puede ver una cla- sificacin de las principales defensas antioxidantes. Las enzimas antioxidantes tienden a aumentar con la edad, en procura de compensar la disminucin de GSH heptico, pero este aumento no alcanza para el secues- tro de los ROS generados, pues hay una prdida de efectividad de las enzimas. Con la edad tambin se pro- duce una disminucin de la sntesis proteica; lo mismo ocurre con los niveles de citocromo P450. Frente a una deficiencia de GSH se observa un aumento de ROS, con el consecuente dao mitocondrial y celular (11). Tanto el GSH como el cido ascrbico (AA) son los principales protagonistas en la destruccin de inter- mediarios de ROS. Si bien sus funciones parecer an re- dundantes, no lo son porque tienen diferente meca- nismo de accin y actan a distintos tiempos o etapas del proceso antioxidante (2)(15). Existe una interrelacin significativa entre GSH y AA. La deficiencia de GSH va acompaada por una Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 54 Met abol i smo del gl ut at i n 47 Figura 2. El ciclo del GSH est compuesto por 5 reacciones enzimticas interrelacionadas; las enzimas intervinientes son: GCT: gluta- mil carboxil transferasa, GT: glutamil transpeptidasa, GS: glutmico sintetasa, GCS: glutamil cisteinil sintetasa. Mantiene el balance redox en la clula y la protege del stress oxidativo, nitrosativo y de los reactivos electroflicos. Acta como coenzima. GSH Participa en procesos de detoxificacin. Controla la permeabilidad de membrana y el transporte de aminocidos. Interviene en el proceso de sntesis de protenas, ADN y ARN. Regula la formacin y el mantenimiento de la forma activa de las enzimas. Tabla II. Principales funciones en el organismo 5-oxoprolina Cistinil-glicina glutamil aminocido GT GCT Degradacin Sntesis de novo glutamato GCS -glutamil-cistena Glicina Recuperacin de aminocidos Cistena GS GSH 5-oxoprolinasa disminucin de AA. La administracin de AA no slo aumenta sus propios niveles, sino que tambin eleva los de GSH; el GSH tambin aumenta con un aumen- to de la vitamina E(16-19). En la Tabla I V se indican al- gunas situaciones en las que el GSH est disminuido. El rol del stressoxidativo en la fisiopatologa de mu- chas enfermedades sugiere que los agentes que dismi- nuyen el stressoxidativo podran tener un impacto im- portante en el progreso de la enfermedad. El GSH es primordial en el sistema antioxidante del organismo y en el metabolismo redox; bajo condiciones de stressoxi- dativo el GSH es agotado, depletado, manifestndose el dao causado por los ROS en las clulas y tejidos (16). GSH y estado redox El estado redox en la clula indica el balance entre las especies oxidadas y las reducidas; est influido por factores fisiolgicos, ambientales y nutricionales. De es- te balance dependen la activacin de enzimas, la snte- sis de ADN, la proliferacin celular, los mecanismos de regulacin de la apoptosis o muerte celular programa- da, el plegamiento de protenas y la activacin de facto- res de transcripcin, entre otros. El GSH y el estado re- dox de algunos tioles (compuestos con grupo -SH) regulan la expresin de genes involucrados en la pato- gnesis de diferentes enfermedades (cncer, ateroes- clerosis, SI DA, diabetes, etc.) (15). Los principales reguladores del estado redox son el GSH, la cistena, la tioredoxina (Trx) y las enzimas supe- rxidodismutasa (SOD) y glutatinperoxidasa (GP X ). A travs de la medida de la concentracin de especies an- tioxidantes, de la actividad de enzimas y de la relacin de concentraciones de las formas oxidada y reducida del GSH (GSSG/GSH) se puede obtener un perfil de comportamiento redox para cada tejido. La determina- cin de la capacidad antioxidante total del plasma tam- bin puede ser til para evaluar el estado redox, mien- tras que la relacin en sangre GSH/GSSG reflejara los cambios que se verifican en tejidos menos accesibles. Es- ta relacin es mayor que 100 en condiciones normales; con el stress oxidativo se acumula GSSG y una propor- cin alterada indica cambios en el estado redox que afectan el balance de la proliferacin, la diferenciacin y la muerte celular (16)(20)(21). Los rganos para transplante se preservan refrige- rados a 2 - 4 C para reducir los cambios o injurias du- rante el per odo de espera. Se observ que el GSH ju- gaba un papel fundamental en el inicio de la apoptosis durante la preservacin en fr o de hepatocitos. Para evaluar su influencia se midieron, en cultivos someti- dos a fr o, los siguientes parmetros: ROS, GSH y GSSG, peroxidacin lip dica y fragmentacin de ADN. Durante el recalentamiento, la adicin de N-acetil cis- te na disminuy significativamente el nmero de clu- las con morfolog a apopttica. Tambin fue menor la produccin de ROS, de perxidos lip dicos y la deple- cin de GSH y de prote nas con grupos -SH (22)(23). Se comprob que el GSH es responsable de la mo- dulacin, durante la preservacin en fr o y el recalen- tamiento, de la induccin apopttica, del nivel de pro- duccin de radicales libres y de la peroxidacin lip dica. Las clulas preapoptticas y apoptticas tie- nen menos GSH y prote nas con grupos -SH que las c- lulas normales, lo que evidencia la regulacin redox del proceso (21)(23). La incubacin con NAC, previa al recalentamiento del rgano, en el caso de transplantes hepticos, ten- dr a importancia teraputica para prevenir los efectos tempranos de la apoptosis. Otra situacin en la que se manifiesta la regulacin del GSH es en la glicosilacin proteica (adicin de glu- cosa a prote nas). Existe una relacin inversa entre ni- Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 54 48 Mart nez Sarrasague M y col . Defensas antioxidantes del organismo (8)(14)(15). Compuestos antioxidantes GSH, ubiquinol, flavonoides, cido rico plasmticos Vitaminas A, C y E Enzimas antioxidantes Superxido dismutasa, glutatin peroxidasa, glutatin reductasa Secuestradores de iones Transferrina, ferritina, lactoferrina, xido ntrico metlicos Tabla III. Principales defensas antioxidantes. envejecimiento diabetes cirrosis GSH disminuido en(13-19) ejercicio violento fibrosis qustica malnutricin proteica stress oxidativo SIDA tratamientos quimioterpicos infecciones retinopatas artritis reumatoidea Tabla IV. Situaciones en las que el GSH est disminuido. veles de GSH y glicosilacin. La hemoglobina glicosila- da (HbG) revela el grado de glicosilacin de otras pro- te nas tambin expuestas a la glucosa circulante y au- menta significativamente en la deficiencia de GSH de los eritrocitos expuestos a elevadas concentraciones de glucosa (24)(25). A continuacin se comentar brevemente la vincu- lacin existente entre los niveles de GSH y determina- das patolog as. GSH y cncer Las clulas cancergenas pueden generar elevada cantidad de agua oxigenada (H 2 O 2 ), la cual contribui- ra en el dao y la mutacin de tejidos, facilitando el crecimiento y la invasin del tumor. El estado persisten- te de stressoxidativo explicara parcialmente algunas ca- ractersticas importantes del cncer (12)(20). El aumento de GSH que puede aparecer en clulas tumorales se puede explicar como consecuencia de un aumento de la actividad mittica. Los cambios de la ve- locidad de proliferacin coinciden con cambios en la concentracin intracelular de GSH. Cuando las clu- las tumorales proliferan se producen ms perxidos, hay aumento de ROS y consecuentemente se oxida el GSH. Si disminuye la velocidad de proliferacin, tam- bin lo hace el nivel de perxidos (26). El aumento de GSSG en sangre acompaando el crecimiento del tumor se puede atribuir a la oxidacin de GSH en los eritrocitos y a un aumento de la libera- cin de GSSG desde diferentes tejidos. La anemia es un s ntoma frecuentemente encontrado en los pacien- tes con cncer; tambin se aprecian cambios enzimti- cos que orientan hacia el estado oxidado. Frente a casos de resistencia en la terapia contra el cncer se considera de utilidad el conocimiento de la relacin GSH/GSSG. Los steres del GSH son frmacos precursores del tripptido que por sus caractersticas qumicas pueden penetrar en las clulas y luego all ser hidrolizados; as se logran elevados niveles de GSH que protegen a las clulas linfticas contra los efectos letales de la radiacin. La funcin ms importante del GSH en la quimioterapia es su participacin en la detoxificacin de xenobiticos, perxidos orgnicos y metales pesa- dos; de este modo protege a las macromolculas de las clulas, como por ejemplo el ADN(13)(20). GSH y ateroesclerosis La oxidacin de la lipoprote na de baja densidad, LDL, es el primer paso en el desarrollo de la ateroes- clerosis. La citotoxicidad de la LDL oxidada tambin se manifiesta en la activacin de los mecanismos apop- tticos. La LDL oxidada se comporta como pro-oxi- dante, aumenta los niveles de ROS y estimula la expre- sin de la enzima decisiva para la s ntesis del GSH, as se proteger an las clulas contra el stress oxidativo in- ducido por la LDL oxidada. El aumento de GSH de- pende del grado de oxidacin de la LDL (2). La enzima glutatinperoxidasa (GP x ) y el GSH pro- tegen contra el stress oxidativo inducido por la LDL oxidada. En cultivos de clulas endoteliales se observ que el tratamiento previo con un agente que disminu- ye los depsitos celulares de GSH, el butilsulfxido (BSO), provoca un aumento de la citotoxicidad provo- cada por LDL oxidada. La situacin se revierte si se usan antioxidantes (8)(27)(28). El sistema antioxidante, importante para prevenir el desarrollo de la ateroesclerosis, actuar a en diferen- tes niveles al prevenir la oxidacin, disminuir la accin de la LDL oxidada y limitar la respuesta celular apop- ttica a la lipoprote na oxidada. GSH y malnutricin El estudio de nios con malnutricin permiti deter- minar que tienen disminuido tanto el GSH como la ve- locidad de sntesis del mismo; presentan, adems, una baja concentracin de cistena extra e intra celular y ele- vados niveles de marcadores de peroxidacin lipdica in- ducida. El edema es una de las manifestaciones que se producen como consecuencia del severo dao a la mem- brana celular por accin de los radicales libres (29). En los nios malnutridos tambin hay un menor aporte de ciste na a partir del metabolismo proteico; en el kwashiorkor, la velocidad de ruptura de las prote - nas est disminuida por un dficit enzimtico; pero no ocurre lo mismo en el marasmo. Las caracter sticas del s ndrome de kwashiorkor se asocian con el dao oxida- tivo debido al desbalance entre la generacin de radi- cales libres y la capacidad antioxidante; se produce el dao oxidativo con las consecuentes subfunciones he- ptica e inmune (29). En ensayos experimentales se observ que una die- ta restringida en aminocidos sulfurados disminu a la velocidad de s ntesis de GSH y disminu a su recambio desde los tejidos. Una modificacin en la disponibili- dad dietaria de ciste na y de su precursor metionina puede modular la velocidad de s ntesis de GSH y sus niveles en sangre, disminuyndolos en el caso de la dieta sin aminocidos azufrados (30). Una situacin as podra presentarse en los casos de la alimentacin parenteral de pacientes que pasaron por una situacin de stress. Puede suceder, por ejemplo, que despus de una ciruga abdominal disminuya la ca- pacidad de sntesis de GSH en los tejidos, pero que se mantenga el GSH de sangre; la diferencia dietaria esta- ra afectando entonces el recambio de GSH entre teji- dos y sangre (30). Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 54 Met abol i smo del gl ut at i n 49 Los aminocidos glicina o cistena son igualmente adecuados para evaluar in vivola velocidad de sntesis del GSH. En pacientes peditricos internados con sep- sis que reciban alimentacin parenteral, se pudo deter- minar mediante el empleo de 13 C-cistena, que la velo- cidad de sntesis de GSH era muy inferior a la de los controles. Se observ que la suplementacin con N-ace- til cistena llev a un aumento significativo, en slo 9 das de tratamiento, de la concentracin de GSH, de cis- tena y de la velocidad de sntesis del tripptido. Tam- bin se comprob un efecto antiinflamatorio como consecuencia de la disminucin de la concentracin de interleuquinas en plasma (5)(31). Se pudo comprobar entonces que la terapia de su- plementacin con ciste na para restablecer el GSH du- rante las primeras etapas del tratamiento de la desnu- tricin disminu a la morbi-mortalidad infantil (29). GSH y enfermedad alcohlica El GSH se sintetiza en el citosol, pero entre 10 y 15% queda en las mitocondrias para protegerlas, prin- cipalmente, del agua oxigenada y de otros ROS que se producen en el metabolismo celular. Mediante la exposicin crnica de ratas a etanol se pudo observar un marcado decrecimiento del GSH mito- condrial (50%) debido a un deficiente transporte desde el citosol; tambin se vio alterada la microviscosidad in- terna de la mitocondria. Estas modificaciones determi- nan una susceptibilidad letal al stress oxidativo (32)(33). La metionina y su forma activa S-adenosil metioni- na son importantes en el metabolismo de fosfol pidos y en la estructura y funcin de la membrana mitocon- drial. La administracin de S-adenosil metionina pre- viene los daos hepticos inducidos por alcohol y pro- tege a la mitocondria. La enzima vinculada en el proceso, metionina adenosil transferasa, es regulada por el estado redox a travs de los niveles intracelula- res de GSH y de la relacin GSH/GSSG. Por aumento del etanol aumenta la generacin de ROS, disminuye la actividad de la metionina adenosil transferasa y disminuyen la S-adenosil metionina, y el GSH. Se genera un c rculo vicioso que se puede inte- rrumpir por la administracin exgena de S-adenosil metionina (33). GSH y SIDA En la infeccin asintomtica por HI V se descono- cen los mecanismos por los que est alterada la ho- meostasis del GSH. El pool eritrocitario de GSH est disminuido, probablemente porque decae la veloci- dad de su s ntesis y tambin porque hay una menor disponibilidad de ciste na (34). Una persistente carga oxidativa conduce a un au- mento del consumo de GSH que no se compensa con un incremento de la velocidad de s ntesis del trippti- do. El hecho de que el nivel de GSH est comprome- tido en individuos infectados con HI V y que esto jue- gue un rol muy importante en la patognesis de la enfermedad est bien documentado aunque todav a se desconozcan los mecanismos responsables de la de- ficiencia de GSH. En los pacientes con esta patolog a existe un 40% menos del tripptido en glbulos rojos y plasma; tambin se encuentra disminuido en las c- lulas CD8 y CD4T y en el fluido epitelial de pulmn. Es importante la instalacin de un tratamiento con N-acetil ciste na o prociste na a fin de revertir parcial- mente la situacin, dado que el GSH es esencial para regular la proliferacin celular, mantener la funcin de los eritrocitos, restringir la replicacin del HI V y sobre todo para aumentar la sobrevida de los pacientes infec- tados. Mediante la administracin de la N-acetil ciste - na se logra restablecer y sostener la homeostasis del GSH (35-37). En la Tabla V se resumen las enfermeda- des antes mencionadas, y su relacin con el GSH. Tcnicas actuales con istopos estables Los istopos estables pueden ser usados, tanto in vi- vocomo in vitro, para determinar aspectos dinmicos del metabolismo. Presentan, respecto de los istopos radiactivos, la ventaja de poder emplearse en grupos vulnerables (nios, mujeres embarazadas)(38). La metodolog a general de los estudios in vivocon- siste en la administracin por v a oral o endovenosa de un compuesto marcado con el istopo estable, para que una vez en el organismo intervenga en el proceso metablico, enzimtico o no, que se desea investigar. Se puede entonces estudiar la velocidad de aparicin o desaparicin de metabolitos a travs de muestras de sangre, orina o an ms conveniente y simple, de aire espirado, obtenidas a diferentes tiempos (39-41). La tcnica ideal con istopos estables es aquella que combina un mtodo no invasivo de administracin del compuesto marcado, con una recoleccin de muestra de caracter sticas similares y que, adems, presenta elevada sensibilidad y especificidad. El empleo de tc- nicas con molculas marcadas con 13 C, un istopo es- table, encuentra numerosas aplicaciones y rene las condiciones mencionadas. La cantidad o la velocidad de aparicin de CO 2 marcado ( 13 CO 2 ), generado a partir de un 13 C-sustrato, podr a ser un indicador del estado de diferentes funciones fisiolgicas relaciona- das con el sustrato. Los metaprobes o probadores meta- blicos permiten estimar tambin la actividad de de- terminadas enzimas en el cuerpo (39)(42-44). Segn la bibliograf a, el cido 13 C-octanoico se em- plea para evaluar el vaciamiento gstrico. El 13 C-trioc- Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 54 50 Mart nez Sarrasague M y col . tanoin, el 13 C-triolein, y el 13 C-triglicridos son usados en el estudio de malnutricin e hipercolesterolemia. El diagnstico y seguimiento de la infeccin por Heli- cobacter pylori se puede realizar empleando 13 C-urea, que por accin de la enzima bacteriana ureasa origina 13 CO 2 que puede ser cuantificado en el aire espirado mediante espectrometr a de masa (42)(43). Una aplicacin clsica de istopos estables la consti- tuye el empleo de 13 C-aminopirina para distinguir dife- rentes grados de enfermedad heptica que afectan los procesos de demetilacin en el citocromo P-450. En in- vestigaciones recientes se usaron anlogos de amino- cidos para evaluar la funcin mitocondrial heptica a travs de la medicin del 13 CO 2 exhalado (45). El aumento de homociste na en plasma es un factor de riesgo para enfermedades cardiovasculares, pues sus manifestaciones aparecen tarde; conviene detectar temprano los problemas de depuracin de la homocis- te na, para, mediante un tratamiento de suplementa- cin vitam nica, disminuir el riesgo de los trastornos circulatorios. Si se usa 13 C-metionina se puede deter- minar in vivola dinmica del ciclo de reconversin del aminocido; el enriquecimiento de 13 CO 2 en el aire espirado puede permitir aproximaciones cuantitativas de su secuencia metablica (46). La incorporacin de 2 H-glicina en el GSH es un ejemplo de istopo estable incorporado a una molcu- la que permite medir la cintica del metabolismo del GSH in vivo. Tambin para determinar la importancia de la ciste na de dieta en la s ntesis de GSH en sangre entera se emple el 13 C-ciste na, y mediante espectro- metr a de masa, se evalu el enriquecimiento isotpico con 13 C del tripptido y de la ciste na plasmtica (34). En un trabajo orientado a evaluar la importancia de los aminocidos con azufre se estudiaron dos grupos de individuos adultos sanos que recibieron dietas dis- tintas: una con aminocidos completos y otra sin ami- nocidos azufrados. El marcador empleado fue 13 C- ciste na, en concentracin suficiente para marcar todo el GSH sangu neo. En las muestras de aire exhalado se determin el 13 CO 2 . Tambin se obtuvieron muestras de sangre cada hora y en ellas se determin 13 C-ciste - na, 13 C-ciste na-GSH y GSH en sangre entera. En la dieta sin aminocidos azufrados se observ un aumen- to de flujo de oxiprolina, aumento de su velocidad de oxidacin y aumento de la excrecin urinaria. Esto evidencia un cambio en la velocidad de s ntesis y en el recambio del GSH (Figura 2) (30). Entre los testsde 13 CO 2 en el aire espirado interesan aquellos que permitan inferir las condiciones en que se encuentran los depsitos de GSH y evaluar la respues- ta en su s ntesis frente a una deplecin estimulada. El empleo de 13 C-oxatiazolidina carboxilato (OTC) permite seguir el curso de la deplecin de GSH an frente a una injuria leve inducida. El mismo compues- to tambin puede ser usado para estimar la capacidad relativa de reposicin de GSH de acuerdo con los dis- tintos estados de stressoxidativo (47). La Figura 3 muestra la ruta metablica de sntesis del GSH y el nivel en el cual interviene la enzima oxoproli- nasa (con el nmero 3 en la figura). El sustrato natural de la enzima es la 5-oxoprolina y la oxotiazolidina es un anlogo, que como se menciona en la introduccin, se emplea con fines teraputicos para aumentar los depsi- tos celulares de cistena y reponer los niveles de GSH. En circunstancias en que las reservas del tripptido estaban disminuidas, ya sea por causas naturales (edad), en en- fermedades (SIDA), o en la deplecin por intoxicacin Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 54 Met abol i smo del gl ut at i n 51 Patologa Cncer Ateroesclerosis Malnutricin Alcoholismo SIDA Tabla V. Relacin entre enfermedades y GSH. Alteracin Estado persistente de stressoxidativo Aumento de la concentracin de ROS La LDL oxidada provoca aumento de la concentracin de ROS Aumenta la apoptosis celular Aumenta la concentracin de ROS que daan la membrana celular; se produce edema y hay subfuncin heptica e inmune Aumenta la generacin de ROS y la susceptibilidad al stressoxidativo Alteraciones a nivel mitocondrial Incremento de procesos oxidativos Se desconocen los mecanismos que alteran la homeostasis del GSH Relacin con GSH Aumentan los niveles de GSSG plasmtico por aumento de la actividad mittica tumoral Aumenta la sntesis de GSH para proteger a las clulas del stressoxidativo Disminuye la concentracin de GSH , la velocidad de sntesis de GSH, la concentracin de cisterna y la concentracin de enzimas por dficit proteico Disminuye la concentracin de GSH mitocondrial Disminuye la actividad enzimtica de metil adenosil.transferasa Disminuye la concentracin de GSH en hemates y en plasma Disminuye la velocidad de sntesis de GSH con acetaminofeno, experiencias realizadas con oxatia- zolidina permitieron calcular indirectamente la movili- zacin de los precursores para la sntesis de GSH (7). El acetaminofeno (APAP = Tylenol R ) es un analgsi- co, antipirtico que en dosis bajas se puede usar para causar artificialmente una deplecin de GSH; en dosis elevadas causa hepatotoxicidad. La oxotiazolidina refle- ja entonces efectivamente el curso de la deplecin de GSH, an ante una injuria suave y puede ser usada pa- ra estimar la capacidad relativa de reposicin de GSH. Con esta finalidad se emple entonces 13 C- oxatiazolidi- na, que por accin de la oxoprolinasa origin cistena y 13 CO 2, detectable en el aire espirado (1)(40). En condiciones basales, las concentraciones intrace- lulares de GSH son lo suficientemente elevadas como para inhibir su propia sntesis (etapa 1 de la Figura 3), de modo que los sustratos fluyen a travs de un shunt o ruta alternativa, en la que intervienen diferentes enzi- mas y originan oxiprolina. Este compuesto, en las con- diciones mencionadas, saturara presumiblemente la va de la 5-oxoprolinasa. Si un anlogo de la oxoprolina, como por ejemplo la 13 C-oxotiazolidina es introducido en las condiciones basales ser hidrolizado en muy baja proporcin debido a la presencia de oxoprolina end- gena en concentraciones elevadas, la enzima no estar disponible para el anlogo marcado y por lo tanto ha- br una menor produccin de 13 CO 2 . La 5-oxoprolina no ejerce un feed backsignificativo de la sntesis de GSH. Por otro lado, en respuesta a un estmulo depletorio agudo de GSH, se produce la sntesis denovodel tripp- tido. Para ello los sustratos se retiran de la va de la oxo- prolina, lo que provoca que sus niveles intracelulares disminuyan y consecuentemente una mayor propor- cin de la 13 C-oxotiazolidina es ahora hidrolizada, lo que se evidencia en una mayor concentracin de 13 CO 2 en el aire espirado. Si aumenta la excrecin de 13 CO 2 , es porque los de- psitos de GSH estn disminuidos y estn alterados los sustratos naturales para la oxoprolinasa. Una adecuada concentracin de GSH da una menor velocidad de con- versin de oxotiazolidina y una disminucin en la pro- porcin de 13 CO 2 en el aire espirado. La prueba de 13 C-oxotiazolidina sirve para identificar individuos de riesgo porque tienen bajos depsitos de GSH, o bien porque tienen disminuida la capacidad de sntesis de GSH. El ensayo con 13 C-oxotiazolidina sirve para caracterizar a los pacientes segn su tasa metablica basal y su capacidad de produccin en respuesta a una in- juria controlada, por ejemplo con acetaminofeno. Tanto en el caso de un aumento basal de la tasa metablica co- mo en el de una baja respuesta estimulada, no se obser- var una buena respuesta a tratamientos con antioxidan- tes y a terapias relacionadas con recuperacin de los niveles de GSH. Estos casos son ms sensibles, por ejem- plo, a los daos de los tratamientos quimioterpicos (47). La oxotiazolidina se usa teraputicamente para esti- mular la s ntesis heptica de GSH, aumentar el GSH intracelular en pacientes dializados o con SI DA, sensi- bilizar tumores al agente quimioterpico, revertir la disfuncin endotelial en pacientes con enfermedades arterio-coronarias, mejorar la respuesta inmune y ali- viar la injuria a los pulmones en pacientes con disfun- cin respiratoria aguda. La efectividad de la administracin directa de GSH es restringida debido a que es fcilmente hidrolizado en intestino e h gado, de all que se probaran drogas que permitieran reponer los niveles de GSH, sin sufrir la limitacin de la degradacin. La oxotiazolidina pue- de ser administrada oralmente, no se le conocen efec- tos adversos serios y es bien tolerada (34)(48). Conclusiones Por todo lo expuesto se comprende el papel pre- ponderante del GSH, no slo en la detoxificacin de Act a Bi oqum Cl n Lat i noam 2006; 40 (1): 45- 54 52 Mart nez Sarrasague M y col . GSH + _ 3 2 1 Cistena Glutamato 5-oxoprolina -glutamilcistena Glicina Figura 3. El GSH es sintetizado en 2 etapas a partir de glutamato, cistena y glicina; en un primer paso (1) interviene la enzima -glutamil- cistein sintetasa, y luego (2) la GSH sintetasa. El GSH ejerce feed back negativo en la reaccin 1. La -glutamilcisteina no convertida en GSH sigue una ruta alternativa, produciendo cistena y 5-oxoprolina; esta ltima es convertida en glutamato va la enzima 5-oxoprolinasa (3). compuestos endgenos y exgenos sino tambin en los procesos de defensa contra el stress oxidativo y su influencia en el balance del estado redox celular. Se asocia envejecimiento con bajos niveles de GSH y tam- bin se lo implica en la teor a de envejecimiento me- diado por radicales libres (13). Es por ello que resulta de inters el desarrollo de una metodolog a que permita evaluar el estado de los depsitos tisulares del tripptido y la respuesta frente a est mulos depletorios del mismo. Si el mtodo rene caracter sticas de especificidad, sensibilidad y cualida- des de no invasivo, resultar beneficioso para ser em- pleado en aquellos casos o situaciones en que otras tcnicas no son recomendadas. Se pueden sumar a es- tas ventajas el hecho de que el empleo de istopos es- tables, en lugar de los radioistopos, evita los inconve- nientes de irradiacin en los grupos de riesgo. Debido que la enzima oxoprolinasa est amplia- mente distribuida en los tejidos, la medida indirecta de su actividad permite inferir un ndice de la activi- dad de s ntesis de GSH y de su homeostasis emplean- do como sustrato 13 C-oxotiazolidina y cuantificando la presencia de 13 CO 2 en el aire espirado, Consecuentemente, el test de 13 C-oxotiazolidina permite la implementacin y el seguimiento de tera- pias, adems de caracterizar a los individuos segn su tasa metablica basal para oxotiazolidina y su capaci- dad de respuesta a una injuria controlada (47). Los tests de aire espirado para diagnstico no son nuevos, pero su asociacin con istopos estables los convierte en metodolog as con un futuro promisorio. Su empleo en la rutina cl nica es an limitado, tal vez por el elevado costo del equipamiento y por la falta de estandarizacin de los protocolos, adems de la nece- sidad de contar con estudios poblacionales que permi- tan normatizar los valores para el diagnstico de enfer- medades (40). CORRESPONDENCI A BI OQ. MAR A MARGARI TA MART NEZ SARRASAGUE Ctedra de F sica. Facultad de Farmacia Y Bioqu mica Jun n 956 1113 CI UDAD AUTNOMA DE BUENOS AI RES. Argentina Tel: (011) 4964-8201 - Fax: (011) 4964-8204 E-mail: marga@ffyb.uba.ar Referencias bibliogrficas 1. Griffith OW. Biological and pharmacologic regulation of mammalian glutathione synthesis. Free Rad Biol Med 1999; 27 (9/10): 922-35. 2. Cho S, Hazama M, Urata Y, Goto S, Horiuchi S, Sumikawa K, et al. 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