Tecnología Del Dna Recombinante Bilogia Molecular PDF

TECNOLOGA DEL DNA
RECOMBINANTE
Y BIOLOGA MOLECULAR

LOS CIDOS NUCLEICOS

Los cidos nucleicos son las molculas de la
herencia y por lo tanto van a participar en los
mecanismos mediante los cuales la informacin
gentica se almacena, replica y transcribe. Esta
no es su nica funcin
Los cidos nucleicos, son macromolculas formadas
por polmeros lineales de otras subunidades
estructurales o monmeros, denominados nucletidos,
unidos mediante enlaces enlaces fosfodister.
Cada nucletido est formado por:
Una base nitrogenada.
Un azcar
Un grupo fosfato
LOS CIDOS NUCLEICOS

Naturaleza qumica del DNA

Las Bases Nitrogenadas son las que contienen la informacin
gentica y los azcares y los fosfatos tienen una funcin
estructural formando el esqueleto del polinucletido.
En el caso del ADN las bases:
Las purinas A y G
Las pirimidinas son T y C
En el caso del ARN
Las purinas son A y G
las pirimidinas son C y U


La forma degradativa final de las
purinas en los primates es el
cido rico, 2,6,8-trioxo purina
y las pirimidinas son degradadas
completamente a agua, anhdrido
carbnico y urea
Es la clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones,
pues permite procesos como la replicacin del ADN y la traduccin del
ARN en protenas y es la base de las tcnicas de ADN recombinante etc

NATURALEZA QUMICA DEL DNA

El azcar es un monosacrido de cinco carbonos,
una pentosa.
La pentosa puede ser D-Ribosa (D-ribofuranosa), en
cuyo caso hablamos de Ribonuclesidos en el ARN
2-D-Desoxirribosa (D-desoxirribofuranosa),
constituyendo los Desoxirribonuclesidos en el ADN


Los Nuclesidos son
unos compuestos
formados por la unin
de una base
nitrogenada a una
pentosa a travs de un
enlace glicosdico.
Los nucletidos son
los steres fosfricos
de los nuclesidos y
estn formados por la
unin de un uno o ms
cidos fosfricos al
carbono 5 de una
pentosa.


EL ADN
Dentro de las clulas, el ADN se encuentra formando los
cromosomas. El nmero de cromosomas depende de la especie,
as por ej, las clulas humanas poseen 46 (23 de cada progenitor).
En los organismos eucariotas casi todo el ADN se encuentra dentro
del ncleo y una mnima parte en otros orgnulos, ej: mitocondrias.
En los seres procariotas (ej: bacterias) el ADN se encuentra en el
citoplasma de la clula (carecen de membrana nuclear)
ESTRUCTURA DEL DNA
El modelo de Watson y Crick (en
1953) consiste en una doble
hlice dextrgira que contiene
azcares y fosfatos en su
exterior y bases nitrogenadas en
su interior.
Las dos cadenas de nucletidos:
son antiparalelas.
Las cadenas se mantienen
unidas mediante los puentes de
hidrgeno que unen las
cadenas opuestas y los enlaces
fosfodiester que conectan el
azucar con los grupos fosfato
adyacentes.
Las dos cadenas del DNA son
complementarias. La A solo se
aparea con la T y la G se aparea
con la C
En el ADN se distinguen varios niveles de
organizacin:
Estructura primaria: se refiere a la secuencia
de bases que lo forman, que en realidad es el
cdigo con la informacin gentica.
Estructura secundaria: .se refiere a la doble
cadena que forma la hlice, fue propuesta por
James Watson y Francis Crick en 1953 ambas
cadenas son complementarias y antiparalelas,
una orientada en sentido 5- 3 y la otra de 3- 5,
la adenina se une a la timina de la cadena
complementaria y la guanina a la citosina.

ESTRUCTURA DEL DNA

El DNA de eucariotas se asocia a
protenas para formar la cromatina.
En funcin del grado de
condensacin y de la actividad
transcripcional se pueden distinguir
dos tipos de cromatina:
Eucromatina
Heterocromatina
Las protenas asociadas a la
cromatina son:
Histonas (protaminas en
espermatozoides)
Protenas no histonas
Hay varios niveles de organizacin
de la cromatina:
Nucleosomas
Estructura de solenoide
Fibra de cromatina
ESTRUCTURA DEL DNA

Estructura terciaria:
Se refiere a como se almacena el ADN en un espacio reducido, para ello,
es necesaria la presencia de unas protenas bsicas denominadas
histonas o las protaminas en los espermatozoides
La unin del ADN con Histonas genera la estructura denominada
nucleosoma. El conjunto de la estructura se denomina fibra de
cromatina de 100 A. Tiene un aspecto repetitivo en forma de collar de
perlas

ESTRUCTURA DEL DNA

ESTRUCTURA DEL DNA

El nucleosoma est compuesto por un octmero de histonas
(H2A, H2B, H3 y H4) alrededor del cual se enrollan dos
(1,65) vueltas de DNA.
Estructura cuaternaria:
La fibra de cromatina de 100 A se empaqueta formando una fibra de
cromatina de 300 A.
El enrollamiento que sufre el conjunto de nucleosomas recibe el nombre
de solenoide. Los solenoides se enrollan formando la cromatina del
ncleo interfsico de la clula eucariota.
Cuando la clula entra en divisin, el ADN se compacta ms, formando
los cromosomas
ESTRUCTURA DEL DNA

Los nucleosomas se pliegan sobre s
mismos para formar una estructura
densamente empaquetada con forma de
solenoide que tiene 30nm de grosor
La fibra de cromatina sufre un
enrollamiento helicoidal
para formar la estructura que
se observa en metafase: la
cromtida (700 nm)
ESTRUCTURA DEL DNA

CONCEPTO DE GEN
Un gen es una secuencia de nucletidos que codifica
para una protena determinada o un RNA.
CONCEPTO DE GEN
Los intrones contiene seales reguladoras del gen
Su existencia permite que los genes sean modulares y se puedan
combinar los exones de diversas maneras produciendo protenas
diferentes con un mismo gen.
El ARN

Se conocen tres tipos principales de ARN y todos ellos
participan en la sntesis de las protenas.
ARN mensajero (ARNm): Consiste en una molcula lineal de
nucletidos monocatenaria, cuya secuencia de bases es
complementaria a una porcin de la secuencia de bases del
ADN.
ARN ribosomal (ARNr): Este tipo de ARN una vez trascrito,
pasa al nucleolo donde se une a protenas. De esta manera se
forman las subunidades de los ribosomas.
ARN de transferencia (ARNt): Este es el ms pequeo de
todos, tiene aproximadamente 75 nucletidos en su cadena,
adems se pliega adquiriendo lo que se conoce con forma de
hoja de trbol plegada. El ARNt se encarga de transportar los
aminocidos libres del citoplasma al lugar de sntesis
proteica.

LA REPLICACIN DEL ADN

El ADN posee la informacin necesaria para transmitir los caracteres
de una especie de generacin en generacin y conseguir la
supervivencia de la especie, para ello, la informacin gentica debe
reproducirse exactamente cada vez que la clula se divide.
Cada especie tiene una cantidad de ADN caracterstica, que en el
ncleo de las clulas eucariticas se encuentra formando los
cromosomas, la mayor parte de clulas somticas de un
organismo es diploide (2n) pues llevan los cromosomas homlogos
heredados del padre y de la madre. Mientras que los vulos y los
espermatozoides son haploides (n)
Las clulas, en el curso de su vida pueden dividirse para producir
clulas hijas (la frecuencia depende de los distintos tejidos), por lo
tanto, las clulas pasan por un periodo de interfase (no divisin) y
otro de divisin (mitosis en clulas somticas o meiosis en clulas
germinales) para dar lugar a las clulas hijas. Durante un periodo
especial de la interfase se produce la duplicacin

REPLICACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS
La replicacin o duplicacin del ADN es el proceso por el que las
molculas de ADN se copian a s mismas en el ncleo de las clulas
siendo semiconservativa, esto quiere decir que al separarse las
dos hebras cada una de las originales sirve de molde para la sntesis
de una nueva, por lo tanto de las dos nuevas molculas cada una
conserva una cadena del ADN original y la otra cadena es de nueva.
La sntesis se realiza siempre en la direccin 5 __ 3 y las dos
hebras antiparalelas son replicadas simultneamente en ambas
direcciones



La enzima que lleva a cabo la replicacin del
ADN es la ADN polimerasa, esta enzima tiene
unos requerimientos especficos para trabajar,
que le imponen restricciones:
Slo aade nucletidos en la direccin 5___3.
Necesita para poder empezar a copiar y unir nucletidos
un molde de ADN.
Necesita un trozo de ARN al cual unir los nucletidos, ya
que ella no puede empezar a unir los nucletidos libres
necesita una pequea cadena ya formada.
Utiliza nucletidos trifosfato.



El inicio de la replicacin, se produce cuando la doble
hlice de ADN es desenrollada y abierta en una
secuencia especfica de nucletidos denominada origen
de replicacin.
En los procariotas existe un nico origen de replicacin,
denominado origen (ORI) cuya longitud es de 200-300
pares de bases; en los eucariotas, en cambio, hay
mltiples orgenes de replicacin (multifocal).
En la molcula de ADN se forma una estructura en forma
de Y, denominada horquilla de replicacin.
La replicacin es bidireccional, por lo tanto existen dos
horquillas de replicacin que se mueven en direcciones
opuestas desde el origen de replicacin


La enzima helicasa que abre la hlice.
El desenrollamiento de la doble hlice da lugar a
superenrollamientos, capaces de detener el proceso, se necesita
la presencia de las enzimas topoisomerasas (o girasa) que
eliminen las tensiones en la fibra.
A continuacin, para evitar que las dos hebras vuelvan a reunirse
se colocan unas protenas llamadas SSB (Single-Strand DNA
Binding proteins), protenas de unin DNA de una sola cadena,
que mantiene la doble hlice abierta estabilizando a las cadenas
sencillas
El proceso es bidireccional, es decir, hay una helicasa trabajando
en un sentido y otra trabajando en sentido opuesto. Se forman
pues las llamadas burbujas de replicacin
RNA-primasa que, sintetiza un corto fragmento de ARN de unos
5-10 nucletidos denominado RNA cebador o primer que acta
como cebador. Se forman un complejo multiproteico denominado
replisoma.


REPLISOMA
La DNA polimerasa III, que a partir de este
cebador comienza a sintetizar en direccin 5__3
una hebra de ADN partir de nucletidos trifosfato.
Esta nueva hebra se sintetiza en el sentido que se
abre la horquilla de replicacin, es de crecimiento
continuo y se denomina hebra conductora.


La replicacin del DNA es semidiscontinua
Sobre la otra hebra complementaria se sintetiza en direccin
contraria y se denomina hebra discontinua o rezagada.
Aqu la DNA polimerasa III sintetiza desde la horquilla hacia
fuera.
La RNA primasa sintetiza pequeos fragmentos de RNA y a partir
de ellos la ADN polimerasa III sintetiza unos 1.000-2000
nucletidos de ADN, (en procariotas) se detiene y vuelve empezar,
formndose los denominados fragmento de Okazaki..
A continuacin interviene la DNA polimerasa I, que, primero,
gracias a su funcin exonucleasa, retira los segmentos de ARN, y
que luego, gracias a su funcin polimerasa, rellena los huecos con
nuceltidos de ADN.
Finalmente la ADN ligasa unir los dos extremos, tanto en la
cadena continua como los sucesivos fragmentos de Okazaki que
se van formando en la cadena discontinua.



REPLICACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRICCIN

Las enzimas de restriccin (o endonucleasas de restriccin)
que son enzimas capaces de reconocer y cortar secuencias
especficas de DNA de doble cadena.
Reconocen una secuencia entre 4-8 pb en el ADN.
El sitio de reconocimiento se llama sitio de restriccin, y la
enzima rompe un enlace fosfodister en la hebra de arriba y otro
enlace fosfodister en la hebra complementaria
Estas enzimas las producen de forma natural las bacterias y
las utilizan como defensa contra los virus cortando su DNA.
El DNA propio se protege frente a la digestin mediante
metilacin de las dianas de corte.
Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de
este modo solo afectan el DNA extrao y no el DNA bacteriano.
Se nombran segn el gnero y la especie de la bacteria de
donde se aisl por primera vez esta enzima.
La primera letra representa el gnero de la bacteria,
Las dos siguientes indican la especie,
La cuarta letra indica la cepa,
Un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han
aislado de esa cepa.
Ej: La enzima HindIII se descubri en Hemophilus influenzae,
EcoRI proviene de Escherichia coli;
Eco RI _ E = gnero Escherichia
Co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Las secuencias reconocidas por las enzimas de restriccin son
normalmente secuencias palindrmicas (secuencias que se
leen igual en ambas direcciones).
Hay tres tipos de enzimas de restriccin:
Las enzimas de Tipo I y III: cortan las dos cadenas del
DNA en una posicin aleatoria a cierta distancia del
sitio de restriccin. No se utilizan normalmente ya que
el sitio de corte no es preciso.
Las enzimas de Tipo II: reconocen una secuencia
especfica y cortan las dos cadenas de la molcula
de DNA con absoluta precisin dentro de la
secuencia reconocida.
Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II
son palindrmicas, es decir, la secuencia de una de
las cadenas leda en direccin 5'__3' es la misma que la
secuencia de la cadena complementaria leda tambin
en direccin 5'___3'.
La enzima de restriccin EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrmica
GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla
complementarias.
La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias
de otros fragmentos de DNA para formar molculas de DNA recombinante.
Las enzimas de restriccin al cortar el
DNA pueden producir 2 tipos de cortes:
1. Cohesivos o pegajosos: Cortes
escalonados, dejando productos con
extremos complementarios (cohesivos).
Ej: Eco RI
2. Romos: Cortes simtricos, dejando
productos con extremos ciegos o
romos
Si las molculas a utilizar presentan extremos
romos, hay que conferirles extremos cohesivos,
por ejemplo, utilizando la enzima
desoxinucleotidil transferasa terminal es para
crear extremos de cadena sencilla mediante la
adicin de colas de nucletidos.
Si a uno de los DNA se le aade, por ejemplo, una
cola de polidA, y al otro DNA se le aade una cola
de poli-dT, se forman colas complementarias, y
los fragmentos pueden unirse mediante puentes
de hidrgeno.
ENZIMAS IMPORTANTES EN INGENIERA GENTICA
DIGESTIN Y LIGACIN DE DNA

Un fragmento de DNA puede cortarse con una enzima
de restriccin y despus unirse a otro fragmento con
extremos complementarios empleando la DNA ligasa.
Solo pueden unirse fragmentos que tengan extremos
complementarios o cohesivos
Si estos fragmentos se ponen juntos, bajo determinadas
condiciones, los fragmentos de DNA de distinto
origen pueden formar molculas recombinantes
estableciendo puentes de hidrgeno entre los extremos
cohesivos.
Luego se utiliza la enzima DNA ligasa para unir
covalentemente los esqueletos azcar-fosfato de los dos
fragmentos, producindose as una molcula de DNA
recombinante


ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para
separar macromolculas (DNA, colorantes, Protenas,..) en
funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades
fsicas.
El trmino electroforesis describe la migracin de las
partculas cargadas bajo la influencia de un campo elctrico.
La electroforesis en gel es una tcnica de separacin
consistente en aplicar corriente elctrica a las molculas para
que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz es la tensin
elctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel.
Las propiedades de una molcula determinan la velocidad con
que un campo elctrico puede desplazarla a travs de un medio
gelatinoso
Electroforesis de DNA

Mtodo de separacin para analizar fragmentos de ADN de 500-
30.000 pb generados por enzimas de restriccin, PCR, etc.
Primero el ADN extrado de la muestra se trata con una
endonucleasa de restriccin genera diferentes fragmentos.
Los fragmentos de ADN resultantes se separan segn su tamao
mediante electroforesis en geles de agarosa.
Durante la electroforesis, las molculas de ADN, que poseen
carga negativa, migran hacia el electrodo positivo.
Las molculas menores se mueven ms deprisa a travs de
los poros del gel que las de mayor tamao. De tal forma que
los fragmentos de DNA migrarn a una razn inversamente
proporcional al logaritmo de su tamao o peso molecular.

Los fragmentos de DNA va a producir un patrn de bandas,
donde cada banda corresponde a un fragmento de un
tamao particular
El tamao de cada fragmento puede ser determinado utilizando
un marcador o una escalera de DNA cuyos fragmentos
tienen pesos moleculares conocidos. Este marcador sirve de
control y migrar paralelo a las bandas de DNA que deseamos
analizar
Finalmente se le aade bromuro de etidio, sustancia que se
intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando
se ilumina con luz ultravioleta.
Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de
luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las
muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso
molecular
Separacin de
los fragmentos a
travs del gel de
agarosa
DNA teido con
bromuro de
etidio emite
fluorescencia
con luz UV
http://www.youtube.com/watch?v=6vKLT5mQoBM electroforesis de DNA
LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS
Se trata de un proceso de unin de dos cadenas complementarias
de ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molcula de cido
nucleico basndose en la complementariedad de bases bajo
determinadas condiciones de pH, temperatura, etc.
Permite estudiar el grado de relacin gentica entre dos cidos
nucleicos, adems de la deteccin de una molcula diana
partiendo de una sonda complementaria a ella.
Se parte de dos poblaciones de cidos nucleicos:
Un conjunto homogneo de cidos nucleicos de secuencia de
bases conocida que acta como sonda
Un conjunto heterogneo de cidos nucleicos de secuencia de
bases desconocida donde queremos detectar la secuencia diana
(complementarias a la sonda).
Una de las secuencias debe estar marcada (istopo radiactivo,
fluorocromo, enzima),
si lo est la sonda, la hibridacin es estndar
y si lo est la diana, la hibridacin es reversa.
La hibridacin puede producirse en medio lquido o sobre soporte
slido, como las membranas de nitrocelulosa donde se fijan una
de las poblaciones de ADN, en la hibridacin estndar se fija el
ADN diana.

LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS
SOUTHERN BLOT

1. El ADN es digerido con una enzima de restriccin.
2. Los fragmentos son separados por tamaos mediante una
electroforesis en un gel. Se realiza una tincin con bromuro de etidio
para comprobar la calidad de la electroforesis y del ADN.
3. Los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados
con un cido dbil y desnaturalizados con NaOH para permitir la
transferencia.
4. El ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa,
5. El filtro se incuba durante un tiempo con la sonda de
oligonucletidos marcada durante la incubacin la sonda se va
hibridando a la temperatura apropiada a los fragmentos de ADN de
cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida).
6. Mediante un lavado se separan los oligonucletidos restantes no
hidridados.
7. Finalmente la sonda unida al fragmento de ADN complementario se
puede visualizar por autorradiografa para el caso de sondas
radiactivas o con luz UV en el caso de flourocromo
http://ihome.cuhk.edu.hk/~z045513/virtuallab/animation/southern.html
SOUTHERN BLOT
NORTHERN BLOT

1. La muestra, en este caso son fragmentos de RNAm (total, vrico, etc.),
2. Se separan por electroforesis en condiciones desnaturalizantes en
presencia de formaldehdo, que forma parte de la composicin del
gel.
3. El ARN se transfiere a la membrana de nitrocelulosa o de nailon y se
hibridan con sondas de ADN marcada, de modo que en condiciones
renaturalizantes se origina un hbrido de RNA-DNA
4. Se puede detectar por autorradiograca con sondas marcadas con
32
P,
o mediante enzimas con sustratos quimioluminiscentes, como por
ejemplo, la luciferasa.
5. Con este proceso se puede analizar, patrones de expresin gnica
de una clula en diferentes estadios de diferenciacin etc.
6. Tanto la tcnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy
en da al haber sido sustituida por tcnicas derivadas de la PCR
NORTHERN BLOT
HIBRIDACIN IN SITU

Es una tcnica que se realiza directamente sobre tejido, clulas o
cromosomas localizados sobre un soporte slido, (un portaobjetos).
La visualizacin puede realizarse por medios isotpicos, enzimticos
o con fluorescencia, siendo evaluada en un microscopio.
Su gran virtud es que permite identificar las clulas donde se
produce la hibridacin que detecta la alteracin genmica,
cromosomica o transcripcional.
Hibridacin in situ acoplada a fluorescencia (FISH)
Hibridacin in situ acoplada a un cromogno (CISH, SISH).
En CISH, las sondas se marcan con un resto antignico y son
detectados por medio de anticuerpos conjugados con una enzima,
que cataliza reacciones de sustratos cromognicos.
Los cromgenos resultantes precipitan en el lugar de destino de la
sonda y se pueden detectar con un microscopio de campo claro.
Ventaja de que permite la visualizacin de contexto tejido,
incluyendo ncleo y forma de la clula, junto con la seal de la
sonda en la misma imagen.
HIBRIDACIN IN SITU
http://www.b2b.invitrogen.com/etc/me
dialib/en/images/ics_organized/applic
ations/clinical_diagnostic/video_agent
s.Par.16348.File.dat/CISHProtocol.sw
f
HIBRIDACIN IN SITU
En l FISH la muestra de DNA diana (cromosomas metafsicos o
ncleos en interfase) se desnaturaliza
Se aade la sonda marcada con un colorante fluorescente (sondas
para Chromosomal painting), que se aparear con el ADN diana y se
vuelve a formar la doble hlice.
La seal emitida por la sonda se observa mediante un microscopio de
fluorescencia y as la muestra de ADN se puede clasificar segn la
presencia o ausencia de la seal.
FISH de metafase: se utiliza sobre todo para detectar
microdeleciones (prdida de un trozo de ADN-genes defectuosos)
especficas en los cromosomas. Diagnosticar sndromes de origen
gentico.
FISH de interfase se utiliza para determinar el nmero de copias de
uno o varios cromosomas (Ejemplo ensayo de aneuploida: se
realiza sobre clulas del fluido amnitico cuando hay una fuerte
indicacin clnica de alguna trisoma) y tambin para detectar
algunas reorganizaciones especficas que son caractersticas de
ciertos tipos de cncer
HIBRIDACIN IN SITU
HIBRIDACIN IN SITU
FISH METAFASE
ste es un ejemplo de una clula en metafase que se
ha hibridado con la sonda diseada para detectar el
sndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH
22/Shprintzen, causado por una microdelecin en el
cromosoma 22. En este caso particular, se emplea una
mezcla bicolor de dos sondas distintas para el
cromosoma 22. La seal verde es un control interno
que hibrida en 22q13. Permite identificar rpidamente
los dos cromosomas 22. La seal roja est situada en
la regin DiGeorge, en 22q11.2. Puesto que ambos
cromosomas 22 tienen la seal roja, en esta clula no
hay microdelecin en la regin DiGeorge y este
paciente no tendra el sndrome DiGeorge.
Una sonda "de pintado" para el
cromosoma 4,

Esta otra prueba de aneuploida muestra un feto femenino con trisoma
21. El ncleo de la izquierda se ha hibridado con sondas diseadas para los
cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y tiene claramente tres seales rojas. El
ncleo de la derecha se ha hibridado con sondas diseadas para los
cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que muestra dos
seales verdes y ninguna roja, es femenino.
MICROARRAYS DE ADN

La base de la tecnologa de microarrays o chips de ADN es la
automatizacin de las tcnicas clsicas de biologa molecular
La principal ventaja es la posibilidad de inmovilizar en la
superficie del microarray miles de sondas de ADN, permitiendo
el anlisis de la presencia/ausencia o de la expresin de miles
de genes de una muestra, incluso de genomas completos
Un microarray de ADN son una serie de sondas de ADN
unidas a una superficie slida (vidrio normalmente) con una
disposicin regular y prefijada de manera que forman una
matriz de secuencias en dos dimensiones.
MICROARRAYS DE ADN
Los hay de tres tipos principales: aquellos que utilizan
como:
Sondas fragmentos de cDNA (DNA complementario a
partir de un cultivo de un tejido o de una muestra clnica),
Fragmentos ms pequeos de ADN (oligonucletidos), o
Productos de PCR.
Los cidos nucleicos de la muestra problema se marca
con un marcador fluorescente o enzimtico y se
incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la
hibridacin.
Durante la hibridacin, la muestra de material gentico
marcada, se unirn a sus complementarias
inmovilizadas en el soporte del chip,
La identificacin y cuantificacin del DNA presente en la
muestra, se realiza en funcin de la intensidad de
fluorescencia de cada punto, la cual se lee por ejemplo
con un lector de luminosidad.
En el caso de los cDNA el resultado es una fotografa
del estado de expresin del ARN de los genes de la
muestra (tumoral o normal).

MICROARRAYS DE ADN

MICROARRAYS DE ADN
Utilidad
Deteccin de genes activados o reprimidos en el
metabolismo celular, ante diferentes situaciones
patolgicas o fisiolgicas.
Deteccin de marcadores tumorales tiles para el
diagnstico, pronstico, prediccin de respuesta
teraputica de las neoplasia y clasificacin de las
neoplasia
Deteccin de dianas teraputicas
Identificacin de microorganismos etc
MICROARRAYS DE ADN

CGH (HIBRIDACIN GENMICA COMPARADA)

Es una tcnica citogentica para detectar regiones
cromosmicas que estn amplificadas o delecionadas en
una muestra, especialmente en tumores.
En la CGH, dos muestras de DNA genmico (una tumoral y una
normal) se marcan con diferentes fluorocromos y se hibridan
simultneamente sobre una extensin de cromosomas
metafsicos.
La relacin de intensidad entre las dos seales fluorescentes
proporciona una medida de la relacin entre el nmero de
copias de las dos muestras de DNA genmico.
Una tcnica derivada de la anterior es la CGH-array, chip de
CGH en la que los DNAs marcados se hibridan sobre una matriz
de fragmentos de DNA bien definidos, inmovilizados sobre un
soporte slido.
Ventajas del CGH array

Diagnstico de fenotipos atpicos y difciles
Deteccin de translocaciones desequilibradas, deleciones y
duplicaciones.
Deteccin de anomalas cromosmicas en mosaico no
detectables por otras tcnicas.
Tasa de diagnstico del 8% tras cariotipo normal previo.
Rapidez de resultado: 5-7 das.
Deteccin de alteraciones no detectables por cariotipo.
Aplicable en caso de mltiples sndromes de microdelecin y
microduplicacin, malformaciones congnitas,
dismorfologa, retraso mental, retraso del desarrollo
MTODOS DE AMPLIFICACIN DE LA DIANA.

Son mtodos in vitro que amplifican enzimticamente una
molcula diana hasta niveles a los cuales pueden ser
fcilmente detectados.
PCR
En 1983 Kary Mullis ide una nueva tcnica para amplificar
DNA en un tubo de ensayo y fue una autntica revolucin para
la ingeniera gentica. El Dr. Mullis recibi en 1993 el Premio
Nobel de Qumica por este Descubrimiento.
La PCR permite generar una gran cantidad de copias de un
fragmento de DNA.
El requisito es disponer de fragmentos cortos de DNA de
cadena sencilla complementarios a los extremos del
fragmento a amplificar.
Estos fragmentos servirn como cebadores para que una
enzima polimerasa sea capaz de incorporar nucletidos
complementarios a la cadena molde.
La cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante
tcnicas sencillas de separacin de fragmentos de DNA
PCR

1. Un molde de DNA monocatenario: el DNA que queremos
amplificar.
2. Una DNA polimerasa: es una enzima capaz de generar
una copia de DNA a partir del DNA molde. Esta reaccin
se lleva a cabo en un tampn apropiado. Adems, como
cofactores de la polimerasa se aaden cationes
divalentes, generalmente en forma de cloruro de
magnesio (MgCl
2
).Se suele utilizar la Taq- polimerasa,
que es una polimerasa termorresistente obtenida de la
bacteria Thermus aquaticus.
3. Un cebador (primer) con un grupo 3-OH libre: Las
enzimas DNA polimerasas nicamente son capaces de
aadir nucletidos al extremo 3-OH libre de una doble
cadena de DNA.
4. Dideoxinucletidos (dNTPs): Los nucletidos se aaden
en forma de desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs).
La base de la PCR es la replicacin catalizada por una DNA
polimerasa
PCR
Partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa
incorpora nucletidos complementarios a partir de la zona
de doble cadena originada por la unin de los cebadores al
molde.
Desnaturalizacin del DNA molde a (94C): En ella, el DNA
diana se incuba a elevada temperatura ( 94C) de tal manera
que las hebras se separan quedando accesibles a la
hibridacin de los primers.
Anillamiento de los primers al DNAs molde: En ella, la
mezcla de reaccin se enfra ( 55 65C) para permitir que
los primers hibriden con la secuencia complementaria.
Extensin de la nueva cadena de DNA (68-72C): Se suele
realizar a 72C y en ella los primers se extienden
mediante una DNA polimerasa, utilizando el DNA diana
como molde, realizndose entre 30 y 50 ciclos en cada
reaccin
(PCR)
http://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU
PCR
Estos tres pasos: desnaturalizacin-
emparejamiento-extensin,
constituye un ciclo de PCR.
Este proceso se repite durante 20-40
ciclos amplificando la secuencia
objeto exponencialmente.
La PCR se lleva a cabo en un
termociclador,
El producto amplificado es luego
detectado por separacin de la
mezcla de reaccin mediante
electroforesis en gel de agarosa

limitaciones de la PCR son:

Requiere el conocimiento previo de parte
de la secuencia que se quiere amplificar
para poder disear los primers
El DNA contaminado puede ser un
problema
El tamao de los productos de PCR no
puede ser mayor de 10-20Kb
Un alto contenido G+C del DNA puede
inhibir la reaccin.
MULTIPLEX PCR.
Es una modificacin de la PCR se incluyen dentro de la
misma reaccin de amplificacin mltiples pares de primers
especficos para diferentes dianas, por lo que se produce
una amplificacin de diferentes dianas;
ventajas:
Se pueden testar grandes regiones de la secuencia del
DNA en busca de alteraciones o modificaciones.
Se pueden testar segmentos no relacionados del
genoma diana.
Se pueden incluir controles internos de amplificacin de
la muestra.
Se puede testar una misma muestra contra diferentes
patgenos
Nested PCR

Para aumentar an ms la sensibilidad de la
PCR puede realizarse una PCR anidada (Nested
PCR),
Consistente en la amplificacin de un segmento
de DNA por PCR, seguida de la amplificacin,
mediante otros cebadores, de un fragmento
interno del primer segmento amplificado.
El desarrollo de esta PCR comporta efectuar una
primera PCR en un tubo.
Pasar el producto de la amplificacin a otro tubo
al que se incorporan los nuevos cebadores para
el fragmento interno que desea amplificarse.
Nested PCR
ventajas:
Mayor sensibilidad
Puede ser utilizado para mejorar la especificidad
para primera PCR que se confirma con la segunda.
Sin embargo, el gran nmero de ciclos de
amplificacin utilizados en la PCR anidada (a veces
ms de 60) puede aumentar notablemente la
probabilidad de resultados falsos positivos

LA RT-PCR

Es una variante de PCR: utiliza ADN complementario (cDNA)
proveniente del ARNm
Se realiza mediante transcripcin inversa mediada por la
enzima transcriptasa inversa, capaz de convertir el ARNm en
una molcula de cDNA dando lugar a un hibrido de RNA-cDNA, el
RNA se degrada por una RNAasa y el cDNA se amplifica por
PCR tradicional
El cDNA se utiliza cuando analizamos la expresin del ARNm de
algn gen de inters. Se trata por tanto de un mtodo muy
sensible que muestra s un gen especfico se expresa en una
muestra dada.
Una de las caractersticas ms importantes es que en el proceso
de RT-PCR, el cDNA generado ya no lleva los intrones que s
tendra el ADN original.
Permite tambien insertar genes eucariotas en organismos
procariotas por tecnologas del ADN recombinante.
LA RT-PCR
La RT-PCR es una prueba importante utilizada para:
El Diagnstico Molecular, por ejemplo para
estudiar el genoma de virus de ARN como los
retrovirus (tales como el VIH) o el virus de la gripe
(virus de la influenza),
Para investigacin cientfica
Para comprobar si cualquier gen especfico se
expresa o no en OGM (Organismos Genticamente
Modificados.

PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL

La nomenclatura que se usa tambin es diferente, si
utilizamos :
ADN genmico entonces hablamos de una qPCR
(quantitative PCR), si por lo contrario,
Si primero obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR, nos
referimos a una RT-qPCR
La PCR en Tiempo Real es, una PCR convencional en la
que los equipos de amplificacin (termocicladores) llevan
incorporados un sistema de deteccin de fluorescencia
(fluormetro), basndose la tecnologa en la utilizacin de
unas molculas especficas denominadas fluorforos y
quenchers.
Nos va a permitir monitorizar, en tiempo real, lo que est
ocurriendo dentro de cada ciclo de amplificacin y va a
sustituir a los pasos de amplificacin, electroforesis y
anlisis de imagen de una PCR tradicional
La clave en la PCR cuantitativa est en la posibilidad de detectar
en tiempo real la amplificacin de un segmento de DNA de
inters conforme transcurre la reaccin y poder cuantificar la
cantidad de ADN en la muestra.
Para llevar a cabo esta deteccin existen varios mtodos:
1 No especficos se vasa en la deteccin de molculas
intercalantes como el colorante SYBR Green I, (que se excita a
497nm y emite a 520nm) que tienen afinidad por el ADN de
doble cadena y que al ser oxidados generan una seal
fluorescente.
La fluorescencia emitida es capturada en la etapa de
extensin de cada ciclo y es proporcional al nmero de copias
de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR.
2 Mtodos de deteccin especficos
Se utiliza una sonda especifica que lleva adherida una
molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta
fluorescencia ("quencher"), de tal forma que slo cuando la
sonda es desplazada de su sitio por accin exonucleasa de la
ADN polimerasa, que escinde uno de los nucletidos de la
sonda a medida que sintetiza la nueva cadena, la molcula
fluorescente se libera de la accin del "quencher" y emite
fluorescencia al ser iluminada con un lser.
La cuantificacin de la fluorescencia emitida durante cada
ciclo de la PCR ser proporcional a la cantidad de ADN que
se est amplificando.
Un ejemplo de estos sistemas son las sondas comerciales
conocidas como TaqMan aunque existen otras en el mercado
(molecular beacons etc)
El parmetro fundamental en una PCR en Tiempo Real y en
funcin del cual se van a realizar todos los clculos analticos y
obtencin de resultados, es el denominado Ciclo Umbral
(Threshold Cycle o Ct), que se define como el ciclo a partir
del cual la fluorescencia es estadsticamente significativa
por encima del ruido de fondo (background)
Posteriormente, con una sonda del gen de la beta globina se pueden detectar si
en individuo lleva la mutacin en un alelo (portador heterocigoto) o en ambos
alelos (portador homocigoto) o en ninguno de los dos. Los RFLP se heredan
segn las reglas de Mendel.
Inmunodeficiencia combinada grave (SCID), una enfermedad mortal del sistema inmunitario
causada por la falta de la enzima adenosina desaminasa (ADA). El gen ADA clonado humano se
transfiere a un vector vrico, que se utiliza para infectar glbulos blancos extrados del paciente. El
gen ADA transferido se incorpora en un cromosoma, donde es activo. Despus de hacer crecer
estas clulas para incrementar su nmero, stas se reimplantan en el paciente, en el que producen
ADA, lo que permite el desarrollo del sistema inmunitario
http://www.youtube.com/watch?v=3ITNtgy6jeI
Ejemplo de Huella gentica por anlisis de VNTR y RFLP

Dos seres humanos no relacionados ser poco probable que tengan
el mismo nmero de minisatlites en un determinado locus

El anlisis consiste en
hacer un ensayo de
hibridacin de Southern y
usar sondas especficas
para detectar los VNTR
(nmero variable de
repeticiones en tndem).
Ejemplo de Huella gentica por anlisis de VNTR

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