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TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE Y BIOLOGA MOLECULAR

1 LOS CIDOS NUCLEICOS ADN y ARN.
Los cidos nucleicos son las molculas de la herencia y por lo tanto van a participar en los
mecanismos mediante los cuales la informacin gentica se almacena, replica y transcribe. Esta
no es su nica funcin. Los nucletidos, van a tener otras funciones biolgicas, entre las que
pueden destacarse, como ejemplo, la de servir de intermediarios en las transferencias de energa
en las clulas (ATP, ADP y otros)
Los cidos nucleicos se clasifican en cidos Desoxirribonucleicos (ADN) que se encuentran
residiendo en el ncleo celular y algunos organelos y en cidos Ribonucleicos (ARN) que actan
en el citoplasma.
Desde el punto de vista qumico los cidos nucleicos, son macromolculas formadas por
polmeros lineales de otras subunidades estructurales o monmeros, denominados nucletidos,
unidos mediante enlaces enlaces fosfodister. Cada nucletido est formado por:
1. Una base nitrogenada.
2. Un azcar
3. Un grupo fosfato.
Las Bases Nitrogenadas son las que contienen la informacin gentica y los azcares y los
fosfatos tienen una funcin estructural formando el esqueleto del polinucletido. En el caso del
ADN las bases son dos Purinas y dos Pirimidinas. Las purinas son A (Adenina) y G (Guanina). Las
pirimidinas son T (Timina) y C (Citosina). En el caso del ARN tambin son cuatro bases, dos
purinas y dos pirimidinas. Las purinas son A y G y las pirimidinas son C y U (Uracilo)
En el siguiente cuadro se muestran los nombres de las principales purinas y pirimidinas:



La forma degradativa final de las purinas en los primates es el cido rico, 2,6,8-trioxo purina y
las pirimidinas son degradadas completamente a agua, anhdrido carbnico y urea.
Un punto fundamental es que las bases nitrogenadas son complementarias entre s, es decir, la
adenina se enlaza con la timina, (A=T), mediante dos puentes de hidrgeno, mientras que la
citosina enlaza con la guanina, (G=C). mediante tres puentes de hidrgeno. Dado que en el ARN
no existe timina, la complementariedad se establece entre adenina y uracilo (A=U).
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La complementariedad de las bases es la clave de la estructura del ADN y tiene importantes
implicaciones, pues permite procesos como la replicacin del ADN y la traduccin del ARN en
protenas y es la base de las tcnicas de ADN recombinante etc


El azcar es un monosacrido de cinco carbonos, una pentosa. La pentosa puede ser D-Ribosa
(D-ribofuranosa), en cuyo caso hablamos de Ribonuclesidos en el ARN, o bien 2-D-
Desoxirribosa (D-desoxirribofuranosa), constituyendo los Desoxirribonuclesidos en el ADN)


Los Nuclesidos son unos compuestos formados por la unin de una base nitrogenada a una
pentosa. Esta unin se efecta a travs de un enlace glicosdico, con configuracin beta ()
entre el carbono uno de ribosa o desoxirribosa y un nitrgeno de las base, el 1 en las pirimidinas,
y el 9 en las purinas, con la prdida de una molcula de agua.
Los nucletidos son los steres fosfricos de los nuclesidos y estn formados por la unin de
un uno o ms cidos fosfricos al carbono 5 de una pentosa. A su vez la pentosa lleva unida al
carbono 1 una base nitrogenada.
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Los nucletidos se unen entre s mediante enlaces fosfodister entre el grupo fosfato de un
nucletido y el carbono 3 de la pentosa del siguiente nucletido. Un polmero de nucletidos (una
hebra de DNA) tiene siempre un extremo 5-fosfato y un extremo 3-hidroxilo.
En resumen: el ADN y ARN, que se diferencian por el azcar (Pentosa) que llevan: desoxirribosa
y ribosa, respectivamente. Adems se diferencian por las bases nitrogenadas que contienen,
Adenina, Guanina, Citosina y Timina, en el ADN; y Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo en el
ARN. Una ltima diferencia est en la estructura de las cadenas, en el ADN ser una cadena
doble y en el ARN es una cadena sencilla exceptuando algunos virus.
1.1 El ADN
El cido Desoxirribonucleico como hemos comentado es el material gentico de todos los
organismos celulares y casi todos los virus. Su secuencia de nucletidos contiene la informacin
necesaria para poder controlar el metabolismo un ser vivo.
Dentro de las clulas, el ADN se encuentra formando los cromosomas. El nmero de
cromosomas depende de la especie, as por ejemplo, las bacterias poseen un nico cromosoma,
mientras que las clulas humanas poseen 46 (23 de cada progenitor).En los organismos
eucariotas casi todo el ADN se encuentra dentro del ncleo y una mnima parte en otros
orgnulos, ej: mitocondrias. En los seres procariotas (ej: bacterias) el ADN se encuentra en el
citoplasma de la clula (carecen de membrana nuclear).
Desde el punto de vista estructural el ADN tiene estructura de doble hlice, la parte ms externa
la forman los grupos fosfato y hacia el interior se encuentran las bases nitrogenadas, emparejadas
de la forma que su tamao lo permite: A-T y C-G. Las dos cadenas del ADN que forman la hlice
se disponen de forma antiparalela con las bases nitrogenadas enfrentadas y unidas por puentes
de hidrgeno. En el ADN se distinguen varios niveles de organizacin: estructuras primaria,
secundaria, terciaria, cuaternaria y niveles de empaquetamiento superiores.
a) Estructura primaria: se refiere a la secuencia de bases que lo forman, que en realidad es el
cdigo con la informacin gentica.
b) Estructura secundaria: .se refiere a la doble cadena que forma la hlice, fue propuesta por
James Watson y Francis Crick en 1953 ambas cadenas son complementarias y antiparalelas,
una orientada en sentido 5- 3 y la otra de 3- 5, la adenina se une a la timina de la cadena
complementaria y la guanina a la citosina.
c) Estructura terciaria: se refiere a como se almacena el ADN en un espacio reducido, para ello,
es necesaria la presencia de unas protenas bsicas denominadas histonas o las protaminas
en los espermatozoides. La unin del ADN con Histonas genera la estructura denominada
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nucleosoma. El conjunto de la estructura se denomina fibra de cromatina de 100 A. Tiene un
aspecto repetitivo en forma de collar de perlas
d) Estructura cuaternaria: La fibra de cromatina de 100 A se empaqueta formando una fibra de
cromatina de 300 A. El enrollamiento que sufre el conjunto de nucleosomas recibe el nombre
de solenoide. Los solenoides se enrollan formando la cromatina del ncleo interfsico de
la clula eucariota. Cuando la clula entra en divisin, el ADN se compacta ms, formando los
cromosomas.



Las secuencias de ADN que constituyen la unidad fundamental de la herencia se denominan
genes. Una parte del gen se transcribe a ARN y otra parte se encarga de definir cundo y dnde
debe expresarse.
Un gen est compuesto, por una secuencia lineal de nucletidos en el ADN, dicha secuencia
determina el orden de los aminocidos en las protenas, es decir, un gen es una secuencia de
nucletidos que codifica para una protena determinada o RNA. Pero en eucariotas, es frecuente
que un gen est constituido por varios fragmentos de DNA separados por secuencias sin sentido
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que no codifican ninguna protena. A las partes con sentido que sirven para fabricar la protena se
les llama exones, y a las partes sin sentido intercaladas en el gen intrones que deben ser
eliminados tras la transcripcin, quedando unidos los exones para formar el ARNm maduro.
Aunque puede parecer que los intrones no sirven para nada ya que son desechados en este
proceso, esto no es cierto ya que en muchas ocasiones contienen importantes seales
reguladoras del gen. Por otra parte, su existencia permite que los genes sean modulares y se
puedan combinar los exones de diversas maneras produciendo protenas diferentes con un mismo
gen. Por ltimo, esta modularidad ha sido un factor muy importante en la evolucin de los genes.
Un gen por tanto es una secuencia genmica (unidad de transcripcin) que codifica un
producto funcional: protena o RNA.
Los genes a su vez est compuestos por exones e intrones y una regin reguladora

1.2 El ARN
Se conocen tres tipos principales de ARN y todos ellos participan de una u otra manera en la
sntesis de las protenas. Ellos son: El ARN mensajero (ARNm), el ARN ribosomal (ARNr) y el
ARN de transferencia (ARNt).
ARN mensajero (ARNm): Consiste en una molcula lineal de nucletidos monocatenaria, cuya
secuencia de bases es complementaria a una porcin de la secuencia de bases del ADN.
ARN ribosomal (ARNr): Este tipo de ARN una vez trascrito, pasa al nucleolo donde se une a
protenas. De esta manera se forman las subunidades de los ribosomas.
ARN de transferencia (ARNt): Este es el ms pequeo de todos, tiene aproximadamente 75
nucletidos en su cadena, adems se pliega adquiriendo lo que se conoce con forma de hoja de
trbol plegada. El ARNt se encarga de transportar los aminocidos libres del citoplasma al lugar
de sntesis proteica.
2 LA REPLICACIN DEL ADN
El ADN posee la informacin necesaria para transmitir los caracteres de una especie de
generacin en generacin y conseguir la supervivencia de la especie, para ello, la informacin
gentica debe reproducirse exactamente cada vez que la clula se divide.
Cada especie tiene una cantidad de ADN caracterstica, que en el ncleo de las clulas
eucariticas se encuentra formando los cromosomas, la mayor parte de clulas somticas de un
organismo es diploide (2n) pues llevan los cromosomas homlogos heredados del padre y de la
madre. Mientras que los vulos y los espermatozoides son haploides (n)
Las clulas, en el curso de su vida pueden dividirse para producir clulas hijas (la frecuencia
depende de los distintos tejidos), por lo tanto, las clulas pasan por un periodo de interfase (no
divisin) y otro de divisin (mitosis en clulas somticas o meiosis en clulas germinales) para
dar lugar a las clulas hijas. Durante un periodo especial de la interfase se produce la duplicacin
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del material gentico y la transcripcin de la informacin gentica, en este periodo l ADN estn
desenrollados, durante la mitosis es cuando adquieren la morfologa tpica de cromosoma.
La replicacin o duplicacin del ADN es el proceso por el que las molculas de ADN se copian a s
mismas en el ncleo de las clulas siendo semiconservativa, esto quiere decir que al
separarse las dos hebras cada una de las originales sirve de molde para la sntesis de una nueva,
por lo tanto de las dos nuevas molculas cada una conserva una cadena del ADN original y la otra
cadena es de nueva. La sntesis se realiza siempre en la direccin 5 __ 3 y las dos hebras
antiparalelas son replicadas simultneamente en ambas direcciones
2.1 PROCESO DE REPLICACIN DEL ADN
La enzima que lleva a cabo la replicacin del ADN es la ADN polimerasa, esta enzima tiene unos
requerimientos especficos para trabajar, que le imponen restricciones:
1) Slo aade nucletidos en la direccin 5___3.
2) Necesita para poder empezar a copiar y unir nucletidos un molde de ADN.
3) Necesita un trozo de ARN al cual unir los nucletidos, ya que ella no puede empezar a
unir los nucletidos libres necesita una pequea cadena ya formada.
4) Utiliza nucletidos trifosfato.
Veamos ahora como se realiza el proceso de replicacin en procariotas:
El inicio de la replicacin, tanto en procariotas como en eucariotas, se produce cuando la doble
hlice de ADN es desenrollada y abierta en una secuencia especfica de nucletidos denominada
origen de replicacin. En los procariotas existe un nico origen de replicacin, comienza siempre
en un punto determinado del cromosoma circular denominado origen (ORI) cuya longitud es de
aproximadamente 300 pares de bases; en los eucariotas, en cambio, hay mltiples orgenes de
replicacin (multifocal). Esto permite completar la replicacin de los cromosomas en un tiempo
razonable
Donde se comienzan a separar las cadenas progenitoras, la molcula de ADN se forma una
estructura en forma de Y, denominada horquilla de replicacin. La replicacin es bidireccional,
por lo tanto existen dos horquillas de replicacin que se mueven en direcciones opuestas desde el
origen de replicacin
Como las cadenas de ADN estn unidas por puentes de hidrgeno, estos se deben romper para
facilitar la separacin de las cadenas para ser copiadas, esta separacin la lleva a cabo la enzima
helicasa que abre la hlice.
El desenrollamiento de la doble hlice da lugar a superenrollamientos en el resto de la molcula,
capaces de detener el proceso, se necesita la presencia de las enzimas topoisomerasas que
eliminen las tensiones en la fibra.
A continuacin, para evitar que las dos hebras vuelvan a reunirse y formar los puentes de
hidrgeno se colocan unas protenas llamadas SSB (Single-Strand DNA Binding proteins),
protenas de unin DNA de una sola cadena, que mantiene la doble hlice abierta estabilizando
a las cadenas sencillas
El proceso es bidireccional, es decir, hay una helicasa trabajando en un sentido y otra trabajando
en sentido opuesto. Se forman pues las llamadas burbujas de replicacin
Como ninguna ADN-polimerasa puede actuar sin cebador, interviene primero una RNA
polimerasa denominada RNA-primasa que, sintetiza un corto fragmento de ARN de unos 5-10
nucletidos denominado RNA cebador o primer que acta como cebador. Esta protena se une a
la helicasa y forman un complejo multiproteico denominado replisoma.
Despus interviene la DNA polimerasa III, que a partir de este cebador (extremo 3-OH) comienza
a sintetizar en direccin 5__3 una hebra de ADN partir de nucletidos trifosfato. La energa
necesaria para el proceso es aportada por los propios nucletidos que pierden dos de sus
fsforos. Esta nueva hebra se sintetiza en el sentido que se abre la horquilla de replicacin, es de
crecimiento continuo y se denomina hebra conductora.
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Sobre la otra hebra complementaria se sintetiza en direccin contraria y se denomina hebra
discontinua o rezagada. Aqu la DNA polimerasa III sintetiza desde la horquilla hacia fuera. La
RNA primasa sintetiza pequeos fragmentos de RNA y a partir de ellos la ADN polimerasa III
sintetiza unos 1.000-2000 nucletidos de ADN, (en procariotas) se detiene y vuelve empezar,
formndose los denominados fragmento de Okazaki. Este proceso se va repitiendo a medida
que se van separando las dos hebras patrn.
A continuacin interviene la DNA polimerasa I, que, primero, gracias a su funcin exonucleasa,
retira los segmentos de ARN, y que luego, gracias a su funcin polimerasa, rellena los huecos con
nuceltidos de ADN.
Finalmente la ADN ligasa unir los dos extremos, tanto en la cadena continua como los sucesivos
fragmentos de Okazaki que se van formando en la cadena discontinua.




Video: http://www.mhhe.com/sem/Spanish_Animations/sp_dna_replication.swf
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3 TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE Y BIOLOGA MOLECULAR
3.1 CONCEPTOS BSICOS
La tecnologa de DNA recombinante es un conjunto de mtodos empleados para localizar, aislar,
alterar, estudiar y recombinar secuencias de DNA.
Cules son las aplicaciones de la tecnologa de DNA recombinante?:
1) La investigacin de la estructura y la funcin de los genes a nivel molecular
2) La creacin de nuevos productos comerciales (biotecnologa)
3) El diagnstico y el tratamiento de enfermedades
Cules son las principales tcnicas de DNA recombinante?:
1) Tcnicas de corte del DNA en localizaciones especficas (enzimas de restriccin)
2) Mtodos para localizar secuencias de DNA (hibridacin de cidos nucleicos)
3) La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
4) Mtodos para obtener numerosas copias de un fragmento de DNA especfico (clonacin
gnica)
5) Procedimientos para introducir secuencias de DNA en clulas receptoras
6) Tcnicas para inducir mutaciones en secuencias de DNA especficas
7) Mtodos de expresin de DNA recombinante
3.2 ENZIMAS DE RESTRICCIN
La ingeniera gentica se desarroll gracias al descubrimiento de las enzimas de restriccin (o
endonucleasas de restriccin) que son enzimas capaces de reconocer y cortar secuencias
especficas de DNA de doble cadena.
Las enzimas de restriccin son endonucleasas que reconocen una secuencia entre 4-8 pb en el
ADN. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restriccin, y la enzima rompe un enlace
fosfodister en la hebra de arriba y otro enlace fosfodister en la hebra complementaria
Estas enzimas las producen de forma natural las bacterias y las utilizan como defensa contra los
virus cortando su DNA. El DNA propio se protege frente a la digestin mediante metilacin de las
dianas de corte. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo
afectan el DNA extrao y no el DNA bacteriano.
Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est
dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima.
La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una
cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado
de esa cepa. Ej: La enzima HindIII se descubri en Hemophilus influenzae, EcoRI proviene de
Escherichia coli;
Eco RI _ E = gnero Escherichia
Co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Las secuencias reconocidas por las enzimas de restriccin son normalmente secuencias
palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Hay tres tipos de enzimas de restriccin:
Las enzimas de Tipo I y III: cortan las dos cadenas del DNA en una posicin aleatoria a cierta
distancia del sitio de restriccin. No se utilizan normalmente ya que el sitio de corte no es preciso.
Las enzimas de Tipo II: reconocen una secuencia especfica y cortan las dos cadenas de la
molcula de DNA con absoluta precisin dentro de la secuencia reconocida. Las secuencias
reconocidas por las enzimas de Tipo II son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia
de una de las cadenas leda en direccin 5'__3' es la misma que la secuencia de la cadena
complementaria leda tambin en direccin 5'___3'.
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Las enzimas de restriccin al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:
1. Cohesivos o pegajosos: Cortes escalonados, dejando productos con extremos
complementarios (cohesivos). Ej: Eco RI

2. Romos: Cortes simtricos, dejando productos con extremos ciegos o romos

Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos, en ingeniera gentica se prefieren aquellos con
extremos cohesivos, puesto que permiten la unin espontnea. Si las molculas a utilizar
presentan extremos romos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo, utilizando la
enzima desoxinucleotidil transferasa terminalse para crear extremos de cadena sencilla
mediante la adicin de colas de nucletidos. Si a uno de los DNA se le aade, por ejemplo, una
cola de polidA, y al otro DNA se le aade una cola de poli-dT, se forman colas complementarias, y
los fragmentos pueden unirse mediante puentes de hidrgeno.
3.3 OTRAS ENZIMAS IMPORTANTES EN INGENIERA GENTICA
1. Nucleasas: endonucleasas y exonucleasas
2. Ligasas
3. DNA polimerasas
3.4 DIGESTIN Y LIGACIN DE DNA
Un fragmento de DNA puede cortarse con una enzima de restriccin y despus unirse a otro
fragmento con extremos complementarios empleando la DNA ligasa. Solo pueden unirse
fragmentos que tengan extremos complementarios cohesivos (o extremos romos). Si estos
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fragmentos se ponen juntos, bajo determinadas condiciones, los fragmentos de DNA de distinto
origen pueden formar molculas recombinantes estableciendo puentes de hidrgeno entre los
extremos cohesivos. Luego se utiliza la enzima DNA ligasa para unir covalentemente los
esqueletos azcar-fosfato de los dos fragmentos, producindose as una molcula de DNA
recombinante


Ej: Para formar molculas de DNA recombinante, se corta DNA de distintas fuentes con EcoRI y
se mezcla para que se unan formando molculas recombinantes. Despus se utiliza la enzima
DNA ligasa para unirlos covalentemente en molculas de DNA recombinante.
Basndonos en esta tecnologa de las enzimas de restriccin tambin se puede detectar por
ejemplo mutaciones puntuales, hacer clonacin de un fragmento DNA recombinante etc
3.5 ELECTROFORESIS EN GEL:
La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar macromolculas (DNA,
colorantes, Protenas,..) en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas. El
trmino electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas bajo la influencia de un
campo elctrico. Electro se refiere a la electricidad y foresis, del griego phoros, significa
trasladar. As pues, la electroforesis en gel es una tcnica de separacin consistente en aplicar
corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la
electroforesis es la tensin elctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las
propiedades de una molcula determinan la velocidad con que un campo elctrico puede
desplazarla a travs de un medio gelatinoso
Electroforesis de DNA
Es un mtodo de separacin frecuentemente utilizado para analizar fragmentos de ADN en un
rango de 500-30.000 pares de bases generados por enzimas de restriccin, PCR, etc.
Existen varios tipos de electroforesis en gel de agarosa pero la electroforesis horizontal es el ms
utilizado para separar molculas de ADN en agarosa. Otros tipos como la electroforesis vertical se
utiliza para separar protenas y utiliza geles de poliacrilamida.
Primero el ADN extrado de la muestra se trata con una endonucleasa de restriccin genera
diferentes fragmentos. Tras la digestin del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan
segn su tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las
molculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las
molculas de ADN, su velocidad de migracin se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las
molculas menores se mueven ms deprisa a travs de los poros del gel que las de mayor
tamao. Los fragmentos de DNA migrarn a una razn inversamente proporcional al logaritmo de
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su tamao o peso molecular. El movimiento de los fragmentos de DNA va a producir un patrn de
bandas, donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamao particular. El tamao de
cada fragmento puede ser determinado utilizando un marcador o una escalera de DNA cuyos
fragmentos tienen pesos moleculares conocidos. Este marcador sirve de control y migrar paralelo
a las bandas de DNA que deseamos analizar.
En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, (ojo con su manipulacin, es
es mutagnico y teratgeno) sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente
cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara
de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los
marcadores de peso molecular.

3.6 LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS
Se trata de un proceso de unin de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN
para formar una molcula de cido nucleico basndose en la propiedad del ADN para formar una
doble hebra por complementariedad de bases bajo determinadas condiciones de pH, temperatura,
etc.
Es un mtodo muy verstil que permite estudiar el grado de relacin gentica entre dos cidos
nucleicos, adems de la deteccin de una molcula diana partiendo de una sonda complementaria
a ella.
Por lo general en las tcnicas de hibridacin se parte de dos poblaciones de cidos nucleicos: un
conjunto homogneo de cidos nucleicos de secuencia de bases conocida que acta como sonda
y otro conjunto heterogneo de cidos nucleicos de secuencia de bases desconocida donde
queremos detectar la secuencia diana (fragmento de ADN de bases complementarias a la sonda).
Una de las secuencias debe estar marcada (istopo radiactivo, fluorocromo, enzima), si lo est la
sonda, la hibridacin es estndar y si lo est la diana, la hibridacin es reversa. La hibridacin
puede producirse en medio lquido o sobre soporte slido, como las membranas de nitrocelulosa
donde se fijan una de las poblaciones de ADN, en la hibridacin estndar se fija el ADN diana.
TCNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACIN:
A). SOUTHERN BLOT
El mtodo tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para la deteccin de
genes especficos en el ADN celular.
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El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los fragmentos son separados por tamaos
mediante una electroforesis en un gel. Se realiza una tincin con bromuro de etidio para
comprobar la calidad de la electroforesis y del ADN.
A continuacin los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un
cido dbil y desnaturalizados con NaOH (desnaturalizacin alcalina) para permitir la
transferencia.
Posteriormente, el ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda
representada una rplica de la disposicin de los fragmentos de ADN presentes en el gel. El filtro
se incuba durante un tiempo con la sonda de oligonucletidos marcada (radiactivamente o con un
fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va hibridando a la temperatura apropiada a los
fragentos de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). Mediante
un lavado posterior se separan los oligonucletidos restantes no hidridados.
Finalmente la sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de
una forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos X (autorradiografa) para el
caso de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz UV, para el caso de sondas con
fluorocromo.

B. NORTHERN BLOT
Es esencialmente idntica al mtodo de Southern blot, salvo que las molculas de cido nucleico
de la muestra, en este caso de RNAm (total, vrico, etc.), se separan por electroforesis en
condiciones desnaturalizantes en presencia de formaldehdo, que forma parte de la composicin
del gel. Esto es debido a que, a pesar de ser una molcula de una sola cadena, se forman
complejas estructuras secundarias que dificultan la migracin.
Al igual que en el Southern blot, el ARN se transfiere a la membrana de nitrocelulosa o de nailon y
se hibridan con sondas de ADN marcada, de modo que en condiciones renaturalizantes se origina
un hbrido de RNA-DNA que se puede detectar por autorradiograca con sondas marcadas con
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P, o mediante enzimas con sustratos quimioluminiscentes, como por ejemplo, la luciferasa.
Con este proceso se puede analizar, patrones de expresin gnica de una clula en diferentes
estadios de diferenciacin etc.
Tanto la tcnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en da al haber sido
sustituida por tcnicas derivadas de la PCR.
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C) HIBRIDACIN IN SITU
Es una tcnica de hibridacin que se realiza directamente sobre tejido, clulas o cromosomas
localizados sobre un soporte slido, habitualmente un portaobjetos. La visualizacin puede
realizarse por medios isotpicos, enzimticos o con fluorescencia, siendo evaluada en un
microscopio. Su gran virtud es que permite identificar las clulas donde se produce la hibridacin
que detecta la alteracin genmica, cromosomica o transcripcional (o de expresin gnica).
Como hemos comentado, la visualizacin de resultados puede realizarse por marcaje con
fluorescencia de la sonda y hablamos de hibridacin in situ acoplada a fluorescencia (FISH) o
cromognico (CISH, SISH).
En CISH, las sondas se marcan con un resto antignico y son detectados por medio de
anticuerpos conjugados con una enzima, normalmente peroxidasa de rbano o fosfatasa alcalina
(AP), que cataliza reacciones de sustratos cromognicos. Los cromgenos resultantes precipitan
en el lugar de destino de la sonda y se pueden detectar con un microscopio de campo claro.
Adems tienen la ventaja de que permite la visualizacin de contexto tejido, incluyendo ncleo y
forma de la clula, junto con la seal de la sonda en la misma imagen.
En l FISH la muestra de DNA diana (cromosomas metafsicos o ncleos en interfase) se
desnaturaliza (separacin de las hebras complementarias). Seguidamente se aade la sonda
marcada con un colorante fluorescente (sondas para Chromosomal painting), que se aparear
con el ADN diana (Hibridacin), y se vuelve a formar la doble hlice.
La seal emitida por la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y as la
muestra de ADN se puede clasificar segn la presencia o ausencia de la seal.
FISH de metafase: se utiliza sobre todo para detectar microdeleciones (prdida de un trozo de
ADN-genes defectuosos) especficas en los cromosomas. Por esta tcnica se pueden diagnosticar
numerosos sndromes de origen gentico.
FISH de interfase se utiliza para determinar el nmero de copias de uno o varios cromosomas
(Ejemplo ensayo de aneuploida: se realiza sobre clulas del fluido amnitico cuando hay una
fuerte indicacin clnica de alguna trisoma) y tambin para detectar algunas reorganizaciones
especficas que son caractersticas de ciertos tipos de cncer.
Ejemplos de FISH de interfase
Esta otra prueba de aneuploida muestra un feto femenino con trisoma 21. El ncleo de la
izquierda se ha hibridado con sondas diseadas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y
tiene claramente tres seales rojas. El ncleo de la derecha se ha hibridado con sondas
diseadas para los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que muestra dos
seales verdes y ninguna roja, es femenino.
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Con la hidridacin en situ tambin se pueden analizar la distribucin de las molculas de RNA
generalmente mensajero en una clula, un tejido o un organismo. Para ello se preparan delgados
cortes de tejido, se figan con cuidado en un portaobjetos y se hibridan con sondas de DNA
especfico.
D) MICROARRAYS DE ADN
La base de la tecnologa de microarrays o chips de ADN es la automatizacin de las tcnicas
clsicas de biologa molecular Southern y Northern blotting, siendo el fundamento de la tcnica la
hibridacin de cidos nucleicos.
La principal ventaja con respecto a las tcnicas clsicas es la posibilidad de inmovilizar en la
superficie del microarray miles de sondas de ADN, permitiendo el anlisis de la
presencia/ausencia o de la expresin de miles de genes de una muestra, incluso de genomas
completos, en un solo experimento.
Un microarray de ADN se define como una serie de sondas de ADN unidas a una superficie
slida (vidrio normalmente) con una disposicin regular y prefijada de manera que forman una
matriz de secuencias en dos dimensiones.
Los hay de tres tipos principales: aquellos que utilizan como sondas fragmentos de cDNA
(DNA complementario sintetizado a partir de RNA mensajero extrado de una clula a partir de un
cultivo de un tejido o de una muestra clnica), los que usan fragmentos ms pequeos de ADN
(oligonucletidos), o bien productos de PCR.
Los cidos nucleicos de la muestra problema se marca con un marcador fluorescente o enzimtico
y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridacin de secuencias homlogas.
Durante la hibridacin, la muestra de material gentico marcada, se unirn a sus complementarias
inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la identificacin y cuantificacin del DNA
presente en la muestra, en funcin de la intensidad de fluorescencia de cada punto, la cual se lee
por ejemplo con un lector de luminosidad.
En el caso de los cDNA el resultado es una fotografa del estado de expresin del ARN de los
genes de la muestra (tumoral o normal). Se trata por tanto de un mtodo de screening masivo
para detectar aquellos genes que se sobre o infraexpresan en una muestra.
Utilidad
Deteccin de genes activados o reprimidos en el metabolismo celular, ante diferentes
situaciones patolgicas o fisiolgicas.
Deteccin de marcadores tumorales tiles para el diagnstico, pronstico, prediccin de
respuesta teraputica de las neoplasia y clasificacin de las neoplasia
Deteccin de dianas teraputicas
Identificacin de microorganismos etc
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E) CGH (HIBRIDACIN GENMICA COMPARADA):
La hibridacin genmica comparada es una tcnica citogentica para detectar regiones
cromosmicas que estn amplificadas o delecionadas en una muestra, especialmente en
tumores.
En la CGH, dos muestras de DNA genmico (una tumoral y una normal) se marcan con diferentes
fluorocromos y se hibridan simultneamente sobre una extensin de cromosomas
metafsicos. La relacin de intensidad entre las dos seales fluorescentes proporciona una
medida de la relacin entre el nmero de copias de las dos muestras de DNA genmico.
Una tcnica derivada de la anterior es la CGH-array, chip de CGH en la que los DNAs marcados
se hibridan sobre una matriz de fragmentos de DNA bien definidos, inmovilizados sobre un
soporte slido.
Ventajas del CGH array
Diagnstico de fenotipos atpicos y difciles
Deteccin de translocaciones desequilibradas, deleciones y duplicaciones.
Deteccin de anomalas cromosmicas en mosaico no detectables por otras tcnicas.
Tasa de diagnstico del 8% tras cariotipo normal previo.
Rapidez de resultado: 5-7 das.
Deteccin de alteraciones no detectables por cariotipo.
Aplicable en caso de mltiples sndromes de microdelecin y microduplicacin,
malformaciones congnitas, dismorfologa, retraso mental, retraso del desarrollo
Esquema de la tcnica de CGH y CGH-array.

16

3.7 MTODOS DE AMPLIFICACIN DE LA DIANA.
Son mtodos in vitro que amplifican enzimticamente una molcula diana hasta niveles a los
cuales pueden ser fcilmente detectados.
A) PCR - REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
En 1983 Kary Mullis ide una nueva tcnica para amplificar DNA en un tubo de ensayo. Se
denomin Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) (siglas de su nombre en ingls
Polymerase Chain Reaction) y fue una autntica revolucin para la ingeniera gentica. El Dr.
Mullis recibi en 1993 el Premio Nobel de Qumica por este Descubrimiento.
La PCR permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA. El requisito
fundamental es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los
extremos del fragmento a amplificar. Estos fragmentos servirn como cebadores para que una
enzima polimerasa sea capaz de incorporar nucletidos complementarios a la cadena molde. Una
vez completada la reaccin la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante
tcnicas sencillas de separacin de fragmentos de DNA.
La base de la PCR es la replicacin catalizada por una DNA polimerasa con cuatro elementos
esenciales:
1) Un molde de DNA monocatenario: es el DNA a partir del cual queremos obtener una copia
de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar.
2) Una DNA polimerasa: es una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA
molde. Esta reaccin se lleva a cabo en un tampn apropiado para el funcionamiento de la
enzima polimerasa. Adems, como cofactores de la polimerasa se aaden cationes
divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl
2
).Se suele utilizar la Taq-
polimerasa, que es una polimerasa termorresistente obtenida de la bacteria Thermus
aquaticus.
3) Un cebador (primer) con un grupo 3-OH libre: Las enzimas DNA polimerasas nicamente
son capaces de aadir nucletidos al extremo 3-OH libre de una doble cadena de DNA. Son
necesarios por tanto molculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena sencilla.
4) Dideoxinucletidos (dNTPs): las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena
complementaria a la cadena molde mediante la incorporacin de nucletidos al extremo 3
libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucletidos se aaden en forma de
desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs).
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: Partiendo de
un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucletidos complementarios a partir de la zona
de doble cadena originada por la unin de los cebadores al molde. Ahora bien, cmo tiene lugar
esta reaccin?. El proceso se lleva a cabo en tres fases: desnaturalizacin, hibridacin y
elongacin.
Desnaturalizacin del DNA molde a (94C): En ella, el DNA diana se incuba a elevada
temperatura ( 94C) de tal manera que las hebras se separan quedando accesibles a la
hibridacin de los primers.
Anillamiento de los primers al DNAss molde: En ella, la mezcla de reaccin se enfra ( 55
65C) para permitir que los primers hibriden con la secuencia complementaria.
Extensin de la nueva cadena de DNA (68-72C): Se suele realizar a 72C y en ella los
primers se extienden mediante una DNA polimerasa, utilizando el DNA diana como molde,
realizndose entre 30 y 50 ciclos en cada reaccin
Estos tres pasos, desnaturalizacin-emparejamiento-extensin, constituye un ciclo de PCR.
Este proceso se repite durante 20-40 ciclos amplificando la secuencia objeto exponencialmente.
La PCR se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento que es programado para un rpido
calentamiento, enfriamiento y mantenimiento de las muestras durante varias veces. El producto
amplificado es luego detectado por separacin de la mezcla de reaccin mediante
electroforesis en gel de agarosa
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Algunas limitaciones de la PCR son:
Requiere el conocimiento previo de parte de la secuencia que se quiere amplificar para poder
disear los primers
El DNA contaminado puede ser un problema
El tamao de los productos de PCR no puede ser mayor de 10-20Kb
Un alto contenido G+C del DNA puede inhibir la reaccin.

B) MULTIPLEX PCR.
En esta modificacin de la PCR se incluyen dentro de la misma reaccin de amplificacin
mltiples pares de primers especficos para diferentes dianas, por lo que se produce una
amplificacin de diferentes dianas; esta modificacin tiene las siguientes ventajas:
Se pueden testar grandes regiones de la secuencia del DNA en busca de alteraciones o
modificaciones.
Se pueden testar segmentos no relacionados del genoma diana.
Se pueden incluir controles internos de amplificacin de la muestra.
Se puede testar una misma muestra contra diferentes patgenos.

C) Nested PCR
Para aumentar an ms la sensibilidad de la PCR puede realizarse una PCR anidada (Nested
PCR), consistente en la amplificacin de un segmento de DNA por PCR, seguida de la
amplificacin, mediante otros cebadores, de un fragmento interno del primer segmento
amplificado. El desarrollo de esta PCR comporta efectuar una primera PCR en un tubo pasar el
producto de la iamplificacin a otro tubo al que se incorporan los nuevos cebadores para el
fragmento interno que desea amplificarse. La Nested PCR presenta algunas ventajas, como:
1) Mayor sensibilidad
2) Puede ser utilizado para mejorar la especificidad para primera PCR que se confirma con la
segunda.
Sin embargo, el gran nmero de ciclos de amplificacin utilizados en la PCR anidada (a veces
ms de 60) puede aumentar notablemente la probabilidad de resultados falsos positivos
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D) LA RT-PCR
Reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR del ingls Reverse
transcription polymerase chain reaction) es una variante de PCR.
El la tcnica de PCR, si usamos como sustrato ADN genmico, entonces tpicamente hablamos
de una PCR, pero si usamos ADN complementario (cDNA) proveniente del ARNm se le conoce
como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR). Esta conversin se logra mediante una reaccin
conocida como transcripcin inversa y controlada por la enzima transcriptasa inversa, capaz
de convertir el ARNm en una molcula de cDNA dando lugar a un hibrido de RNA-cDNA, el RNA
se degrada por una RNAasa y el cDNA se amplifica en por PCR tradicional. Este mtodo fue
copiado de los retrovirus que usan una transcriptasa inversa para convertir su genoma de ARN en
ADN duplicarse en millones de partculas virales.
El cDNA se utiliza cuando analizamos la expresin del ARNm de algn gen de inters. Se trata
por tanto de un mtodo muy sensible que muestra s un gen especfico se expresa en una
muestra dada.
Una de las caractersticas ms importantes es que en el proceso de RT-PCR, el cDNA generado
ya no lleva los intrones que s tendra el ADN original. De este modo, al expresar el cDNA
producto de la RT-PCR, se generar un ARNm formado exclusivamente por exones. Esto ha
permitido darle a esta tcnica uno de sus usos ms importantes: insertar genes eucariotas en
organismos procariotas por tecnologas del ADN recombinante.
La RT-PCR es una prueba importante utilizada para el Diagnstico Molecular, por ejemplo para
estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (tales como el VIH) o el virus de l a gripe
(virus de la influenza), para investigacin cientfica y tambin para comprobar si cualquier gen
especfico se expresa o no en OGM (Organismos Genticamente Modificados
E) PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL
La sensibilidad de la tcnica de PCR es alta pero presenta algunos inconvenientes, como son que
no es una tcnica cuantitativa y una relativamente alta probabilidad de obtener falsos positivos
por contaminacin. Para solventar este ltimo problema se debe optimizar la secuencia de los
cebadores, as como la temperatura precisa para que estos se unan al ADN en la localizacin
correcta y realizar una adecuada manipulacin de los reactivos.
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Por otra parte para solventar el problema de la cuantificacin se han generado unas variaciones
sobre el esquema inicial de la PCR, dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa o
PCR en tiempo real. La nomenclatura que se usa tambin es diferente, si utilizamos ADN
genmico entonces hablamos de una qPCR (quantitative PCR), si por lo contrario, primero
obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR, nos referimos a una RT-qPCR.
La PCR en Tiempo Real es, bsicamente, una PCR convencional en la que los equipos de
amplificacin (termocicladores) llevan incorporados un sistema de deteccin de fluorescencia
(fluormetro), basndose la tecnologa en la utilizacin de unas molculas especficas
denominadas fluorforos y quenchers. Ambos factores, nos va a permitir monitorizar, en tiempo
real, lo que est ocurriendo dentro de cada ciclo de amplificacin y va a sustituir a los pasos de
amplificacin, electroforesis y anlisis de imagen de una PCR tradicional.
La clave en la PCR cuantitativa est en la posibilidad de detectar en tiempo real la amplificacin
de un segmento de DNA de inters conforme transcurre la reaccin y poder cuantificar la cantidad
de ADN en la muestra. Para llevar a cabo esta deteccin existen varios mtodos:
1 No especficos se vasa en la deteccin de molculas intercalantes como el colorante SYBR
Green I, (que se excita a 497nm y emite a 520nm) que tienen afinidad por el ADN de doble
cadena y que al ser oxidados generan una seal fluorescente. La fluorescencia emitida es
capturada en la etapa de extensin de cada ciclo y es proporcional al nmero de copias de
ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR.

2 Mtodos de deteccin especficos se utiliza una sonda especifica que lleva adherida una
molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma
que slo cuando la sonda es desplazada de su sitio por accin exonucleasa de la ADN
polimerasa, que escinde uno de los nucletidos de la sonda a medida que sintetiza la nueva
cadena, la molcula fluorescente se libera de la accin del "quencher" y emite fluorescencia al
ser iluminada con un lser. La cuantificacin de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de
la PCR ser proporcional a la cantidad de ADN que se est amplificando. Un ejemplo de estos
sistemas son las sondas comerciales conocidas como TaqMan aunque existen otras en el
mercado (molecular beacons etc)

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El parmetro fundamental en una PCR en Tiempo Real y en funcin del cual se van a realizar
todos los clculos analticos y obtencin de resultados, es el denominado Ciclo Umbral
(Threshold Cycle o Ct), que se define como el ciclo a partir del cual la fluorescencia es
estadsticamente significativa por encima del ruido de fondo (background).

ALGUNOS EJEMPLOS DE APLICACIONES:
Aplicacin diagnosticas para deteccin de Anemia falciforme
La anemia drepanoctica (anemia de clulas falciformes) se origina por la mutacin puntual de un
solo nucletido por cambio de A por T en el gen de beta globina humana localizado en el brazo
corto del cromosoma 11. Esto genera en la poblacin un polimorfismo, definido por la presencia
del alelo normal o el mutado, en cada uno de los dos cromosomas 11 homlogos.
El posible diagnstico gentico de esta enfermedad se puede realizar a travs de un polimorfismo
RFLP (polimorfismo de longitud en los fragmentos de restriccin). As las personas afectadas
puede presentar la falta de un lugar de corte para la enzima de de restriccin Mst II, por tanto, en
el digerido de restriccin del DNA de portadores del gen de la anemia falciforme, Mst II generara
un fragmento mayor que el DNA de las personas sanas. Posteriormente, con una sonda del gen
de la beta globina se pueden detectar si en individuo lleva la mutacin en un alelo (portador
heterocigoto) o en ambos alelos (portador homocigoto) o en ninguno de los dos. Los RFLP se
heredan segn las reglas de Mendel.

Aplicaciones en Terapia gnica.
Los mtodos de aislamiento y clonacin de genes especficos desarrollados originalmente como
una herramienta de investigacin se estn utilizando actualmente para tratar enfermedades
genticas mediante transferencia de alelos normales humanos mediante terapia gnica.
La terapia gnica lleva este proceso un paso ms adelante, y persigue modificar el genoma de las
clulas somticas transfiriendo copias normales de genes para que produzcan cantidades
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adecuadas del producto gnico normal, cuya accin corregira la enfermedad gentica. La
expedicin de estos genes estructurales y de sus secuencias reguladoras se consigue utilizando
vectores o sistemas de transferencia de genes. El vector se mezcla con una suspensin de
clulas diana, y entra en la clula por medio de un receptor de la superficie celular. Una vez en el
citoplasma, el genoma vrico que transporta el gen humano clonado se integra en uno de los
cromosomas de la clula diana.

Terapia gnica para el tratamiento de la inmunodeficiencia combinada grave (SCID), una enfermedad mortal del sistema
inmunitario causada por la falta de la enzima adenosina desaminasa (ADA). El gen ADA donado humano se transfiere a
un vector vrico, que se utiliza para infectar glbulos blancos extrados del paciente. El gen ADA transferido se incorpora
en un cromosoma, donde es activo. Despus de hacer crecer estas clulas para incrementar su nmero, stas se
reimplantan en el paciente, en el que producen ADA, lo que permite el desarrollo del sistema inmunitario.
Ejemplo de Clonacin

Resumen de los pasos seguidos en la clonacin de un vector plasmdico. Los vectores plasmdicos se
aslan y se cortan con una enzima de restriccin. El DNA a clonar se corta con la misma enzima de
restriccin, produciendo una coleccin de fragmentos. Estos fragmentos se reparten entre los vectores y se
transfieren a huspedes bacterianos para su replicacin. Las clulas bacterianas que contienen plsmidos
pueden identificarse por crecimiento en un medio selectivo, y pueden aislarse. El DNA clonado puede
recuperarse del husped bacteriano para nuevos anlisis.
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Ejemplo de Huella gentica por anlisis de VNTR