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NDICE

INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA ..................................................................................................... 7
Notas histricas .................................................................................................................................. 8
El estudio de la Enzimologa ............................................................................................................. 11
Bibliografa general ........................................................................................................................... 12
CAPTULO 1: Las reacciones qumicas: criterios de espontaneidad y cintica ................................... 14
1.1 En qu circunstancias tiene lugar espontneamente una reaccin? ....................................... 15
1.2 La velocidad de las reacciones qumicas .................................................................................... 19
CAPITULO 2: Catlisis enzimtica: trminos, conceptos y caractersticas generales......................... 32
2.1 Conceptos y trminos ................................................................................................................ 33
2.2 Naturaleza qumica de las enzimas ........................................................................................... 39
2.3 La especificidad de las enzimas ................................................................................................ 41
2.4 Otros aspectos de la catlisis enzimtica .................................................................................. 45
2.5 Teoras sobre la accin enzimtica ............................................................................................. 45
CAPTULO 3: Clasificacin y nomenclatura de las enzimas. Reacciones enzimticas ........................ 48
3.1 Principios generales de clasificacin y nomenclatura de enzimas ............................................ 48
3.2 Reacciones enzimticas .............................................................................................................. 50
3.2.1 Grupo 1: Oxidorreductasas ................................................................................................. 50
3.2.2 Grupo 2: Transferasas ......................................................................................................... 55
3.2.3 Grupo 3: Hidrolasas ............................................................................................................. 59
3.2.4 Grupo 4: Liasas .................................................................................................................... 64
3.2.5 Grupo 5: Isomerasas.............................................................................................................. 1
3.2.6 Grupo 6: Ligasas o Sintetasas ................................................................................................ 3
CAPITULO 4: Coenzimas o cofactores .................................................................................................... 6
4.1 Introduccin .................................................................................................................................. 6
4.2 Coenzimas asociadas a procesos redox ....................................................................................... 8
4.2.1 Coenzimas piridnicas (NAD
+
, NADP
+
) ................................................................................... 8
4.2.2 Coenzimas flavnicas ........................................................................................................... 12
4.2.3 Coenzimas hemnicas .......................................................................................................... 15
4.2.4 Quinonas ............................................................................................................................. 19
4.2.5 cido ascrbico (vitamina C) ............................................................................................... 20
4.2.6 Glutatin .............................................................................................................................. 21
4.2.7 Otras coenzimas redox ........................................................................................................ 23
4.3 Coenzimas asociados a otras reacciones (no redox) .................................................................. 24
4.3.1 Tiamina pirofosfato ............................................................................................................. 24
3

4.3.2 Piridoxal fosfato .................................................................................................................. 25
4.3.3 Coenzimas folnicas ............................................................................................................. 27
4.3.4 Coenzimas cobamdicas ...................................................................................................... 30
4.3.5 Biotina ................................................................................................................................. 33
4.3.6 S-adenosil metionina .......................................................................................................... 34
4.3.7 Pantetenas .......................................................................................................................... 35
4.3.8 Carnitina .............................................................................................................................. 37
4.3.9 3'-Fosfoadenosil 5'-fosfosulfato (PAPS)............................................................................. 38
4.3.10 Adenosina 5' trifosfato (ATP) ............................................................................................ 39
4.3.11 Otros nucletidos que operan como coenzimas............................................................... 40
CAPTULO 5: Cintica de las reacciones enzimticas ......................................................................... 41
5.1 Introduccin ................................................................................................................................ 41
5.1.1 Inters de los estudios cinticos ......................................................................................... 41
5.1.2 Concepto de velocidad inicial ............................................................................................. 43
5.2 Efecto de la concentracin de enzima ........................................................................................ 44
5.3 Efecto de la concentracin de substrato .................................................................................... 48
5.3.1 Estudio cintico de la interaccin enzima-substrato ......................................................... 49
5.3.2 Mecanismo de Michaelis y Menten ................................................................................... 51
5.3.3 Concepto de K
m
.................................................................................................................. 52
5.3.4 Concepto de V
max
................................................................................................................ 55
5.3.5 Aproximacin de estado estacionario ................................................................................ 55
5.3.6 Eficiencia cataltica de las enzimas ...................................................................................... 57
5.3.7 Determinacin experimental de Km y Vmax ...................................................................... 59
5.4 Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas ................................................ 61
5.4.1. Bases moleculares .............................................................................................................. 61
5.4.2 Significado biolgico del efecto del pH ............................................................................... 65
5.5 Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas ..................................................... 66
5.5.1 Bases moleculares ............................................................................................................... 66
5.5.2 Significado biolgico del efecto de la temperatura ............................................................ 68
CAPTULO 6: Inhibicin enzimtica ...................................................................................................... 69
6.1 Concepto e importancia ............................................................................................................. 69
6.2 Tipos de inhibidores ................................................................................................................... 71
6.2.1 Inhibidores reversibles ........................................................................................................ 71
6.2.2 Inhibidores irreversibles ...................................................................................................... 72
6.3 Inhibicin competitiva ............................................................................................................... 73
6.3.1 Cintica de la inhibicin competitiva ................................................................................. 73
4

6.3.2 Diagnstico cintico de la inhibicin competitiva ............................................................... 75
6.3.3 Aspectos estructurales de la inhibicin competitiva.......................................................... 77
6.3.4 Anlogos de estado de transicin ....................................................................................... 80
6.3.5 Anticuerpos catalticos ........................................................................................................ 82
6.3.6 Importancia prctica de la inhibicin competitiva ............................................................. 83
6.4 Otras formas de inhibicin reversible ........................................................................................ 84
6.4.1 Inhibicin no competitiva .................................................................................................... 84
6.4.2 Inhibicin acompetitiva o anticompetitiva ......................................................................... 86
6.5 Inhibicin irreversible ................................................................................................................. 87
6.5.1 Generalidades ..................................................................................................................... 87
6.5.2 Reactivos de grupo -SH ....................................................................................................... 88
6.5.3 Metales pesados ................................................................................................................. 91
6.5.4 Inhibidores que combinan con cationes esenciales ............................................................ 91
6.5.5 Reactivos especficos de grupo y marcadores de afinidad ................................................. 91
6.6 Substratos suicidas ..................................................................................................................... 93
6.6.1 Modo de accin de los antibiticos -lactmicos ............................................................... 94
6.6.2 Resistencia a los antibiticos -lactmicos: la -lactamasa ............................................... 96
6.6.3 Otros inhibidores suicidas ................................................................................................... 98
CAPTULO 7: El Centro Activo enzimtico. Mecanismos de la accin enzimtica ............................. 99
7.1 El centro activo ........................................................................................................................... 99
7.1.1 Concepto ............................................................................................................................. 99
7.1.2 Pruebas experimentales de la existencia del centro activo .............................................. 100
7.1.3 Nmero de centros activos ............................................................................................... 102
7.1.4 Aminocidos y grupos qumicos implicados en el centro activo ....................................... 103
7.2 Mecanismos de la accin enzimtica ....................................................................................... 107
7.3.1 Efectos de proximidad y orientacin................................................................................. 108
7.3.2 Catlisis cido-base ........................................................................................................... 109
7.3.3 Grupos nuclefilos y electrfilos ....................................................................................... 112
7.3.4 Formacin de intermediarios covalentes con la enzima ................................................... 112
7.3.5 Efectos mecanocunticos .................................................................................................. 113
7.4 Estudio del centro activo de la quimotripsina .......................................................................... 114
CAPITULO 8: Regulacin de la actividad enzimtica, 1 ..................................................................... 119
8.1 Generalidades ........................................................................................................................... 119
8.1.1 Tipos de regulacin enzimtica ......................................................................................... 120
8.2 Control por retroalimentacin negativa .................................................................................. 123
8.2.1 Retroalimentacin negativa en sistemas enzimticos ...................................................... 124
5

8.2.2 Caractersticas generales del control enzimtico por retroalimentacin negativa .......... 127
8.3 Alosterismo ............................................................................................................................... 129
8.3.1 Definicin .......................................................................................................................... 129
8.3.2 Pruebas experimentales .................................................................................................... 132
8.3.3 Alosterismo y cooperatividad ........................................................................................... 132
8.3.4 Interpretacin cuantitativa del alosterismo ...................................................................... 136
8.3.5 La aspartato transcarbamilasa .......................................................................................... 138
8.3.6 La hemoglobina ................................................................................................................. 143
CAPTULO 9: Regulacin de la actividad enzimtica, 2. Modificacin covalente de las enzimas.
Activaciones proteolticas .................................................................................................................. 149
9.1 Introduccin .............................................................................................................................. 149
9.1.1 Modificacin covalente: su importancia biolgica ............................................................ 149
9.1.2 Formas de modificacin covalente ................................................................................... 152
9.1.3 Concepto de segundo mensajero...................................................................................... 153
9.2 Regulacin de la glucgeno fosforilasa .................................................................................... 156
9.2.1 Reaccin catalizada y formas moleculares de la glucgeno fosforilasa ............................ 156
9.2.2 Cascada de activacin en la glucgeno fosforilasa ........................................................... 158
9.2.3 Mecanismos moleculares en el sistema de la glucgeno fosforilasa ................................ 161
9.2.4 Otras actividades ligadas al sistema de la glucgeno fosforilasa ...................................... 170
9.3 Otros sistemas de fosforilacin de protenas ........................................................................... 173
9.3.1 Protein kinasas A ............................................................................................................... 173
9.3.2 Protein kinasas G ............................................................................................................... 174
9.3.3 Protein kinasas C ............................................................................................................... 174
9.3.4 Protein kinasas dependientes de calcio-calmodulina ....................................................... 174
9.3.5 Protein tirosin kinasas ....................................................................................................... 176
9.4 Otras formas de modificacin covalente .................................................................................. 177
9.4.1 ADP-ribosilacin ................................................................................................................ 177
9.4.2 Adenilacin y Uridilacin ................................................................................................... 178
9.5 Activaciones proteolticas: Zimgenos digestivos ........................................................................ 181
9.5.1 Pepsina .............................................................................................................................. 182
9.5.2 Tripsina .............................................................................................................................. 182
9.5.3 Quimotripsina .................................................................................................................... 183
9.6 Activaciones proteolticas: Coagulacin de la sangre ............................................................... 183
9.6.1 El proceso de coagulacin: generalidades ........................................................................ 184
9.6.2 Polimerizacin del fibringeno ......................................................................................... 185
9.6.3 Formacin de trombina ..................................................................................................... 188
6

9.6.4 Formacin del complejo protrombinasa ........................................................................... 189
CAPTULO 10: Enzimas en Medicina .................................................................................................. 193
10.1 Las enzimas en el diagnstico clnico ..................................................................................... 193
10.1.1 Procedencia de las enzimas sricas ................................................................................. 194
10.1.2 Alteraciones en la concentracin enzimtica en suero .................................................. 194
10.1.3 Estudio de las principales enzimas con inters diagnstico ........................................... 196
10.2 Enzimas en Teraputica .......................................................................................................... 201
10.2.1 Teraputicas sustitutivas ................................................................................................. 202
10.2.2 Enzimas en Ciruga .......................................................................................................... 203
10.2.3 Trastornos de la circulacin ............................................................................................ 204
10.2.4 Trastornos de la coagulacin sangunea ......................................................................... 204
10.2.5 Enzimas en teraputica antineoplsica ........................................................................... 205
10.2.6 Otros usos teraputicos de enzimas ............................................................................... 205

7


INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA



Si algo distingue realmente a la Bioqumica del resto de las disciplinas qumicas, es el papel
central que en los seres vivos desempean las enzimas. Y si algn elemento distintivo hay en
la Bioqumica frente a las ciencias biolgicas es que las enzimas nos brindan un modelo
interpretativo de uso general para todas ellas sin excepcin en trminos de la teora
atmico-molecular. El estudio de las biomolculas no es en s mismo ms que una serie de
captulos de la Qumica Orgnica, por ms que se utilicen tcnicas poco convencionales
desde el punto de vista de esta ciencia. Lo realmente nico en la qumica biolgica es esa
impresionante cantidad de catalizadores especficos encargados cada uno de un
determinado proceso dentro de los muchos miles de reacciones qumicas posibles en lo
organismos. Cmo son las enzimas? Cmo funcionan? Cmo se forman? La respuesta a
estas preguntas, entendidas en su ms amplio significado, nos brindara la explicacin a
todos los fenmenos que asociamos a la vida: la posibilidad de un metabolismo; de su
regulacin, y por tanto de su integracin a un nivel fisiolgico; igualmente, de su biosntesis
y todos los fenmenos genticos a ella asociados; y por ltimo, de las complicadas pautas
evolutivas y adaptativas de los organismos vivientes.

No es de extraar, por tanto, que los espectaculares avances de la Bioqumica
habidos en los ltimos treinta aos hayan tenido lugar normalmente en torno a sistemas
experimentales nacidos del estudio "convencional" de las enzimas. Los mtodos y tcnicas
de purificacin y aislamiento de enzimas han marcado las pautas de toda la Bioqumica
preparativa o extractiva; los mtodos que la Enzimologa emplea en la cuantificacin de
enzimas forman la base de la Bioqumica Analtica, habiendo transcendido su uso al Anlisis
Qumico General; el estudio qumico de los inhibidores ha creado los protocolos que hoy se
siguen en el desarrollo sistemtico de nuevos frmacos.

Y ya en la esfera puramente terica, el estudio de las reacciones enzimticas nos ha
suministrado un modelo de aplicacin general a todas las interacciones biolgicas; el de un
ligando unindose a un receptor de naturaleza proteica, y desencadenando en l un cambio
que es el ltimo responsable molecular del efecto fisiolgico investigado. Por otra parte, el
estudio cintico de cadenas de reacciones enzimticas nos va dando una idea, hoy todava
aproximada, de las complejidades dinmicas que pueden surgir en el ser vivo por la accin
de los enzimas, y que en un terreno puramente especulativo podemos relacionar sin
demasiada dificultad con cuestiones tan abstractas como el origen objetivo del tiempo
biolgico o las asimetras (y simetras) espaciales que surgen en la ontogenia de los seres
vivos.

En el momento actual quiz es posible que el trmino "Enzimologa" pueda sonar un
tanto pasado de moda, sobre todo en comparacin con otros como "Biotecnologa" o
8

"Ingeniera Gentica", y que nos recuerde los viejos laboratorios donde se haca Bioqumica
clsica all por los aos 50 y 60. Por ello trato de reivindicar la importancia de la misma. Si la
Biotecnologa no es otra cosa que introducir en gran escala a las enzimas en el proceso
productivo y econmico, la Ingeniera Gentica actual no es concebible sin la ayuda de una
serie muy concreta de enzimas; y adems, sus ltimas aspiraciones son enteramente
enzimticas: la introduccin de nuevos procesos metablicos all donde normalmente no
los hay. La Gentica Molecular se ocupa de los planos del edificio viviente; la Enzimologa,
del estudio del propio edificio funcionando.

El propsito del autor de este libro es presentar una visin actualizada de las
enzimas, pero a un nivel de estudiante de Grado, y especficamente, en el rea de Ciencias
de la Salud. Para el especialista hay numerosas y magnficas monografas, aparte de series
peridicas e innumerables artculos de investigacin y de divulgacin que tratan con
enzimas directa o indirectamente. A tal fin se da una cierta extensin a captulos como la
cintica enzimtica, que en los textos consagrados de Bioqumica ocupan un espacio a
nuestro juicio harto reducido, pero sin llegar por ello a extremos monogrficos o
especializados. El autor pretende demostrar que la metodologa del estudio de las enzimas,
tanto en lo puramente tcnico como en lo ms conceptual y abstracto, es la indicada para el
abordaje de la gran mayora de los problemas, puros o aplicados, que nos plantea el estudio
de los seres vivientes.




Notas histricas

1. Los orgenes


El pensamiento yatroqumico que floreci a partir de Paracelso, en el s.XVI, es el ms
remoto antecedente histrico de la Bioqumica y de la Enzimologa. Precisamente el
representante ms genuino de este pensamiento, Van Helmont, a principios del s.XVII
sugiri que la digestin de los alimentos implicaba su transformacin a partir de
"fermentos", tomando este trmino de la tecnologa del vino, y en la idea de que ambos
procesos tenan mucho en comn. Este pensamiento discrepaba radicalmente de la
tradicin galnica, que vea en la digestin una serie de "cocciones". Tanto en un caso como
en otro imperaba el razonamiento de analoga, pero hemos de reconocer que van Helmont
estaba mucho ms cerca de la realidad. Y adems, desde entonces se estableci una
fructfera relacin entre los estudios que hoy llamaramos bioqumicos con los proceso de
digestin y de fermentacin, pues ambos fenmenos fueron desde entonces el objeto
principal de los estudios que han desembocado en la moderna Enzimologa.

Rn de Raumur (1683-1757) emprendi hacia el final de su vida (1752) una serie de
estudios sobre la digestin que representaron un importante avance metodolgico.
9

Alimentando a aves con tubos metlicos rellenos de distintas materias alimenticias estudi
las transformaciones de stas a lo largo del tubo digestivo y pudo comprobar que exista
realmente una transformacin qumica de los alimentos durante la digestin. Lazzaro
Spallanzani (1729-1799) ampli estos estudios dejando fuera de duda el hecho de la
transformacin qumica de los alimentos durante el proceso digestivo. Si consideramos que
por aquel entonces su contemporneo Antoine de Lavoisier (1743-1794) reduca a
trminos qumicos el proceso respiratorio, que Karl Wilhelm Scheele (1742-1786)
comenzaba el estudio de los "productos naturales" y que unos pocos aos ms tarde (1804)
John Dalton (1766-1844) resucitaba en trminos cientficos el primitivo atomismo de
Demcrito, bien podemos sugerir que estaba teniendo lugar una verdadera revolucin
qumica al mismo tiempo que la Revolucin Francesa. En cuanto al proceso digestivo, en
1836, Schwann y Eberle describieron un principio en el jugo gstrico capaz de degradar
protenas, al que denominaron "pepsina".

Otro campo, el de las reacciones qumicas, se desarrollaba ampliamente por aquel
entonces. En lo que a nuestra discusin se refiere, es importante sealar que en 1812
Kirchoff demostr la produccin de azcar a partir de almidn por accin de cidos sin que
stos quedaran modificados; y en 1814 comprob que el mismo proceso poda tener lugar
en presencia de un extracto de trigo en lugar de cidos. Unos aos ms tarde (1817-1822), e
independientemente, Davy, Dbereimer, Mitscherlich y Thnard descubrieron que la
descomposicin del perxido de hidrgeno era acelerada por metales, sin cambios
apreciables en stos; Thnard, por su parte, observ el mismo fenmeno en presencia de
fibrina sangunea. En 1833 Payen y Persoz obtuvieron a partir de malta un principio similar
al antes mencionado de Kirchoff, al que dieron el nombre de "diastasa"; por su parte,
Robiquet en 1830 descubri en las almendras amargas un principio "albuminoide" que era
capaz de descomponer la amigdalina en glucosa, benzaldehido y CNH (y bautizado
posteriormente por Liebig y Whler como "emulsina"). Con todos estos datos y algunos
ms, Jns Jacob Berzelius (1779-1848) elabor su teora de la catlisis, central en toda esta
discusin. Por ello le citamos literalmente:


"...Tenemos amplias razones para suponer que en las plantas y en los animales
vivientes tienen lugar miles de procesos catalticos entre los tejidos y los fluidos, y
que de ellos resulta la formacin de gran nmero de distintos compuestos, para
cuyo origen a partir de la sangre o de los jugos vegetales no podemos asignar hoy
da una causa conocida" (1836)


Y aqu entra en escena otro gran protagonista de la historia de la Enzimologa: el
estudio de la fermentacin alcohlica.



2. La fermentacin alcohlica

10


Conocido desde tiempo inmemorial, este proceso empez a recibir atencin cientfica a
finales del siglo XVIII. En 1779 la Academia de Ciencias de Francia estableci un premio
consistente en una libra de oro para el trabajo que arrojara luz sobre el hasta entonces
misterioso proceso qumico. Aunque este premio fue retirado en 1793, no hay duda que
contribuy decisivamente a nuestro actual conocimiento no slo de las fermentaciones,
sino de la Enzimologa en general.

J.L.Gay-Lussac (1778-1850) reconoci como productos el etanol y el CO
2
, aunque sus
datos no establecieron la estequiometra del proceso. C.Cagniard-Latour (1777-1859)
sugiri la naturaleza celular de la levadura, estimando su dimetro en 6-
el proceso de gemacin. Igualmente demostr las diferencias entre la levadura de cerveza y
la del vino; desde el punto de vista qumico, comprob el requerimiento de compuestos
nitrogenados en el proceso. Observaciones similares fueron llevadas a cabo por F.T.Ktzing
(1807-1893) y por T.Schwann (1810-1882).

Justus von Liebig (1803-1873), junto con F.Whler (el autor de la sntesis de urea)
consideraban la levadura como una sustancia qumica "inestable" que al comunicar su
inestabilidad al azcar lo degradaba a alcohol. Esto entraba en contradiccin con el punto
de vista sostenido por Schwann, Ktzing y Cagniard-Latour, es decir, la naturaleza celular de
la levadura. Por tanto se plante la cuestin de si las fermentaciones dependan de la
propia calidad "viviente" de la clula o bien se trataba de un componente "inanimado" de la
misma. Liebig defenda esta ltima postura, mientras que Schwann sostena la primera.

Los experimentos de Louis Pasteur (1822-1895) parecieron dar la razn
enteramente a Schwann. En 1860 escriba lo siguiente:


"...El acto qumico de la fermentacin es esencialmente un fenmeno correlativo a
un acto vital, que comienza y termina con ste. Creo que la fermentacin alcohlica
no puede tener lugar si no viene acompaada de la organizacin, desarrollo y
multiplicacin de las clulas, o bien de la vida continua de las clulas ya formadas"


A consecuencia de este punto de vista, se estableci la distincin entre fermentos
"organizados" (o formes), de los que la levadura era el ejemplo, y fermentos "no
organizados" (o informes) como la diastasa, pepsina, emulsina, invertasa, etc. (cuya lista iba
creciendo), que podan ser extrados de las clulas. Precisamente para evitar esta
complicada nomenclatura, Khne introdujo en 1878 el trmino "enzima" (literalmente, en
la levadura) para denominar los hasta entonces conocidos como "fermentos no
organizados", indicando as que estaban dentro de la clula, pero que no eran la clula. El
punto de vista de Pasteur prevaleci momentneamente, a pesar de que algunas voces se
alzaron en contra (en particular las de Claude Bernard, Berthelot y Traube; citamos a este
ltimo (1878):

11

"...Los fermentos no son, como crea Liebig, sustancias inestables que transmiten a
materiales normalmente no reactivos su vibracin qumica, sino que son sustancias
qumicas, relacionadas con las protenas y que como todas las dems sustancias
poseen una estructura qumica definida...La hiptesis propuesta por Schwann y
Pasteur de que la fermentacin ha de ser considerada como expresin de la
actividad vital de los organismos inferiores no es satisfactoria... Los fermentos son la
causa de los procesos qumicos vitales no slo en los organismos inferiores, sino
tambin en los superiores".


En 1897 E. Bchner (1860-1917) dio con la clave final al preparar un extracto acelular de
levadura capaz de fermentar azcar, lo que ech por tierra la teora celular de la
fermentacin (y todo el vitalismo que implicaba); la totalidad del proceso fermentativo
poda ser llevada a cabo por enzimas individuales en el sentido de los definidos por Khne
(es decir, los "no organizados").

Y por fin, Arthur Harden (1865-1940) utiliz el sistema de Bchner mediante una
metodologa que pas a ser clsica en todos los estudios metablicos: calentamiento,
dilisis, inhibidores, etc. de forma que unos aos ms tarde Meyerhof pudo enumerar una
a una todas las enzimas y reacciones de la fermentacin alcohlica.

A partir de entonces, el desarrollo histrico de la Enzimologa se confunde con sus captulos
concretos, y a ellos nos remitimos. Igualmente, el origen de la Bioqumica moderna
podemos cifrarlo en el momento en que qued resuelta la polmica sobre las
fermentaciones; la aparicin de las enzimas en la escena cientfica fue lo suficientemente
importante como para discernir esta ciencia de sus diversas predecesoras, como la
Fisiologa, la Farmacia, la Qumica y la Agronoma. Adems, los estudios de Harden y Young
dotaron a la nueva ciencia de su arma principal: el sistema acelular.


El estudio de la Enzimologa


A lo largo de esta obra, trataremos de presentar la Enzimologa de acuerdo con la siguiente
sistemtica:

- En primer lugar, se repasan algunas nociones de qumicofsica que son necesarias para la
comprensin, siquiera superficial, de las reacciones qumicas. Los conceptos importantes
que se abordan son: la energa libre, la velocidad y el orden cintico de las reacciones y el
fenmeno de catlisis tratado de una manera general.

- Pasamos a continuacin a una visin introductoria de la catlisis enzimtica. Para ello
definimos los principales trminos propios de la Enzimologa, para seguir con las principales
propiedades de las enzimas: su naturaleza qumica, su especificidad y su eficiencia
12

cataltica. Se discuten por ltimo las principales teoras sobre la accin enzimtica.

- En el captulo 3 se describen las reacciones enzimticas, con las normas vigentes de
clasificacin y nomenclatura. El captulo 4 presenta el estudio de las coenzimas, los
reactivos especficos de la qumica biolgica.

- Los dos captulos siguientes se refieren a la cintica de las reacciones enzimticas y a sus
inhibidores, respectivamente (caps. 5 y 6). Veremos cmo el estudio cintico nos ayuda a
comprender los mecanismos bsicos de reaccin y nos permite en muchas circunstancias
un estudio de los pasos individuales. La inhibicin, que se estudia inicialmente bajo un
punto de vista cintico, se termina discutiendo en trminos ms estructurales, indicando su
importancia prctica, y muy particularmente como paradigma de la teraputica
farmacolgica.

- El siguiente captulo (7) trata de la estructura molecular de las enzimas. Se contempla
dicho estudio sobre todo en torno al centro activo enzimtico, presentndose los diversos
mtodos de su estudio. Por otra parte, las estructuras primarias de las molculas de enzima
nos introducen a la evolucin filogentica y el origen de los enzimas.

- La regulacin de la actividad enzimtica, que se presenta en el siguiente captulo (8), tiene
la enorme importancia de ser el nexo de unin entre el nivel metablico celular y la
fisiologa del organismo. Se presentan el fenmeno del alosterismo, otros modelos
regulatorios, la regulacin covalente de los enzimas y las cascadas de actividades
enzimticas (estos dos ltimos aspectos en el captulo 9).

- Se estudian a continuacin (cap. 10) algunos aspectos de la Enzimologa aplicada a la
Medicina, muy especialmente en el diagnstico y en la teraputica.



Bibliografa general



Mencionamos a continuacin algunas referencias bibliogrficas y de Internet que pueden
ser de utilidad en el estudio de la Enzimologa.


Libros y artculos


Barrow, G.M. Qumica Fsica, 3 ed. Ed.Revert, Barcelona, 1975

Cornish-Bowden, A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. Portland Press, London 1984.
13


Fersht, A.R. Enzyme Structure and Metabolism, 2 ed. W.H.Freeman and Co. New York 1984

Koshland, D.E.Jr. Evolution of catalytic function Cold Spring Harbor Symposia on Quantiative
Biology, vol. LII, 1-7, 1987

Matthews

Monod, J., Wyman, J., Changeux, J-P. On the nature of allosteric transitions: a plausible
model J.Mol.Biol. 12, 88-118, 1965

Nelson, D.L. & Cox, M.M. Lehninger. Principios de Bioqumica Omega, 2001

Nez de Castro, I. Enzimologa, Pirmide, Madrid 2001

Price, N.C. & Stevens, L. Fundamentals of Enzymology Oxford University Press, Oxford 1987

Prigogine, I & Stengers, I. La Nueva Alianza. Metamorfosis de la Ciencia. Alianza Editorial.,
Madrid 1979

Segel, I.H. Enzyme Kinetics. Behavior and Analysis of rapid equilibrium and steady-state
systems John Wiley and Sons, New York, 1975

Stryer

Voet, D. & Voet J.G. Bioqumica, Panamericana 2006


Pginas web


http://www.expasy.ch/enzyme/

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

http://en.wikipedia.org/wiki/Enzymes

http://en.wikipedia.org/wiki/Coenzyme

http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_kinetics

http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_inhibitor



14


CAPTULO 1: Las reacciones qumicas: criterios de espontaneidad y
cintica





Los organismos vivientes mantienen de forma constante y simultnea varios miles de
reacciones qumicas, cuyo conjunto llamamos metabolismo. Este conjunto de reacciones es
tan caracterstico de los mismos que de hecho, un punto de vista perfectamente vlido para la
definicin de vida es la capacidad de mantenimiento de un metabolismo. Por el momento, no
sabemos de ningn proceso nuclear que tenga lugar en los seres vivos, y de ah que la
metodologa ms adecuada para el estudio de los seres vivos sea la propia de la Qumica. En
qumica estudiamos las reacciones desde el punto de vista de su velocidad y de su mecanismo.
Ambos tipos de estudio son asimismo cruciales, como veremos, en el particular terreno de la
Bioqumica. Pero en este ltimo se da un hecho de importancia transcendental: la prctica
totalidad de las reacciones qumicas que se dan en un ser vivo estn catalizadas, es decir, en
ellas interviene un agente que no aparece en la estequiometra global de la reaccin pero que
15

acelera la consecucin del equilibrio. Se conocen, como es lgico, muchas otras reacciones
catalizadas fuera del mundo viviente, pero a lo largo de ste y los prximos captulos
trataremos de ver por qu la catlisis biolgica es tan importante en el contexto de un curso
de Bioqumica. Antes de entrar en esta materia especfica, es preciso que consideremos
brevemente algunas generalidades sobre las reacciones qumicas, particularmente su
posibilidad y su velocidad.


1.1 En qu circunstancias tiene lugar espontneamente una reaccin?


La funcin bsica de toda ciencia natural es la prediccin de fenmenos, y los fenmenos
qumicos forman parte de nuestra experiencia cotidiana. Por ejemplo, tenemos todos una idea
bastante aproximada de qu sustancias pueden entrar en combustin al acercar una llama;
sabemos que es mucho ms fcil disolver sal que sacarla de la solucin; y que una vez cuajada
la clara de un huevo no podemos restituir sta a su estado original. Es decir, en muchos casos
tenemos una concepcin emprica del sentido espontneo en que cursan las reacciones, y
evidentemente puede ser de gran utilidad un conjunto de reglas cientficas que nos permitan
discernir clara y cuantitativamente la posibilidad o no de reacciones qumicas. La respuesta a
este problema nos la da la Termodinmica clsica, de forma que hoy da podemos predecir con
toda exactitud la posibilidad de cualquier reaccin qumica real o imaginable. Veamos a
continuacin dichos criterios.




1.1.1 El calor absorbido o desprendido en reacciones qumicas


Somos conscientes de que en muchas reacciones qumicas hay intercambio de calor. Cuando
un sistema se transforma a presin y temperatura constantes, el calor desprendido o
absorbido en el proceso recibe el nombre de entalpa (y se representa por H). Como los
procesos biolgicos tienen lugar por lo general en estas condiciones, en lo sucesivo
utilizaremos calor y entalpa prcticamente como sinnimos. Asimismo, hemos de sealar una
importante convencin respecto a las variaciones de entalpa en una transformacin: el
incremento en entalpa se considera positivo cuando el sistema absorbe calor a partir del
entorno; en caso contrario, el incremento se considera negativo. Por ejemplo, si se nos dice
que una reaccin cursa con un incremento de entalpa de -100 kJ (kilojoules), ello significa que
la tranformacin desprende esa energa en forma de calor desde el sistema al entorno. El caso
contrario (absorcin de calor por el sistema desde el entorno) se representa como variacin
positiva de entalpa.

Pues bien: una primera aproximacin emprica a la definicin de un criterio de espontaneidad
en las reacciones qumicas nos dira que en nuestra experiencia son ms usuales aquellas
16

reacciones en las que se desprende calor. As, definiramos como espontneas las reacciones
exotrmicas (reacciones que desprenden calor, con incremento negativo de entalpa) y como
no espontneas las reacciones endotrmicas (esto es, que absorben calor, con incremento
positivo de entalpa).

Es fcil refutar esta hiptesis, pues bastan unas pocas observaciones para comprobar que
existen procesos endotrmicos y que son sin embargo espontneos. Por ejemplo, la entrada
en solucin de sales como el cloruro amnico es un proceso perfectamente espontneo, y sin
embargo cursa con absorcin de calor, como podemos comprobar al tacto por el enfriamiento
del recipiente que contiene la solucin. Por tanto, no es factible un criterio sobre
espontaneidad de las reacciones qumicas basado nicamente en la entalpa.


1.1.2 Orden o desorden introducido en un sistema: la entropa

Fijmonos en el ejemplo que refutaba la hiptesis anterior. La disolucin de una sal amnica
en agua es un proceso endotrmico y sin embargo, espontneo. El fenmeno de disolucin de
la sal implica el paso de un sistema altamente ordenado, cual es el caso de un slido cristalino,
al desorden propio de una solucin, similar al que existe en el estado gaseoso. Toda vez que el
desorden de un sistema es medido por una magnitud termodinmica de estado, la entropa,
que se representa con el smbolo S, y que el Segundo Principio establece el aumento global
de la entropa en cualquier transformacin que sufra un sistema aislado, podramos pensar
que un criterio vlido para dictaminar la espontaneidad de las reacciones sera el siguiente:
Son espontneas las transformaciones de un sistema que cursen con un incremento de
entropa (y que por tanto van a favor de la flecha del tiempo). Debemos hacer notar que en
este caso definimos como positivas las variaciones en las que aumenta la entropa del sistema.

Tampoco es vlido este segundo criterio. Por ejemplo, la congelacin del agua a 0C y presin
atmosfrica es un fenmeno totalmente espontneo y cursa con una importante disminucin
entrpica, la propia de pasar del relativamente desordenado estado lquido al orden propio de
los slidos cristalinos. Igualmente, la desnaturalizacin de una protena cursa con un fuerte
incremento de entropa en el sistema, ya que la estructura nativa de aqulla representa un
sistema muy ordenado, y sin embargo, las protenas no se desnaturalizan espontneamente.







1.1.3 Trabajo til potencial en una transformacin: la Energa Libre

A pesar de las consideraciones anteriores, las transformaciones espontneas cursan por lo
general o con desprendimiento de calor o con incremento de entropa. Existe una tercera
magnitud termodinmica de estado, la energa libre de Gibbs, que se representa como G y
17

que se define por la siguiente ecuacin en procesos isotrmicos a presin constante:

[1]
G = H - TS

en la que vemos que entran como variables la entalpa H, la entropa S y la temperatura
absoluta T. La energa libre de Gibbs representa la cantidad mxima de trabajo til que puede
obtenerse en una transformacin a presin constante, y constituye un criterio vlido para
predecir la espontaneidad de las reacciones qumicas. As, un incremento negativo en energa
libre (es decir, cuando el sistema desprende energa libre hacia el entorno) significa que la
transformacin puede tener lugar espontneamente. Una variacin positiva tiene lugar
cuando el sistema absorbe energa, y tales transformaciones no pueden tener lugar
espontneamente. La magnitud G tiene una gran importancia en todo tipo de clculos
qumicos, y por tanto en los biolgicos.


1.1.3.1 Normalmente se dispone de tablas en las que se especifican las energas libres
standard de formacin de compuestos. Esta magnitud es el incremento en energa libre que
tiene lugar en la reaccin de formacin del compuesto a partir de sus elementos en estado
standard (se toma como cero la energa libre de formacin standard de un elemento en su
estado ms estable). Estas energas libres de formacin se refieren a estados standard, es
decir, concentracin unidad, 298 K (25 C), 1 atm de presin, etc. A partir de las energas de
formacin de los reactivos y productos podemos calcular muy fcilmente la energa libre
standard de una reaccin dada. Esta energa libre standard se representa por el smbolo G
0
.
________________________________________

Ejemplo: Calclese la energa libre standard de la descomposicin del perxido de hidrgeno:
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2
. Esta es un interesante reaccin en el metabolismo celular, catalizada por
enzimas llamados peroxidasas, de las cuales el ejemplo ms representativo es la catalasa, que
cataliza esta misma reaccin. Sabemos que las energas libres de formacin son:

H
2
O
2
G
0
= -103.04 kJ/mol

H
2
O G
0
= -227.65 kJ/mol

O
2
(oxgeno molecular) G
0
= 0 kJ/mol

Solucin: Al ser la energa libre una funcin termodinmica de estado, su variacin depende
nicamente de los estados inicial y final de la reaccin, sin importar el camino seguido. Por
tanto, las energas libres se suman o restan de la misma forma que en ecuaciones
termoqumicas. A partir de la relacin

G
0
= G
0
(productos) - G
0
(reactivos)

Tendremos para la ecuacin propuesta:
18


G
0
= -227.65 -(-103.04 + 0) = -124.61 kJ/mol

Lo cual nos indica que en condiciones standard, la reaccin cursar espontneamente de
izquierda a derecha, tal como ha sido enunciada.

________________________________________

En aquellas reacciones en que intervienen cidos, el protn H
+
suele ser un reactivo o un
producto; a concentracin unidad, por tanto, las energas libres standard de las reacciones en
que intervienen cidos disociados total o parcialmente, se refieren a pH = 0 (es decir, el pH
para el cual [H
+
]=1 M.. En el medio biolgico el pH siempre es cercano a 7 (la neutralidad cido
base) y se prefiere, por esa razn, calcular las energas libres standard de las reacciones a pH 7,
es decir, a una concentracin de protones igual a 10
-7
M. Las energas libres as calculadas se
representan por el smbolo G
0
'.


1.1.3.2 Para unas condiciones dadas, diferentes de las standard, podemos calcular el
incremento en energa libre de una reaccin concreta A B mediante la relacin


[2]

] [
] [
ln
'
0
A
B
RT G G + A = A


En la que R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta, y [A] y [B] las
concentraciones de reactivo y producto, respectivamente.



1.1.3.3 De la relacin anterior podemos obtener otra muy interesante, mediante la cual se
calcula la constante de equilibrio de una reaccin a partir de la energa libre standard, o
viceversa. En el equilibrio, G = 0, y por tanto,

[3]
G
0
= -RT ln(K
eq
)


En la que K
eq
es la constante de equilibrio de la reaccin, y R y T tienen el mismo significado
que en [2]. Esta relacin nos indica que (a) son espontneas aquellas reacciones para las que
G
0
es negativa, o lo que es lo mismo, tienen una K
eq
mayor que la unidad; y a la inversa, (b)
no pueden producirse espontneamente reacciones para las que G
0
es positiva, o bien, cuya
constante de equilibrio es menor que la unidad.
19



1.1.3.4 Por til que sea la magnitud energa libre standard, debemos tener muy en cuenta que
una cosa son las condiciones standard de una reaccin y otra muy distinta las condiciones
actuales en que se desarrolla la reaccin que nos interesa. As, por ejemplo, podemos ver que
una reaccin metablica cuyo clculo de energa libre standard nos indica que tiene lugar
espontneamente en un sentido, puede estar funcionando en el metabolismo en sentido
inverso porque las condiciones en el interior de la clula son evidentemente distintas, y en
particular las concentraciones de reactivos y productos.


1.1.3.5 Por ltimo, veamos la reaccin de combustin aerbica de la glucosa:

[4]
C
6
H
12
O
6
+ 6O
2
6CO
2
+ 6H
2
O G
0
= -2858 kJ/mol

Segn las consideraciones anteriores, esta reaccin cursar espontneamente puesto que
transcurre con un fuerte incremento negativo en energa libre. Sin embargo, todos somos
conscientes de que la glucosa en presencia de oxgeno (por ejemplo, dentro de un frasco) es
perfectamente estable y no arde "espontneamente". Esto no est en contradiccin con todo
lo que acabamos de exponer, ya que la energa libre standard nos informa acerca de la
posibilidad de una reaccin, pero no nos da ninguna informacin acerca de la dimensin
tiempo de los fenmenos. Para tener una idea de la velocidad con que transcurre una
reaccin, no nos queda hoy por hoy ms remedio que ir al laboratorio y estudiarla
experimentalmente. Quiz los progresos en qumica cuntica y las actuales facilidades de
clculo nos permitan algn da hacer predicciones tericas de la velocidad; entre tanto, slo las
determinaciones empricas nos valen para algo, como veremos a continuacin.




1.2 La velocidad de las reacciones qumicas



La velocidad en sentido qumico es la variacin de concentracin por unidad de tiempo, o ms
propiamente, la variacin instantnea en concentracin. Para una reaccin cualquiera A B,
podemos medir su velocidad bien como (a) velocidad de desaparicin del reactivo A, es
decir, -d[A]/dt, o bien (b) velocidad de aparicin del producto B, es decir, d[B]/dt.

La velocidad de una reaccin qumica depende de varios factores cuyo efecto podemos medir
experimentalmente en el laboratorio. De estos factores tienen especial significacin para
nosotros la concentracin de reactivos, la temperatura y la presencia o ausencia de
catalizadores.
20




1.2.1 Velocidad y concentracin: orden de reaccin y molecularidad


Hacia 1850 Wilhemy estudi la reaccin de inversin de la sacarosa:

[5]
C
12
H
22
O
11
(sacarosa) + H
2
O C
6
H
12
O
6
(glucosa) + C
6
H
12
O
6
(fructosa)

Olvidndonos por el momento de que el agua es un reactivo en esta reaccin, los resultados
que obtuvo eran compatibles con la siguiente ley: La velocidad de la reaccin es
directamente proporcional a la concentracin de sacarosa. Es decir,

[6]
-d[A]/dt = d[B]/dt = d[C]/dt = k[A]

Donde representamos como A la sacarosa, B la glucosa y C la fructosa; k representa la
constante de proporcionalidad entre la velocidad y la concentracin. En general, para una
reaccin irreversible

[7]

aA + bB cC + dD

En donde A y B son los reactivos, C y D los productos, y a, b, c y d los respectivos
coeficientes estequiomtricos, la velocidad v (en ausencia de productos, es decir, en el
momento t=0 de la reaccin) puede en general expresarse como

[8]
v = -d[A]/dt = -d[B]/dt = d[C]/dt = d[D]/dt = k[A]
x
[B]
y


es decir, como el producto de las concentraciones de los reactivos elevadas a los
exponentes x e y (que no son necesariamente iguales a los coeficientes estequiomtricos a y
b).

1.2.1.1 Llamamos orden de reaccin a la suma de los exponentes que aparecen en la
ecuacin de velocidad. En el caso de la inversin de la sacarosa, el orden es de uno, o
reaccin de primer orden; en el caso de la reaccin [7], el orden es de (x+y). En este ltimo
caso podemos tambin decir que la reaccin es de orden x respecto a A, de orden y
respecto a B y de orden global (x+y).


Es importante sealar que el orden de reaccin es una magnitud experimental, es decir, que
21

la obtenemos a partir de mediciones en el laboratorio. En este sentido, debemos tener
presente que son posibles rdenes de reaccin no enteros; por ejemplo, en la reaccin de
descomposicin del acetaldehido

[9]
CH
3
-CHO CH
4
+ CO

la experimentacin nos dice que tiene un orden de 3/2 con respecto al acetaldehido, a pesar
de que la observacin de la ecuacin estequiomtrica nos hara pensar en un primer orden
para esta reaccin.

De la misma manera, son posibles rdenes cero de reaccin. Ms adelante tendremos
ocasin de ver que en las reacciones catalizadas por enzimas, a altas concentraciones de
substrato, el orden es prcticamente de cero, es decir, la velocidad es independiente de la
concentracin del reactivo.

Volvamos a la ecuacin [7]. En ella se deca que la velocidad puede ser igual a k[A]
x
[B]
y
, y
por tanto el orden de reaccin global igual a (x+y). Es importante insistir en el hecho de que
el orden de reaccin no es necesariamente igual a la suma de los coeficientes
estequiomtricos, ya que el orden de reaccin depende del mecanismo de la misma, y no
de su estequiometra global. Supongamos una reaccin en la que dos molculas de A
reaccionen con una de B para dar el producto C:

[10]
2A + B C

Para esta reaccin son posibles varios mecanismos. Por ejemplo: en un caso podemos
suponer que las tres molculas colisionan simultneamente para producir C. En ese caso la
reaccin sera de orden 3. Ahora bien, si la reaccin transcurre de manera que en primer
lugar reacciona una molcula de A con una de B para dar un intermediario X y ste
posteriormente reacciona con una nueva molcula de A para dar el producto C, el orden ya
no sera de 3, sino que estara comprendido entre 2 y 3. Y de esta misma manera podemos
pensar en muchos otros mecanismos para esta reaccin, cada uno de los cuales nos dara un
orden distinto. De hecho, rdenes de reaccin de 3 son muy raros en la prctica; y
superiores a 3 son realmente excepcionales.


1.2.1.2 Por las consideraciones anteriores debemos definir un nuevo concepto en la
cintica de reacciones qumicas, la molecularidad. La molecularidad de una reaccin es el
nmero de molculas que participan en la configuracin del complejo activo (vase ms
adelante), y por tanto, es un nmero que necesariamente ha de ser entero, a diferencia del
orden de reaccin. Y as como ste es una magnitud experimental, la molecularidad lo es
terica, ya que se debe definir para los pasos elementales del mecanismo. En el ejemplo
[10] vimos que podamos postular varios mecanismos. De los propuestos, en el primero de
ellos habra una sola reaccin de molecularidad 3; en el segundo, haba dos reacciones
22

sucesivas de molecularidad 2 cada una.


1.2.1.3 Particularmente importantes en el mundo biolgico son los procesos de primer
orden. Definamos estos procesos como los que obedecen a la relacin

[11]
-d[A]/dt = k[A]

Esta relacin puede integrarse directamente y conduce a la expresin

[12]
A
t
= A
0
exp(-kt)

En la que A
t
es la cantidad de A que queda a tiempo t; A
0
es la cantidad inicial de A; k la
constante de primer orden, y t el tiempo. Si tomamos logaritmos naturales de esta
expresin llegamos a

[13]
ln A
t
= ln A
0
- kt

lo cual indica que si representamos el logaritmo de A en funcin del tiempo, obtendremos
una lnea recta de pendiente -k y cuyo corte en ordenadas ser igual al logaritmo de A
0
. Por
otra parte, se define en estos procesos otra importante magnitud derivada: el semiperodo o
tiempo en que A queda reducido a A/2. No es difcil deducir de [13] que el semiperodo t
1/2

es igual a

[14]
t
1/2
= ln2/k


________________________________________

Ejemplos:

(a) La desintegracin de un elemento radioactivo es un proceso de primer orden. Por tanto,
si conocemos la constante k (que en este caso se llama constante de desintegracin) y la
actividad total A, podremos conocer la actividad A
t
en cualquier tiempo t pasado o futuro.
En este principio se basan los mtodos de datacin radioqumica de muestras biolgicas,
midiendo la cantidad de
14
C que permanece en una muestra y calculando el perodo de
tiempo que ha tenido que transcurrir a partir de una proporcin de
14
C igual a la de los seres
vivientes.

(b) Otro mtodo de datacin de muestras biolgicas consiste en la medicin de la relacin
D-aspartato/L-aspartato. Teniendo en cuenta que en un ser viviente todo el cido asprtico
23

presente lo est en forma L-, y que el D-aspartato se forma por racemizacin del ismero
L- despus de la muerte, siendo ste un proceso de primer orden, conocida dicha relacin
en la muestra se puede calcular el perodo aproximado de muerte de la muestra biolgica.
(c) La inactivacin de enzimas por agentes fsicos o qumicos es muy a menudo un proceso
de primer orden. As, en algunos procesos patolgicos, como el infarto de miocardio, la
destruccin de las clulas hace que se vierta su contenido a la circulacin sangunea. Entre
los componentes celulares vertidos a la sangre se encuentran muchas enzimas; alguna de
ellas, como la creatin kinasa, nos sirven para diagnosticar la presencia de un infarto.
Teniendo en cuenta que a lo largo del tiempo la actividad enzimtica en la sangre va
disminuyendo segn un proceso de primer orden, a partir de mediciones seriadas del
enzima podemos calcular la cantidad inicial vertida a la sangre, y de esta manera podemos
tener una idea de la extensin y gravedad del infarto.

(d) La inactivacin por calor de algunas enzimas, como la fosfatasa alcalina, sigue un proceso
de primer orden. Esta enzima se emplea como indicador de enfermedades seas o del rbol
biliar, entre otras; y las enzimas de distintas procedencias se pueden distinguir por su
estabilidad trmica. As, el semiperodo de inactivacin de la fosfatasa alcalina de origen
seo a 56 C es de dos minutos, mientras que el de la de procedencia heptica es de 7
minutos.

(e) La desaparicin de un componente (por ejemplo, un medicamento) de cualquiera de los
compartimentos lquidos del organismo sigue muchas veces una cintica de primer orden (y
a veces tambin de rdenes superiores). Teniendo presente este hecho, podemos hacer un
diseo racional de las pautas teraputicas para que la concentracin de medicamento se
mantenga en niveles ptimos.

________________________________________



1.2.1.4 La ecuacin [5] representaba la inversin de la sacarosa. En realidad se trata de una
reaccin bimolecular, en la que una molcula de agua ataca al enlace glicosdico constitudo
entre glucosa y fructosa. Sin embargo, las mediciones experimentales nos muestran que
aparentemente es una reaccin de primer orden. Ello es debido a que siendo uno de los
reactivos el agua y teniendo lugar la reaccin en solucin acuosa, el agua aparece a una
concentracin muy elevada (55.5 M) y en la prctica constante, ya que es mucho mayor que
la de reactivos y productos. Este tipo de procesos (de hecho, todas las reacciones de
hidrlisis en el medio biolgico) se comportan como si fueran de primer orden a pesar de
ser bimoleculares. Por ello reciben el nombre de procesos de pseudo primer orden.




1.2.2 Velocidad y temperatura: concepto de energa de activacin

24


En 1889, Arrhenius propuso que la dependencia de la constante de velocidad k en funcin
de la temperatura viene dada por la expresin

[15]
k = A exp(-E
a
/RT)

en la que R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta, A el llamado factor de
frecuencia y E
a
la energa de activacin. Tomando logaritmos en la expresin [15] llegamos a

[16]
ln k = -E
a
/RT + ln A

En la que vemos que una representacin del logaritmo de la constante de velocidad en
funcin del recproco de la temperatura absoluta 1/T nos da una recta cuya pendiente
es -E
a
/R y su corte en ordenadas ln A (figura 1.1) Por tanto, podemos calcular la energa de
activacin midiendo el valor de la constante de velocidad en funcin del recproco de la
temperatura y representando los datos conforme a la ecuacin [16], lo que se conoce como
representacin de Arrhenius.

Podemos dar una interpretacin de esta relacin de la siguiente forma: La temperatura es
una medida de la energa cintica media de las molculas de un reactivo. Para una
temperatura concreta T, las energas de las molculas se distribuyen conforme a una ley de
25

probabilidad no muy diferente de las que rigen para fenmenos aleatorios; habr un cierto
nmero de molculas con energa igual a la media, otras con energas superiores y otras con
energas inferiores. El factor exp(-E
a
/RT) (factor de Boltzmann) es precisamente la fraccin
de molculas con una energa igual o mayor a la requerida para reaccionar. El factor de
frecuencia, A, por su parte, tiene las mismas dimensiones que la constante de velocidad k, y
es proporcional a la frecuencia de colisiones entre las molculas, de ah su nombre.

La ecuacin de Arrhenius nos indica que las molculas reactivas deben alcanzar una energa
crtica E
a
antes de que puedan reaccionar. La figura 1.2, por su parte, nos muestra
grficamente el concepto de energa de activacin como la barrera que debe superarse para
alcanzar el complejo activo, de energa mxima, y a partir de l, caer del lado de los
productos. Por otra parte, en esta grfica se ve que el intercambio global de energa, E no
depende del camino que siga la reaccin, sino nicamente de los estados inicial y final.

La ecuacin [16] nos demuestra que la constante de velocidad se hace mayor a medida que
disminuye la energa de activacin. Como veremos, la accin de los catalizadores es
precisamente sta: Disminuir la energa de activacin gracias a situar los reactivos en un
entorno fsicoqumico ms favorable a su interaccin.


_______________________________________

Las representaciones de Arrhenius no se utilizan solamente en el campo de la qumicofsica.
26

Una descripcin rigurosa del efecto de la temperatura sobre cualquier fenmeno biolgico
debe hacerse en base a este tipo de representaciones. Por ejemplo, el estudio del efecto de
la temperatura sobre la funcin cardiovascular en animales poiquilotermos, como los
reptiles, se hace mediante representaciones de Arrhenius. Puede observarse que hay
variables, como la frecuencia cardaca, que dentro de ciertos lmites siguen una relacin
similar a la ecuacin [1.16].

A veces se emplea el ndice Q
10
; si a es el valor de una variable a la temperatura T, y a' el
valor de la misma a la temperatura T+10, el Q
10
es el cociente a'/a. Un valor grande de este
ndice denota una fuerte dependencia de la temperatura. Una regla emprica aproximada
para las reacciones qumicas en general es que su Q
10
es aproximadamente de 2 (pero como
toda regla emprica debe utilizarse con suma cautela).
_________________________________________




1.2.3 Catlisis

Las velocidades de reaccin se ven alteradas por la presencia de catalizadores. El trmino
catlisis fue propuesto por Berzelius en 1835 para describir la accin de sustancias que "por
su mera presencia inducen reacciones qumicas que no tendran normalmente lugar en su
ausencia". Hay una serie de ideas centrales respecto al fenmeno de catlisis:

1.2.3.1 Los catalizadores no entran en la ecuacin estequiomtrica global

Esto quiere decir que aun cuando participan en la reaccin, los catalizadores no sufren
cambio alguno por efecto de la misma, o si lo sufren, en el transcurso de la reaccin vuelven
a su estado original; de esta forma, en la ecuacin estequiomtrica global apareceran
iguales tanto en el trmino de la derecha como en el de la izquierda, por lo que pueden ser
eliminados de la misma.

Una reaccin cualquiera A B catalizada por X puede representarse como

[17]
A + X B + X
con los pertinentes pasos intermedios, si los hubiere; por ejemplo,

[18]
A + X AY BX B + X
Por esta razn, las reacciones catalizadas siempre pueden representarse como un proceso
cclico (figura 1.3). Este hecho tiene particular importancia en el metabolismo, en el que las
vas cclicas (como el ciclo de Krebs, por ejemplo), se comportan catalticamente.
27



1.2.3.2 Los catalizadores no alteran la posicin de equilibrio de la reaccin


Antes hemos visto la relacin entre la energa libre standard G
0
y la constante de
equilibrio de una reaccin, K
eq
. Siendo la energa libre una magnitud termodinmica de
estado, su variacin depende nicamente de los estados inicial y final, y no del camino
seguido en la transformacin. Como la constante de equilibrio es funcin de la energa libre
standard, podemos decir lo mismo de la posicin de equilibrio. Por lo tanto, esta posicin es
independiente del camino seguido por la reaccin, con o sin catalizador. Lo que altera el
catalizador es la velocidad de la reaccin. Ostwald demostr que un catalizador que alterara
la posicin de equilibrio de una reaccin entrara en contradiccin con el Primer Principio de
la Termodinmica.

Por otra parte, dado que un catalizador no modifica la posicin de equilibrio de una
reaccin, pero altera su velocidad, debemos concluir que los catalizadores alteran tanto la
reaccin directa como la inversa, y en la misma medida.

Sea la reaccin reversible

[19]
A B
k
d
k
i

28


en la que k
d
es la constante de velocidad directa y k
i
la inversa. En este caso, K
eq
= k
i
/k
d
; si
K
eq
no se modifica por la accin del catalizador, pero aumenta k
d
, tiene necesariamente que
aumentar k
i
.





1.2.3.3 Los catalizadores modifican la energa de activacin.


Segn la teora de las colisiones, para que se produzca una reaccin entre tomos o
molculas, stas deben primero colisionar entre s. De esta forma se explica que a una
mayor concentracin de reactivo se acelere la reaccin. Ahora bien, no todas las colisiones
son eficaces; para que lo sean se necesita que las molculas reaccionantes posean una
cierta energa cintica y adems, que las molculas entren en colisin con la orientacin
precisa.

Los catalizadores permiten un nivel energtico ms bajo, bien sea por introducir un nuevo
agente en la reaccin que posteriormente se regenera (por ejemplo, en la catlisis especfica
cido-base), o bien por permitir el encuentro de las molculas en la orientacin adecuada
(caso de la catlisis heterognea). En todo caso, la accin del catalizador se traduce en una
disminucin de la energa de activacin, haciendo ms grande el factor de Boltzmann, y por
tanto, aumentando el nmero de molculas con capacidad de reaccionar en unas
condiciones dadas (figura 1.4)
29


________________________________________

Una reaccin ampliamente estudiada y de gran importancia industrial es la sntesis de
amonaco por el proceso Haber, en el que se hace reaccionar nitrgeno e hidrgeno en fase
gaseosa para producir amonaco:

[20]
N
2
+ 3H
2
2NH
3
G
0
= -91.83 kJ/mol

A pesar del valor negativo de G
0
, que nos indica que el equilibrio favorecer la formacin
de amonaco, la reaccin es extraordinariamente lenta, y para que se lleve a cabo se
necesitan temperaturas de 450 C y presiones que van de 200 a 1000 atmsferas. El
amonaco as obtenido se utiliza ampliamente en la fabricacin de fertilizantes, explosivos,
fibras sintticas, etc., de tal manera que la cantidad total de amonaco producido por la
industria qumica viene a ser de unas 510
7
Tm/ao.

Los seres vivos, en concreto las llamadas bacterias fijadoras de nitrgeno, realizan un
proceso que globalmente es anlogo al de Haber, fijando el nitrgeno atmosfrico a
compuestos amnicos como los aminocidos, pero en una magnitud global mucho mayor;
por esta va se incorporan aproximadamente 1.7510
8
Tm/ao. Lo realmente notable es que
este proceso tiene lugar a presin atmosfrica y a la temperatura del suelo, que es donde
residen las bacterias capaces de realizar esta funcin (gneros Rhizobium, Azotobacter,
Clostridium, etc.). Estas cifras nos dan idea de la extremada eficiencia de los catalizadores
30

biolgicos, capaces de reducir la energa de activacin hasta hacer posible un proceso a
temperatura y presin ambientales que de otra forma (e incluso en presencia de
catalizadores metlicos) requiere unas condiciones mucho ms extremas, y por tanto,
consumidoras de energa.
_______________________________________


1.2.3.4 Catlisis homognea y heterognea

Se suele distinguir entre catlisis homognea, en la cual toda la reaccin tiene lugar en la
misma fase fsicoqumica, y catlisis heterognea, en la cual la reaccin ocurre en una
interfase (lquido-slido, gas-slido, gas-lquido), tambin llamada catlisis de superficie. La
catlisis homognea de mayor inters para nosotros es la que tiene lugar en solucin, y
particularmente la catlisis general cido-base o la catlisis especfica cido-base, que
estudiaremos con mayor detenimiento en un captulo posterior.

La catlisis heterognea tiene lugar en superficies, normalmente de partculas slidas
finamente divididas (con lo que se incrementa la superficie activa del catalizador), mediante
la adsorcin de molculas a dicha superficie. De esta manera los reactivos se encuentran a
una concentracin local mucho mayor en la superficie del catalizador y en orientaciones
ptimas para producir la reaccin. Aun cuando no podemos discutir con la extensin
adecuada este tema, es importante sealar que el primer tratamiento cuantitativo sobre la
adsorcin a slidos fue el publicado por Langmuir en 1916; segn este autor, la adsorcin
de gases a slidos sigue la relacin

[21]

bP
bP
+
=
1
u

en donde es la fraccin de sitios en el slido ocupados por el gas, es decir, el cociente (n
de sitios ocupados/n de sitios totales), b es una constante emprica (determinada a partir
de medidas experimentales), y P es la presin parcial del gas (equivalente a lo que en una
solucin sera su concentracin). Al estar definida para una temperatura dada, la relacin
[21] recibe el nombre de isoterma de adsorcin de Langmuir.

No es exagerado afirmar que esta relacin es una de las ms importantes en el campo de la
qumica biolgica. Como veremos, en la catlisis enzimtica hay componentes de catlisis
homognea (general y especfica cido-base, por ejemplo), y de catlisis heterognea
(puesto que la reaccin se lleva a cabo en una zona concreta de la superficie del enzima).
Por esta ltima razn, las mejores descripciones cuantitativas de la catlisis enzimtica se
hacen en base a expresiones anlogas a la isoterma de adsorcin de Langmuir (por ejemplo,
la ecuacin de Michaelis-Menten):

[22]
31


s K
s V
v
m
+
=
max


que relaciona la velocidad de una reaccin enzimtica, v, con la concentracin de substrato,
s, y dos constantes empricas, K
m
y V
max
, y que estudiaremos muy detenidamente en los
siguientes captulos. Obsrvese que al dividir ambos miembros de la ecuacin [22] por V
max
,
obtenemos

[23]

s K
s
V
v
m
+
= = u
max


dividiendo numerador y denominador por K
m
, y llamando b = 1/K
m
,

[24]

bs
bs
+
=
1
u

Anloga a la isoterma de adsorcin de Langmuir en [21].

32



CAPITULO 2: Catlisis enzimtica: trminos, conceptos y
caractersticas generales





Los seres vivientes se caracterizan por llevar a cabo varios miles de reacciones qumicas
diferentes, a cuyo conjunto damos el nombre de metabolismo. Estas reacciones no tienen
lugar aleatoriamente; en lneas generales, los fines que persiguen son los siguientes: (a)
proveer a la clula de energa en una forma directamente aprovechable; (b) sintetizar los
elementos plsticos necesarios en la estructura celular; (c) generar y procesar seales
informativas a efectos regulatorios y adaptativos; y (d) propagar y mantener la informacin
gentica propia de la especie. La mera enumeracin de estos fines nos da una idea de la
complejidad de los sistemas bioqumicos, y de las complicadas reagrupaciones moleculares
que tienen lugar en el metabolismo. Todas las reacciones que en un momento dado tienen
33

lugar en la clula cursan, como es lgico, en el sentido de un incremento negativo en
energa libre en la forma definida por la ecuacin 1.2 del captulo anterior. Ahora bien, la
gran mayora de ellas seran extremadamente lentas para el ritmo temporal propio de los
seres vivientes; por eso todas ellas, o al menos la gran mayora, son reacciones catalizadas, y
llamamos enzimas a estos catalizadores. Pero a diferencia de otros catalizadores que
emplea la Qumica, las enzimas tienen la particularidad de ser especficas para cada
reaccin. No sera rigurosamente exacto, pero tampoco muy alejado de la realidad, afirmar
que en el metabolismo hay tantas enzimas como reacciones; en otras palabras, cada
reaccin tiene su enzima especfica. Uno de los criterios exigidos cuando se propone
tericamente una va metablica estriba en el hallazgo de una enzima especfica para cada
uno de los pasos postulados.

En este captulo vamos a tratar de ofrecer una idea de las caractersticas ms
relevantes de la catlisis enzimtica, como la naturaleza proteica de las enzimas, su
especificidad y su eficiencia como catalizadores. Antes de entrar a estos apartados, vamos a
definir algunos trminos comnmente empleados en Enzimologa, y de los que se har
amplio uso en el presente estudio.


2.1 Conceptos y trminos


2.1.1 Enzima

Siguiendo la definicin de Dixon y Webb, llamamos enzima a "una protena dotada de
actividad cataltica debida a su capacidad de activacin especfica". Son varios los puntos
que merecen comentario en esta definicin.

En primer lugar, y ya desde el principio hacemos alusin al carcter proteico de las
enzimas. Este concepto predomin en la Bioqumica hasta que en la dcada de los 80 del
pasado siglo se descubrieron RNAs con actividad cataltica (ribozimas). No obstante, casi
todas las enzimas conocidas son protenas, y en este curso partiremos de esa base. En la
mayora de los casos, la actividad enzimtica se debe a los grupos qumicos propios de las
protenas. Esto no excluye que en determinadas ocasiones (a) la actividad cataltica est
ligada a grupos no proteicos asociados a la enzima; o bien (b) el caso citado de las ribozimas,
molculas de RNA dotadas de actividad cataltica. Pero estas excepciones no contradicen en
absoluto el principio antes citado. Ms adelante se discutir con mayor profundidad este
concepto.

Al hablar de "capacidad de activacin" estamos dando a entender la accin propia de
todos los catalizadores, esto es, la disminucin en la energa de activacin. Pero tambin
aludimos al modo de accin concreto de las enzimas. Como veremos, la accin enzimtica
procede gracias a la formacin de un complejo enzima-substrato, que no hay que confundir
con el "complejo activo" de la cintica qumica; el complejo enzima-substrato (complejo ES)
34

es una entidad bastante ms estable, y representa un mnimo local de energa potencial en
la coordenada de reaccin (figura 2.1), a diferencia del complejo activo, que es un mximo.


Por ltimo, el adjetivo "especfica" se refiere a una caracterstica general y propia de
todas las enzimas, consistente en su capacidad para catalizar slo una o unas pocas
reacciones similares (a diferencia de los catalizadores convencionales) y que se tratar ms
adelante con mayor detenimiento. Su generalidad es motivo suficiente para que entre en la
definicin de enzima.

2.1.1 Substrato

Denominamos substrato a la sustancia sobre la que acta la enzima, y a quien se
refiere por otra parte la especificidad de la misma. Tngase en cuenta que la gran mayora
de las enzimas tienen ms de un substrato; las reacciones estrictamente monosubstrato son
la excepcin. Igualmente, el substrato entra a formar parte del complejo ES al interaccionar
con los grupos activos de la enzima.

2.1.3 Centro activo

Es la regin de la molcula de enzima que fija el substrato y contiene los grupos qumicos
que lo transforman. Ntese que el concepto de "centro activo" indica un carcter
heterogneo en la catlisis enzimtica, en el sentido de que el substrato es fijado a la
molcula de enzima en un sitio especfico. Como veremos, la razn molecular de la
especificidad radica en la configuracin tridimensional, altamente precisa, del centro activo.
En lneas generales, existe un solo centro activo por molcula de enzima o protmero (vase
ms adelante). Conviene pensar en el centro activo como realizando dos funciones: una, la
35

fijacin especfica del substrato; otra, su transformacin. En muchos casos estas funciones
no son estrictamente disociables; an as, nuestra idea de la catlisis enzimtica se ve
facilitada por esta distincin.

Hoy da disponemos de las estructuras tridimensionales de muchas enzimas. Muy a menudo
se logra la cocristalizacin de la enzima con su substrato o un anlogo del mismo. En la
figura 2.2 se presenta la estructura de la ribonucleasa pancretica unida a un anlogo de
substrato, un oligodesoxinucletido (que se fija a la enzima pero no reacciona por no
disponer de un 2-OH).



2.1.4 Protmero

Es ste un trmino introducido por Monod, Wyman y Changeux. Alude a que al poseer
estructura cuaternaria la mayor parte de las enzimas, a veces de una gran complejidad,
llamamos protmero a la mnima parte de la molcula capaz de exhibir actividad
enzimtica, o lo que es lo mismo, la parte de la molcula que configura un nico centro
activo. Protmero y subunidad son, en ocasiones, equivalentes: as, la
gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa de msculo de conejo posee cuatro subunidades
idnticas, todas ellas activas. Pero en otras ocasiones, como en la aspartato
transcarbamilasa, un protmero consta de ms de una subunidad; la enzima necesita dos
subunidades tipo C (la estructura cuaternaria es C
6
R
6
) para configurar un centro activo. Las
36

asociaciones de protmeros y subunidades tienen un importante papel en los fenmenos de
regulacin enzimtica.


2.1.5 Actividad enzimtica

Entendemos por actividad enzimtica la velocidad con que transcurre una reaccin
catalizada por una enzima. Ntese que exclumos cualquier otro significado que pueda
atribuirse al trmino "actividad"; una enzima muy activa, en el presente estudio, significa
que est catalizando muy rpidamente una reaccin. La velocidad de una reaccin
enzimtica es en todo momento directamente proporcional a la concentracin de enzima;
por tanto, la actividad es una medida de la concentracin de enzima.

La actividad enzimtica se expresa en unidades de velocidad (concentracin/tiempo). En
principio se utilizaban unidades arbitrarias, derivadas del mtodo de ensayo, y a la unidad se
le sola dar el nombre del autor del mtodo. As se hablaba de unidades Bodansky, unidades
Karmen, unidades Rosalki, etc.etc. Posteriormente se normaliz la medida de la actividad
enzimtica en (a) la Unidad Internacional y (b) el katal.

La Unidad Internacional (UI) es la actividad enzimtica que transforma un mol de substrato
por minuto a 25 C y en condiciones ptimas de pH. Esta unidad fue la recomendada por la
I.U.B. hasta que con la adopcin del sistema SI de unidades fue necesario definir el katal.

El katal (kat) es la actividad enzimtica que transforma un mol de substrato por segundo, sin
referirse a ningn otro tipo de condicin. Puede observarse que el katal es una unidad
muchsimo ms grande que la UI (1 kat = 6.10
7
UI). Por esa razn se prefieren submltiplos
del mismo, como el kat o el nkat.

Es importante insistir en la equivalencia actividad - concentracin. Ya hemos tenido ocasin
de comentar que en muchas circunstancias patolgicas el contenido celular de los tejidos
daados se vierte a la sangre, y por esa razn podemos estimar la magnitud del dao
midiendo la cantidad de una enzima "marcadora" presente en el suero. Resulta a veces
sorprendente que esta cantidad sea medida como "UI/L" o "kat/L". Pero dada la
proporcionalidad directa entre actividad y concentracin enzimtica, tan vlida es esta
forma de expresin como la de g/L o mg/L, por ejemplo.


2.1.6 Actividad especfica, actividad molecular, nmero de recambio

Se define la actividad especfica como la actividad por unidad de masa de protena en la
preparacin enzimtica. Es ste un trmino ampliamente utilizado en la purificacin de
enzimas. En una preparacin cruda de enzima, existe una gran cantidad de protena
contaminante, que no tiene nada que ver con la enzima que tratamos de purificar. A
medida que la purificacin avanza, vamos eliminando la protena contaminante. Si la
purificacin va bien, se conserva la actividad enzimtica pero aumenta la actividad
37

especfica. Es obvio que la actividad especfica a lo largo de una purificacin llega a un lmite
superior correspondiente a la actividad intrnseca de la enzima pura.

Cuando conocemos el peso molecular de la enzima, podemos medir la actividad molecular
como actividad enzimtica por mol de enzima. Si conocemos el nmero de centros activos
por molcula de enzima, podremos expresar la actividad del centro cataltico como moles
de substrato transformados por mol de centro activo y por segundo. Esta ltima medida de
actividad era conocida tambin como nmero de recambio o nmero de turnover.


2.1.7 Inhibidor

Es el agente cuya presencia en la reaccin hace disminuir la actividad enzimtica. Existen
inhibidores que alteran irreversiblemente la estructura de la enzima y su efecto, por tanto,
no desaparece al eliminar el inhibidor. Son los llamados inhibidores irreversibles. Otros, por
el contrario, se fijan reversiblemente a la molcula enzimtica y su efecto desaparece
cuando son eliminados: son los inhibidores reversibles. El estudio de la inhibicin enzimtica
es de suma importancia, y le dedicaremos todo un captulo.


2.1.8 Activador

Es el agente cuya presencia en la reaccin hace que aumente la actividad enzimtica. El
fenmeno de activacin es un tanto ms ambiguo que el de inhibicin, ya que en algunas
ocasiones se trata de un componente cuya presencia en la reaccin es obligatoria, como por
ejemplo los activadores metlicos, mientras que en otras es un efector de alguna regulacin
fisiolgica, o incluso un agente capaz de restaurar la estructura nativa de la protena
enzimtica, perdida en parte por las maniobras experimentales de purificacin y ensayo
(caso de los compuestos -SH como mercaptoetanol y ditiotreitol).

2.1.9 Coenzima

Es un componente adicional, aparte de enzima y substrato, que es necesario para la
reaccin enzimtica, y que tiene la particularidad de participar en muchas reacciones
enzimticas diferentes (aunque generalmente del mismo tipo). Algunas de ellas (como los
nucletidos flavnicos, figura 2.3) suelen volver al estado original al trmino del ciclo
reactivo, y hay autores que reservan el trmino coenzima para stas. Otras, por el contrario,
aparecen modificadas al trmino de la reaccin (como los nucletidos de nicotinamida,
figura 2.4) y en la misma lnea sera preferible el trmino de cosubstrato; ambos tipos de
agentes, en conjunto, seran los cofactores. En el presente trabajo, sin embargo, no se har
esta distincin terminolgica, y utilizaremos indistintamente estos trminos.
38



Ya desde aqu es interesante sealar la relacin que existe entre los trminos de coenzima y
39

vitamina. Muchas coenzimas tienen estructuras qumicas complejas que no pueden ser
sintetizadas por nuestro organismo. Por lo general, no se trata de toda la molcula, sino tan
solo de una parte. Esta porcin no sintetizable debe necesariamente ingresar en el
organismo con la dieta, y por ello son factores obligatorios en la alimentacin: muchos de
ellos son lo que llamamos vitaminas. Ahora bien, conviene no confundir los trminos: ni
todas las coenzimas son vitaminas, ni todas las vitaminas forman parte de coenzimas, al
menos en el sentido restringido en el que han sido definidos aqu.

2.1.10 Isoenzima

Las grandes vas metablicas son comunes a todos los seres vivos, y se llevan a cabo gracias
a enzimas que catalizan la misma reaccin aunque tengan estructuras moleculares
diferentes. Pero este fenmeno no se da solamente entre diferentes especies, sino entre
diferentes rganos y tejidos del mismo individuo. As, por ejemplo, la hexokinasa (ATP:D-
hexosa fosfotransferasa), enzima que permite la entrada de glucosa en el metabolismo a
travs de su transformacin en glucosa-6-fosfato, presenta diferentes formas segn el
tejido de procedencia: hexokinasa cerebral, hexokinasa muscular, hexokinasa heptica, etc.,
cada una de ellas con diferente estructura molecular.



2.2 Naturaleza qumica de las enzimas


Hoy da sabemos por un impresionante cmulo de evidencia que la gran mayora de
enzimas son protenas. Este concepto, que hoy se da por hecho, ha recibido sin embargo a
lo largo de muchos aos, hasta aproximadamente la mitad del siglo pasado, mltiples
ataques que curiosamente se han basado en la extremada eficiencia cataltica de las
enzimas. As, durante las primeras dcadas del siglo, no se dispona de mtodos
suficientemente sensibles para la deteccin de las minsculas concentraciones proteicas
que se dan en algunas preparaciones enzimticas purificadas. Por tanto, al persistir en ellas
sin embargo una apreciable actividad enzimtica, poda ser lgico pensar que la actividad
cataltica no estaba ligada a las protenas; en todo caso, stas podran ser un mero
"soporte" de la actividad enzimtica. Este hecho, unido al estudio qumico de muchos
enzimas en los que el centro activo estaba constitudo por un grupo prosttico (flavnico o
porfirnico, por ejemplo), y por tanto, no proteico, eran los principales argumentos que se
esgriman contra el concepto de la naturaleza proteica de las enzimas.

Sin embargo, dicho concepto ha prevalecido de tal manera que hoy nadie duda de la
naturaleza protenica de las enzimas. El fallo en le deteccin de protena era debido, como
se dijo, a la inadecuacin de los mtodos cuantitativos para detectar cantidades muy
pequeas de protena, junto con las impresionantes cifras de actividad molecular de
algunos enzimas. En cuanto a los grupos prostticos detectados en algunos enzimas, hoy da
sabemos que son efectivamente parte del centro activo enzimtico, pero su reactividad y su
40

funcin biolgica, en definitiva, se deben al entorno proteico de la apoenzima (Cuando una
enzima presenta un grupo prosttico, denominamos holoenzima a la enzima completa, y
apoenzima a la parte especficamente proteica de la misma).

Repasaremos a continuacin las principales lneas de evidencia que nos llevan a afirmar
categricamente la naturaleza proteica de las enzimas.

1. Una de las primeras observaciones a este respecto fue que la actividad enzimtica puede
ser eliminada de una preparacin mediante tratamiento de la misma con enzimas
proteolticas, como pepsina, tripsina o quimotripsina.

2. Anlogamente, la actividad enzimtica desaparece de las muestras biolgicas con
aquellos tratamientos capaces de desnaturalizar las protenas: calor, interfases, solventes
orgnicos, reactivos de grupos -SH, urea, guanidina, extremos de pH, etc.

3. Los mismos procedimientos que se emplean en la purificacin y aislamiento de protenas
son los adecuados para la purificacin de enzimas; por ejemplo, precipitacin isoelctrica,
precipitacin salina, cromatografa y electroforesis. En estadios avanzados de purificacin,
por ejemplo, la electroforesis de protenas llega a presentar una nica banda a partir de
preparaciones enzimticas purificadas.

4. El peso molecular de las enzimas, en aquellos casos en que puede ser determinado, es
compatible con una estructura proteica.

5. Un importantsimo avance en la determinacin de la naturaleza qumica de las enzimas
fue la cristalizacin de la ureasa por Sumner en 1926. A falta de otros mtodos ms
avanzados para definir criterios de pureza, durante mucho tiempo se consider que la
obtencin de un compuesto en estado cristalino era la mxima purificacin posible. Una
enzima en estado cristalino, y dando todas las reacciones propias de una protena,
constituy una importante evidencia a favor de la naturaleza proteica de las enzimas. Hoy
sabemos que los primeros cristales de Sumner contenan muchas impurezas. No obstante,
su trabajo fue seguido por los estudios de Northrop y Kunitz sobre la cristalizacin de
enzimas proteolticas digestivas. Hoy da se cuentan por centenares las enzimas que han
podido ser purificadas hasta la cristalizacin; todas ellas son protenas.

6. La prueba definitiva de estructura que se exige en Qumica es la sntesis a partir de la
estructura postulada. Pues bien, esto se consigui por vez primera en el caso de la
ribonucleasa pancretica. Independientemente, los grupos de Merrifield, en la Universidad
Rockefeller, y de Denkewalter y Hirschmann en la Compaa Merck, consiguieron la sntesis
por medios qumicos de esta enzima. Las propiedades de la enzima sinttica, includas por
supuesto las catalticas, son idnticas a la enzima natural.

7. Al aplicar a enzimas cristalinas los mtodos de difraccin de rayos X para el conocimiento
de su estructura terciaria, no solamente se ha comprobado su estructura proteica. Los
estudios de Phillips sobre la lisozima de clara de huevo, pioneros en este campo, pudieron
41

determinar incluso la disposicin molecular de los grupos enzimticos en relacin a la
estructura molecular del substrato, comprobando la complementaridad estereoespecfica
entre unos y otros y el papel determinante de algunos residuos en la accin cataltica. Se
dispone hoy da de estudios similares con muchas otras enzimas; los avances en
cristalografa de rayos X han llegado al punto de que la autntica dificultad de los mismos
sea lograr la cocristalizacin de enzima y ligando (substrato o anlogo estructural del
mismo).



2.3 La especificidad de las enzimas


La caracterstica diferencial ms llamativa de las enzimas en relacin a los catalizadores
inorgnicos radica en su especificidad. La mayor parte de las enzimas son nicamente
capaces de actuar sobre un substrato dado o a lo sumo sobre molculas muy parecidas al
mismo. No obstante, existen grados diferentes de especificidad, que van desde la absoluta
de aquellas enzimas que slo pueden actuar sobre un nico substrato a la relativa de
aquellas otras que reconocen a lo sumo un determinado grupo qumico, como ster o
amida. Veremos a continuacin algunos datos referentes a la especificidad enzimtica.




2.3.1 Especificidad sobre estereoismeros

Cuando el substrato tiene un centro de asimetra, la especificidad suele ser absoluta si el
grupo atacado est sobre el carbono asimtrico. As, las reacciones de oxidacin de los
hidroxicidos que contienen el grupo -CHOH- suelen ser absolutamente especficas hacia el
ismero L- o hacia el D-, no actuando la enzima en absoluto sobre el enantimero. Si el
carbono asimtrico est relativamente lejos del grupo atacado en la reaccin enzimtica, la
especificidad ya no es tan absoluta y puede haber un cierto grado de reactividad por parte
del enantimero; en otras ocasiones ste se comporta como inhibidor competitivo.

Por otra parte, las enzimas son capaces de llevar a cabo sntesis asimtrica, es decir, de
generar un solo enantimero a partir de un grupo simtrico. Por ejemplo, en la reduccin
del piruvato llevada a cabo por la lactato dehidrogenasa, encontramos que slo se produce
L-lactato (en el caso de la enzima de fuentes animales) o D-lactato (en la enzima procedente
de bacterias). Esta reaccin se presenta en la figura 2.4.

La especificidad suele ser absoluta asimismo en el caso de ismeros geomtricos (ismeros
cis-trans) cuando el grupo atacado es el que porta el doble enlace. Un caso particularmente
llamativo es el de la fumarato hidratasa, que presenta especificidad cis-trans absoluta hacia
el fumarato y especificidad ptica absoluta hacia el L-malato (figura 2.5)



2.3.2 Proquiralidad


Las enzimas son capaces de diferenciar grupos iguales en molculas simtricas, lo cual es
imposible por medios qumicos convencionales. As, en la molcula de citrato, la enzima
aconitasa ataca al grupo -CH
2
-COOH que procede de oxalacetato, mientras que no acta
sobre el grupo idntico procedente de acetato (vase figura 2.6).



Ogston ha explicado el fenmeno de proquiralidad en el sentido expresado en la figura 2.7:
Cuando un carbono C est sustitudo por dos grupos x, un grupo y y un grupo z (es decir,
cuando su estructura puede representarse como Cx
2
yz), caben dos formas de interaccin
con el centro activo de la enzima en el caso en que sean necesarios tres de los cuatro grupos
para la fijacin. Slo una ser la forma correcta, y de ese modo la enzima reconocer como
distintos los dos grupos idnticos.



2.3.3 Especificidad relativa

Algunas enzimas, particularmente esterasas, fosfatasas y peptidasas tienen una
especificidad muy dbil hacia sus substratos. As, las enzimas citadas nicamente reconocen
en sus substratos los grupos -CO-O- (esterasas), -CO-NH- (peptidasas) o -CH
2
-O-PO
3
H
2

(fosfatasas). No obstante, existen algunas enzimas de estos tres grupos que presentan
especificidad absoluta hacia sus substratos.


2.3.4 Especificidad en enzimas multisubstrato

Cuando la enzima cataliza una reaccin multisubstrato (lo cual es ms regla que excepcin
en Bioqumica), la especificidad suele ser absoluta hacia todos ellos. Esto ocurre
particularmente con las deshidrogenasas y las kinasas (bisubstrato) y las sintetasas
(trisubstrato). Como es lgico, existen tambin excepciones a esta regla. La alcohol
deshidrogenasa es completamente especfica hacia uno de sus substratos, la coenzima
NAD
+
, pero admite muchos tipos de alcohol como segundo substrato.



2.3.5 Especificidad en secuencias de nucletidos

Un interesantsimo grupo de enzimas, las endonucleasas de restriccin, ampliamente

utilizadas en la moderna tecnologa gentica, reconocen secuencias especficas en los cidos
nucleicos, a veces de hasta doce pares de nucletidos. As, la enzima EcoRI, enzima de
restriccin obtenida de E.coli, es capaz de reconocer especficamente la secuencia

-GAATTC-
-CTTAAG-

Por otra parte, las aminoacil-tRNA sintetasas son capaces de reconocer una secuencia
especfica en el tRNA propio del aminocido que activan; esta secuencia se sabe que es
diferente del anticodon.



2.4 Otros aspectos de la catlisis enzimtica


Ya mencionamos anteriormente que una de las caractersticas ms sobresalientes de las
enzimas es su extraordinaria eficiencia como catalizadores. Las actividades molares de las
enzimas oscilan entre 10 molculas por segundo y centro activo para las ms lentas hasta
cifras tan altas como 10
8
molculas por segundo y centro activo para las ms rpidas. Este
hecho, unido a la ya comentada especificidad de las reacciones enzimticas, hace que
muchos campos de la tecnologa moderna, particularmente los relativos al procesado de
alimentos o el reciclaje de residuos, por citar slo algunos, estn muy interesados en la
catlisis enzimtica en un doble sentido: (a) utilizacin de enzimas naturales aisladas de
fuentes biolgicas; (b) estudio de los mecanismos enzimticos al objeto de mejorar procesos
artificiales.

Por otra parte, las enzimas son catalizadores polivalentes en el sentido de que son muchos
los tipos de reacciones catalizadas por ellos, a pesar de que los mecanismos intrnsecos de la
catlisis enzimtica son relativamente pocos. Entre las reacciones catalizadas encontramos:
reacciones redox, transferencia de grupos, hidrlisis, deshidrataciones y decarboxilaciones,
fosforolisis, condensaciones aldlicas, reacciones de radicales libres, polimerizaciones,
etc.etc.



2.5 Teoras sobre la accin enzimtica


El carcter protenico de las enzimas lleva a pensar en una interaccin entre el substrato y
una porcin de la superficie de la protena enzimtica (el centro activo) para explicar la
accin de las enzimas. Por otra parte, el estudio cintico de las reacciones enzimticas nos
muestra (como veremos en captulos posteriores) que la accin procede a travs de la
formacin de un complejo enzima-substrato; para una reaccin monosubstrato,



E + S ES E + P


donde E es la enzima, S el substrato, P el producto de la reaccin y ES el complejo
enzima-substrato. La suposicin de que la reaccin tiene lugar en la superficie de la
molcula de enzima da un carcter de catlisis heterognea a la accin enzimtica, y de ah
que su velocidad pueda expresarse por una relacin anloga a la isoterma de adsorcin de
Langmuir, como veremos al estudiar la cintica enzimtica (la ecuacin de Michaelis-
Menten).

Pero por otra parte, la especificidad de las reacciones enzimticas nos indica que la
interaccin enzima-substrato est mediada a travs de una disposicin altamente precisa de
los grupos qumicos de la enzima, de forma que slo pueden entrar al centro activo las
molculas que encajen perfectamente en los mismos. De esta forma, una pequea variacin
en la estructura molecular del substrato podra impedir su fijacin al centro activo.

Estas ideas fueron adelantadas por Emil Fischer en 1894, cuando propuso su conocida
analoga de la llave y la cerradura para explicar la especificidad enzimtica; una enzima es
especfica hacia su substrato de la misma forma que una cerradura slo puede ser abierta
por una llave determinada. Esta idea se ha mantenido bsicamente inalterada durante
dcadas, y ha dado lugar a lo que podramos llamar el modelo de interaccin estereoqumica
que explica no slo la accin enzimtica, sino muchos otros fenmenos biolgicos que
tienen lugar a travs de la interaccin de una protena y un ligando (por ejemplo, la accin
hormonal y el efecto de frmacos).

A pesar de su general aceptacin, el modelo de llave y cerradura no explica algunos
fenmenos en Enzimologa. Para eliminar estos inconvenientes Koshland en 1959 ampli la
hiptesis de llave y cerradura para dar origen a la teora del ajuste inducido, segn la cual, la
fijacin del substrato al centro activo altera la configuracin de la enzima de modo que
acerca los grupos encargados de su transformacin a sus objetivos especficos. Este punto
de vista est ms de acuerdo con lo que hoy sabemos de la estructura proteica, que
imaginamos mucho ms flexible que lo que se supona; y asimismo encaja con el modo de
accin de los llamados efectores alostricos. Esto no quiere decir que se haya abandonado la
idea de llave-cerradura; de hecho, la accin de muchas enzimas se puede explicar en esa
lnea; el ajuste inducido no ha hecho sino ampliar su significado; en un smil mecnico,
podramos hablar de llaves y cerraduras flexibles para exponer nuestro actual concepto de
la accin enzimtica.

La teora del ajuste inducido conduce a un desarrollo ulterior sobre la accin enzimtica.
sta puede ser descrita en trminos de estabilizacin del estado de transicin. El estado de
transicin es una especie qumica inestable, situada en un mximo de energa potencial, con
una configuracin tridimensional que no es ni la de los reactivos ni la de los productos, sino
una forma intermedia. As, la fijacin al centro activo de la enzima depende de la disposicin
estereoqumica precisa y complementaria de una serie de grupos qumicos. Esta
complementaridad se refiere, pues, sobre todo al estado de transicin, y no a los reactivos o

productos en su estado basal. Este concepto ser analizado ms detenidamente en el
captulo 6 de esta obra, cuando se hable de los llamados anlogos de estado de transicin,
poderossimos bloqueadores de la accin enzimtica (figura 2.8).





CAPTULO 3: Clasificacin y nomenclatura de las enzimas.
Reacciones enzimticas




3.1 Principios generales de clasificacin y nomenclatura de enzimas



A lo largo del s.XIX y durante gran parte del XX no se dispona de una nomenclatura o
clasificacin sistemtica de las enzimas. El nombre de cada enzima reflejaba vagamente la
reaccin catalizada en el mejor de los casos, y no era en absoluto extrao encontrar
nombres nacidos directamente de la jerga del laboratorio descubridor: diastasa (separador,
por separar dextrinas solubles a partir de almidn insoluble); Zwischenferment (enzima
intermedia), Gelbferment (enzima amarilla), y otros que an siguen hoy en plena vigencia a
pesar de su inadecuacin o su falta de sistemtica descriptiva: catalasa, pepsina, tripsina,
etc. En otras ocasiones se pretenda reflejar el gnero o especie biolgica de procedencia;
as, la ficina, un grupo de enzimas proteolticas extradas del gnero Ficus, o la papana,
aislada del latex de la papaya. Por ltimo, y ya de una forma semisistemtica, se intentaba

denominar a la enzima por el substrato atacado y aadiendo al mismo el sufijo -asa: ureasa,
maltasa, tirosinasa, etc. El inconveniente de esta forma de denominacin era obvio: no
daba ningn detalle sobre el tipo de reaccin catalizada.

Para tratar de poner orden y dar lugar a un criterio uniforme de clasificacin, en los aos 50
del siglo pasado se constituy en el seno de la I.U.B. una Comisin para redactar una serie
de reglas a partir de las cuales la denominacin de las distintas enzimas fuera inequvoca.
Esta Comisin (Enzyme Commission, E.C.) present sus primeras propuestas al V Congreso
de la IUB celebrado en Mosc (1961), propuestas que han sido revisadas y perfeccionadas
varias veces y forman la base de la clasificacin que hoy se utiliza, aun cuando estas
recomendaciones no son ni mucho menos seguidas al pie de la letra en la bibliografa
bioqumica. Muy brevemente expondremos los principios generales de la Clasificacin
Internacional, que pueden encontrarse en las direcciones web
http://www.expasy.ch/enzyme/ (Base de datos ENZYME en el entorno ExPASy), y
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ (Nomenclatura de enzimas en la pgina de
la IUPAC IUBMB).


3.1.1 Nomenclatura

La clasificacin de las enzimas se hace sobre la base de la reaccin catalizada. sta, junto
con los substratos, forma el nombre completo de la enzima. Adems de este nombre
sistemtico, en muchas enzimas se recomienda tambin un nombre ms corto, en general
menos descriptivo pero ms consagrado por el uso. En todo caso las recomendaciones de la
E.C. cuidan que en estos casos no haya ambigedades o equvocos en la denominacin.
Adems del nombre sistemtico y del nombre usual, cada enzima es reconocida por un
nmero sistemtico formado por cuatro elementos numricos separados por punto y
precedido de las siglas E.C. Por ejemplo,

Acetil-CoA:colina O-acetiltransferasa (Nombre sistemtico)

Colina acetiltransferasa (Nombre recomendado)

[E.C. 2.3.1.6] (Nmero)


En el nombre sistemtico vemos: la reaccin catalizada (O-acetil transferasa) y el nombre de
los substratos (acetil-CoA y colina), en orden dador:aceptor. El nombre recomendado, colina
acetiltransferasa, sustituye al primitivo colinacetilasa con el que era conocido esta enzima.
El nmero consta de cuatro elementos; el primero [2] corresponde al grupo, en este caso el
grupo 2 (transferasas). El segundo y tercer elemento [3] y [1] son subgrupos y
sub-subgrupos de la clasificacin; y por ltimo, el cuarto elemento [6], la enzima individual.

Ahora bien, enzimas que catalizan una misma reaccin pueden proceder de muy diversas
fuentes (microorganismos, vegetales, animales), y vara ampliamente su estructura
molecular; igualmente, dentro de un mismo organismo, enzimas que catalizan la misma

reaccin pueden corresponder a estructuras moleculares distintas (isoenzimas). Por ello, se
suele aadir entre parntesis la fuente biolgica de la enzima, y en su caso el rgano; por
ejemplo,


[E.C. 2.7.1.1], ATP:D-hexosa fosfotransferasa, hexokinasa (cerebro de rata)




3.1.2 Clasificacin

La clasificacin de las enzimas se hace distribuyndolos en seis grupos conforme a la
naturaleza de la reaccin catalizada. El nmero de grupo (1-6) es el que aparece como
primer elemento en el nmero sistemtico de la enzima. Estos grupos son los siguientes:

1.Oxidorreductasas; 2. Transferasas; 3. Hidrolasas; 4. Liasas; 5. Isomerasas; y 6. Ligasas.

Pasamos a continuacin a un descripcin somera de estos grupos y sus principales
reacciones.





3.2 Reacciones enzimticas


En la exposicin que sigue, como regla general, no mencionaremos en este apartado a
efectos de brevedad enzimas que vamos a encontrar ms adelante en el curso, en la parte
correspondiente a metabolismo. Se ha seleccionado las reacciones ms ilustrativas de la
accin de cada grupo.




3.2.1 Grupo 1: Oxidorreductasas


Las oxidorreductasas son enzimas que catalizan reacciones de oxidacin-reduccin, que en
el medio biolgico tienen lugar a travs de la transferencia de electrones o tomos de
hidrgeno de un dador (reductor) a un aceptor (oxidante). Otras veces la reaccin consiste
en la incorporacin de tomos de oxgeno en el substrato. El nombre sistemtico de las
oxidorreductasas se forma as:


Dador:aceptor oxidorreductasa

Por ejemplo: Glucosa: O
2
oxidorreductasa, glucosa oxidasa, [E.C. 1.1.3.4]



3.2.1.1 Clasificacin sistemtica de las oxidorreductasas

En el nmero sistemtico de las oxidorreductasas, el primer dgito es el de grupo. Por ello
todas ellas llevan el nmero 1 en dicha posicin. El segundo elemento del nmero
sistemtico en las oxidorreductasas es el subgrupo. En la mayora de los casos, pero no en
todos, los subgrupos dependen de la naturaleza del dador electrnico. Por ejemplo (no
exhaustivo):

1.1.-.- Actan sobre grupos alcohol (-CHOH-)
1.2.-.- Actan sobre grupos aldehido u oxo (-CHO, -CO-)
1.3.-.- Actan sobre grupos -CH-CH-
1.4.-.- Actan sobre grupos -CH-NH
2

1.5.-.- Actan sobre grupos -CH-NH-
1.6.-.- Actan sobre NADH o NADPH

Y as hasta 20 subgrupos, constando cada uno, adems de varios sub-subgrupos.

En el contexto de esta obra, sera excesivo seguir al pie de la letra las recomendaciones de la
EC para hacer una descripcin elemental de las enzimas. Se ha presentado esta clasificacin
nicamente a efectos informativos.



3.2.1.2 Nomenclatura alternativa (recomendada) para las oxidorreductasas

Al tratar de oxidorreductasas es muy frecuente utilizar nombres abreviados o triviales.
Ahora bien, estos nombres aluden a categoras de oxidorreductasas que no se
corresponden, a veces en absoluto, con la clasificacin sistemtica. Por su inters, y su uso
generalizado, damos a continuacin alguno de estos nombres: Deshidrogenasas, Oxidasas,
Oxigenasas, Hidroxilasas o Reductasas. En cada caso se citarn una o dos enzimas
caractersticas de la categora.


3.2.1.3 Algunas reacciones enzimticas catalizadas por oxidorreductasas

- (a) Deshidrogenasas

La transferencia de electrones catalizada por estas enzimas se hace en forma de tomos de
hidrgeno (2 tomos, esto es, dos protones y dos electrones, o un ion hidruro H
-
, un protn
y dos electrones). Puede verse que en lo que respecta a la clasificacin anterior, podemos

encontrar deshidrogenasas en todos los grupos. Las deshidrogenasas utilizan siempre
alguna coenzima; por ejemplo, nucletidos de nicotinamida (NAD
+
, NADP
+
), nucletidos de
flavina (FAD, FMN), cido lipoico, cido ascrbico, quinonas, pteridinas, etc.


Un gran nmero de reacciones redox estn catalizadas por deshidrogenasas.

EC 1.1.1.1, Alcohol deshidrogenasa (ADH). Cataliza la oxidacin de alcoholes a aldehidos,
con NAD
+
como aceptor. Se trata de una importante enzima, implicada en el metabolismo
del etanol o alcohol etlico, siendo la ltima enzima del proceso de fermentacin alcohlica.
Tiene poca especificidad, dado que es capaz de oxidar un gran nmero de alcoholes
primarios o secundarios y hemiacetales. Es una metaloenzima, que contiene Zn o Fe.


CH
3
CH
2
OH
CH
3
CHO
NADH + H
+
NAD
+
Etanol Acetaldehido
EC 1.1.1.1







- (b) Oxidasas

Son las enzimas que utilizan como aceptor electrnico el oxgeno molecular, producindose
por lo general H
2
O
2
o H
2
O, o incluso el anin superxido O
2
-
,en el curso de la reaccin. Al
utilizar O
2
, estas reacciones son aerbicas, mientras que las catalizadas por deshidrogenasas
pueden tener lugar aerbica o anaerbicamente. Las oxidasas suelen ser flavoprotenas o
metaloprotenas, o ambas cosas a la vez; las reacciones que catalizan suelen ser bastante
complejas.

EC 1.1.3.4, Glucosa oxidasa. (GOD) Se trata de una enzima de origen fngico con una gran
cantidad de aplicaciones biotecnolgicas. Es una flavoprotena con estructura de
homodmero, y utiliza FAD como cofactor. La gran mayora de los mtodos actuales de
determinacin de glucosa en fluidos biolgicos se basa en la reaccin catalizada por esta
enzima.


O
OH
OH
OH
OH
HOCH
2
O
OH
OH
OH
HOCH
2
O
H
2
O
2
O
2
EC 1.1.1.34
D-Glucosa D-Gluconolactona



- (c) Peroxidasas

Utilizan perxidos (R-O-OH) y muy frecuentemente el perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) como
aceptores electrnicos. Hemos visto que este ltimo compuesto se produce muy
frecuentemente en las reacciones catalizadas por oxidasas, y puede resultar bastante
daino hacia las estructuras celulares. De ah que sean necesarias enzimas encargadas de su
reduccin a H
2
O. Este papel lo cumplen las peroxidasas. En general, las peroxidasas suelen
ser hemoprotenas, es decir, con un grupo prosttico porfirnico. Las peroxidasas
corresponden al subgrupo 1.11.-.- de la clasificacin sistemtica.

AH
2
+ H
2
O
2
A + 2H
2
O

EC 1.11.1.6 Catalasa. Pertenece a este grupo la catalasa, enzima que cataliza la
descomposicin de H
2
O
2
a H
2
O y oxgeno molecular O
2
. Es muy abundante en los leucocitos
polimorfonucleares, y es la responsible del burbujeo de oxgeno cuando la sangre entra en
contacto con perxido de hidrgeno (agua oxigenada).

2H
2
O
2
2H
2
O + O
2



- (d) Oxigenasas (no confundir con Oxidasas)

Introducen oxgeno molecular en la molcula de substrato, lo que resulta normalmente en
la apertura de una estructura cclica cuando la introduccin se hace en un enlace doble
(dioxigenasas), o bien se introduce un solo tomo de oxgeno y el otro se libera en forma de
agua (monooxigenasas). Aparecen en los subgrupos 1.13 y 1.14 de la clasificacin
sistemtica.


EC 1.13.11.5 Homogentisato-1,2-dioxigenasa. Forma parte de la va de degradacin de los
aminocidos fenilalanina y tirosina. Su carencia congnita conduce a la enfermedad
metablica conocida como alcaptonuria.


HO
OH
CH
2
COO
-
O
2
COO
-
O
O COO
-
Homogentisato Maleilacetoacetato



- (e) Hidroxilasas

Catalizan la introduccin de un tomo de oxgeno a partir de oxgeno molecular con
formacin de un grupo hidroxilo -OH, al tiempo que que un segundo dador electrnico
reduce al tomo de oxgeno restante. Como en el caso anterior, corresponden a los
subgrupos sistemticos 1.13 y 1.14.

EC 1.14.16.1, Fenilalanina 4-monooxigenasa (Fenilalanina hidroxilasa). Cataliza la
formacin de tirosina a partir de fenilalanina, introduciendo un grupo hidroxi- en el anillo
bencnico de la fenilalanina. Utiliza como correductor un biopterina reducida (representada
por AH
2
). Es una enzima clave en el metabolismo de los aminocidos aromticos, y su
deficiencia congnita conduce a una grave enfermedad congnita, la fenilcetonuria.
CH
2
C NH
3
+
H
COO
-
CH
2
C NH
3
+
H
COO
-
OH
AH
2
A
O
2
H
2
O
Fenilalanina Tirosina



- (f) Reductasas

Se trata de un nombre que se asigna sin ninguna sistemtica a muchas reacciones
catalizadas por oxidorreductasas, cuando la reaccin relevante, o de importancia biolgica,
es una reduccin.

EC 1.5.1.3, Dihidrofolato reductasa. Reduce el dihidrofolato a tetrahidrofolato, que es una
coenzima activa en la transferencia de grupos monocarbonados, de gran importancia en el
metabolismo de nucletidos (sntesis del anillo purnico). Por ello su inhibicin especfica se
emplea en la quimioterapia antineoplsica, mediante un inhibidor competitivo de esta
enzima, el methotrexate.



N
N
NH
NH
CH
2
R
OH
H
2
N N
N
NH
CH
2
NH
CH
2
R
OH
H
2
N
H
NADPH + H
+
NADP
+
Dihidrofolato
Tetrahidrofolato






3.2.2 Grupo 2: Transferasas



La reaccin general catalizada por este grupo de enzimas es

A-X + B A + B-X

En rigor, esta reaccin general sera asimismo vlida para las oxidorreductasas si el grupo
transferido X fuera un par electrnico, dos tomos de hidrgeno o un ion hidruro.
Asimismo, las hidrolasas catalizan una reaccin similar. Igualmente, las reacciones de
fosforolisis, similares a las de hidrlisis, son catalizadas por enzimas de este grupo que
reciben el nombre de fosforilasas. Desde el punto de vista de nomenclatura, las transferasas
forman su nombre sistemtico como

Dador:aceptor grupo-transferasa

y se clasifican conforme al grupo transferido.




3.2.2.1 Clasificacin sistemtica de las transferasas

Algunos de los subgrupos ms representativos de este grupo son:

2.1.-.-Transfieren grupos monocarbonados (-CH
3
, -CHO, -COOH, -CHNH
2
, etc.)
2.4.-.- Glicosiltransferasas
2.5.-.- Transfieren grupos alquil- o aril-, distintos del grupo metil-.
2.6.-.- Transfieren grupos nitrogenados
2.7.-.- Transfieren grupos fosforados



3.2.2.2 Algunas reacciones enzimticas catalizadas por transferasas


(a) Subgrupo 2.1: Transfieren grupos monocarbonados

El subgrupo 2.1 comprende a las transferasas de grupos monocarbonados, esto es, que
transfieren entre dador y aceptor los grupos metilo -CH
3
, hidroximetilo -CH
2
OH, formil -CHO
y formimino -CHNH. Las metiltransferasas utilizan normalmente como dador la coenzima
S-adenosil metionina (SAM); las transferencias de los restantes grupos se hacen a partir de
coenzimas folnicas. Estos ltimos tienen particular importancia en la sntesis de
nucletidos, entre otros procesos.

EC 2.1.1.6 Catecol-O-metiltransferasa (COMT). Transfiere el grupo metilo de la S-
adenosilmetionina (SAM) a un catecol aceptor. SAM se convierte en S-adenosil
homocistena (SAHC). Se trata de una reaccin de gran importancia en el catabolismo de
aminas neurotransmisoras (catecolaminas), como dopamina, adrenalina y noradrenalina.
Esta enzima funciona en combinacin con la aminooxidasa (monoaminooxidasa, MAO, EC
1.4.3.4) para dar los distintos catabolitos de estas aminas.


OH
OH
C HO H
CH
2
NH
3
+
OH
O
C HO H
CH
2
NH
3
+
CH
3
SAM
SAHC
Noradenalina 3-O-Metilnoradrenalina


(d) Subgrupo 2.4: Glicosil transferasas

En el subgrupo 2.4 estn las glicosiltransferasas, que transfieren restos glicosilo entre dador
y aceptor. En ocasiones el aceptor es fosfato inorgnico, y en ese caso hablamos de
fosforilasas. Estas reacciones suelen ser reversibles en las condiciones intracelulares, de
modo que la fosforilasa, por ejemplo, puede catalizar la transferencia de restos glicosdicos
desde un ster fosfato a una cadena de poli- u oligosacrido. Otras veces se transfiere todo
un segmento oligosacrido, como en el caso de la enzima ramificante del glucgeno.
Asimismo, muchas de estas enzimas utilizan como substratos derivados de
nuclesido-difosfatos, como el UDP, ADP o CDP. En este subgrupo encontramos enzimas de
una gran importancia metablica; adems de las ya citadas fosforilasas, tenemos todos los
implicados en la glucuronoconjugacin de compuestos, importantsima reaccin de los

procesos destoxificantes del organismo.


EC 2.4.1.1 Glucgeno fosforilasa. Esta enzima tiene una extraordinaria importancia
metablica, por cuanto que cataliza la reaccin de degradacin del glucgeno, heptico o
muscular. La reaccin de degradacin es una fosforolisis (de ah le viene el nombre a la
enzima) realizada sobre un residuo -1,4-glucosil situado en los extremos no reductores de
-glucanos como amilopectina, amilosa o glucgeno.

Utiliza como cofactor piridoxal fosfato.La enzima heptica controla, mediante esta reaccin,
el nivel de glucemia sistmica. Por ello no es de extraar que sea una enzima fuertemente
regulada; alostricamente, mediante una activacin ejercida por AMP e inhibicin por ATP,
ADP y glucosa-6-fosfato; y lo que es ms importante, a travs de una compleja cascada de
modificaciones covalentes, que se exponen detalladamente en el captulo 9 de esta obra.

Glucgeno (n) + Fosfato Glucgeno (n-1) + Glucosa-1-fosfato





(c) Subgrupo 2.6: transfieren grupos nitrogenados

Otro importante subgrupo de transferasas es el 2.6 que agrupa las enzimas encargadas de la
transferencia de grupos nitrogenados, y particularmente el 2.6.1 (aminotransferasas o
transaminasas). Estas ltimas catalizan el intercambio de un grupo amino entre un
aminocido y un cetocido; se trata de reacciones reversibles que utilizan como coenzima el
piridoxal fosfato. Una pareja aceptor-dador muy frecuente en estas reacciones es
oxoglutarato-glutamato. De esta manera en el catabolismo de los aminocidos el nitrgeno
amnico va concentrndose en forma de glutamato, para formar posteriormente amonaco
libre mediante la glutamato dehidrogenasa. Por otra parte, las aminotransferasas tienen
una gran importancia en Bioqumica Clnica, como elementos diagnsticos de enfermedades
hepticas y miocrdicas (v. cap. 14)



EC 2.6.1.1 Aspartato aminotransferasa (AST, glutamato-oxalacetato transaminasa, GOT).
Cataliza la transaminacin de aspartato (y tambin fenilalanina, tirosina y triptfano) a 2-
oxoglutarato, con formacin de glutamato y el correspondiente cetocido (oxalacetato en
caso de aspartato). Es una reaccin fcilmente reversible, de gran importancia en el
metabolismo de aminocidos. Es una enzima ampliamente distribuda por todos los tejidos
animales, siendo especialmente abundante en el hgado y en el msculo cardaco. Se trata
de un homodmero que utiliza piridoxal fosfato como cofactor (ver cap. 4) y que presenta en
eucariotas dos isoenzimas, una citoplsmica y otra mitocondrial. Su determinacin se
emplea ampliamente en Bioqumica Clnica como marcador de enfermedades hepticas y
cardacas, aunque se especificidad es menor que la de otras enzimas.


COO
-
C
CH
2
COO
-
H NH
3
+
+
COO
-
CO
CH
2
CH
2
COO
-
COO
-
CO
CH
2
COO
-
+
COO
-
C
CH
2
CH
2
COO
-
NH
3
+
H
Aspartato
o-Cetoglutarato
Oxalacetato
Glutamato


EC 2.6.1.2 Alanina aminotransferasa (ALT, glutamato-piruvato transaminasa, GPT). Se trata
de una reaccin muy similar a la anterior, aunque el substrato prcticamente nico es la
alanina, que cede su grupo amino al 2-oxoglutarato con formacin de piruvato y glutamato.
Al igual que la AST, requiere piridoxal fosfato, tiene gran importancia metablica, es un
heterodmero y presenta isoenzimas citoplsmica y mitocondrial. Es una enzima inducible
por glucocorticoides. A pesar de estar ampliamente distribuda, su valor como enzima
marcadora es bastante mayor que el de la AST, dado que es particularmente abundamente
en hgado. Todas las enfermedades del parnquima heptico cursan con elevaciones
sustanciales en sangre de la ALT (GPT).

COO
-
C
CH
3
H NH
3
+
+
COO
-
CO
CH
2
CH
2
COO
-
COO
-
CO
CH
3
+
COO
-
C
CH
2
CH
2
COO
-
NH
3
+
H
o-Cetoglutarato
Glutamato
Alanina
Piruvato






(f) Subgrupo 2.7: Fosfotransferasas o kinasas


El subgrupo 2.7 contiene a unas enzimas de gran importancia metablica y fisiolgica: las
fosfotransferasas. Dentro del mismo, los apartados 2.7.1 a 2.7.4 contienen las enzimas
llamados comnmente kinasas. Normalmente el compuesto dador es el ATP, o ms
propiamente, el complejo ATP-Mg
2+
. La importancia de estas enzimas deriva del hecho de
ser enzimas activantes de multitud de substratos, que entran en el metabolismo en forma
de steres fosfricos. En el subgrupo 2.7.7 encontramos las nucleotidil transferasas, entre
las que se encuentran enzimas como las DNA polimerasas y las RNA polimerasas.




EC 2.7.3.2, Creatinkinasa (CK, Creatinfosfokinasa, CPK). Cataliza la transferencia de un
fosfato desde el ATP a la creatina para formar creatinfosfato, un fosfgeno muy abundante
en tejidos cuyas necesidades energticas son grandes y pueden fluctuar ampliamente, como
el msculo esqueltico, corazn, cerebro y espermatozoides.

Se trata de una enzima homo- o heterodimrica formada por subunidades de tipo B o de
tipo M (existen adems otros dos tipos de subunidades de origen mitocondrial). As, las
isozimas de la CK pueden ser BB, MB y MM. La isozima BB es predominante en el tejido
cerebral, y la MM en el msculo esqueltico. La isozima MB est presente en el msculo
miocrdico y se utiliza en qumica clnica como enzima marcadora de infarto de miocardio,
siendo su nivel elevado un signo relativamente precoz del mismo, muy especfico y con
importancia pronstica.

NH
3
+
C HN
N
CH
3
CH
2
COO
-
NH
C HN
N
CH
3
CH
2
COO
-
P
O
O
-
O
-
ATP
ADP
Creatina
Creatinfosfato




3.2.3 Grupo 3: Hidrolasas



Son enzimas que catalizan reacciones de hidrlisis. La reaccin general catalizada puede
representarse como

A-B + H
2
O A-H + HO-B

El nombre de las hidrolasas se forma a partir del substrato seguido de "hidrolasa". Ahora
bien, el nombre comn o recomendado de estas enzimas se forma con el nombre del
substrato seguido del sufijo "asa"; es decir, en nombres como ureasa, fosfatasa, amilasa,
etc., se entiende que se trata de enzimas hidrolticas. En muchos casos, particularmente en
las proteinasas, se conservan nombres consagrados por el uso sin que tengan ninguna
sistemtica; por ejemplo, tripsina, pepsina, papana, ficina, etc.


3.2.3.1 Clasificacin sistemtica de las hidrolasas


Presentamos alguno de los subgrupos ms representativos.

3.1.-.- Hidrolizan enlaces ster
3.2.-.- Glicosidasas
3.4.-.- Pptido hidrolasas
3.6.-.- Hidrolizan acil-anhdridos


(a) Subgrupo 3.1. Hidrolizan enlaces ster


EC 3.1.1.7, Acetilcolinesterasa. Esta enzima hidroliza la acetilcolina a acetato y colina. y de
esta manera se interrumpe la accin de este neurotransmisor en los receptores colinrgicos.
Es el inactivador fisiolgico de este tipo de sinapsis. Por ello, los inhibidores de la
acetilcolinesterasa (por ejemplo, los organofosfricos, ver cap. 6) hacen persistir el efecto
de la acetilcolina, lo que en la placa neuromuscular se traduce en una activacin continua de
la misma, produciendo parlisis muscular (y en su caso la muerte a travs de la parlisis
respiratoria).

CH
3
CO O CH
2
CH
2
N
+
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
COO
-
CH
2
CH
2
N
+
CH
3
CH
3
CH
3
HO
H
2
O
Acetilcolina
Acetato Colina
+



EC 3.1.3.1, Fosfatasa alcalina. Hidroliza una gran variedad de steres fosfricos y se
caracteriza por tener un ptimo de pH alcalino (en torno a 10). Requiere para su actividad
zinc y magnesio. No se conoce con exactitud la funcin de esta enzima, que tambin cataliza
transfosforilaciones; no obstante, se cree que tiene un papel importante en los procesos de
osificacin. Es una enzima muy ampliamente distribuda y se presenta en muchas formas
isozimticas: placentaria, seudoplacentaria, intestinal y tisular (a su vez, con formas
heptica, sea y renal). Es un importante marcador en Bioqumica Clnica, sobre todo de
enfermedades del aparato hepatobiliar (p.e. colestasis) y del sistema seo (enfermedad de
Paget, tumores seos primitivos, metstasis seas de tumores, etc.)


EC 3.1.3.2, Fosfatasa cida. Hidroliza una gran cantidad de fosfomonosteres, y tambin es
capaz de catalizar transfosforilaciones, al igual que la fosfatasa alcalina. La principal
deiferencia con sta radica en su pH ptimo, que est entre 5 y 6, y de ah su nombre. Se
conocen varias isozimas de la fosfatasa cida: las isozimas S y F del hemate, variantes de la
ACP1; la ACP2, o fosfatasa cida lisosmica; la ACP5, o fosfatasa cida tartrato-resistente
(que aumenta en determinados estados patolgicos: enf. de Gaucher, enf. de Hodgkin,

ciertas leucemias linfocticas); y la ACPP o fosfatasa cida prosttica, que es un marcador
caracterstico de los carcinomas prostticos.

En ambas enzimas la reaccin es la siguiente:

R O P
O
O
-
O
-
H
2
O
+ R OH HO P
O
O
-
O
-
Fosfomonoster
Alcohol
Fosfato inorgnico





Subgrupo 3.2: Glicsido hidrolasas (glicosidasas)

Es un numeroso grupo de enzimas cuya accin consiste en la hidrlisis de enlaces
glicosdicos. Tienen un gran inters biotecnolgico, en las industrias del almidn, de la
celulosa y otros productos naturales (ver cap. 14). Se clasifican en tres subgrupos: 3.2.1,
rompen O-glicsidos; 3.2.2 rompen N-glicsidos; 3.2.3, rompen S-glicsidos. El mecanismo
de accin de todas ellas es similar, presentando dos residuos de aminocidos dicarboxlicos
(asprtico o glutmico) en el centro activo.


EC 3.2.1.17 Lisozima. Hidroliza los enlaces -glicosdicos establecidos entre residuos de N-
acetilmurmico y N-acetil glucosamina de los peptidoglicanos bacterianos. Se trata de una
enzima ampliamente difundida en la naturaleza, desde los bacterifagos hasta los
mamferos, y cumple una funcin esencialmente bactericida. Est presente en multitud de
secreciones (lgrima, clara de huevo, etc.) y su estructura y funcin estn muy bien
estudiadas. Fue la primera enzima que pudo estudiarse mediante cristalografa de rayos X
formando complejo con su substrato.



Subgrupo 3.4: Pptido hidrolasas

En el subgrupo 3.4 encontramos las pptido hidrolasas, que hidrolizan enlaces
peptdicos -CO-NH-. Normalmente se distingue entre peptidasas, antiguamente llamadas
exopeptidasas, de las proteinasas o endopeptidasas. Las primeras hidrolizan los enlaces
peptdicos situados en los extremos de la cadena; distinguimos as las aminopeptidasas, que
operan sobre el N-trmino, y las carboxipeptidasas, que lo hacen sobre el C-trmino. Las
proteinasas operan sobre enlaces peptdicos establecidos en el interior de las cadenas
polipeptdicas.


Las pptido hidrolasas se clasifican asimismo atendiendo al mecanismo cataltico. ste
puede ser de cuatro tipos distintos: (1) Presentan una serina en el centro activo,
acompaada de una histidina y un residuo dicarboxlico (aspartato o glutamato),
constituyendo lo que se llama una trada cataltica. Son las serin proteinasas. (2) Poseen en
el centro activo un grupo -SH de una cistena, siendo por lo dems el mecanismo cataltico
muy parecido al de las anteriores. Se conocen como tiol proteinasas. (3) El sitio activo es un
residuo dicarboxlico, normalmente cido asprtico: son las aspartil-proteinasas o
proteinasas cidas. (4) Otras tienen un ion metlico, generalmente Zn
2-
, vital para la
actividad cataltica: las metaloproteinasas.



(a) Serin proteinasas


EC 3.4.21.1, Quimotripsina. Es una enzima pancretica, producida como zimgeno en las
clulas acinares de este rgano, y que se activa proteolticamente en la luz intestinal. Es una
enzima muy bien conocida, siendo el prototipo de las serinproteinasas. Su centro activo est
configurado por los residuos de serina, histidina y asprtico y su modo de accin muy bien
estudiado (ver captulo 7). Tiene preferencia por enlaces -Tyr-X-, -Trp-X-, -Phe-X y -Leu-X.

EC 3.4.21.4 Tripsina. Es asimismo una enzima pancretica, producida como zimgeno que se
activa al ser secretado a la luz intestinal por la accin de la propia enzima o de la
enteropeptidasa (EC 3.4.21.9). Se trata tambin de una serin proteinasa con un centro
activo y un mecanismo cataltico muy parecido al de la quimotripsina. Rompe enlaces
constitudos por un aminocido dibsico y cualquier otro aminocido, es decir, -Arg-X y -Lys-
X

Entre las serinproteinasas tenemos asimismo una gran cantidad de factores de la
coagulacin sangunea, como por ejemplo la trombina.


(b) Tiol proteinasas

EC 3.4.22.2 Papana. Es el prototipo de tiolproteinasa, con un residuo de cistena en el
centro activo y un mecanismo cataltico similar al de las serinproteinasas (ver cap. 7). Se
extrae del latex de la papaya. Hidroliza una amplia variedad de enlaces peptdicos y tiene
muchas aplicaciones en la tecnologa de alimentos. Otras tiolproteinasas de origen vegetal
son la ficina y la bromelana.


(c) Proteinasas cidas

EC 3.4.23.1 Pepsina. Es el prototipo de proteinasa cida(o aspartilproteinasa).Se trata de la
enzima propia de la secrecin gstrica. Se produce como zimgeno (pepsingeno) en las
clulas principales de la mucosa gstrica y se activa a travs del pH cido del contenido

gstrico. Presenta cinco isoenzimas distintas, de las cuales la principal es la pepsina A. Tiene
preferencia por enlaces establecidos entre aminocidos hidrofbicos y o aromticos en
ambas posiciones respecto al enlace roto. Tiene la particularidad de tener un pH ptimo de
accin muy bajo, entre 0 y 2.


(d) Metaloproteinasas

EC 3.4.24.7 Colagenasa intersticial. Rompe las molculas de colgeno en el dominio
helicoidal, aproximadamente a las tres cuartas partes de la molcula desde el N-trmino.
Requiere un ion de zinc para su actividad cataltica.




Subgrupo 3.6: Acil anhdrido hidrolasas

En el subgrupo 3.6 encontramos las hidrolasas de anhdridos de cido. Tienen particular
importancia en este grupo las que hidrolizan anhdridos fosfricos, y sobre todo las
adenosin trifosfatasas o ATPasas. Son enzimas ampliamente distribudas y su accin est
acoplada a procesos de transporte inico y transduccin de energa; por ejemplo, la
Na
+
,K
+
-ATPasa de la membrana plasmtica, o la Ca
++
-ATPasa de la mitocondria.


EC 3.6.1.37 ATPasa transportadora de Na
+
-K
+
(ATPasa bomba de sodio). Se encuentra esta
enzima en la membrana plasmtica de las clulas animales, de las que forma parte integral.
La hidrlisis de ATP llevada a cabo por esta enzima est acoplada al transporte contra
gradiente de Na
+
y K
+
(sodio hacia el exterior y potasio hacia el interior celular). Por esta
razn tiene una extraordinaria importancia en todos los fenmenos celulares acoplados al
gradiente inico (como excitabilidad, p.e.). Es un heterotrmero , y su actividad puede
ser inhibida de forma caracterstica por los glicsidos cardiotnicos (digital, ouabana, etc.) y
por el anin vanadato.

EC 3.6.1.38 ATPasa transportadora de Ca
2+
(ATPasa bomba de calcio). Se encuentra
formando parte integral de las membranas del retculo endoplsmico, y su funcin consiste
en bombear contra gradiente iones de calcio hacia el interior de las vesculas. En el msculo
cumple una funcin destacada, ya que es el ion Ca
2+
el segundo mensajero que induce la
contraccin muscular. Esta ATPasa vuelve a integrar los iones liberados a sus depsitos en el
retculo sarcoplsmico (nombre especfico que recibe el retculo endoplsmico en la clula
muscular)..






3.2.4 Grupo 4: Liasas



Son enzimas que catalizan reacciones de rotura (o establecimiento) de un enlace de forma
que la reaccin puede describirse como adicin o sustraccin de un grupo a o desde un
doble enlace, y que normalmente suelen ser reversibles. Se caracterizan por tener un
substrato en una direccin y dos en la contraria. Esquemticamente las reacciones lisicas
pueden describirse como

A=B + X AXB

El nombre sistemtico de estas enzimas se forma as:

Substrato grupo-liasa

Por ejemplo: L-Malato hidro-liasa (Fumarato hidratasa, E.C.4.2.1.2)

Entre los nombre recomendados para estas enzimas, encontramos, por ejemplo,
descarboxilasas, enzimas que eliminan CO
2
; sintasas (no confundir con sintetasas), cuando
la reaccin relevante es la de unin; aldolasas, cuando catalizan condensaciones aldlicas;
hidratasas, cuando la reaccin consiste en una adicin de agua a un doble enlace.

La clasificacin de las liasas se hace conforme al enlace atacado.


3.2.4.1 Clasificacin sistemtica de las liasas

4.1.-.- Liasas C-C
4.2.-.- Liasas C-O
4.3.-.- Liasas C-N
4.4.-.- Liasas C-S
4.5.-.- Liasas C-halgeno
4.6.-.- Liasas P-O
4.99.-.- Otras liasas



3.2.4.2 Algunas reacciones enzimticas catalizadas por liasas

(a) Subgrupo 4.1: Liasas C-C

El subgrupo 4.1 contiene varios sub-subgrupos importantes de enzimas. 4.1.1 son las
descarboxilasas, enzimas que eliminan grupos carboxilo, de gran importancia en el
metabolismo. Muchas de ellas utilizan tiamina difosfato o piridoxal fosfato como coenzimas.
El sub-subgrupo 4.1.2 son las aldehido-liasas o aldolasas, que catalizan condensaciones

aldlicas; en 4.1.3 estn agrupadas las oxocido-liasas, con enzimas de gran importancia
metablica, como la citrato sintasa o enzima condensante. Veremos su accin detallada al
estudiar el metabolismo.


EC 4.1.1.22 Histidina descarboxilasa. Cataliza la descarboxilacin de histidina para dar
histamina. sta reaccin y otras similares son importantes en la sntesis de numerosos
neurotransmisores. Esta enzima es un homodmero que requiere piridoxal fosfato. La
histamina es un efector muy potente en los estados alrgicos y anafilcticos.

COO
-
C NH
3
+
H
CH
2
HN
N
CO
2
CH
2
CH
2
HN
N
NH
3
+
Histidina
Histamina




(b) Subgrupo 4.2: Liasas C-O

El subgrupo 4.2 son las liasas C-O. En el apartado 4.2.1 encontramos las hidro-liasas
(hidratasas o dehidratasas), enzimas que catalizan la adicin o eliminacin de agua en un
doble enlace.

EC 4.2.1.1 Carbonato deshidratasa (anhidrasa carbnica). Esta enzima cataliza la
hidratacin de CO
2
a cido carbnico, el cual se disocia inmediatamente en bicarbonato y
protn.

CO
2
+ H
2
O H
2
CO
3
HCO
3
-
+ H
+


Requiere zinc como cofactor, y se conocen al menos siete formas moleculares distintas de la
enzima en mamferos. Tiene una gran importancia fisiolgica, ya que participa en el proceso
de transporte de gases en sangre, en la secrecin de HCl por el estmago y en la excrecin
renal de bicarbonato.

3.2.5 Grupo 5: Isomerasas


Catalizan reagrupamientos dentro de la misma molcula. A pesar de ser (aparentemente)
enzimas monosubstrato, muchas veces las reacciones catalizadas por estas enzimas son
muy complicadas.


3.2.5.1 Clasificacin sistemtica de las isomerasas

5.1.-.- Racemasas y epimerasas
5.2.-.- Isomerasas cis-trans
5.3.-.- Oxidoreductasas intramoleculares
5.4.-.- Transferasas intramoleculares (mutasas)
5.5.-.- Liasas intramoleculares
5.99.-.- Otras isomerasas


3.2.5.2 Algunas reacciones enzimticas catalizadas por isomerasas


(a) Subgrupo 5.1: Racemasas y epimerasas

El subgrupo 5.1 contiene las racemasas y las epimerasas, que catalizan la inversin de
configuracin en un carbono asimtrico. Son importantes las que actan sobre aminocidos
y sobre monosacridos o sus UDP-derivados.

EC 5.1.1.1 Alanina racemasa. Presentamos esta reaccin como ejemplo de las aminocido
racemasas. Requiere piridoxal fosfato como cofactor. Es una enzima importante en el
metabolismo bacteriano, en el que la D-alanina es necesaria en la sntesis del
peptidoglicano.

COO
-
C H
3
N
+
H
CH
3
COO
-
C
CH
3
H NH
3
+
L-Alanina
D-Alanina



(b) Subgrupo 5.2: Isomerasas cis-trans

En el subgrupo 5.2 encontramos enzimas que catalizan isomerizaciones cis-trans en torno a
un doble enlace.

EC 5.2.1.3 Retinal isomerasa. Cataliza la isomerizacin de todo-trans-retinal a 11-cis-retinal.

Tiene, por esa razn, una gran importancia en el proceso visual, ya que ste consiste en la
absorcin de un fotn por el ismero 11-cis para dar lugar al todo-trans. La retinal
isomerasa regenera la molcula receptora.


(c) Subgrupo 5.3: Oxidorreductasas intramoleculares

Las oxidorreductasas intramoleculares constituyen el subgrupo 5.3; tienen importancia, por
ejemplo, las enzimas que interconvierten aldosas en cetosas, o que transfieren dobles
enlaces entre carbonos de la misma molcula.

EC 5.3.1.9 Glucosa-6-fosfato isomerasa (fosfoglucosa isomerasa, fosfohexosa isomerasa) Es
una enzima de la va glicoltica encargado de la interconversin entre glucosa-6-fosfato y
fructosa-6-fosfato. Es un homodmero. Las formas mutantes de esta enzima son causa de
anemias hemolticas.

O
CH
2
O P
O
-
O
O
-
CH
2
OH
OH
OH
OH
O
CH
2
O P
-
O
O
-
O
OH
OH
OH
OH
oD-Glucosa-6-fosfato
o-D-Fructosa-6-fosfato


(d) Subgrupo 5.4: Transferasas intramoleculares (mutasas)

El subgrupo 5.4 contiene a las transferasas intramoleculares; genricamente reciben el
nombre de mutasas. Catalizan la transferencia de un determinado grupo de una parte a otra
de la misma molcula.

EC 5.4.2.4 Bisfosfoglicerato mutasa. Cataliza la conversin de 1,3-bisfosfoglicerato en 2,3
bisfosfoglicerato. La reaccin tiene lugar de manera que la enzima es en primer lugar
fosforilada por 1,3 bisfosfoglicerato para dar fosfoenzima y 3-fosfoglicerato; en una segunda
fase, este ltimo es refosforilado en la posicin 2. El bisfosfoglicerato es un importante
efector alostrico de la hemoglobina, que da lugar a una disminucin en la afinidad de sta
por el oxgeno. La ausencia de esta enzima es causa de anemias hemolticas.


CO O PO
3
2-
C HO H
CH
2
O PO
3
2-
COO
-
C H
CH
2
O PO
3
2-
O O
3
P
2-
1,3-bisfosfoglicerato
2,3-bisfosfoglicerato



(e) Subgrupo 5.99: Otras isomerasas

EC 5.99.1.2 DNA topoisomerasa. Esta enzima cataliza la interconversin entre distintos
ismeros topolgicos del DNA, por ejemplo, la relajacin de un superenrollamiento
negativo. A diferencia de la siguiente, no requiere ATP. Participa en multitud de procesos
asociados a la replicacin, reparacin y recombinacin del material gentico. Estas acciones
las lleva a cabo a travs de la introduccin de un corte en una cadena (nick, melladura) y el
cabo roto de DNA se fija transitoriamente a travs de un fosfodister al grupo fenol de un
residuo de tirosina. Posteriomente la cadena rota vuelve a soldarse por accin de la misma
enzima.

EC 5.99.1.3 DNA topoisomerasa dependiente de ATP (DNA girasa). Interconvierte ismeros
topolgicos de DNA a travs de la rotura dependiente de ATP de DNA. A diferencia de la
anterior, la DNA girasa rompe los dos filamentos del cido nucleico. Esta enzima puede
introducir superenrollamiento negativo o positivo en molculas de DNA. No aparece en
eucariotas. La DNA girasa es inhibida por los antibiticos del grupo de las quinolonas (cido
nalidxico, ciprofloxacino, etc.)



3.2.6 Grupo 6: Ligasas o Sintetasas


Catalizan la unin de dos molculas concomitante a la hidrlisis de un enlace pirofosfato del
ATP u otro nuclesido trifosfato. Para estas enzimas se utiliza el nombre de "sintetasas" en
contraposicin a las "sintasas", que son liasas y no requieren la rotura de un enlace rico en
energa. Las reacciones catalizadas por las sintetasas suelen ser bastante complejas, ya que
son reacciones trisubstrato como mnimo. La reaccin general podra describirse como

A + B + ATP A-B + ADP + Pi

o bien

C + D + ATP C-D + AMP + PPi

Siendo Pi fosfato inorgnico y PPi pirofosfato inorgnico.



3.2.6.1 Clasificacin sistemtica de las ligasas

Se clasifican conforme a la naturaleza del enlace formado:

6.1.-.- Ligasas C-O
6.2.-.- Ligasas C-S
6.3.-.- Ligasas C-N
6.4.-.- Ligasas C-C
6.5.-.- Ligasas P-O



3.2.6.2 Algunas reacciones enzimticas catalizadas por ligasas


(a) Subgrupo 6.1: Ligasas C-O

El subgrupo 6.1 contiene las ligasas que forman enlaces C-O. Entre ellas, el sub-subgrupo
6.1.1 es el correspondiente a las aminoacil-tRNA sintetasas, enzimas encargadas de la
activacin de los aminocidos en la sntesis de protenas.

EC 6.1.1.1 Tirosina-tRNA ligasa (Tirosil-tRNA sintetasa). Citamos a esta enzima como el
prototipo de las aminoacil-tRNA sintetasas, enzimas encargadas de la unin de un
aminocido a su tRNA especfico. La reaccin es dependiente de ATP, formndose en una
primera fase un aminoacil-adenilato y transfirindose despus el residuo aminoacil al
trmino 3' del polinucletido. Estas enzimas son de una especificidad absoluta para sus
substratos, tanto el aminocido como el tRNA.

(1) Aminocido + ATP Aminoacil-AMP + PPi

(2) Aminoacil-AMP + tRNA AMP + Aminoacil-tRNA



(b) Subgrupo 6.3: Ligasas C-N

Las sintetasas que forman enlaces C-N estn en el subgrupo 6.3. Entre ellas destacan la
asparragina- y glutamina sintetasas, encargadas de la introduccin de NH
3
en el carboxilo
terminal de aspartato o glutamato.



EC 6.3.1.2 Glutamato-amonio ligasa (Glutamina sintetasa). La actividad de esta enzima
consiste en la formacin de un grupo amida por unin de amonaco al -carboxilo del cido
glutmico, con formacin de glutamina (en dos pasos). Es una enzima de gran importancia

metablica por cuanto que es un sistema central en el metabolismo nitrogenado. Se
encuentra sometida a un complicado sistema de regulacin por modificacin covalente.

Glutamato + ATP + NH
4
+
Glutamina + ADP + Pi



(c) Subgrupo 6.4: Ligasas C-C

El subgrupo 6.4 presenta las enzimas encargadas de formar enlaces C-C, normalmente en
reacciones de carboxilacin, por lo que las enzimas de este grupo son las llamadas
carboxilasas (no confundir con las descarboxilasas). La mayor parte de ellas contienen
biotina como grupo prosttico.

EC 6.4.1.2 Acetil-CoA carboxilasa. Es una enzima multifuncional. La actividad que nos
interesa en este contexto es la formacin de malonil-CoA a partir de acetil-CoA y CO
2
, que es
el paso limitante en la biosntesis de cidos grasos. Es el prototipo de las enzimas conocidas
como carboxilasas. Utiliza, como todas las carboxilasas, biotina como cofactor (ver captulo
4). Es una enzima sometida a regulacin, con efectos alostricos y modificacin covalente a
travs de fosforilacin.


CO S CoA
CH
3
CO
2
ATP ADP
+ Pi
CO S CoA
CH
2
COO
-
Acetil-CoA Malonil-CoA






CAPITULO 4: Coenzimas o cofactores





4.1 Introduccin


Ya hemos visto en el captulo 2 el significado de estos trminos. Una coenzima es una
molcula que participa en un determinado tipo de reacciones enzimticas, generalmente de
una de dos maneras distintas: (a) o bien como grupo prosttico, en cuyo caso suele estar
fuertemente unida al centro activo enzimtico, a veces de forma covalente, y que en este
caso permanece inalterada una vez terminado el ciclo de reaccin (es decir, una
participacin propiamente cataltica), o bien (b) como una molcula adicional que acta
como transportador entre dos reacciones distintas, catalizadas por enzimas diferentes, de
forma que la molcula es modificada en una reaccin y regenerada en la siguiente. Hay
quien reserva el trmino de coenzima para el primer caso, y de cosubstrato para el segundo
(y cofactores como abarcando a ambos). En el presente trabajo, sin embargo, aplicaremos el
trmino coenzima por igual en las dos categoras. Bien es verdad que en el segundo caso no

est clara la distincin entre substrato y coenzima; y que definimos a stas en funcin de
una segunda reaccin ulterior que lo puede regenerar. Pero en el caso de las primeras, es
decir, los llamados grupos prostticos, encontramos el mismo comportamiento, salvo que la
regeneracin se produce sobre el mismo centro activo enzimtico, no necesitndose una
segunda enzima.

En todo caso, el concepto de coenzima queda en realidad reducido al de transportador de
grupos qumicos. Casi todas las reacciones enzimticas pueden ser interpretadas en
trminos de transferencia:

A-X + B A + B-X


donde el grupo transferido X puede ser, por ejemplo, electrones o equivalentes de
reduccin en las oxidoreductasas; fosfato, grupos amino, grupos monocarbonados, residuos
glicosdicos, grupos acilo, etc., en otras reacciones. Y adems, podemos considerar asimismo
la existencia de coenzimas (ATP o GTP) que transfieren energa libre qumica entre unas
reacciones y otras. Por lo tanto, es este concepto de coenzimas como transportadores el
que nos interesa; otros elementos que puedan participar en la reaccin enzimtica, como
metales, efectores o moduladores, etc., no son considerados coenzimas. Tambin veamos
en el captulo anterior que las reacciones hidrolsicas pueden interpretarse en trminos de
transferencia.

Ya adelantamos la estrecha relacin existente entre las vitaminas, factores dietticos
indispensables, y algunas coenzimas. Siendo stas por lo general molculas orgnicas
complejas, la sntesis de la totalidad de la molcula es con frecuencia imposible en los
distintos organismos; por ello, en muchos casos es necesario el aporte diettico de la
totalidad o parte de la molcula coenzimtica. Su falta en la dieta da lugar a las llamadas
enfermedades carenciales, como el escorbuto, el beri-beri, la pelagra, etc. Durante un
tiempo se dio mucha importancia a las enfermedades carenciales en la Patologa Humana, y
por consiguiente, al estudio de las vitaminas como tales en Bioqumica. Hoy preferimos
hablar de ello en el contexto ms general de las coenzimas. Determinados sndromes
carenciales presentan hoy da un inters renovado debido al uso de anlogos de coenzimas
en la teraputica (por ejemplo, el antiflico methotrexate en la quimioterapia
antineoplsica), que desencadenan alteraciones similares a la carencia diettica de los
mismos. Por otra parte, existen vitaminas cuya adscripcin a coenzimas determinadas es
ms que dudosa; bien sea por desconocerse su modo de accin, o bien porque su funcin
fisiolgica no es lo que se espera de una coenzima en el sentido estricto en que fueron
arriba definidos; tal es el caso de los retinoides (vitamina A), en los que su participacin en el
proceso visual no es propiamente una funcin coenzimtica de transportador (en todo caso
de transductor) y su papel en otros procesos celulares es an bastante oscuro aunque sin
duda importantsimo. Por tanto, en la presente exposicin aludiremos al carcter
vitamnico all donde sea pertinente en cuanto a la discusin de las coenzimas.




4.2 Coenzimas asociadas a procesos redox



4.2.1 Coenzimas piridnicas (NAD
+
, NADP
+
)


NAD
+
(Nicotinamido adenil dinucletido, Niacin adenil dinucletido) y NADP
+
(NAD
+
fosfato)
son dos importantes transportadores redox en el metabolismo celular. Actan
fundamentalmente como coenzimas de deshidrogenasas, pero tambin tienen un
importante papel, como veremos, en otros procesos como la ADP-ribosilacin de protenas.
En el trabajo clsico de Harden y Young de 1904 se estableca que la fermentacin acelular
de glucosa requera la presencia de un factor termoestable y dializable, que fue bautizado
por los autores como cozimasa. Purificado posteriormente por von Euler y cols. y por
Warburg y Christian en 1936, su conocimiento qued complementado por el
descubrimiento del NADP por estos ltimos autores como factor dializable necesario para la
oxidacin de la glucosa-6-fosfato en hemates. Estos dos factores han recibido los nombres
de Coenzima I y DPN (difosfopiridin nucletido), el NAD
+
, y Coenzima II y TPN (trifosfopiridin
nucletido) el NADP
+
. Ambas coenzimas estn ampliamente distribudas en todo tipo de
clulas y tejidos; dentro de su papel como transportadores redox, podemos decir en lneas
generales que el NAD
+
participa preferentemente en procesos asociados a fermentaciones y
respiracin, mientras que el NADP
+
, o ms bien su forma reducida NADPH, suele proveer el
poder reductor necesario para las biosntesis celulares.


4.2.1.1 Estructura qumica y modo de accin


La hidrlisis de NAD
+
da lugar a 1 adenina, 1 nicotinamida, 2 ribosa y 2 ortofosfato. La de
NADP
+
produce los mismos componentes, pero con 3 ortofosfatos en lugar de dos. En la
figura 4.1 se presentan las estructuras de estas dos coenzimas.


O
O
H
H
OH
H
OH
CH
2
H
O P
O
O
-
O P
O
O
-
O CH
2
N
N
N
N
NH
2
OH OH
N
CONH
2
+
O
O
H
H
O
H
OH
CH
2
H
O P
O
O
-
O P
O
O
-
O CH
2
N
N
N
N
NH
2
OH OH
N
CONH
2
P O
-
O
O
-
+
NAD
+
NADP
+

Figura 4.1 Estructura de las coenzimas piridnicas (formas oxidadas)


En el caso del NAD
+
, podemos ver que se trata de un nucletido de adenina unido a un
nucletido de nicotinamida a travs de sus fosfatos. La nicotinamida (tambin llamada
niacina) es la 3-amidopiridina (de ah el nombre de coenzimas piridnicas). Los enlaces de
ambas bases a sus respectivas ribosas son del tipo -N-glicosdico. La unin glicosdica en
- da lugar a anlogos inactivos de estos coenzimas (-NAD
+
y -NADP
+
). En el NADP
+
el
fosfato adicional aparece unido al C-2' de la ribosa adenosnica.

En su forma oxidada, el anillo piridnico de la nicotinamida se presenta en forma catinica, y
de ah la representacin como NAD
+
y NADP
+
de los mismos, a pesar de que al pH celular,
los fosfatos estn ionizados y por tanto estos compuestos presentan una carga neta de -1 el
NAD
+
y -2 el NADP
+
.

Al ser reducidos por un dador electrnico adecuado en presencia de la correspondiente
enzima, por ejemplo, etanol y alcohol deshidrogenasa, el anillo piridnico se reduce a una
forma quinonoide, desapareciendo la carga positiva y pasando el carbono 4 a una forma
metilnica -CH
2
- (figura 4.2). Con la reduccin hay un aumento significativo de la
absorbancia a 340 nm, lo que se emplea para el ensayo de todas las enzimas ligadas a estas
coenzimas.

En el curso de la reduccin, pues, el substrato que se oxida pierde dos tomos de hidrgeno
(dos protones y dos electrones), transfirindose a la coenzima un ion hidruro (H
-,
un protn
y dos electrones) y liberndose a la solucin el protn restante.




N
CONH
2
N
H H
CONH
2
AH
2
A + H
+
+
Forma oxidada, NAD
+

Forma reducida, NADH


Figura 4.2 Reduccin del anillo piridnico de nicotinamida


Por esa razn las reacciones asociadas a estas coenzimas se representan as:

AH
2
+ NAD
+
A + NADH + H
+

o bien

AH
2
+ NADP
+
A + NADPH + H
+




4.2.1.2 Significacin metablica y fisiolgica


Un gran nmero de oxidorreductasas utiliza coenzimas piridnicas. La gran mayora de
reacciones redox a nivel substrato, por ejemplo, suelen ser deshidrogenaciones ligadas a
estas coenzimas. No es de extraar, por tanto, la distribucin tan extensa de las mismas en
todas las clulas y tejidos. En los animales predomina en cantidad la pareja NAD
+
/NADH
sobre la de NADP
+
/NADPH, mientras que en los vegetales la proporcin suele ser
aproximadamente la misma; en el caso del primero predomina la forma oxidada, NAD
+
y en
el del segundo la forma reducida NADPH.



(a) NAD
+


El par redox NAD
+
/ NADH + H
+
participa, entre otras muchas reacciones, en
oxidorreducciones ligadas a procesos de produccin energtica, como la fermentacin de la
glucosa y la degradacin aerbica de cidos grasos, azcares y aminocidos. En el primer
caso, se produce en primer lugar NADH que posteriormente es regenerado a NAD
+
; no hay

produccin energtica directa, por tanto, a partir de estas coenzimas. En las degradaciones
aerbicas, sin embargo, el NADH producido por las deshidrogenasas del ciclo de Krebs o de
la -oxidacin son oxidadas por la cadena respiratoria y en ltimo trmino sus electrones
van a parar al oxgeno, teniendo lugar al mismo tiempo la fosforilacin oxidativa, con
produccin de ATP.

(b) NADP
+


En las clulas el NADPH se produce esencialmente en las reacciones redox de la va de las
pentosas; su concentracin determina lo que se ha dado en llamar poder reductor de la
clula, que es ampliamente utilizado en procesos de biosntesis (cidos grasos, esteroides,
etc.), as como de destoxificacin y mantenimiento. A diferencia de los procesos
respiratorios, que tienen lugar en la mitocondria, las biosntesis ligadas a NADPH son de
localizacin citoplsmica.

Por otra parte, el poder reductor generado en el proceso fotosinttico en plantas verdes o
microorganismos autotrficos toma normalmente la forma de NADPH.


4.2.1.3 Carcter vitamnico


Una gran cantidad de organismos, entre ellos el hombre, son incapaces de sintetizar el anillo
de nicotinamida (o el correspondiente cido nicotnico), por lo cual deben recibirlo como
factor diettico esencial. En el s.XVIII el mdico de la corte de Felipe V Gaspar de Casal
describi el "mal de la rosa" en poblaciones cuya alimentacin era esencialmente a base de
maz. Esta enfermedad, llamada asimismo pelagra, consiste en una serie abigarrada de
sintomatologa neurolgica, cutnea e intestinal (la trada dermatitis- diarrea-demencia). En
1937, Elvehjem y Woolley demostraron que la pelagra poda ser prevenida por la
administracin de cido nicotnico o de nicotinamida, recibiendo as el nombre de factor PP
(preventivo de la pelagra) reconocido por los estudios de von Euler y Warburg como un
componente de la primitiva cozimasa de Harden y Young. Tambin es conocida como
Vitamina B
3
.

En realidad, la pelagra es una deficiencia alimenticia casi generalizada; es decir, producida
no slo por la deficiencia de nicotinamida, sino que va acompaada de otras deficiencias
vitamnicas o proteicas; de ah su variabilidad semiolgica. En cualquier caso, se ha podido
comprobar que en los enfermos de pelagra el metabolismo oxidativo no est alterado
significativamente; ello da pie a pensar que la limitacin en estos enfermos est en el papel
que el NAD
+
desempea en otros procesos, particularmente la ADP-ribosilacin de protenas
y su papel en la reparacin del DNA (por ejemplo, en la DNA-ligasa) y en otros procesos
asociados al flujo de informacin gentica.





4.2.2 Coenzimas flavnicas


La presencia de pigmentos flavnicos (del Lat. flavus, amarillo) fue detectada el siglo XIX en
preparaciones de suero de leche; pigmentos de este tipo fueron parcialmente
caracterizados en los aos 30 de este siglo por Szent-Gyrgyi y Ellinger, entre otros. Fue el
descubrimiento por Warburg de la enzima amarilla capaz de oxidar el NADPH producido en
la reaccin de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa lo que dio pie al conocimiento ms
sistemtico de estas coenzimas. Warburg observ que al tratar con metanol la enzima
amarilla se disociaba en un pigmento y una protena incolora. El pigmento fue caracterizado
como flavin mononucletido (FMN), nombre algo incorrecto dado que la unin de la base
(isoaloxazina) al azcar (en realidad el polialcohol ribitol) no es propiamente una unin
glicosdica; una forma ms correcta de denominarlo sera la de riboflavin fosfato. Con
posterioridad al descubrimiento del FMN, Warburg y Christian estudiaron la D-aminocido
oxidasa, otra flavoenzima pero conteniendo flavin adenin dinucletido (FAD). El FAD es la
unin del FMN con un nucletido de adenina a travs de los fosfatos, como en el caso del
NAD+ (figura 4.3).

O
H
H
OH
H
OH
CH
2
H
O P
O
O
-
O P
O
O
-
O N
N
N
N
NH
2
CH
2
C
C
C
CH
2
OH H
OH H
OH H
N
N
NH
N
H
3
C
H
3
C
O
O
FMN (Riboflavin fosfato)
5'-AMP
FAD
Flavin adenin dinucletido





Figura 4.5: Estructura de las coenzimas flavnicas

A pesar de lo que superficialmente pudiera parecer al ver las estructuras de las coenzimas
flavnicas, y particularmente del FAD, sus caractersticas biolgicas son bastante diferentes a
las de las coenzimas piridnicas. El rasgo diferencial ms acusado es sin duda la unin con la
protena. Mientras en el caso de NAD
+
y NADP
+
esta unin no es ms intensa que la de
cualquier substrato, las coenzimas flavnicas aparecen fuertemente unidas a la protena
enzimtica, formando lo que comnmente llamamos flavoprotenas. En la flavoprotena

tiene lugar normalmente todo el ciclo cataltico; la coenzima es reducida por un dador
electrnico y oxidada por un aceptor sobre la misma molcula, a diferencia de las coenzimas
piridnicas, que necesitan dos enzimas distintas, y por tanto, su disociacin de los mismas.
Otra importante diferencia estriba en que muchas coenzimas flavnicas, formando las
correspondientes flavoprotenas, pueden utilizar el oxgeno molecular como aceptor
electrnico.


4.2.2.1 Estructura qumica y modo de accin

La estructura de estas coenzimas se presenta en la figura 4.3. Constan de una base tricclica,
la isoaloxazina, unida a travs del N-10 al polialcohol ribitol. Esta estructura recibe el
nombre de riboflavina, y como su sntesis no es posible en el organismo humano, debe
ingresar como tal en la dieta. Tiene, por tanto, carcter vitamnico (vitamina B
2
).

El ribitol esterificado en C-5' a fosfato da lugar al riboflavin fosfato o flavin mononucletido
(FMN), el cual aparece como coenzima en multitud de flavoprotenas. La unin del FMN a
travs de un anhdrido fosfrico con 5'-AMP da lugar al flavin adenin dinucletido (FAD),
que es la otra coenzima flavnica.

El modo de accin en reacciones redox puede observarse en la figura 4.4
N
N
NH
N
H
3
C
H
3
C
O
O
N
N
NH
NH
H
3
C
H
3
C
O
O
N
NH
NH
NH
H
3
C
H
3
C
O
O
Forma oxidada
Semiquinona
Forma reducida

Figura 4.4: Formas redox de las coenzimas flavnicas


La isoaloxazina plenamente oxidada puede captar uno o dos equivalentes de reduccin en
forma de tomos de hidrgeno (y no ion hidruro como en las coenzimas piridnicas). Esto da
lugar a que existan tres grados en el proceso de reduccin del anillo: la forma oxidada, la
semiquinona y la forma plenamente reducida (FMNH
2
y FADH
2
). Las distintas flavoenzimas

(se conocen alrededor de un centenar) se diferencian entre s, por tanto, respecto al modo
de oxidorreduccin en tres grupos: (a) las que oscilan entre las formas plenamente reducida
y plenamente oxidada, es decir, F - FH
2
, como la glucosa oxidasa; (b) las que oscilan entre la
forma oxidada y la semiquinona, F - FH

, como es el caso de la dihidrolipoamida

deshidrogenasa; y (c) las que oscilan entre la semiquinona y la forma plenamente reducida,
es decir, FH

- FH
2
.



4.2.2.2 Flavoprotenas


FAD y FMN aparecen en la clula unidos a protenas formando las llamadas flavoprotenas.
Como ya se ha dicho, la unin de las coenzimas a la apoprotena es mucho ms fuerte que
en el caso de los piridin nucletidos, hasta el punto que pueden ser propiamente
considerados como grupos prostticos. La unin es muy fuerte, con constantes de
disociacin del orden de 10
-8
M a pH 7. El aumento de la fuerza inica y el descenso del pH
favorecen la disociacin del grupo flavnico, dejando libre la apoprotena. En ocasiones
encontramos la coenzima unida covalentemente a la estructura proteica, generalmente a
residuos de histidina o cistena.

La unin con la protena produce cambios importantes en las propiedades de las flavinas:

(a) La unin a la protena determina la aparicin de especificidad. Las flavinas libres pueden
ser reducidas u oxidadas por multitud de dadores o aceptores electrnicos. La unin a la
protena hace mucho ms restringido el conjunto de compuestos que pueden reaccionar
con la flavina.

(b) La unin a la protena favorece la interaccin de las flavinas con otros grupos,
particularmente metales como Fe o Mo. Esto permite un gran espectro de actividades redox
para estas protenas. En este mismo sentido, podemos decir que aunque la mayor parte de
las flavoprotenas contienen un solo grupo prosttico, puede haberlas con dos, en cuyo
caso, teniendo en cuenta los modos de reduccin que veamos antes (reducida,
semiquinona y oxidada), los estados de oxidorreduccin de algunas flavoprotenas pueden
ser extremadamente variados.



4.2.2.3 Carcter vitamnico

La riboflavina no puede ser sintetizada por el organismo animal; de ah que fuera reconocida
como factor vitamnico en la dieta con el nombre de vitamina B
2
. Sin embargo, no se conoce
en el hombre una enfermedad carencial definida por la falta de riboflavina; s se ha
reconocido la falta de la misma en sndromes pluricarenciales, como el kwashiorkor y la
pelagra. Las caractersticas clnicas supuestamente debidas a la falta de riboflavina, como
lesiones en torno a la boca y lengua, o posibles alteraciones corneales, se observan tambin

en otros estados carenciales, por lo que no pueden ser consideradas como especficas.




4.2.3 Coenzimas hemnicas



Las estructuras tetrapirrlicas cclicas, porfirinas, presentan una amplsima distribucin en
toda la materia viviente. Podemos decir que su evolucin ha ido pareja con la del
metabolismo aerbico en general, es decir, con todos aquellos procesos relacionados con el
oxgeno. Desde la clorofila, pigmento tetrapirrlico cclico modificado presente en
organismos fotosintticos (y por tanto, relacionados con la evolucin del O
2
libre en la
atmsfera), hasta las peroxidasas encargadas de combatir los efectos txicos del propio
oxgeno, pasando por transportadores de oxgeno, como hemoglobina y mioglobina y
transportadores de electrones como los citocromos, encontramos estructuras cuyo tipo
general se presenta en la figura 4.5. Esta estructura aparece con un metal coordinado y
formando el grupo prosttico de una protena, que en conjunto denominamos
hemoprotenas. Estos grupos, por otra parte, se comportan como coenzimas en el sentido
en que se expuso en la introduccin: al igual que los grupos flavnicos, no se disocian de la
protena.
N N
Fe
++
H
3
C
CH
2
CH
3
CH CH
2
CH
2
-
OOC
N
CH
3
H
2
C
CH
2
COO
-
N
H
3
C CH
CH
2
Hemo b


Figura 4.5: Estructura del grupo hemo. Se trata de una protoporfirina IX
coordinada a un ion Fe
++
. El hemo es el grupo prosttico caracterstico de la
hemoglobina y de los citocromos b.


A diferencia de los grupos flavnicos y piridnicos que hemos visto hasta ahora, nuestro

organismo sintetiza por completo la porfirina, por lo cual no tiene carcter vitamnico. Est
descrita en humanos una serie interesantsima de trastornos metablicos relacionados con
la sntesis del grupo porfirnico, las denominadas porfirias. Y adems, el inters que
presentan estos compuestos se extiende tambin a sus productos de degradacin, los
pigmentos biliares (bilirrubina, biliverdina, etc.)



4.2.3.1 Estructura qumica y modo de accin

Podemos apreciar en la figura 4.5 que se trata de un sistema tetrapirrlico cclico,
denominado genricamente porfirina y que de manera caracterstica es capaz de formar
quelatos con un tomo o ion metlico coordinado a los cuatro nitrgenos centrales del
anillo.

El papel fisiolgico de estos compuestos est ntimamente ligado al metal que
invariablemente aparece coordinado al sistema tetrapirrlico planar, que en las formas
funcionales de estas estructuras, aparece como grupo prosttico de una protena. En la
mayora de los casos, este metal es el hierro, bien en forma ferrosa, o en forma frrica, o
alternando ambas, o incluso en estados de valencia superiores, como en las peroxidasas.
Dado que el hierro se presenta en complejos hexacoordinados de forma octadrica (figura
4.6) su unin al grupo porfirnico deja libres otras dos posiciones de coordinacin. Estas
posiciones estn normalmente ocupadas bien por grupos de la apoprotena, o por ligandos
propios del sistema, o no estn ocupadas. El grupo porfirnico suele estar ubicado en el
interior de la estructura proteica, dado su carcter hidrofbico.

6
5
N4 N3
N2 N1


Figura 4.6: Forma octadrica de los ligandos de coordinacin al hierro en las
hemoprotenas. Las posiciones 1-4 estn ocupadas por los nitrgenos pirrlicos;
5 y 6, por ligandos de la protena o bien, el 6, por otros ligandos (oxgeno, agua,
cianuro, etc.)

Existen tres grandes grupos de hemoprotenas relacionadas con el metabolismo aerbico:
las protenas transportadoras de oxgeno hemoglobina y mioglobina; las peroxidasas y los
citocromos. En esta exposicin trataremos brevemente de estos dos ltimos.




4.2.3.2 Las peroxidasas


Las peroxidasas (o hidroperoxidasas) son un grupo de hemoenzimas cuya funcin
metablica fundamental es la descomposicin de perxidos, productos a su vez de multitud
de reacciones oxidsicas. Tienen una amplia distribucin en la naturaleza, paralela al
desarrollo de la vida aerbica; en este sentido contribuyen a la defensa antioxidante de la
clula. Los perxidos, producto de numerosas reacciones metablicas, dan lugar a radicales
libres altamente reactivos y perjudiciales para la integridad de las estructuras celulares. Las
peroxidasas se encargan indirectamente, pues, de su eliminacin. Una peroxidasa
particularmente abundante es la catalasa, enzima encargada de la eliminacin de perxido
de hidrgeno (ver cap. 3)

Casi todas las peroxidasas conocidas suelen ser hemoprotenas que contienen una
ferriprotoporfirina IX. El modo de reaccin de las peroxidasas es bastante complejo y puede
seguirse por mediciones pticas y magnticas. As se ha podido determinar, por ejemplo,
que en el curso de la reaccin las posiciones quinta y sexta del complejo estn
esencialmente vacantes, y que el hierro pasa por estados de valencia superiores a tres
(iones ferrilo, 4
+
y perferrilo, 5
+
).

La mayor parte de la catalasa celular est contenida en los peroxisomas, orgnulos celulares
que contienen tambin D-aminocido oxidasa y urato oxidasa. Estas partculas son
especialmente abundantes en los leucocitos polimorfonucleares, consumen una gran
cantidad del oxgeno celular y se cree que tienen un importante papel en la defensa
antioxidante. Hay quien cree que los peroxisomas son un vestigio de las partculas
respiratorias de las clulas protoeucariticas, antes del establecimiento evolutivo del
sistema simbitico mitocondrial.



4.2.3.3 Los citocromos

Los citocromos fueron descubiertos por McMunn en el siglo XIX al estudiar tejidos animales
con un espectroscopio y observar sus bandas de absorcin caractersticas. Fue Keilin
alrededor de 1925 quien sistematiz el conocimiento en torno a estas hemoprotenas (y a
quien debemos el nombre de las mismas).

A diferencia de la hemoglobina y la mioglobina, los citocromos tienen ocupadas todas las
posiciones de coordinacin y su funcin fisiolgica se ejerce a travs de la alternancia de
estados ferroso (2
+
) y frrico (3
+
) en el hierro coordinado. Por esa razn los citocromos
actan esencialmente como transportadores electrnicos, y no como enzimas. Los
citocromos son molculas amplsimamente difundidas en la Naturaleza, y son el prototipo
de molculas conservadas, esto es, con secuencias de aminocidos muy poco variadas a lo
largo de la escala filogentica.

Los citocromos operan como transportadores electrnicos. Las reacciones en que participan

pueden representarse como

D
-
+ cit (Fe
3+
) D + cit (Fe
2+
)

A + cit (Fe
2+
) A
-
+ cit (Fe
3+
)

Es decir, el dador electrnico D cede un electrn a la forma oxidada del citocromo, el
ferricitocromo, que se reduce a ferrocitocromo; ste cede el electrn a un aceptor que se
reduce. Encontramos entre los diversos citocromos conocidos una amplia gama de
potenciales redox. Estas variaciones se deben al entorno proteico del grupo hemo, que vara
de unos a otros.

Existen tres tipos principales de citocromos que reciben el nombre de citocromos a, b y c.
Los citocromos a suelen tener por lo general un potencial redox elevado y por tanto los
encontramos como dadores a los aceptores terminales de electrones: O
2
en organismos
aerbicos, NO
3
-
y SO
4
2-
en bacterias anaerbicas. Estos citocromos que reducen a los
aceptores terminales se caracterizan por tener vacante la sexta posicin de coordinacin, a
diferencia de todos los dems citocromos, en los que el hierro aparece hexacoordinado.
Esta es la razn por la cual los citocromos terminales son sensibles a cianuro y monxido de
carbono, cuyo modo de accin consiste precisamente en la unin al hierro a travs de la
sexta posicin vacante e impidiendo su funcionamiento normal. La porfirina de los
citocromos a es el llamado hemo A, que se caracteriza por la presencia de una cadena
lateral poliprenoide (fitil) sustituyendo a la porfirina. En ocasiones se presentan varios
citocromos sobre un mismo complejo proteico; tal es el caso de la citocromo oxidasa, que es
una protena conteniendo citocromos a y a
3
adems de Cu
2+
.

Los citocromos b suelen aceptar electrones a partir de substratos de bajo potencial dentro
de la cadena respiratoria. Su grupo prosttico es una protoporfirina IX con un ion de hierro,
es decir, el mismo grupo hemo que la hemoglobina y la mioglobina, con la diferencia de que
el ion de hierro oscila entre los estados 2
+
y 3
+
. Dentro de este tipo nos encontramos,
aunque con caractersticas algo diferentes, al citocromo P-450, caracterstico de los sistemas
redox microsmicos de clulas animales, implicados en importantes procesos de
hidroxilacin (de esteroides, compuestos xenobiticos, compuestos aromticos, etc.). En
realidad, en torno al citocromo P-450 se establece todo un sistema de transporte
electrnico no mitocondrial responsable de una gran parte del consumo celular de oxgeno,
en el que se incluyen otros citocromos, flavoprotenas y ferrosulfoprotenas.

Los citocromos c tienen un potencial redox intermedio entre los a y los b; por ello los
encontramos como transportadores centrales en los sistemas redox celulares. Uno de ellos,
el citocromo c (los dems se conoces como c
2
, c
3
, etc.) tiene la particularidad de ser
fcilmente extrable de la mitocondria por su solubilidad en agua. Esta caracterstica lo hace
nico en su gnero, dado que los dems suelen estar fuertemente unidos a membranas de
manera que su estudio ha de hacerse necesariamente a partir de la disociacin de stas por
mtodos ms o menos drsticos: detergentes, pH, etc. El grupo prosttico en este tipo de
citocromos es el hemo C, cuya estructura es anloga al B excepto en la unin a la protena,
que en este caso es covalente a travs de dos residuos de cistena invariantes en la protena.




4.2.4 Quinonas


Un grupo muy extendido de cofactores redox est basado en el anillo quinnico y su
eventual reduccin a hidroquinona (figura 4.7).

O
O
OH
OH
AH
2 A


Figura 4.7: El anillo quinnico como transportador redox.

Las formas biolgicamente relevantes de este tipo de coenzimas aparecen sustitudas y con
una cadena lateral poliprenoide, a travs de la cual se piensa que estos cofactores se anclan
en las estructuras lipdicas relacionadas con el transporte electrnico. A diferencia de los
cofactores que hemos estudiado en los tres ltimos apartados, las ubiquinonas no aparecen
unidas a una protena en sus fuentes naturales. Existen tres grupos interesantes dentro de
este tipo de coenzimas: las ubiquinonas, las plastoquinonas y las vitaminas K.



4.2.4.1 Ubiquinona o Coenzima Q


La ubiquinona mitocondrial, tambin llamada coenzima Q, es un transportador redox cuya
estructura aparece en la figura 4.8.


O
O
CH
3
O
O CH
3
CH
3
CH
3
n
Ubiquinona (Coenzima Q)


Figura 4.8: Estructura de la ubiquinona o coenzima Q.

Posee una cadena lateral poliprenoide compuesta por diez unidades isoprnicas en
mamferos y seis en algunas bacterias. La ubiquinona opera en el transporte electrnico
mitocondrial, entre los complejos I y III y entre los complejos II y III, cuestin que
estudiaremos detalladamente en el metabolismo.

La ubiquinona no tiene carcter vitamnico.


4.2.4.2 Otras quinonas

Existen en la naturaleza muchas otras quinonas que operan como coenzimas redox: las
plastoquinonas, compuestos anlogos a la ubiquinona en la cadena de transporte
electrnico fotosinttico del cloroplasto; las vitaminas K o naftoquinonas y la
pirroloquinolina quinona (PQQ), grupo prosttico de las quinoprotenas, protenas presentes
en bacterias metilotrficas de gran inters biotecnolgico.



4.2.5 cido ascrbico (vitamina C)

Se trata de una molcula muy abundante en todos los seres vivos que opera esencialmente
como transportador redox, aunque son relativamente pocas las reacciones enzimticas
conocidas en las que participa como coenzima. Por esta razn se piensa que su abundancia
en los tejidos se debe ante todo a su poder antioxidante, ya que reacciona de forma
espontnea con multitud de aceptores electrnicos. El cido ascrbico es una vitamina para
los primates y el cobaya; el resto de los seres vivos sintetiza la molcula. Su sndrome
carencial es el escorbuto, enfermedad ampliamente conocida por los marineros de la poca
de navegacin a vela. Fueron precisamente estudios conducidos por la Royal Navy britnica
durante el siglo XVIII los que sentaron las bases de la prevencin del escorbuto mediante las
verduras frescas, y sobre todo, el zumo de lima. Reconocido en el siglo XX como vitamina (la
vitamina C), fue aislado y cristalizado por Szent-Gyrgyi en 1928, determinando Haworth
posteriormente su estructura.



4.2.5.1 Estructura qumica

La estructura del cido ascrbico se muestra en la figura 4.9. Opera como transportador
redox mediante la cesin de dos hidrgenos y su transformacin a cido dehidroascrbico.
La forma reducida tiene carcter cido por la ionizacin del grupo enediol. El anillo lactnico
se hidroliza fcilmente en el cido dehidroascrbico, dando lugar a la forma abierta, que ya
no puede volver a reducirse.

O
O
OH HO
C
H
2
C
HO
H
OH
O
O
O O
C
H
2
C
HO
H
OH
cido Ascrbico cido Dehidroascrbico
AH
2
A


Figura 4.9: cidos ascrbico y dehidroascrbico

El cido ascrbico puede ser oxidado por multitud de aceptores electrnicos; entre ellos
tenemos diversos colorantes, nitrato de plata (dando lugar a plata metlica), oxgeno y yodo
en presencia de trazas de metal, etc.



4.2.5.2 Funciones biolgicas

El cido ascrbico participa como coenzima en algunas reacciones de hidroxilacin
catalizadas por las correspondientes hidroxilasas. Entre stas tenemos la dopamina
-hidroxilasa, enzima que da lugar a noradrenalina en la sntesis de catecolaminas
neurotransmisoras. Asimismo, participa en el proceso de hidroxilacin de residuos de lisina
y prolina en el colgeno, en presencia de oxgeno e ion ferroso.





4.2.6 Glutatin


El glutatin es el tripptido -glutamil cisteinil glicina (fig 4.10). Descubierto en la levadura
en 1888, se obtuvo su sntesis en 1935. No tiene carcter vitamnico.


COO
-
C
+
H
3
N H
CH
2
CH
2
CO NH CH
CH
2
SH
CO NH CH
2
COOH
-Glutamil
Cisteinil Glicina


Figura 4.10: Glutatin reducido (GSH)


Est presente en la prctica totalidad de tejidos y clulas vivas, a concentraciones que
pueden llegar al nivel mM. Es el tiol de bajo peso molecular ms abundante entre las
biomolculas. Se suele representar la estructura del glutatin como GSH para la forma
reducida y GSSG el disulfuro. La reaccin ms caracterstica es su oxidacin al disulfuro:

2GSH + A GSSG + AH
2



La oxidacin a GSSG puede tener lugar mediante yodo o ferricianuro. Tambin puede ser
oxidado por oxgeno molecular y citocromo c.

Otra reaccin importante caracterstica del glutatin es la transferencia del grupo
-glutamilo a un aminocido, reaccin catalizada por la -glutamil transferasa:

GSH + aa -Glu-aa + Cys-Gly


Las funciones del glutatin pueden establecerse en dos categoras: (a) protectoras contra el
stress oxidativo y (b) de transporte y metablicas. Nos ocuparemos solamente de las
primeras.

(1) El glutatin participa en reacciones de transhidrogenacin, intercambiando sus
equivalentes reductores con otros tioles intracelulares, por lo que se cree que su principal
misin es el mantenimiento de stos en estado reducido. Se ha podido comprobar que
intercambia hidrgeno in vivo con cistena, homocistena, coenzima A y protenas. Se han
aislado igualmente disulfuros mixtos.

(2) Participa asimismo como donador de la capacidad reductora necesaria para la formacin
de desoxirribonucletidos (sistema de la ribonucletido reductasa).

(3) El glutatin forma parte de sistemas de proteccin contra perxidos y radicales libres. La

enzima clave en estos procesos es la glutatin peroxidasa, en cuya reaccin acta como
correductora la forma GSH producindose GSSG. Posteriormente ste se reduce a GSH por
el concurso de la GSSG reductasa, enzima muy difundida que utiliza NADPH. As, una de las
consecuencias del dficit en glucosa-6-fosfato dehidrogenasa es la inversin de la relacin
celular normal GSH/GSSG, que en condiciones normales es muy superior a la unidad.
Asimismo hay en dicho dficit desnaturalizacin de la hemoglobina y destruccin de la
membrana.

(4) Puede ser oxidado enzimticamente por cido dehidroascrbico en presencia de
glutation dehidrogenasa; la forma oxidada, por su parte, es reducida por la glutation
reductasa en presencia dla coenzima NADPH.



4.2.7 Otras coenzimas redox

Estudiaremos en su contexto metablico otras coenzimas que participan en procesos de
oxidorreduccin, como las ferredoxinas (o protenas NHI, Non-Heme Iron), las biopterinas, el
cido lipoico, etc.




4.3 Coenzimas asociados a otras reacciones (no redox)



4.3.1 Tiamina pirofosfato



Tiamina pirofosfato es una coenzima que opera esencialmente como transportador de
grupos carbonilo (aldehido o ceto) y por tanto con un importante papel metablico en las
reacciones en que participan cetocidos o cetosas. Fue reconocido como un cofactor
indispensable en la decarboxilacin no oxidativa de piruvato en levadura por Lohman y
Schuster en 1937, y caracterizado con el nombre de cocarboxilasa:

CH
3
CO COO
-
CH
3
CHO + CO
2
Piruvato
Acetaldehido


Previamente se haba reconocido a la tiamina como un factor nutricional esencial en el
hombre y los animales, habiendo sido aislada independientemente por Jansen y Donath,
por una parte, y Windaus, en Alemania, en 1925 (recibi el nombre de vitamina B
1
). Pronto
se demostr su papel fundamental en la descarboxilacin oxidativa de piruvato y de -
cetoglutarato, reacciones ambas asociadas el ciclo de Krebs. La estructura de la tiamina fue
establecida por Williams y Cline en 1935 (figura 4.11)

N
N
H
3
C
CH
2
N
+
S
H
3
C
CH
2
CH
2
O P O P O
-
O
-
O
-
O O
Tiamina pirofosfato


Figura 4.11 Tiamina pirofosfato


4.3.1.1 Estructura qumica y modo de accin


La tiamina consta de una pirimidina sustituda unida a un grupo tiazlico, como se puede
apreciar en la figura 4.11. La parte activa de la molcula es el grupo tiazlico. La coenzima
activa es tiamina pirofosfato (TPP), que aparece unida a la protena enzimtica de una forma
bastante dbil.


La tiamina pirofosfato participa en varias reacciones enzimticas . Para nosotros, las ms
importantes son las ya citadas descarboxilaciones oxidativa y no oxidativa de -cetocidos.
Por ejemplo, la no oxidativa a acetaldehido y la oxidativa a acetil-CoA catalizada por el
complejo de la piruvato dehidrogenasa; una reaccin similar es la decarboxilacin de
-cetoglutarato a succinilCoA en el ciclo de Krebs. En estos dos ltimos casos, se trata de
reacciones muy complejas que requieren la accin concertada de varias enzimas y
coenzimas.


4.3.1.2 Carcter vitamnico


Los animales pluricelulares han perdido la capacidad de sntesis de tiamina, por lo cual debe
ingresar en la dieta como factor esencial, y en este contexto recibe el nombre de vitamina
B
1
. Es asimismo un factor indispensable para el crecimiento de muchos microorganismos.

La carencia de vitamina B
1
en los animales de experimentacin produce una polineuritis
comparable al sndrome carencial que se da en humanos, el beriberi, polineuritis endmica
en el Sudeste asitico y en general en todos los pases cuya alimentacin se hace a base de
arroz descascarillado. En otro contexto, el dficit de tiamina es un factor patognico
importante en el sndrome de Wernicke-Korsakow de los alcohlicos crnicos.





4.3.2 Piridoxal fosfato



El piridoxol o piridoxina fue parcialmente caracterizado por Birch y Gyorgy en 1934. Su
estructura fue determinada por Gale y Epps, y Braunstein y Kritzman independientemente
en 1943. Caracterizado en principio como un factor necesario para la prevencin de la
acrodinia, dermatitis carencial desarrollada en ratas sometidas a dietas sintticas
suplementadas con tiamina y riboflavina, se pudo comprobar posteriormente que alguno de
los metabolitos urinarios del piridoxol tenan una capacidad preventiva mucho mayor,
particularmente la forma aldehido piridoxal y la amnica piridoxamina. En sistemas
microbiolgicos de ensayo se determin que el metabolito activo es el piridoxal fosfato, lo
que es cierto asimismo para los dems organismos. Es un factor indispensable en la dieta
humana; como tal se le conoce como vitamina B
6
.

El piridoxal fosfato participa en una gran cantidad de reacciones enzimticas. La gran
mayora de ellas, pero no todas, estn relacionadas con el metabolismo de los aminocidos.
Este es el aspecto qumico mejor conocido del piridoxal como coenzima, que discutiremos a
continuacin.



4.3.2.1 Estructura qumica y modo de accin; metabolismo de aminocidos


El piridoxol es la 3-hidroxi 4,5-dihidroximetil 2-metil piridina (fig.4.12). La forma
enzimticamente activa es el piridoxal fosfato, en el que el sustituyente en 4 es un grupo
aldehido y el alcohol en 5 aparece esterificado a ortofosfato. En esta forma aparece unido
ms o menos fuertemente a las protenas en las que opera como coenzima.

N CH
3
HOH
2
C
CHO
O P
O
O
-
O
-
N
CH
2
OH
OH
CH
3
HOH
2
C
N
OH
CH
3
HOH
2
C
CHO
N
OH
CH
3
HOH
2
C
CHNH
2
Piridoxol
Piridoxal
Piridoxamina
Piridoxal fosfato


Figura 4.12: Estructura de las diversas formas del piridoxal


El espectro de reacciones en que participa el piridoxal fosfato se extiende principalmente en
las relacionadas con el metabolismo y reacciones generales de aminocidos. Participa entre
otras muchas, en (a) racemizaciones; (b) transaminaciones; (c) descarboxilaciones.

En la forma descrita, el piridoxal fosfato acta como coenzima en los grupos 2.4.1
(aminotransferasas o transaminasas), 4.1.1 (carboxiliasas o decarboxilasas) y 5.1.1
(aminocido racemasas), entre otros.


4.3.2.2 Otras reacciones dependientes de piridoxal fosfato


Algunas reacciones no directamente relacionadas con el metabolismo de los aminocidos
dependen asimismo de piridoxal fosfato. Entre ellas destaca la glucgeno fosforilasa (EC
2.4.1.1) encargada de la degradacin del glucgeno. No se conoce el modo de accin de la
coenzima en esta reaccin.

Otros enzimas o grupos en los que participa el piridoxal son: transferasas de grupos CH
2
OH-,
CHO-, CHNH
2
-, etc. (grupo 2.1.2) y algunas aldehido-liasas del grupo 4.1.2.





4.3.2.3 Carcter vitamnico

No se ha descrito en la especie humana un sndrome propio de la carencia de vitamina B
6
.
En pacientes tratados durante mucho tiempo con isoniazida (un tuberculosttico) pueden
aparecer sntomas de deficiencia (dermatitis, anemia microctica, etc.) que remiten
rpidamente ante el tratamiento con la vitamina. En el hombre, como en todos los
mamferos, el requerimiento de B
6
vara con el aporte proteico de la dieta. Cuanto mayor es
ste, mayor es el requerimiento de vitamina B
6
.



4.3.3 Coenzimas folnicas


El cido flico fue primitivamente aislado a partir de levadura por Day como un factor
nutricional requerido para el crecimiento de Lactobacillus. Aislado posteriormente de las
hojas de espinaca, en las que se presenta en elevada concentracin, y de donde deriva
precisamente su nombre (Lat. folium, hoja), fue reconocido como factor vitamnico
(vitamina B
9
) en la dieta humana; su carencia es la responsable de la aparicin de anemias
megaloblsticas. Como veremos, algunos frmacos activos en la teraputica antineoplsica
son anlogos de cido flico (aminopterina y methotrexate, por ejemplo), por lo que el
sndrome carencial correspondiente tiene una cierta importancia clnica.

La coenzima activa es el cido tetrahidroflico (THF), forma reducida del cido dihidroflico
que se oxida muy fcilmente en presencia de O
2
, razn por la cual esta ltima es la forma
comn en que se asla esta coenzima a partir de fuentes biolgicas. El papel metablico del
cido tetrahidroflico est ntimamente relacionado con la transferencia de grupos
monocarbonados, particularmente formil (-CHO), hidroximetil (-CH
2
OH), formimino
(-CHNH), metileno (-CH
2
-) y metenil (-CH=); con menor frecuencia opera como
transportador de grupos metilo (-CH
3
). En este sentido podemos considerar al cido
tetrahidroflico como miembro de una familia de coenzimas involucrados de un modo u
otro en el metabolismo de grupos monocarbonados, y que estara integrado, adems del
THF, por S-adenosil metionina (como transportador principal de grupos metilo), la biotina
(de grupos carboxilo -COOH) y las coenzimas cobamdicas (cuya funcin no suele ser la de
transportadores estrictos, como los anteriores, sino que participan en sus
interconversiones).

4.3.3.1 Estructura qumica y modo de accin

Qumicamente el cido tetrahidroflico es una pteridina reducida unida al cido
p-aminobenzoico o 4-aminobenzoico (PAB) y ste a uno o varios residuos de cido glutmico
unidos a travs del grupo -carboxilo, dando lugar a la estructura pteroil n-glutmico o
pteroil poliglutmico (figura 4.13). El grado de polimerizacin del cido glutmico vara entre
1 y 10.


N
N
NH
NH
OH
H
2
N
N
C NH
O
C H
COO
-
CH
2
CH
2
CO OH
H
n
Pteridina reducida
4-Aminobenzoico
Poliglutamato


Figura 4.13: Estructura del cido tetrahidroflico (THF)

La funcin transportadora de grupos monocarbonados tiene lugar a travs de la formacin
de enlaces covalentes entre stos y los nitrgenos 5 y 10 de la pteridina. Algunas de estas
estructuras se presentan en la figura 4.14: N
10
formil-THF (1), N
5
N
10
metenil-THF (2), y N
5
N
10

metilen-THF (3)

N
N
NH
NH
OH
H
2
N
N
C
O
C
O
H
NH Poliglutamato
N
N
NH
N
OH
H
2
N
N
C
O
CH
2
NH Poliglutamato
N
N
NH
N
OH
H
2
N
HC N
+
C
O
NH Poliglutamato
N
10
formil THF
N
5
,N
10
metilen THF
N
5
,N
10
metenil THF


Figura 4.14: Algunas coenzimas folnicas. El grupo transportado se representa en rojo

Participan como coenzimas en los siguientes sistemas, entre otros:

Transferasas: EC 2.1.1.13-14, enzimas encargadas de la transferencia de grupo metilo
desde metil-THF a homocistena para dar metionina. La enzima de mamfero requiere una

coenzima cobamdica. EC 2.1.2.1-10, que catalizan las reacciones propias de estas
coenzimas: transferencias de grupos formil, hidroximetil, formimino, etc.

Ligasas: EC 4.3.2.12, dihidrofolato sintetasa; EC 4.3.3.2, metenil-THF sintetasa; y EC 4.3.4.3,
formil-THF sintetasa.

La funcin transportadora de grupos monocarbonados es esencial en la sntesis de
nucletidos, y por lo tanto, en la sntesis de cidos nucleicos. Tanto en la sntesis del anillo
purnico como en muchos otros procesos asociados a dicha sntesis (por ejemplo,
conversin de uracilo en timina) las coenzimas folnicas son indispensables.


4.3.3.2 Carcter vitamnico

La carencia de cido flico (vitamina B
9
) en la especie humana se traduce en una anemia de
tipo megaloblstico como principal sntoma (Se llaman megaloblsticas las anemias que
cursan con hemates de mayor tamao que el normal). La causa de la misma radica
probablemente en la incapacidad de sntesis de cidos nucleicos ante la carencia de cido
flico. En este sentido, sealaremos que las coenzimas folnicas participan en la
incorporacin de dos carbonos del anillo purnico (C2 y C8) y en la incorporacin del grupo
5-metil de la timina. En las carencias experimentales de cido flico puede observarse que el
suplemento de la dieta con purinas hace desaparecer el sndrome carencial.

La importancia de este tipo de megaloblastosis ha aumentado ltimamente debido al
empleo de agentes antiflicos en la teraputica antineoplsica, en especial methotrexate y
aminopterina. Por tanto, estas anemias pueden darse en individuos sometidos a este tipo de
tratamientos.


4.3.3.3 Farmacologa asociada al cido flico

Los anlogos de cido flico se emplean en la teraputica antineoplsica por su papel de
inhibidores indirectos de la sntesis de cidos nucleicos. Los principales antiflicos son los ya
citados aminopterina y methotrexate (fig. 4.15), que operan inhibiendo a la dihidrofolato
reductasa, encargada de la formacin de cido tetrahidroflico.


N
S
O
O
NH R
H
H
N
N
NH
NH
H
2
N
N
C NH
O
C H
COO
-
CH
2
CH
2
CO OH
CH
3
NH
2
n
Methotrexate
Sulfonamidas


Figura 4.15: Anlogos de cido flico empleados en teraputica

En otro orden de cosas, la teraputica antibacteriana emplea desde principios del siglo XX
las sulfonamidas (ver fig.4.15) que son nalogos del cido 4-aminobenzoico y en cuya
presencia no puede tener lugar la sntesis normal de cido flico en bacterias (inhiben la
folato sintetasa de estos organismos). Por esta razn las sulfonamidas no actan sobre
organismos incapaces de formar cido flico, como por ejemplo la especie humana; y de ah
su inters teraputico. Una accin parecida puede atribuirse al cido p-aminosaliclico (PAS),
primer quimioterpico que se demostr efectivo en el tratamiento antituberculoso.




4.3.4 Coenzimas cobamdicas


En 1926 Murphy describi el valor teraputico del extracto de hgado en la anemia
perniciosa humana, un sndrome megaloblstico asociado a trastornos gstricos. En 1948, e
independientemente, los equipos de Folkers en Estados Unidos y Smith en Inglaterra
cristalizaron el factor responsable, al que se le haba dado el nombre de vitamina B
12
. En
1957, gracias a los estudios de D.Hodgkin se pudo conocer la complicada estructura qumica
de la misma. Se trata de un factor que no es sintetizado ni por animales ni por plantas;
nicamente ciertos microorganismos, afortunadamente muy abundantes, producen esta
vitamina. Es asimismo requerida para el crecimiento de muchos otros microorganismos, lo
que ha facilitado su aislamiento gracias al desarrollo de ensayos microbiolgicos. Otra
observacin importante fue que la anemia perniciosa humana se debe en la mayor parte de
los casos no a la falta de vitamina B
12
, sino a la carencia de una protena presente en la
secrecin gstrica, el factor intrnseco, que es el responsable de la absorcin intestinal de la
vitamina B
12
.


4.3.4.1 Estructura qumica



Tal y como es normalmente aislada del extracto de hgado, la vitamina B
12
aparece bajo la
forma de cianocobalamina, cuya estructura se presenta en la figura 4.16.



Figura 4.16: Estructura de la cianocobalamina.


Consiste en un sistema tetrapirrlico llamado corrina y una estructura parecida a un
nucletido (bencimidazol). El anillo corrnico (por lo que las coenzimas cobamdicas se
llaman tambin corrinoides), es semejante a una porfirina, con la salvedad de presentar dos
pirroles unidos directamente y no por el habitual grupo metnico de las porfirinas.
Coordinado a los nitrgenos pirrlicos aparece un ion de cobalto, cuyo estado de valencia
vara segn la naturaleza de los distintos corrinoides. La quinta posicin de coordinacin del
cobalto aparece unida al nucletido. El ligando de la sexta vara; en la cianocobalamina se
trata de un ion cianuro CN
-
pero es un artefacto del mtodo de extraccin. En esta posicin
pueden verse asimismo los grupos hidroxi, agua, nitrito, cloruro y sulfato, dando lugar a las
distintas cobalaminas: hidroxicobalamina, acuocobalamina, nitritocobalamina, etc.

Las formas activas como coenzimas cobamdicas o corrinoides presentan la sexta posicin
de coordinacin del cobalto ocupada por un ligando distinto a los aniones con los que
suelen ser aisladas. En un caso se trata del nuclesido 5'-desoxiadenosina (otra singularidad:
los desoxinuclesidos del DNA son 2'-desoxi y no 5'-desoxi como en este caso), y hablamos
entonces de adenosilcorrinoides. En otros casos la sexta posicin est ocupada por agua, por
lo que hablamos de acuocorrinoides. Los sistemas enzimticos mejor caracterizados en los
que participan las coenzimas cobamdicas son por lo general sistemas bacterianos. Son muy
pocas las enzimas conocidas de tejidos de mamfero que requieran estas coenzimas.



4.3.4.2. Modo de accin


Se ha podido comprobar que los adenosil corrinoides participan en reacciones en las que
hay un intercambio de hidrgeno con otro grupo situado en principio en un carbono
contiguo (intercambio 1,2), aunque en ocasiones puede darse este intercambio de forma
intermolecular y no necesariamente intramolecular. Un ejemplo de estas reacciones es la
catalizada por la metilmalonil-CoA mutasa, que se presenta en la figura 4.17.

CO S CoA
C
COO
-
H CH
3
CO S CoA
CH
2
CH
2
COO
-
Metilmalonil CoA
Succinil CoA


Figura 4.17: Reaccin de la metilmalonil-CoA mutasa

Las coenzimas cobamdicas participan en muchas otras reacciones, de distinto tipo; desde la
ribonucletido reductasa bacteriana (fundamental en la sntesis de DNA), pero no en la de
mamferos.

Tambin participan en la formacin de metionina a partir de homocistena; esta actividad
existe tanto en bacterias como en mamferos. De hecho, se puede mantener a ratas en
dietas carentes de metionina si se las suplementa con homocistena.

Las cobamidas participan tambin en la sntesis de metano en bacterias metanognicas.



4.3.4.3 Carcter vitamnico

Ni las plantas superiores ni los animales son capaces de sintetizar coenzimas cobamdicas, y
para muchos microorganismos se trata de un factor necesario para su crecimiento. La
carencia "pura" de vitamina B
12
no existe en la prctica; normalmente la flora bacteriana
intestinal sintetiza toda la necesaria en la nutricin. En la especie humana, el sndrome
carencial (anemia perniciosa) se debe esencialmente a la carencia de factor intrnseco. ste
es una glicoprotena producida por las clulas parietales del estmago, con un P.M. de 50
kDa, que fija vitamina B
12
en la proporcin 1:1 y que es esencial para la absorcin de la
vitamina en los tramos distales del tubo digestivo. Una vez absorbidas, las cobalaminas
circulan en la sangre asociadas a dos protenas, transcobalaminas I y II.

Las principales fuentes naturales de esta vitamina se dan en los fangos y en el estircol; los
tejidos animales, como el hgado, pueden ser asimismo una fuente rica en la vitamina, pero
no los vegetales.







4.3.5 Biotina


Reconocida en principio como un factor de crecimiento para la levadura, la biotina fue
aislada de la yema de huevo por Kgl en 1935, y se identific con la coenzima R de
Rhizobium. Du Vigneaud, en 1943, estableci su estructura qumica e identific la biotina
como el factor capaz de prevenir la aparicin del sndrome txico de la clara de huevo
(producido por la administracin a ratas de grandes cantidades de clara de huevo cruda).
Los estudios de Lardy sugirieron un papel para la biotina en las reacciones de carboxilacin,
ampliamente corroborados por estudios posteriores. La biotina tiene en el hombre carcter
vitamnico (fue conocida como vitamina H, pero hoy se prefiere el nombre de Vitamina B
7
).


4.3.5.1 Estructura qumica y modo de accin

La estructura de la biotina se presenta en la figura 4.18. Se presenta normalmente unida a
las protenas a travs del carboxilo de su cadena lateral unido a un grupo -amino de la
lisina. De hecho, en hidrolizados de estas enzimas se encuentra frecuentemente la biocitina,
formada por la unin de biotina y lisina.

NH HN
S
CO
NH
CH
CO
HN
CH
OC
R
NH
OC
CH
HN
R'
NH HN
S
COOH
Biotina
Biotinil-protena
(unin a c-amino de lisina)


Figura 4.18: Estructura de la biotina y su unin a protena.

Las reacciones en que participa la biotina son esencialmente carboxilaciones dependientes
de ATP (que se hidroliza a ADP en el proceso), catalizadas por enzimas del grupo 6.4 (ligasas
C-C). Como ejemplos podemos citar la piruvato carboxilasa y la acetil-CoA carboxilasa.



Las reacciones de carboxilacin mediadas por biotinil-enzimas tienen lugar mediante la
formacin dependiente de ATP de carboxibiotina (fig.4.19).

NH N
S
COOH
C
O
HO
NH HN
S
COOH
ATP
ADP + Pi
CO
2
Biotina
Carboxibiotina

Figura 4.19: Estructuras de biotina y carboxibiotina


4.3.5.2 Avidina

El sndrome txico de la clara de huevo se debe a la existencia en sta de una concentracin
apreciable de avidina. Se trata de una glicoprotena de 70 kDa compuesta por cuatro
subunidades idnticas y que es capaz de fijar biotina con una extraordinaria afinidad (K
a
de
aprox. 10
15
). De ah que la toxicidad de la clara de huevo resulte de eliminar prcticamente
toda la biotina libre.





4.3.6 S-adenosil metionina


La S-adenosil metionina (SAM, S-AM) es una coenzima que participa en la prctica totalidad
de las reacciones de metilacin que se dan el medio biolgico. No tiene carcter vitamnico,
siendo sintetizada por el organismo humano siempre que haya suministro diettico de
metionina (que es un aminocido esencial)


4.3.6.1 Estructura qumica

En la figura 4.20 aparece la estructura de la S-adenosil metionina. La caracterstica ms
acusada de este compuesto es la presencia de un grupo sulfonio, lo que le confiere un
carcter de compuesto de alta energa de hidrlisis.



O
H
H
OH
H
OH
CH
2
H
N
N
N
N
NH
2
S
+
CH
3
CH
2
CH
2
C
NH
3
+
H
-
OOC
S-Adenosil metionina (SAM)


Figura 4.20 Estructura de la S-adenosil metionina


4.3.6.2 Funcin metablica

La prctica totalidad de las metilaciones metablicas conocidas estn mediadas por la
S-adenosil metionina. Es decir, casi todas las enzimas del grupo 2.1.1 operan con esta
coenzima. Alguno de los procesos con particular inters biolgico son los siguientes:

(a) Sistemas de metilacin de DNA. El reconocimiento del DNA como "propio" tiene lugar en
las clulas a travs de un patrn especfico de metilacin de las bases. Si ste no existe, el
DNA es degradado por enzimas de restriccin. Las metilaciones ms frecuentes tienen lugar
en N6 de adenina y C5 de citosina.

(b) Sntesis de ribotimidilato a partir de UMP para la formacin de tRNA.

(c) Sntesis de lecitinas (fosfatidil colinas) a partir de fosfatidil-etanolaminas.

(6) Metabolismo e interconversiones de neurotransmisores; por ejemplo, formacin de
adrenalina a partir de noradrenalina; O-metilacin de catecoles por la catecol-O-metil
transferasa (COMT); metilacin de la N-acetil serotonina por la HIOMT (hidroxiindol-O-metil
transferasa) para dar melatonina, hormona muy abundante en la glndula pineal y cuya
actividad parece estar ligada a ritmos biolgicos cuyo perodo es de 24 horas (ritmos
circadianos).




4.3.7 Pantetenas


Estas coenzimas funcionan metablicamente como transportadores de grupos acil. Dentro
del grupo se distinguen dos coenzimas: la coenzima A y la protena transportadora de acilos
(ACP, Acyl Carrier Protein).

La coenzima A es una molcula de muy amplia distribucin en todas las clulas. En realidad,

podemos decir que las formas metablicamente activas de los cidos grasos son derivados
de coenzima A, un poco de la misma manera que los steres fosfricos son la forma
metablica activa de los azcares.

La coenzima A est relacionada con el requerimiento diettico de cido pantotnico como
factor vitamnico (Vitamina B
5
). Lipmann demostr la participacin del cido pantotnico en
la estructura de la coenzima A. Posteriormente, Vagelos caracteriz un pptido requerido
en la biosntesis citoplsmica de cidos grasos, llamado protena transportadora de acilos
(ACP segn las siglas inglesas) y cuyo grupo activo era otro derivado de cido pantotnico, la
4'-fosfopantetena.


4.3.7.1 Estructura qumica

El cido pantotnico (fig.4.21) es la pantoil -alanina. Es sta la parte de la molcula que los
organismos animales no pueden sintetizar y que es requerida por tanto en la dieta. La unin
del cido pantotnico con la cisteamina (producida por descarboxilacin de cistena) da
lugar a la pantetena, que es la estructura comn en estos dos coenzimas.

CH
2
OH C
CH
3
CH
3
CHOH CO NH CH
2
CH
2
COOH
CH
2
OH C
CH
3
CH
3
CHOH CO NH CH
2
CH
2
CO NH CH
2
CH
2
SH
c. Pantotnico
Pantetena
c. Pantoico
|-Alanina
Cisteamina


Figura 4.21: Estructura del cido pantotnico y de la pantetena.

La coenzima A se forma por unin de la pantetena a un 3'-fosfo ADP (fig.4.22) dando lugar a
una compleja estructura con muchos sitios reactivos potenciales; los estudios de Lynen, sin
embargo, demostraron que el grupo reactivo de la coenzima A es el tiol (-SH) terminal.
Como tantas otras coenzimas, pues, la coenzima A presenta una estructura de nucletido de
adenina.

O
H
H
OH
H
CH
2
H
N
N
N
N
NH
2
O P
O
O
-
O P
O
O
-
O
H
3
C CH
3
HO H
C
N
C
N
HS
O
H
O
H
O
P O
-
O
O
-
Coenzima A


Figura 4.22: Estructura de la coenzima A

La ACP es un pptido de un peso molecular de aproximadamente 8500 en E.coli. El grupo
prosttico es una pantetena unida por un enlace fosfodister a un residuo de serina en el
pptido.


4.3.7.2 Modo de accin

El aislamiento y caracterizacin de la coenzima A por parte de Lynen demostr que la accin
de la coenzima A es a travs de la formacin de tiolsteres. Estos steres tilicos son
compuestos de alta energa de hidrlisis. La coenzima A se une a los grupos acil- a travs de
este tipo de enlaces. Los acil-CoA (o acil-S-CoA) formados participan en todo tipo de
reacciones en los que se requiere un cido carboxlico activado. Esto nos da idea de la gran
importancia de la coenzima A en el metabolismo de cidos grasos.

La ACP opera en la sntesis de cidos grasos catalizada por el complejo de la cido graso
sintetasa citoplsmica. En este sentido, los derivados de ACP llevan a cabo reacciones muy
parecidas a los derivados de coenzima A.




4.3.8 Carnitina


La carnitina (-hidroxi -butirobetana, fig.4.23) es un transportador de acilos con una
funcin muy concreta: la translocacin de cidos grasos a travs de la membrana
mitocondrial. Los derivados de CoA y la propia CoA son molculas muy grandes que no
atraviesan dicha membrana. Por ello las enzimas 2.3.1.7 y 2.3.1.8 (acil-CoA: carnitina
aciltransferasas) forman los correspondientes derivados acil-carnitina. En este caso el
enlace formado es un O-acil de alta energa con el carboxilo de la carnitina.


CH
3
N
CH
3
CH
3
CH
2
CHOH CH
2
COOH
Carnitina


Figura 4.23: Estructura de la carnitina.


No parece que la carnitina tenga carcter vitamnico. Ahora bien, su sntesis requiere lisina y
S-adenosilmetionina, por lo que algunos autores recomiendan su adicin a la dieta, sobre
todo a deportistas; parece que en muchos casos la concentracin de carnitina es limitante
en cuanto a la oxidacin mitocondrial de los cidos grasos.




4.3.9 3'-Fosfoadenosil 5'-fosfosulfato (PAPS)


Esta coenzima es el principal donador de grupos sulfato en el metabolismo, al tiempo que
en los organismos capaces de reducir sulfato a sulfuro (vegetales y algunos
microorganismos), el PAPS es la forma primitiva de entrada del azufre en el metabolismo. Su
estructura aparece en la figura 4.24.

O
H
H
OH
H
O
CH
2
H
O P
O
O
-
O N
N
N
N
NH
2
S
O
O
-
O
P O
O
-
-
O
Fosfoadenosil fosfosulfato (PAPS)


Figura 4.24: Estructura del fosfoadenilil fosfosulfato (PAPS).

El PAPS no tiene carcter vitamnico. Esta coenzima opera con todas las sulfotransferasas
del grupo 2.8.2. Algunas de las funciones ms importantes de este proceso son las
siguientes:

(a) Transferencia de grupos sulfato a polisacridos en la formacin de condroitin sulfatos,
heparina, heparan- y dermatan sulfatos, etc.


(b) Formacin de sulftidos por sulfatacin de glicolpidos.


4.3.10 Adenosina 5' trifosfato (ATP)

Toda la energa libre producida o captada en los procesos de fermentacin, respiracin y
fotosntesis adopta en todos los organismos conocidos la forma de ATP. El papel de este
nuclesido trifosfato fue establecido por Lipmann, y la variedad de procesos en los que
participa a todos los niveles metablicos impide una discusin completa en el presente
contexto. La estructura del ATP se presenta en la figura 4.25. Toda la molcula puede ser
sintetizada por cualquier organismo; no tiene, pues, ningn carcter vitamnico.

O
H
H
OH
H
OH
CH
2
H
O P
O
O
-
O P
O
O
-
O N
N
N
N
NH
2
P
O
-
O
O
-
Adenosina-5'-trifosfato (ATP)


Figura 4.25: Estructura del adenosin-5'-trifosfato (ATP).

Las reacciones en que participa ATP pueden clasificarse dentro de dos grandes grupos:
transferencia de alguna porcin de la molcula de ATP a un aceptor adecuado, o bien rotura
de los enlaces pirofosfato del ATP para suministrar energa libre a reacciones en principio
desfavorables energticamente.


(a) Reacciones de transferencia ligadas al ATP

La gran mayora de las enzimas de los grupos 2.7.1-4 (fosfotransferasas o kinasas) utilizan
ATP para la transferencia de un fosfato a un aceptor adecuado.


(b) Suministro de energa para otras reacciones

El ATP participa tambin en procesos que normalmente no tendran lugar por sus
caractersticas energticas. En este caso, el proceso en cuestin aparece acoplado a la
hidrlisis de algn enlace del ATP que provee un intercambio energtico favorable.



4.3.11 Otros nucletidos que operan como coenzimas


En el metabolismo de los monosacridos son fundamentales los derivados de
uririndifosfato. Los UDP-monosacridos son los substratos preferentes de las enzimas del
grupo 2.4.1 (hexosil transferasas). Estos derivados operan normalmente en la formacin de
glicsidos (hetersidos y polisacridos) y de glucuronoconjugados en los procesos de
destoxificacin, as como en reacciones de transformacin del azcar (intercambio UDP-
glucosa por UDP-galactosa, por ejemplo)

Otros nucletidos participan tambin en reacciones similares. As, en los vegetales los
nucletidos de adenina sustituyen a los de uracilo en todas estas reacciones. En otros
procesos operan como coenzimas de transferencia los CDP-derivados (por ejemplo,
CDP-colina y CDP-etanolamina en la sntesis de lpidos complejos). Otros derivados
nucleotdicos lo son de GDP (p.e. GDP-manosa o GDP-fucosa) o de CMP
(CMP-N-acetilneuramnico).



CAPTULO 5: Cintica de las reacciones enzimticas


5.1 Introduccin


5.1.1 Inters de los estudios cinticos

Con mucha frecuencia la cintica de reacciones enzimticas es un tema que para
estudiantes de Biologa o Medicina parece algo innecesariamente formalista, adems de
tedioso. Este punto de vista se ve reforzado cuando al pasar al laboratorio, vemos que el
comportamiento real de las enzimas dista a veces mucho de la pretendida claridad de las
explicaciones cinticas. En particular, en el campo de la regulacin enzimtica, vemos muy a
menudo que cada enzima agota su especie; es decir, los modelos "generales" para explicar
comportamientos regulatorios se aplican, y con dificultades, a un nmero reducido de
casos.


Sin embargo, la importancia de los estudios cinticos bien merece emplear un tiempo
considerable en su estudio. Trataremos a continuacin de ofrecer algunas razones; veamos
primero las ms generales:

(a) En la Biologa actual falta todava un tratamiento rigurosamente cuantitativo de los
fenmenos. Como veremos, la cintica de la accin enzimtica se describe mediante
relaciones cuya importancia transciende el marco relativamente restringido de los
biocatalizadores para dar lugar a una primera aproximacin cuantitativa al fenmeno
viviente, en tanto en cuanto una gran cantidad de hechos biolgicos pueden reducirse a una
interaccin protena-ligando. De todas estas interacciones, la que tiene lugar entre enzima y
substrato es, de lejos, la ms y mejor estudiada.

(b) El conocimiento del mecanismo de reaccin implica llegar a niveles atmicos y
moleculares, lo cual no es siempre posible, a pesar de todos los progresos instrumentales.
En estos casos, un estudio cintico detallado es la nica va de que disponemos para
obtener algn dato sobre el mecanismo de la reaccin. Incluso cuando es posible un estudio
ms estructural del mecanismo, el estudio cintico es una condicin previa; cualquier
camino propuesto para la reaccin deber concordar con los datos experimentales
cinticos.

(c) De todos es conocida la sensibilidad de los sistemas biolgicos a variables como pH y
temperatura, particularmente en organismos pluricelulares. Esta sensibilidad no slo se
aprecia a nivel qumico, sino tambin, y a veces dramticamente, en aspectos fisiolgicos y
fisiopatolgicos. La constancia del medio interno, principio bsico en la fisiologa, no es ms
que el prerrequisito para el correcto funcionamiento de las enzimas (o en sentido amplio, de
los receptores). De ah la importancia del estudio de las variables cinticas mencionadas.

(d) El fenmeno de la inhibicin enzimtica es la base y fundamento de toda la Teraputica
farmacolgica y de todo tipo de accin qumica selectiva sobre el medio biolgico, como por
ejemplo el control de plagas en la agricultura. Por tanto, el diseo racional y la evaluacin
de todos los compuestos potencialmente tiles requiere necesariamente por el estudio
cintico de la reaccin que inhiben.

Pasemos a continuacin a ofrecer razones de tipo ms concreto:

(e) En muchas ocasiones es necesario conocer la actividad enzimtica de una determinada
muestra biolgica, tanto en el terreno tecnolgico como en la investigacin pura. El diseo
de un sistema eficiente de ensayo de actividad es una condicin ineludible para que la
medida tenga garanta. Y para ello, es imprescindible el conocimiento del efecto que tienen
las distintas variables cinticas: concentracin de enzima, concentracin de substrato, pH,
temperatura, etc. En la misma lnea, la definicin correcta de unidades pasa siempre por un
conocimiento cintico detallado de la reaccin enzimtica.

(f) El empleo creciente de reactivos enzimticos en procesos industriales exige
generalmente un diseo cuidadoso antes de su incorporacin a los reactores donde vayan a

ser empleados. El estudio cintico de las enzimas es por tanto condicin previa a todo tipo
de aplicacin industrial de los mismos.

(g) Cuando acometemos la purificacin de una enzima a partir de un material biolgico la
nica fuente vlida de informacin sobre la misma nos la da su estudio cintico, ya que
dentro de ciertos lmites, puede dar datos interesantes para la identificacin de la enzima
aun en preparaciones no purificadas.

La velocidad de las reacciones enzimticas se estudia tradicionalmente en funcin de cuatro
variables: concentracin de enzima, concentracin de substrato, pH y temperatura. Aun
cuando constituyen captulos aparte, la inhibicin enzimtica y la regulacin enzimtica se
consideran parte del estudio cintico. Antes de pasar a estudiar estas variables conviene
establecer el concepto de velocidad inicial.


5.1.2 Concepto de velocidad inicial


Cuando a travs de algn mtodo de monitorizacin continua de la reaccin seguimos la
marcha en el tiempo de una reaccin enzimtica, obtenemos, con tiempos suficientemente
largos, curvas como la que aparece en la figura 5.1. En la misma se presenta el curso
temporal (o curva de progreso) de una reaccin enzimtica S P. Se ilustra el concepto de
velocidad inicial como la tangente a tiempo t=0.

En estas grficas representamos la desaparicin del substrato o la aparicin del producto en
funcin del tiempo. Puede apreciarse que la curva va aplanndose progresivamente a
medida que transcurre el tiempo de reaccin, lo cual significa que la velocidad va
hacindose cada vez menor. Pueden ser muchas las razones de este fenmeno; pero entre
ellas es obvio que la desaparicin del substrato es la razn principal.




Por esta razn, las medidas de actividad enzimtica (recurdese que en Enzimologa
actividad es sinnimo de velocidad) slo son vlidas en los primeros tramos de la curva de
progreso. En rigor, la velocidad vlida para la medida es la pendiente a tiempo cero, que es
la llamada velocidad inicial (en la figura 5.1 la medicin vlida de velocidad es la tangente a
la curva para t=0). Normalmente los ensayos enzimticos son diseados de manera que el
tramo lineal de la curva de progreso sea lo ms largo posible, con lo que se facilita la
medicin de la velocidad inicial. Ahora bien, cuando se trata de puntos experimentales
reales, trazar una tangente a t=0 puede ser mucho ms difcil de lo que la figura 5.1
muestra. En lo sucesivo, y mientras no se especifique lo contrario, siempre que hablemos de
velocidad, queremos decir velocidad inicial.

En los apartados que siguen estudiaremos muy someramente la cintica de las reacciones
enzimticas. En el contexto del presente curso, no tendra sentido discutir, por ejemplo, la
cintica multisubstrato o las cinticas de estado inicial (o pre-estado estacionario), as como
los efectos de pH y temperatura desde un punto de vista cuantitativo. Por esa razn nos
centraremos en la cintica monosubstrato, y con preferencia, bajo las suposiciones de
Michaelis-Menten. (ver ms abajo)



5.2 Efecto de la concentracin de enzima



La velocidad de una reaccin enzimtica, segn muestran las determinaciones
experimentales, y siendo constantes el resto de las condiciones, es directamente
proporcional a la concentracin de enzima, segn se muestra en la figura 5.2.


Dicho de otro modo, la reaccin enzimtica es de primer orden en relacin a la
concentracin de enzima [E]; k es una constante de velocidad.

[1]
] [
] [ ] [
E k
dt
S d
dt
P d
=

=

En general, este es un resultado propio de todos aquellos procesos que, como la catlisis,
son de ndole regenerativa, tal y como aparece expresado grficamente en la figura 5.3, y no
es atribuible a ninguna caracterstica especfica de las enzimas.


De hecho, uno de los argumentos que utiliz Krebs para postular el ciclo de los cidos
tricarboxlicos que lleva su nombre era la relacin lineal entre el consumo de oxgeno y la
concentracin de una serie de aniones orgnicos que como el citrato, succinato, malato y
oxalacetato, son intermediarios del mismo, y que por lo tanto se regeneran en cada ciclo de
reaccin (figura 5.4).


Un fenmeno parecido tiene lugar en la biosntesis citoplsmica de cidos grasos, proceso
enteramente dependiente de la presencia de CO
2
y cuya velocidad es proporcional a la
concentracin del mismo (normalmente en forma de ion bicarbonato HCO
3
-
). El CO
2
se
incorpora mediante la acetil-CoA carboxilasa y posteriormente se regenera al condensarse
la unidad malonil- con la unidad acil- en la superficie de la sintetasa de cidos grasos (figura
5.5).

No obstante, nos encontramos en el laboratorio muchas situaciones experimentales en las
que no podemos evidenciar esta relacin lineal entre concentracin de enzima y velocidad
de reaccin. Esto es debido generalmente a artefactos experimentales, como veremos
seguidamente.

Algunas veces, particularmente en preparaciones muy activas, la representacin de
actividad frente a concentracin de enzima, da lugar a curvas que progresivamente se
aplanan (ver figura 5.6). La razn ms comn para este fenmeno es el agotamiento del
substrato. Al ser muy alta la actividad, la concentracin de substrato disminuye muy
rpidamente hasta hacerse limitante.


Este efecto es particularmente importante cuando en el laboratorio clnico medimos
actividades enzimticas muy altas (por ejemplo, la alanina aminotransferasa en las hepatitis
vricas) en las que si no repetimos la medicin con el suero (que es donde est la enzima)
convenientemente diludo, se corre el peligro de subestimar la verdadera actividad
enzimtica presente en el mismo, y por tanto, dar un informe equivocado a efectos
diagnsticos o pronsticos. En general, cuando obtenemos un aplanamiento de la relacin
entre concentracin de enzima y velocidad se trata de un defecto metodolgico.



5.3 Efecto de la concentracin de substrato



Cuando ensayamos la actividad de una enzima en funcin de la concentracin de substrato,
manteniendo constantes todas las dems condiciones, como concentracin de enzima, pH,
temperatura y concentracin de otros substratos si los hubiere, obtenemos una relacin
como la que se presenta en la figura 5.7. En ella podemos ver que a bajas concentraciones
del substrato la velocidad aumenta de forma casi lineal; esta dependencia se va aplanando a
medida que aumenta la concentracin y para concentraciones muy altas, la curva se
aproxima asintticamente a un lmite mximo, la velocidad mxima, que no se modifica por
mucho que aumentemos la concentracin de substrato.


En otras palabras, la velocidad de una reaccin enzimtica es de orden mixto respecto a la
concentracin de substrato: casi de primer orden a bajas concentraciones y casi de orden
cero a las concentraciones altas del mismo, siendo de orden fraccionario entre 1 y 0 para las
concentraciones intermedias. La forma geomtrica que resulta de esta relacin, es decir, la
grfica presentada en la figura 5.7, es la de una hiprbola rectangular.

En el captulo 3 hemos visto que la accin enzimtica puede interpretarse mediante un
modelo que supone al substrato fijndose a una regin especfica y complementaria de la
superficie de la enzima, el centro activo, en el que los grupos qumicos de la protena
transforman al substrato. Dado que la enzima est a una concentracin finita, y que el
nmero de centros activos por tanto tambin lo es, hay en total un nmero fijo y
determinado de sitios; cuando la concentracin del substrato es suficientemente alta, todos
los sitios estarn ocupados y la velocidad no aumentar aun cuando aumente la
concentracin del substrato. Se dice entonces que la enzima est saturada. En general, los
mecanismos que dan lugar a este tipo de curvas se denominan saturantes.


5.3.1 Estudio cintico de la interaccin enzima-substrato

Suponemos que las enzimas operan segn el siguiente mecanismo:

[2]

E + S ES E + P
k
+1
k
+2
k
-1


En donde E es la enzima, S el substrato, ES el complejo enzima-substrato y P el producto.
Para evitar confusiones en las letras, en lo sucesivo llamaremos e a la concentracin de
enzima libre, e
0
a la de enzima total, s a la de substrato, x a la del complejo
enzima-substrato y p a la del producto. Igualmente, y para simplificar el tratamiento
matemtico del mecanismo, suponemos que el complejo ES (cuya concentracin es x) se
forma reversiblemente a partir de E y S, con constantes de velocidad de k
+1
para la reaccin
directa y k
-1
para la inversa; y que el complejo se descompone irreversiblemente a E y P con
constante de velocidad k
+2
. Si la cantidad inicial de enzima en la reaccin es e
0
, en cualquier
momento se cumplir que e
0
= e + x. Asimismo, y por simplicidad, supondremos que la
concentracin de substrato es mucho mayor que la de enzima, esto es, s >> e
0
. Con estas
premisas podramos plantear el mecanismo como un conjunto de ecuaciones diferenciales
que no admiten solucin analtica (que se presentan, a efectos informativos, en la figura
5.8).

Las nicas soluciones posibles son las numricas o bien aquellas que introducen ciertas
suposiciones simplificadoras del mecanismo. En cualquier caso, la velocidad de la reaccin
siempre ser

[3]


x k v
2 +
=

Donde v es la velocidad, k
+2
la constante de velocidad de formacin de producto P y x la
concentracin de complejo enzima-substrato. La figura 5.9 representa una curva de
progreso para este mecanismo calculada numricamente.



5.3.2 Mecanismo de Michaelis y Menten


Brown y Henri en 1902 fueron los primeros en sugerir el mecanismo [2], es decir, que la
accin enzimtica tiene lugar formndose primero un complejo ES que posteriormente se
descompone a E + P. En 1913, Michaelis y Menten postularon una suposicin adicional
sobre este mecanismo que conduce a una solucin sencilla que concuerda con los datos
experimentales en la mayora de los casos (suposicin de equilibrio rpido)

Estos autores introdujeron una nueva simplificacin (aadida a la suposicin de que s >> e
0
)
en este mecanismo al postular que la formacin del complejo ES a partir de enzima y
substrato es mucho ms rpida que su descomposicin ulterior a enzima y producto; y por

tanto, se alcanza el equilibrio muy rpidamente. Dicho de otra forma, k
+1
k
-1
>> k
+2
. En ese
caso, y utilizando la misma nomenclatura que en el apartado anterior, podemos utilizar una
ecuacin de equilibrio para obtener la concentracin x del complejo ES:

[4]
| || |
| |
( )
x
s x e
x
es
ES
S E
K
m

= = =
0


En donde K
m
es la constante de equilibrio de disociacin del complejo ES, y por tanto, igual
al cociente de las constantes de velocidad k
-1
/k
+1.
Despejando x,

[5]
s K
s e
x
m
+
=
0


Pero la velocidad de la reaccin enzimtica, segn [3] es dp/dt = k
+2
x; por lo tanto, al
sustituir el valor de x por [5] obtenemos

[6]
s K
s e k
x k
dt
dp
v
m
+
= = =
+
+
0 2
2


Ahora bien: si el producto k
+2
x nos da la velocidad de la reaccin, el producto k
+2
e
0

representa la mxima velocidad que puede alcanzar la misma; de hecho, este producto sera
la velocidad en el caso de que toda la enzima estuviera en forma de complejo ES (es decir,
cuando toda la enzima est saturada por el substrato, x = e
0
). Por esa razn, a partir de
ahora, llamaremos V
max
a dicho producto, con lo que la ecuacin [6] se transforma en:

[7]
s K
s V
v
m
+
=
max


Que es la relacin conocida como ecuacin de Michaelis-Menten. Representada
grficamente, vemos que se trata de una hiprbola rectangular cuya asntota es V
max
, como
la curva representada en la figura 5.10. Esta relacin nos da la velocidad inicial obtenida
para cualquier concentracin s del substrato siempre que conozcamos las dos constantes K
m

y V
max
, cuyo significado analizaremos a continuacin.


5.3.3 Concepto de K
m


1. La K
m
definida segn el tratamiento de Michaelis-Menten que acabamos de exponer, es
la constante de equilibrio de la disociacin del complejo ES:


[8]
| || |
| | ES
S E
K
m
=


considerando E, S y ES a sus concentraciones de equilibrio. Por tanto, un valor grande de la
K
m
significa que en el equilibrio predominan las formas libres [E] y [S], o en otras palabras,
que la afinidad de la enzima por el substrato es pequea. Por el contrario, un valor pequeo
de K
m
supone que la afinidad de la enzima por el substrato es grande, ya que en el equilibrio
predominar el complejo [ES] sobre las formas libres. Por otra parte, de la ecuacin [8] se
puede deducir que la K
m
se mide en unidades de concentracin. Hemos de tener en cuenta
asimismo que la K
m
es una constante que se define para una pareja enzima-substrato; por
ejemplo, en la reaccin de la hexokinasa

[9]
Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP

hablaremos de la K
m
de la glucosa, de la K
m
del ATP, de la K
m
de la glucosa-6-fosfato y de la
K
m
del ADP (estas dos ltimas para la reaccin inversa).

Ahora bien, se debe tener presente que el concepto de K
m
como medida de afinidad es
solamente vlido en aquellos casos en que el mecanismo obedezca a las condiciones de
Michaelis y Menten, es decir, cuando la formacin de complejo ES sea mucho ms rpida
que la descomposicin de ste hacia el producto, lo cual es por lo general la regla en
muchas reacciones enzimticas.

2. La K
m
es independiente de la concentracin de enzima. Se obtienen experimentalmente
los mismos valores de esta constante ante cualquier concentracin de enzima.

3. De [7] puede deducirse fcilmente que cuando la concentracin de substrato es igual a su
K
m
, la velocidad de la reaccin ser igual a V
max
/2. Otra forma, pues, de definir la K
m
es la
siguiente: aquella concentracin de substrato para la cual la velocidad es igual a la mitad de
la mxima. En la figura 5.10 se ilustra grficamente este concepto.


En este sentido, podemos denominar tambin a la K
m
como s
0.5
, es decir, concentracin de
substrato que da lugar a 0.5V
max
. En el caso de que la enzima obedezca al mecanismo de
Michaelis, s
0.5
es la constante de disociacin del complejo enzima-substrato.

Como veremos ms adelante, la ecuacin de Michaelis-Menten, con las oportunas
salvedades, puede describir todos aquellos fenmenos en los que exista interaccin de un
ligando con un receptor. En ese caso, el parmetro s
0.5
, definido como la concentracin de
ligando que provoca un efecto igual a la mitad del mximo posible, se toma siempre como
una medidad de afinidad del ligando con el receptor. Si es grande, la afinidad es pequea, y
si es pequea, la afinidad es grande. Por ejemplo, la afinidad de la hemoglobina por el
oxgeno (fijacin que, por cierto, no puede ser descrita por dicha ecuacin) se mide en
trminos de P
50
, parmetro que significa la presin parcial de oxgeno que da lugar a un 50
% de saturacin; y que tiene, por lo tanto, el mismo significado que la s
0.5
o la K
m
(bajo
suposiciones de Michaelis-Menten).

4. En el captulo 2 vimos que podemos considerar al centro activo de las enzimas como
dotado de dos funciones: (1) la fijacin estereoqumicamente complementaria del substrato
y (2) su transformacin cataltica. Estas dos funciones no son necesariamente
independientes la una de la otra. Con las reservas oportunas, podemos decir que la K
m

describe cuantitativamente la primera de estas dos funciones. Veremos este concepto con
ms detenimiento al hablar de la inhibicin enzimtica.


5. Cuando la concentracin de un substrato es aproximadamente igual o menor a su K
m
, la
dependencia de la velocidad respecto a la concentracin de substrato es ms o menos
lineal. Esto significa que en dicho intervalo de concentraciones las variaciones que pueda
haber en la concentracin de substrato dan lugar a variaciones aproximadamente
proporcionales en la velocidad. Por ello, a estas concentraciones de substrato, podemos
considerar que las enzimas poseen una cierta autoregulacin; una acumulacin de substrato
conduce a un incremento en la velocidad de la enzima que lo transforma, y viceversa. Se ha
pretendido que las concentraciones intracelulares de estado estacionario de los substratos
tienden a estar en los niveles prximos a su K
m
. No se puede dar una norma general a este
respecto, pero este hecho es cierto para muchos metabolitos.


5.3.4 Concepto de V
max


1. La V
max
representa la velocidad que se consigue cuando la concentracin de substrato
tiende a infinito, es decir, es la asntota superior de la ecuacin de Michaelis-Menten; o
bien, la velocidad conseguida cuando toda la enzima presente est en forma de complejo
enzima-substrato. Esta constante tiene dimensiones de velocidad, y por tanto, en cintica
enzimtica se expresa en UI o en kat (v. Cap. 2)

2. La propia definicin de V
max
como k
+2
e
0
(en el mecanismo [2]) nos permite deducir que la
V
max
es directamente proporcional a la concentracin de enzima. En este contexto se
prefiere denominar a la constante k
+2
como k
cat
que es el nmero de recambio o de turnover
de la enzima, es decir, el nmero de moles de substrato transformadas en la unidad de
tiempo por mol de enzima, y sus dimensiones son de t
-1
. e
0
es la concentracin molar de
enzima. Por tanto, V
max
queda establecida como el producto k
cat
e
0
. Al ser k
cat
independiente
de la concentracin de enzima, hoy da se prefiere el uso de esta constante en lugar de V
max
.

3. A partir de la consideracin anterior, podemos suponer a la V
max
como la medida
cuantitativa de la intensidad de transformacin cataltica del substrato, de la misma manera
que la K
m
representaba la funcin de fijacin al mismo.



5.3.5 Aproximacin de estado estacionario


Las suposiciones de Michaelis y Menten no son de aplicacin a todas las enzimas. En
particular, cuando se trata de sistemas multisubstrato, la disociacin de productos a partir
del complejo puede ser tan rpida como la fijacin de substratos al mismo.

Volvamos a la figura 5.9, en la que se presentaba la solucin numrica del sistema de
ecuaciones diferenciales que describan la accin enzimtica (figura 5.8). Puede observarse
que durante un perodo de tiempo muy apreciable la concentracin del complejo
enzima-substrato x permanece prcticamente constante (es decir, dx/dt = 0) Esta fue la

base para que Briggs y Haldane propusieran en 1925 el mecanismo de estado estacionario
para derivar una relacin entre velocidad y concentracin de substrato que no estuviera
sometida a las restricciones del mecanismo de Michaelis, particularmente en lo que a los
valores relativos de constantes de velocidad se refiere. Si exceptuamos los primeros
momentos de la reaccin, la concentracin de complejo ES (representada por x) permanece
prcticamente constante. En estas condiciones, tenemos:

La cintica enzimtica formal se describe a partir de una serie de ecuaciones diferenciales
que aparecen en la figura 5.8. La ecuacin que describe la dinmica del complejo enzima-
substrato x es la siguiente:

[10]
dx/dt= k
+1
es -(k
-1
+ k
+2
) x

El sistema de ecuaciones que aparece en la figura no tiene solucin analtica, pero se
pueden hacer aproximaciones numricas, una de las cuales aparece en la figura 5.9. En ella
se aprecia que durante un perodo muy apreciable de tiempo la concentracin de x
permanece constante (lo que llamamos estado estacionario). Por lo tanto, podemos decir
que en ese caso,

[11]
dx/dt= k
+1
es -(k
-1
+ k
+2
) x = 0

Entonces,

[12]
2 1
1
+
+
+
=
k k
es k
x
Pero sabemos que

[13]
e
0
= e + x || e = e
0
- x

Es decir, la enzima total e
0
es igual a la enzima libre e ms el complejo enzima-substrato x. Y
la enzima libre es igual a e
0
menos el complejo x.

Sustituyendo el valor de e en la ecuacin [2] y desarrollando trminos,

[14]
k
+1
e
0
s xs = (k
-1
+ k
+2
)x

Despejando x,

[15]

s
k
k k
s e
x
+
+
=
+
+
1
2 1
0


Llamando K
m
al cociente [(k
-1
+ k
+2
)/k
+1
],


[16]
s K
s e
x
m
+
=
0


La velocidad de la reaccin ser

[17]
s K
s e k
x k v
m
+
= =
+
+
0 2
2


Pero k
+2
e
0
= V
max
, y por lo tanto,

[18]
s K
s V
v
m
+
=
max



Ecuacin anloga a la de Michaelis-Menten (ecuacin [7]) pero en la que K
m
tiene un
significado distinto. Si bajo condiciones de equilibrio rpido (condiciones de Michaelis-
Menten), K
m
puede ser descrita como el cociente k
-1
/k
+1
, en condiciones de estado
estacionario ser (k
-1
+k
+2
)/k
+1
. Por tanto, bajo la suposicin de estado estacionario, K
m
no
mide la afinidad de la enzima por el substrato. Sin embargo, K
m
sigue siendo la s
0.5
, es decir,
la concentracin de substrato para la cual se alcanza una velocidad igual a V
max
/2.

La hiptesis de estado estacionario es la que normalmente se emplea cuando tratamos con
sistemas multisubstrato, ya que la derivacin de ecuaciones de velocidad por este
procedimiento es fcil y directa. No la trataremos aqu.



5.3.6 Eficiencia cataltica de las enzimas



La velocidad de una reaccin enzimtica correspondiente al mecanismo estudiado viene
dada por la ecuacin de Michaelis-Menten (ecuacin [7]). Para concentraciones altas de
substrato (s >> K
m
), esta ecuacin se reduce a:


[19]
0 max
e k V v
cat
= =


En la cual no aparece ningn trmino en s, lo que nos indica que en estas condiciones la
reaccin enzimtica es orden cero respecto al substrato. Sin embargo, a concentraciones
bajas de substrato (s << K
m
), la ecuacin de Michaelis-Menten toma la forma

[20]
s e
K
V
v
m
0
max
=



En la que vemos que la reaccin es primer orden respecto a substrato y segundo orden
global (ya que depende de dos trminos de concentracin, e
0
y s, siendo la constante
k
cat
/K
m
la constante de velocidad de segundo orden. Esta constante representa la eficiencia
cataltica de la enzima, y su valor ser tanto mayor cuanto ms eficiente sea sta. Pero
enzimas y substratos se encuentran normalmente en un medio acuoso, y en ltimo trmino
la velocidad de la reaccin llegara a estar controlada por la velocidad de difusin de
enzimas y substratos en dicho medio. La estructura molecular de las enzimas puede llegar a
hacerse extremadamente eficiente en la catlisis, pero es obvio que no tiene ningn sentido
evolutivo obtener eficiencias catalticas superiores a la velocidad de difusin. sta se ha
calculado en un orden de magnitud de 10
8
moles/segundo; por ello, esta cifra representa un
lmite mximo a la eficiencia cataltica de las enzimas. Muchas enzimas conocidas alcanzan
esta cifra: se dice que son enzimas controladas por difusin, o bien enzimas plenamente
evolucionadas. Algunas se presentan en la tabla I:





Tabla I

Eficiencia cataltica de algunas enzimas


Enzima

k
cat
K
m
k
cat
/K
m

Catalasa 4 x 10
7
1.1 3.63 x 10
7

Fumarasa 8 x 10
2
5 x 10
-6
1.6 x 10
8

Anhidrasa carbnica 10
6
1.2 x 10
-2
8.3 x 10
7






5.3.7 Determinacin experimental de Km y Vmax


K
m
y V
max
son constantes empricas, es decir, deben necesariamente determinarse a partir
de experimentacin. Para ello, seleccionamos un intervalo adecuado de concentraciones de
substrato y ensayamos la actividad enzimtica para cada concentracin, manteniendo todas
las dems condiciones de ensayo constantes: pH, temperatura, fuerza inica y
concentracin de enzima. Normalmente las determinaciones se hacen como mnimo por
duplicado o triplicado, y para cada condicin determinamos la velocidad inicial.

Por lo general, antes de proceder a la determinacin de las constantes cinticas se
requieren experimentos previos. Por ejemplo, una rango adecuado de concentraciones de
substrato es aqul en el que vaya includa la K
m
; concentraciones demasiado pequeas
daran lugar a una recta de pendiente positiva; concentraciones demasiado altas daran
lugar a una recta de pendiente cero; en ninguno de los dos casos podramos determinar
eficazmente las constantes cinticas. Por ello, en experimentos previos se debe determinar
al menos el orden de magnitud en el que se encuentra la K
m
. Si se trata de una enzima
multisubstrato, debemos asimismo experimentar con la concentracin ptima de los otros
substratos. La seleccin de la concentracin de enzima es asimismo importante. Una
concentracin demasiado alta puede dar dificultades a la hora de determinar velocidades
iniciales (vase ms arriba); una concentracin demasiado baja puede crear problemas con
la sensibilidad del mtodo de seguimiento o con el tiempo necesario para cada ensayo. Las
condiciones de pH y temperatura deben tambin ser objeto de experimentos previos.

Una vez realizado el ensayo, representamos en una grfica los resultados obtenidos; la
concentracin de substrato en el eje X, y la velocidad inicial obtenida para cada condicin en
el eje Y. Un resultado tpico se presenta en la figura 5.10, en la que los resultados parecen
seguir claramente la ecuacin de Michaelis. A partir de ella podemos determinar la V
max
(como la asntota superior) y a continuacin la K
m
como concentracin de substrato que da
lugar a una velocidad igual a V
max
/2

.


Ahora bien, este tipo de grficas no nos permite una determinacin precisa de V
max
, y por
tanto de K
m
. El error de los puntos experimentales hace muy difcil situar exactamente la
asntota; por otra parte, ajustar los puntos a una hiprbola es ms difcil que hacerlo a una
lnea recta. Por estas razones se prefiere hacer transformaciones lineales de la ecuacin de
Michaelis-Menten.


5.3.7.1 Transformaciones lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten


Si transformamos la ecuacin de Michaelis-Menten en las siguientes expresiones:


[21]
max max
1 1 1
V s V
K
v
m
+ =

[22]
max max
1
V
K
s
V v
s
m
+ =

[23]
max
V
s
v
K v
m
+ =

Podemos ver que se trata de otras tantas ecuaciones de una recta. En el primer caso [21],
tenemos que la representacin de 1/v en funcin de 1/s nos da una lnea recta cuya
pendiente es K
m
/V
max
; su corte en ordenada es 1/V
max
y el corte en abscisa es -1/K
m
, tal y
como aparece en la figura 5.11. Este tipo de representacin se llama recproca doble, o bien
representacin de Lineweaver y Burk.

A partir de cualquiera de ellas, mediante una regresin de mnimos cuadrados, o bien
grficamente sobre papel milimetrado, pueden obtenerse los valores de K
m
y de V
max
. En los
tres casos se procede de una manera parecida: obtenidos los puntos experimentales, se
traza la lnea de regresin; esta lnea nos brinda el valor de la pendiente y el corte en
ordenadas, a partir de los cuales calculamos los valores de K
m
y de V
max
.. Por lo general, los
puntos se ponderan respecto a la dispersin obtenida en los correspondientes duplicados o
triplicados de cada punto.

El uso cada vez ms generalizado de ordenadores en el anlisis de datos cinticos hace que
el inters de estos mtodos sea cada vez ms reducido. En general, hoy da los programas
cinticos parten de regresiones no lineales, lo que les hace mucho ms eficientes y
verstiles. Existen hoy da paquetes de programas adaptados al clculo de las constantes
cinticas que brindan una gran cantidad de informacin adicional.






5.4 Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas

5.4.1. Bases moleculares

El pH del medio es una de las variables a las que ms sensible es la accin enzimtica. En
general, cuando representamos el efecto del pH sobre la actividad de una enzima se suelen
obtener grficas como la presentada en la figura 5.12.


Se trata de una curva acampanada que muestra una regin de actividad mxima (el pH
ptimo de la enzima) con regiones de actividad decreciente a uno y otro lado. En algunos
casos falta una de las dos ramas descendentes; en otros, la regin ptima est extendida en
una amplia gama de pH; pero la forma ms usual de dependencia es la citada en primer
lugar.

En algunos casos un estudio detenido de los efectos del pH puede dar informacin muy
valiosa sobre los grupos presentes en el centro activo. Pero los efectos del pH son, por lo
general, mucho ms complejos. Teniendo en cuenta que el pH determina el estado de
ionizacin de los grupos qumicos tanto del substrato como de la enzima, el efecto de esta
variable puede ejercerse sobre: (a) la ionizacin del substrato; (b) la ionizacin de los grupos
enzimticos del centro activo, que a su vez pueden determinar variaciones sobre la fijacin
del substrato o sobre la actividad cataltica, o ambas a la vez; (c) la ionizacin de grupos en
la molcula de enzima no directamente relacionados con la actividad enzimtica, pero s con
el mantenimiento de su estructura tridimensional, y de ah su efecto indirecto sobre los
grupos del centro activo.

Podemos entender estos efectos analizando la dependencia de pH de la enzima succinato
deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la transformacin de succinato en fumarato, una
importante reaccin del ciclo de Krebs de los cidos tricarboxlicos. Tiene un pH ptimo en
torno a 7. La fijacin de substrato a la enzima media a travs de interacciones inicas entre
los grupos carboxilo del substrato y aminocidos dibsicos (lisina y arginina) situados en la
superficie de la enzima.


1. A pH 7 (figura 5.13) podemos ver cmo el estado de ionizacin es tal que los dos
carboxilos del succinato estn disociados (con carga negativa) y los dos aminocidos de la
superficie de la enzima protonados (con carga positiva). La interaccin enzima-substrato es
ptima en estas condiciones.

2. A pH 2 (figura 5.14), inferior al pK de los carboxilos del substrato, ste se presenta en
estado protonado, y por tanto no tiene carga elctrica, lo que impide su fijacin al centro
activo de la enzima.


3. A pH 13 (figura 5.15), superior al pK de los grupos bsicos laterales de lisina y arginina,
stos aparecen en su forma de base conjugada, que en este caso no tiene carga elctrica. En
estas condiciones tampoco se puede fijar el substrato.


En muchas enzimas est presente el aminocido histidina en el centro activo. Por lo general,
la forma activa de las histidina en este contexto es la disociada (sin carga elctrica, dejando
libre el par electrnico del nitrgeno imidazlico). Es obvio que el descenso de pH provocar
la protonacin de este grupo (figura 5.16), impidiendo as su funcionamiento como reactivo
(ver captulo 7).

Podramos citar de esta manera ejemplos para casi todas las enzimas en las que conocemos
la estructura y el mecanismo cataltico.



5.4.2 Significado biolgico del efecto del pH


En los organismos pluricelulares, una de las constantes ms cuidadosamente mantenidas es
el pH del medio interno, en el que unas pocas dcimas de variacin pueden llegar a ser
incompatibles con la vida. La razn fundamental de esta falta de tolerancia radica
precisamente en la sensibilidad de las enzimas del metabolismo celular hacia el pH. Por otra
parte, pequeas variaciones locales del pH pueden dar lugar a alteraciones delicadas en la
actividad enzimtica, lo que supone una posibilidad de regulacin intracelular de la
actividad enzimtica. Si tenemos en cuenta que los principales grupos implicados en la
catlisis enzimtica son el imidazol de la histidina, el hidroxilo de serina, carboxilos de
aspartato y glutamato, tiol de cistena y amino de lisina, no es de extraar que las
variaciones de pH afecten a la actividad enzimtica puesto que todos estos grupos son
susceptibles de disociacin cido-base. Si a esto aadimos que las interacciones de tipo

salino pueden ser determinantes en la unin del substrato a la enzima, y stas dependen de
grupos con carga elctrica, estaremos en condiciones de comprender la importancia del
efecto del pH sobre la actividad enzimtica (tal como hemos visto en el ejemplo del
apartado anterior)

El interior celular posee una alta concentracin protenica y sin duda es sta la defensa
principal del citoplasma ante cambios del pH. No ocurre as, sin embargo, en el medio
interno (es decir, el medio extracelular) de organismos pluricelulares; de ah que en el curso
de la evolucin hayan surgido complejos sistemas de regulacin cido-base. En los
mamferos, estos sistemas implican a la sangre (plasma y glbulos), al aparato respiratorio,
al rin, al sistema nervioso y al sistema endocrino. Su estudio queda fuera de contexto en
este manual, pero no est de ms recordar su existencia a efectos de una mejor
comprensin del efecto del pH.

Ahora bien, una vez ms debemos ampliar el significado de la interaccin enzima-substrato.
Esta unin no es ms que un caso del modelo ms general de interaccin entre protenas y
ligandos (Modelo de Interaccin Estereoqumica). En este modelo generalizado, el pH
cumple el mismo papel que hemos visto en el caso de la cintica enzimtica; de ah que
todo tipo de interaccin protena-ligando (receptores hormonales, receptores nerviosos,
sistemas de transporte, efectos farmacolgicos, etc.) sea extremadamente sensible a
variaciones del pH.



5.5 Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas


5.5.1 Bases moleculares

Cuando estudiamos en el laboratorio el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las
reacciones enzimticas normalmente se obtienen curvas parecidas a la representada en la
figura 5.17, es decir, una curva acampanada, no muy diferente en aspecto a la que se
observa al comprobar el efecto del pH. Por esa razn hablamos de la existencia de una
temperatura ptima para la actividad enzimtica, que corresponde al mximo de la curva.


El efecto de la temperatura es mucho ms complejo de lo que esta simple curva pudiera
sugerir. Dos son los componentes principales en juego: por una parte, el efecto cintico de
la temperatura sobre las constantes individuales de velocidad en la catlisis enzimtica; por
otra parte, el efecto de la temperatura sobre la estructura enzimtica.

Estos dos factores operan en sentido inverso; una mayor temperatura acelera la velocidad
de las reacciones individuales, tal como establece la ecuacin de Arrhenius:

[15]
|
.
|

\
|
=
RT
E
A k
a
cat
exp

pero al propio tiempo, el aumento de temperatura promueve la desnaturalizacin de la
protena, fenmeno que va acompaado de la disminucin y eventual prdida total de la
actividad enzimtica.

Respecto a este ltimo efecto, podemos ver que la temperatura inactiva a las enzimas casi
de forma generalizada. Temperaturas de 70 C son suficientes para hacer desaparecer la
actividad en unos pocos minutos; la fosfatasa alcalina del tejido seo presenta un
semiperodo de inactivacin a 56 C de escasamente dos minutos. Las enzimas
termorresistentes conocidas proceden de microorganismos habituados a altas temperaturas
ambientales, como Bacillus stearotermophilus (entre las Bacterias) o bien las Arqueas
termoacidfilas que se encuentran en manantiales termales o en los fondos marinos

cercanos a la crestas medioocenicas, en las que la actividad volcnica permite
temperaturas locales extremadamente altas para las que se observan normalmente en
dichos ambientes.


5.5.2 Significado biolgico del efecto de la temperatura


Podemos hacer respecto a la temperatura consideraciones finales anlogas a las que se
hicieron sobre el pH en el apartado anterior. El margen de temperaturas sobre el que se
desarrollan los seres vivos es, en trminos relativos, casi tan estrecho como el de pH. Desde
los seres que viven a temperaturas rticas hasta los microorganismos termfilos, el margen
es ligeramente superior a los 100 C. Para los animales homeotermos, lo es de hecho mucho
ms reducido. La base molecular de esta restriccin est en el efecto de la temperatura
sobre las reacciones enzimticas, en el sentido amplio a que antes nos referamos, esto es,
el efecto de la temperatura sobre todo tipo de interaccin protena-ligando.






CAPTULO 6: Inhibicin enzimtica




6.1 Concepto e importancia


Se denomina inhibidor a todo agente capaz de hacer disminuir la actividad de una enzima.
En el estudio de la Enzimologa, sin embargo, el trmino inhibidor posee un significado algo
ms restringido. Dentro de la definicin que hemos adelantado es lgico que podamos
considerar, por ejemplo, al ion H
+
como inhibidor, dado que muchas enzimas pierden
actividad por el lado cido de la escala de pH, o bien al ion OH
-
por una razn similar; las
temperaturas elevadas seran tambin inhibitorias; los agentes desnaturalizantes de la
protena enzimtica tambin lo seran, y as sucesivamente.

Por esta razn vamos a restringir el uso del trmino inhibidor a aquellos agentes que hacen
disminuir la actividad enzimtica al interaccionar con los grupos especficos responsables de

la accin cataltica o de su regulacin. Esta accin cataltica la concebimos en un doble
sentido: fijacin especfica del substrato y su transformacin qumica. Ntese que podamos
haber establecido esta restriccin a los agentes que actan sobre el centro activo. No lo
hemos hecho as porque como veremos, pueden existir regiones en la molcula de la
enzima no directamente relacionadas con el mismo y que sin embargo pueden modular su
accin cataltica (los centros alostricos). Aun cuando los agentes capaces de actuar sobre
centros alostricos pueden perfectamente ser denominados inhibidores en el sentido de
esta definicin, dejaremos su estudio para un captulo ulterior.

El estudio de la inhibicin enzimtica es de una enorme importancia tanto en Enzimologa
bsica como en sus aplicaciones:

1. El empleo de inhibidores es un instrumento ampliamente utilizado en el estudio de los
mecanismos cinticos. Las medidas de velocidad inicial no pueden por s solas llevar al
conocimiento completo de un mecanismo, y muy particularmente, en el estudio de la
cintica multisubstrato.

2. Los inhibidores brindan una informacin valiossima acerca de las caractersticas
moleculares del centro activo. Hay inhibidores de estructura parecida al substrato cuyo
estudio sirve para determinar las caractersticas estricas de aqul. Otros inhibidores atacan
de forma especfica a los diferentes grupos que pueden estar implicados en la
transformacin cataltica. A veces esta ltima interaccin es muy especfica. As, los
organofosfricos atacan al residuo de serina del propio centro activo de las serin-enzimas,
dejando intactos todos los dems residuos de este aminocido que pudiera haber en la
molcula. Por otra parte, el estudio de la fijacin de un inhibidor especfico nos puede dar
amplia informacin sobre el nmero de centros activos presentes en una muestra
enzimtica. En la actualidad, una lnea muy importante de inhibidores est constituda por
los llamados anlogos de estado de transicin, que como su nombre indica, tienen una
forma molecular parecida a la conformacin energizada del substrato cuando ocupa el
centro activo de la enzima. En esta lnea, hoy da es posible el diseo altamente especfico
de frmacos y drogas a partir del conocimiento de la estructura del centro activo y del
complejo activo. Un tipo especial de inhibidores, los substratos suicidas, son un arma
fundamental de la Teraputica moderna.

3. El empleo de inhibidores que bloquean una enzima especfica ha sido determinante en el
estudio de vas metablicas: as, el empleo de yodoacetato, inhibidor de grupos SH, fue
crucial en el enunciado de la va glicoltica y el de malonato, inhibidor competitivo de
succinato, en el del ciclo de Krebs de los cidos tricarboxlicos.

4. Muchos inhibidores son tan especficos como el substrato. De esta forma, se pueden
disear inhibidores que afectan solamente a una determinada enzima sin alterar para nada
a ninguna otra. Esto constituye la base de toda la teraputica qumica o Farmacologa.
Podemos apreciar claramente este concepto cuando ampliamos el modelo
enzima-substrato a toda interaccin entre una protena y su ligando especfico. De esta
forma, el modo de accin de los frmacos llega en ltimo trmino a interpretarse siempre
como una competicin entre el frmaco y el ligando fisiolgico (que es el substrato en el

caso de las enzimas). Hay que hacer notar que esta competicin no tiene por qu ser
necesariamente inhibitoria; en muchos casos, es, de hecho, agonstica. Por ejemplo: el
ligando fisiolgico del receptor colinrgico muscarnico es la acetilcolina; el alcaloide
muscarina (obtenido del hongo Amanita muscaria) excita al receptor de la misma manera
que la acetilcolina (es decir, la muscarina es un agonista) mientras que el alcaloide atropina
(obtenido de la planta Atropa belladonna) se fija al receptor pero bloquendolo (por lo que
la atropina es un antagonista). De un modo parecido actan los receptores hormonales y,
en general, los receptores a todas las seales qumicas.

5. Al igual que los frmacos, muchos otros agentes de gran importancia econmica son
inhibidores enzimticos. Por ejemplo, los insecticidas, tando clorados como
organofosforados; los herbicidas, defoliantes y todo tipo de fitosanitarios; muchos aditivos
de la industria alimentaria, etc.

Por estas razones, el estudio de la inhibicin enzimtica es un tema central en toda
exposicin sistemtica de la Enzimologa. Este estudio se hace tanto en trminos cinticos
como desde el punto de vista estructural.



6.2 Tipos de inhibidores


Dentro de la restriccin que establecimos ms arriba, se consideran dos tipos generales de
inhibidores: reversibles e irreversibles.



6.2.1 Inhibidores reversibles

Los inhibidores reversibles son aquellos cuyo efecto desaparece cuando los eliminamos de
la solucin por dilisis o cualquier otro procedimiento. La inhibicin se ejerce a travs de su
fijacin reversible a la enzima segn el proceso

[1]
E + I EI
K
i


en el que el equilibrio se alcanza muy rpidamente. Para este equilibrio definimos una
constante de disociacin, K
i
(obsrvese que se trata de una K mayscula, lo que indica una
constante de equilibrio), que tiene respecto al inhibidor el mismo significado que la K
m
en la
teora de Michaelis respecto al substrato. Por tanto, una K
i
pequea supondr una afinidad
grande del inhibidor hacia la enzima, y viceversa. Tengamos en cuenta tambin que la
fijacin del inhibidor puede tener lugar a los diferentes complejos que aparecen en el curso

de la accin enzimtica. As, habr inhibidores que se fijan a la forma libre de la enzima E
(como en [1]); otros lo harn al complejo ES; y otros pueden hacerlo a ambos, E y ES.

La actividad de una enzima viene descrita por dos constantes, K
m
y k
cat
. En este sentido, los
inhibidores pueden actuar sobre una de ellas o sobre las dos. Segn este criterio, se
distinguen tres tipos bsicos de inhibidores reversibles: Inhibidores competitivos, cuando su
efecto consiste en un aumento aparente de la K
m
respecto al substrato sin efecto sobre V
max

(o ms propiamente, sobre la k
cat
); Inhibidores no competitivos, cuando disminuyen el valor
de la V
max
sin afectar al valor de la K
m
; e Inhibidores mixtos, cuando ambas constantes
aparecen afectadas. Dentro de este ltimo grupo se suele hacer distincin entre los
inhibidores mixtos y los inhibidores acompetitivos o anticompetitivos. En esta exposicin
estudiaremos con cierto detenimiento los primeros.

Atendiendo a la forma enzimtica afectada, los tipos de inhibidores descritos en el prrafo
anterior tienen las siguientes correspondencias: los inhibidores competitivos slo pueden
fijarse a la enzima libre, compitiendo en ello con el substrato de forma que la fijacin es
mutuamente exclusiva; los inhibidores no competitivos se fijan indistintamente a la enzima
libre E y al complejo enzima-substrato ES; los inhibidores anticompetitivos slo pueden
hacerlo al complejo enzima-substrato ES; y los mixtos operan como los no competitivos
pero alterando de alguna manera la fijacin del substrato a la enzima.



6.2.2 Inhibidores irreversibles

Los inhibidores irreversibles son aquellos que reaccionan con la enzima, modificndola de
forma covalente, de tal manera que aunque eliminemos al inhibidor la accin del mismo
persiste. En contraste con los inhibidores reversibles, cuyo equilibrio se establece
rpidamente, una caracterstica distintiva de los inhibidores irreversibles es que su accin es
dependiente del tiempo; es decir, el grado de inhibicin depende del tiempo a que haya sido
expuesta la enzima al inhibidor. Por ello, su accin se describe a partir de una ecuacin de
velocidad:

[2]

E
E'
k
i


En la que k
i
(Obrvese que se trata de una k minscula, constante de velocidad) es la
constante de velocidad del proceso tal que


[3]
v
i
= k
i
[E][S]



donde v
i
es la velocidad de inactivacin. Ntese que en este caso (a) no consideramos la
existencia de un equilibrio: esta inhibicin es irreversible; (b) el proceso se describe por una
constante de velocidad de segundo orden k
i
, y no por una constante de disociacin K
i
como
en el caso de los inhibidores reversibles.

Ahora bien, conviene no tomar el trmino irreversible demasiado al pie de la letra. Una
enzima atacada por un inhibidor irreversible puede en ocasiones reactivarse mediante un
tratamiento qumico que produzca el efecto inverso al del inhibidor. As, los grupos -SH
transformados en disulfuro -S-S- por un agente oxidante pueden reactivarse mediante un
agente reductor. Por ello hay quien prefiere llamar a la inhibicin irreversible inactivacin, y
al proceso contrario, reactivacin.

En la discusin que sigue, discutiremos algunos aspectos de los inhibidores competitivos, de
los inhibidores irreversibles y de los llamados substratos suicidas.





6.3 Inhibicin competitiva




Es aquella inhibicin reversible en la cual el inhibidor impide o dificulta la fijacin del
substrato al centro activo de la enzima, sin afectar a su transformacin cataltica; es decir, el
substrato, si llega a fijarse al centro activo, es transformado con toda normalidad.


6.3.1 Cintica de la inhibicin competitiva

Cinticamente, la inhibicin competitiva corresponde al mecanismo

[4]
E
EI
ES E + P
I
S
k
+1
k
+2
k
+3
k
-1
k
-3


En el cual vemos que tanto el substrato como el inhibidor pueden fijarse a la enzima siendo

esta fijacin mutuamente exclusiva; el inhibidor impide la fijacin del substrato, y ste, la
del inhibidor (es decir, ambos compiten por la fijacin a la enzima). Es por esta competicin
entre uno y otro por lo que este tipo de inhibicin recibe su nombre. Naturalmente, el
complejo EI es improductivo y no da lugar a productos. A partir de estos dos equilibrios
podemos fcilmente darnos cuenta de que para una concentracin dada de inhibidor, las
concentraciones altas de substrato harn desaparecer la inhibicin, alcanzndose la misma
V
max
que en la reaccin no inhibida. Eso s, har falta una mayor concentracin de substrato
para llegar a este nivel; y por tanto, una mayor concentracin de substrato para llegar a
V
max
/2, lo que nos muestra el principal dato cintico de la inhibicin competitiva: un
aumento aparente de la K
m
hacia el substrato en presencia del inhibidor, y sin que se
modifique la V
max
.

1. Tratando el mecanismo por una suposicin de equilibrio rpido (segn Michaelis y
Menten), veramos que los complejos ES y EI se forman mucho ms rpidamente que la
evolucin de ES hacia enzima libre y producto. En ese caso, definimos las constantes
respectivas de equilibrio de disociacin K
m
y K
i
de la siguiente forma:

[5]


| || |
| | ES
S E
K
m
=
| || |
| | EI
I E
K
i
=


Llamando (como en el captulo anterior) e
0
a la concentracin de enzima total, e a la enzima
libre, x a la del complejo ES, y a la del complejo EI, s a la concentracin de substrato, e i a la
de inhibidor, y suponiendo que tanto la concentracin de substrato como la de inhibidor son
mucho mayores que la de enzima total, tendremos que

[6]

( )
x
s y x e
K
m

=
0

( )
y
i y x e
K
i

=
0



Para obtener una ecuacin de velocidad en funcin de las concentraciones de substrato e
inhibidor, sabiendo que v = k
+2
x, resolveramos el sistema de ecuaciones [6] para x y
obtendramos

[7]
s
K
i
K
s e
x
i
m
+
|
|
.
|

\
|
+
=
1
0


que multiplicado por k
+2
nos dara la siguiente ecuacin de velocidad:

[8]
s
K
i
K
s V
x
i
m
+
|
|
.
|

\
|
+
=
1
max



en la que vemos que K
m
aparece multiplicada por el factor (1 + i/K
i
), en donde i es la
concentracin de inhibidor y K
i
es la constante de disociacin del complejo EI tal como se
defini en 6.5. Esta expresin nos muestra todas las caractersticas de la inhibicin
competitiva: un aumento aparente de la K
m
y la desaparicin del efecto inhibidor a altas
concentraciones de substrato. Obsrvese que para una concentracin de inhibidor igual a su
K
i
, la K
m
aparente toma un valor de dos veces la K
m
real. Asimismo, podemos ver que la
eficiencia del inhibidor como tal ser tanto ms grande cuando menor sea el valor de K
i
; y al
igual que en el caso de la K
m
, sus dimensiones son de concentracin. Para concentraciones
muy altas de s, la inhibicin desaparece.

En un tratamiento de estado estacionario del mecanismo [4], llegaramos a un resultado
idntico (con la salvedad del distinto significado de la K
m
).



6.3.2 Diagnstico cintico de la inhibicin competitiva


Grficamente, el efecto del inhibidor competitivo aparece en la figura 6.1. En la
representacin directa (v frente a s) vemos que la presencia del inhibidor hace disminuir la
pendiente de la curva en todos sus puntos, pero tiende a alcanzar la asntota V
max
, lo que
tiene lugar a concentraciones suficientemente altas de substrato.


En la representacin recproca doble vemos cmo el corte en ordenada (1/V
max
) no se
modifica, pero la pendiente de la recta (K
m
/V
max
) es mayor en presencia que en ausencia de
inhibidor, siendo el corte en abscisa igual a -1/ K
m
=1/[K
m
(1+i/K
i
)] (figura 6.2)





6.3.3 Aspectos estructurales de la inhibicin competitiva

Por regla general, los inhibidores competitivos son todos ellos anlogos estructurales del
substrato, es decir, molculas muy parecidas. Si a esto unimos el hecho de que la inhibicin
competitiva es tan especfica como la interaccin enzima-substrato, as como las
peculiaridades cinticas de la inhibicin competitiva, surge inmediatamente la idea de que
el inhibidor en este caso es un "falso substrato" que ocupa el lugar de ste en el centro
activo, pero que no reacciona. Es decir, tiene la suficiente similitud con el substrato como
para poder fijarse a los grupos complementarios (impidiendo la fijacin del substrato
normal), pero tambin las suficientes diferencias como para no poder reaccionar. La accin
de un inhibidor competitivo se representa esquemticamente en la figura 6.3.

Es importante, sin embargo, no llevar demasiado lejos esta equivalencia entre anlogo e
inhibidor competitivo. El concepto de inhibicin competitiva es puramente cintico, y se
refiere al aumento aparente de la K
m
por el substrato. Que muchos inhibidores competitivos
sean anlogos qumicos del substrato no significa necesariamente que todos los anlogos
vayan a ser inhibidores o viceversa. Como veremos, muchos inhibidores fisiolgicos, es
decir, efectores de la normal regulacin de una enzima, se comportan como inhibidores
competitivos en el sentido de aumentar la K
m
aparente, pero sin que tengan ningn
parecido estructural con el substrato (y por esa razn se les llama alostricos, en
contraposicin a los aqu tratados, que seran isostricos).

En general, los anlogos de substrato caen en alguna o varias de las siguientes clases:
enantiomricos, cuando se trata de la imagen especular de una molcula asimtrica;
anomricos, referidos a las formas o del enlace glicosdico; ismeros posicionales,
ismeros geomtricos; productos de reaccin, que en muchos casos compiten con el
substrato por la enzima libre, o bien, en general, compuestos con parecido estructural por el

substrato. As, en el bien conocido caso de la succinato dehidrogenasa, han sido descritos
como inhibidores competitivos, entre otros, los compuestos que aparecen en la figura 6.4.
La analoga estructural de uno de ellos (oxalacetato) se ilustra en la figura 6.5.


En el caso de la succinato deshidrogenasa, el estudio de las constantes de inhibicin nos

muestra que los inhibidores ms potentes son aquellos con carboxilos terminales situados a
una distancia parecida a la del substrato; as, la K
i
por oxalacetato es de 1.6 mM mientras
que por malonato es de 40 mM. Por tanto, este estudio nos indica que la presencia de los
dos grupos carboxlicos (ambos ionizados al pH de ensayo) es importante para la fijacin al
centro activo de la enzima, y la distancia entre ambos tambin (malonato es peor inhibidor
que oxalacetato). Esto implica, adems, la existencia en el centro activo de dos grupos
electropositivos. Ntese que es perfectamente posible que la enzima pueda tener mayor
afinidad por el inhibidor que por el propio substrato normal.

Cada enzima tiene, lgicamente, sus propios inhibidores competitivos. Una lnea muy
importante de stos son los anlogos de base o anlogos de nuclesido, que interfieren en
todos los procesos asociados al DNA o al RNA (replicacin, transcripcin, transcripcin
inversa, etc.).

Adems de los anlogos de substrato, un grupo de compuestos muy importante son los
anlogos de cofactor o coenzima, sobre todo por su uso teraputico; por ejemplo, las
sulfonamidas (anlogos del cido 4-aminobenzoico, figura 6.6) o los antiflicos como el
methotrexate (figura 6.7); otros anlogos de cofactores son piridin-3-sulfonato (anlogo de
nicotinamida), desoxipiridoxol fosfato (anlogo de piridoxal fosfato), piritiamina (anlogo de
tiamina), etc.


Otro grupo muy interesante de inhibidores, que se suelen comportar como competitivos (o
como inhibidores suicidas, v. ms adelante), son los inhibidores naturales. Entre stos
tenemos la avidina, protena presente en la clara de huevo capaz de fijar biotina (un
cofactor enzimtico, cap. 4) con extraordinaria afinidad (K
d
10
-15
M); la
1
-1-antitripsina y

protenas relacionadas, que inhiben la actividad de serinproteasas (llamadas genricamente
serpinas); las cistatinas, que inhiben las tiolproteasas, etc.etc.



6.3.4 Anlogos de estado de transicin


Segn vimos en el captulo 2, el modo de accin de las enzimas puede explicarse en el
sentido de que la complementaridad estereoqumica tiene lugar no entre la enzima y el
substrato, sino ms bien entre la enzima y el estado de transicin de la reaccin catalizada.
El estado de transicin es una especie molecular de vida media muy corta, y representa un
mximo en el perfil energtico de la reaccin. No obstante, se han podido sintetizar
anlogos estables de estructura parecida al estado de transicin para multitud de enzimas, y
que reciben el nombre de anlogos de estado de transicin (AET). El concepto de inhibidor
competitivo se ampla, pues, con la inclusin de estos anlogos.

La primera caracterstica de los anlogos de estado de transicin es su extraordinaria
afinidad hacia la enzima, con K
i
en el orden nM; de hecho, en muchas ocasiones, varios
rdenes de magnitud menor que la K
m
del substrato natural. Sin embargo, la velocidad de
fijacin (medida por la constante de velocidad k
+1
) es en ocasiones bastante menor que la
correspondiente a aqul. Este resultado se corresponde con lo que hoy se piensa sobre el
modo de accin de las enzimas, en un sentido de ajuste inducido: la fijacin distorsiona la
estructura del substrato para aproximarla a la del estado de transicin; por ello, ste y el

substrato son especies estructuralmente distintas y las enzimas han evolucionado para fijar
el substrato, y no a su estado de transicin; aunque una vez fijado es mucho ms difcil
desplazarlo de la unin a la enzima.

Los AET son unos inhibidores muy potentes de la accin enzimtica; lo que unido a su
especificidad, hace que exista una investigacin muy activa en este campo para el diseo de
frmacos, lo cual, a su vez, impulsa el estudio del modo de accin de las enzimas para el
conocimiento de los diferentes estados de transicin.

Como ejemplo de AET tenemos el fosfonoacetil-L-aspartato (PALA), sobre la aspartato
transcarbamilasa, enzima limitante de la biosntesis de pirimidinas. Esta enzima transfiere el
grupo carbamil fosfato al aspartato, formando carbamil aspartato, que posteriormente dar
lugar al anillo pirimidnico. En la figura 6.8 se representan las estructuras de los substratos,
del estado de transicin de la enzima y del AET.

Muchos frmacos utilizados en clnica humana son AETs. Por ejemplo, el Captopril, utilizado
ampliamente como agente antihipertensivo, es un AET de la enzima convertidora de
angiotensina. Esta enzima cataliza la produccin de angiotensina II, pptido cuya accin
vasoconstrictora es muy potente (figura 6.9)





6.3.5 Anticuerpos catalticos


Por otra parte, los AET se han utilizado para la produccin de anticuerpos catalticos o
inmunoenzimas. Se trata de anticuerpos monoclonales desarrollados contra haptenos que
son anlogos de estado de transicin de determinadas reacciones qumicas. Los anticuerpos
as producidos presentan una complementaridad estereoqumica con el estado de
transicin de la reaccin, lo que en determinadas circunstancias permite que el anticuerpo
tenga actividad cataltica. Tal es el caso de la 4-nitrofenil fosforilcolina, que es anlogo del
estado de transicin de la hidrlisis del correspondiente carbonato (figura 6.10). Un
anticuerpo monoclonal producido contra 4-nitrofenil fosforilcolina (como hapteno) es capaz
de catalizar la hidrlisis del carbonato.




6.3.6 Importancia prctica de la inhibicin competitiva


El modelo de interaccin entre una protena y un ligando constituye uno de los
fundamentos de la Biologa actual. Hemos visto cmo esta interaccin explica multitud de
fenmenos biolgicos que no estn directamente relacionados con la catlisis enzimtica.
Por ello hablamos de seales qumicas en un sentido mucho ms general. La accin de los
neurotransmisores sobre sus receptores es un ejemplo. En ltimo trmino, la accin de
stos consiste en alterar el comportamiento de una neurona en sentido excitatorio o
inhibitorio; pero el efecto molecular inmediato, del que deriva todo lo dems, es la
interaccin del neurotransmisor con su receptor, interaccin estereoqumicamente
complementaria que se rige por las mismas relaciones que la catlisis enzimtica, y que
participa de toda su fenomenologa.

La inhibicin competitiva representa una manera de inhibir de forma especfica una enzima,
o en un sentido ms amplio, de inhibir la fijacin de un ligando determinado a su receptor, y
tambin de forma especfica. Por esta razn, los inhibidores competitivos constituyen el
principal contingente de compuestos que utiliza la Farmacologa, y el fenmeno de
competicin, en su forma ms general, la base y fundamento de toda la Teraputica
qumica. En la mayora de casos en los que se conoce el modo de accin de una droga

encontramos una competicin como razn ltima de la accin del frmaco. Pero adems, al
ser este fenmeno especfico, por estar mediado a travs de una interaccin estereoqumica
complementaria, la inhibicin competitiva permite la supresin o atenuacin de un proceso
concreto sin alterar en principio ningn otro. Claro est que nos estamos refiriendo aqu a
una generalizacin, con todos sus inconvenientes. No todos los frmacos son inhibidores;
los hay que actan como agonistas, es decir, produciendo los mismos efectos que el ligando
fisiolgico; aunque en estos casos el efecto del frmaco suele ser ms persistente que el de
aqul, al no ser metabolizado eficientemente. De la misma forma, no todas las drogas
teraputicas (o de abuso) son estrictamente inhibidores competitivos, en el sentido cintico
del trmino; las hay con modos de inhibicin mucho ms complejo, o que operan como
inhibidores irreversibles (v. ms adelante). Asimismo, este sentido restrictivo que hemos
dado a la Farmacologa excluye, sin razn aparente, a todo tipo de teraputica sustitutiva.
La idea que realmente pretendemos comunicar es que las acciones farmacolgicas que
emprendemos sobre un organismo, y que se hacen con compuestos muchas veces
radicalmente extraos al mismo, en ltimo trmino van dirigidas a la modificacin de una
interaccin entre un ligando y su receptor. Las ms de las veces esta modificacin es una
inhibicin competitiva.



6.4 Otras formas de inhibicin reversible


Mencionaremos en este apartado la inhibicin no competitiva y la inhibicin
anticompetitiva. Ambos tipos de inhibicin son tiles en los estudios cinticos de velocidad
inicial, pero tienen muy poca aplicacin prctica. A continuacin se resumen las principales
caractersticas de estos tipos de inhibidores.



6.4.1 Inhibicin no competitiva


Llamamos inhibidores no competitivos a aquellos que no impiden la fijacin del substrato,
pero que inhiben su transformacin cataltica, y se corresponden con el mecanismo descrito
en la figura 6.11. En un sentido cintico, la inhibicin no competitiva pura se manifiesta por
una disminucin de la V
max
aparente sin modificacin de la K
m
por los substratos.


A partir de consideraciones de equilibrio (es decir, en las condiciones de Michaelis-Menten)
en las que la formacin de producto a partir de ES es mucho ms lenta que el
establecimiento del equilibrio entre E, S e I), la inhibicin no competitiva puede describirse
por la relacin

[9]
s K
K i
s V
v
m
i
+
+
=
) 1 (
max


en la que vemos que V
max
aparece dividida por el factor (1+i/K
i
). Esto nos muestra el
carcter cintico de la inhibicin no competitiva, a saber: un descenso del valor de V
max
(o
ms propiamente, de la k
cat
) sin alteracin de la K
m
. Por tanto, aun cuando la concentracin
de substrato suba indefinidamente, la inhibicin no desaparece. Este efecto, como veremos,
puede tambin ser visto en los inhibidores irreversibles, en los que se aprecia una
disminucin aparente de V
max
; pero en este caso, el efecto se realiza sobre e
0
, la enzima
total; mientras que el de los inhibidores no competitivos reversibles tiene lugar sobre k
cat
.

Al representar grficamente los resultados de una inhibicin no competitiva, vemos que en
la grfica directa el valor de V
max
se hace menor, y la inhibicin no desaparece por mucho
que aumente la concentracin de substrato. En la grfica recproca doble vemos cmo el
sistema inhibido se caracteriza por un corte en ordenada y una pendiente mayores en el
sistema inhibido que en el sistema control, sin que se modifique el corte en abscisa, que en

esta representacin es igual a -(1/K
m
) (figura 6.11).


6.4.2 Inhibicin acompetitiva o anticompetitiva

Una forma cintica interesante de inhibicin mixta es la que llamamos acompetitiva o
anticompetitiva. Este nombre pretende ser una traduccin del ingls uncompetitive. En
realidad, la palabra anticompetitiva responde mejor al carcter cintico de esta inhibicin.
La inhibicin competitiva desaparece ante concentraciones altas del substrato, mientras que
este tipo de inhibicin que nos ocupa se hace ms intensa ante el aumento en la
concentracin de substrato. De ah el nombre de anticompetitiva. Corresponde a un
mecanismo en el cual el inhibidor slo puede fijarse al complejo ES, no pudiendo hacerlo a
la forma libre de enzima (figura 6.12). La consecuencia del mismo es que la fijacin de
inhibidor depende de la fijacin previa de substrato, por lo cual una mayor concentracin de
ste favorecer la inhibicin (y de ah el nombre de anticompetitiva).







Bajo suposiciones de equilibrio, este tipo de inhibicin se comporta segn la ecuacin


[10]
( )
( )
s
K i
K
K i
s V
v
i
m
i
+
+
+
=
1
1
max


En la que vemos que el efecto de un inhibidor anticompetitivo consiste en reducir K
m
y V
max

por el mismo factor (1+i/K
i
). Las representaciones directa y recproca doble de este tipo de
inhibicin se presentan en la figura 6.12. En la grfica recproca doble se aprecia que las
lneas correspondientes al sistema inhibido tienen la misma pendiente que la del control,
con lo cual son rectas paralelas.



6.5 Inhibicin irreversible


6.5.1 Generalidades

A diferencia de todos los modos inhibitorios que hemos tratado hasta ahora, la inhibicin
irreversible consiste en una reaccin qumica entre el inhibidor y la enzima de tal manera
que se alteran los grupos funcionales de sta, bien sean los encargados de la fijacin del
substrato o de su transformacin cataltica, o de ambos. La inhibicin irreversible
corresponde en general al mecanismo

[11]
E + I E'
k
i


En el que la molcula enzimtica reacciona con el inhibidor para dar una forma inactiva (o
menos activa) E', dependiendo este proceso de una constante de velocidad k
i
(y que por ello
representamos con k minscula). Cinticamente, la inhibicin irreversible se describe con
una ecuacin de segundo orden como

[12]
| || | I E k
dt
de
i
=

Este mecanismo nos muestra la caracterstica ms tpica de la inhibicin irreversible: su
dependencia del tiempo. Con el paso de ste la inhibicin va hacindose ms y ms patente
hasta que se puede llegar a la desaparicin total de la actividad. La efectividad del inhibidor
no se mide en trminos de una K
i
, que corresponde a una constante de equilibrio, sino en
trminos de una constante de velocidad k
i
. A veces los estudios cinticos de un inhibidor
irreversible dan un patrn parecido a la inhibicin no competitiva, cuando los ensayamos

sobre tiempos muy cortos de incubacin con la enzima. La caracterstica propia de la
inhibicin no competitiva es una disminucin aparente de la V
max
. Siendo esta constante el
producto k
cat
e
0
, podemos decir que los inhibidores no competitivos actan sobre k
cat
y los
irreversibles sobre e
0
, pero la accin de unos y otros puede parecer similar. Para
diferenciarlos, no hay ms que estudiar la dependencia de la inhibicin con respecto al
tiempo. La inhibicin irreversible aumenta con el paso del tiempo; igualmente, una
inhibicin reversible no competitiva desaparece cuando sometemos la mezcla de reaccin a
dilisis u otro procedimiento similar.

Conviene sealar asimismo lo relativo de la denominacin "irreversible". Con ello se quiere
decir que la reaccin de la enzima con el inhibidor es irreversible, estando la posicin de
equilibrio muy hacia la derecha en [11]. Ahora bien, en muchas ocasiones podemos
reactivar a la enzima por otro tratamiento qumico. Quiz fuera ms adecuado referirse a
los inhibidores irreversibles como inactivadores.

Otra caracterstica general de los inhibidores irreversibles es que suelen ser sustancias muy
txicas para los organismos. La especificidad enzimtica est sobre todo determinada por
los grupos encargados de la fijacin del substrato a la enzima. Los grupos reactivos del
centro activo, por su parte, son comunes a muchsimas enzimas. Como tendremos ocasin
de ver ms adelante, estos grupos son, por ejemplo, el -OH de la serina, el imidazol de la
histidina, el -SH de la cistena, y el -amino de la lisina, aparte de metales que puedan
desempear un papel importante en el mecanismo cataltico. Por ello, todos los agentes
que puedan reaccionar con estos grupos se comportarn como inhibidores irreversibles no
slo de una enzima (que sera el caso de los inhibidores competitivos) sino de todas las
enzimas que tuvieran en su centro activo el grupo en cuestin. Su accin por tanto se
extiende a muchas enzimas a la vez; y por eso suelen ser altamente txicos in vivo. Dentro
de este tipo de inhibidores estudiaremos los reactivos de grupo SH, los metales pesados y
los agentes quelantes de cationes esenciales.

Ahora bien, el concepto de especificidad en la fijacin de substrato o de anlogo
competitivo puede ser adoptado tambin en el diseo de inhibidores irreversibles. Se
tratara de seudosubstratos capaces de fijarse especficamente al centro activo de una
determinada enzima y que son adems capaces de reaccionar covalentemente con los
grupos cercanos al centro activo. Es as como han surgido potentes inhibidores muy
especficos, que encuentran un gran nmero de aplicaciones tanto en el estudio de los
mecanismos enzimticos como en aplicaciones clnicas o tecnolgicas. Dentro de este grupo
tenemos los reactivos especficos de grupo y los marcadores de afinidad, capaces de
reaccionar con grupos situados en las cercanas del centro activo o en el mismo centro
activo tras una fijacin especfica.


6.5.2 Reactivos de grupo -SH


La cadena lateral del aminocido cistena desempea un papel muy importante tanto en el
mantenimiento de la estructura tridimensional de una protena, a travs del grupo disulfuro

(-S-S-) como en el centro activo de una enzima, a travs de las propiedades del grupo -SH.
En forma de tiolato -S
-
se trata de un nuclefilo potente con propiedades muy parecidas al -
OH de la serina. Hay muchos agentes capaces de reaccionar con este grupo. Entre los
principales, tenemos:

1. Reactivos que promueven la alquilacin de grupos -SH como por ejemplo: halocidos y
sus derivados (yodoacetato, yodoacetamida), mostazas S y N, cloroacetofenona,
cloropicrina, bromobencilcianuro, fluoropiruvato. Estos agentes inducen la formacin de un
tiolter estable a hidrlisis, y por lo tanto las enzimas no son susceptibles de reactivacin.
Esta reaccin es dependiente de pH, ya que el grupo reaccionante es el ion -S
-
.
En la figura
6.13 se presenta el modo de accin del yodoacetato.

2. Reaccin con dobles enlaces, como por ejemplo el cido maleico y la N-etilmaleimida
(NEM). Se trata de una reaccin parecida a la anterior, dado que se forma un tiolter
estable, siendo la reaccin dependiente de pH (figura 6.13)

3. Agentes formadores de mercptidos: HgCl
2
, mercuriales, arsenito, arsenicales trivalentes
y metales como Cu, Pb, Cd y Ag. Uno de los agentes ms utilizados es el
p-cloromercuribenzoato (que en solucin acta como p-hidroximercuribenzoato) (figura
6.14). La accin de estos agentes puede ser revertida con compuestos -SH como cistena,
ditiotreitol, o mercaptoetanol.

4. Agentes oxidantes, que promueven la oxidacin del grupo tiol -SH a disulfuro -S-S- (figura
6.15): glutation oxidado, sulfito, tetrationato, c.perfrmico, perxido de hidrgeno,
aloxana, ferricianuro y ditio(bis)nitrobenzoico.






6.5.3 Metales pesados

Adems de la formacin de mercptidos que veamos en un apartado anterior, los metales
pesados como Ag, Pb, Tl, Hg y Cd pueden reaccionar con otros grupos de la protena
enzimtica: carboxilo de aspartato y glutamato, imidazol, serina, fenol, amino, arginina,
indol, etc. A concentraciones superiores a 1 mM los metales pesados se comportan como
precipitantes.



6.5.4 Inhibidores que combinan con cationes esenciales

Estos inhibidores ejercen su accin a travs de la formacin de complejos o quelatos de
tomos metlicos indispensables en la accin enzimtica y que as son eliminados del centro
activo.

1. Los iones cianuro (CN
-
), sulfuro (S
-
), las azidas y el monxido de carbono deben su accin
inhibitoria a la formacin de complejos con metales. Por tanto, todas las metaloenzimas son
susceptibles de ser inactivados por estos agentes. En particular, es llamativa la inactivacin
en sistemas que contienen Fe, Cu y Zn; en menor medida, Mn y Co. El efecto txico del
cianuro se debe a la inactivacin de la citocromo oxidasa al ocupar la sexta posicin de
coordinacin de un hemo a, grupo prosttico de los citocromos a (ver cap. 4).

2. Los agentes como el EDTA (etilendiamino tetraactico) tienen la particularidad de formar
quelatos con metales de valencia igual o superior a 2; por tanto, pueden inhibir sistemas
que dependan de Fe, Cu. Mg, Ca, y Mo (en particula Ca y Mg). El EDTA y compuestos
parecidos inhibirn dependiendo de la estabilidad relativa del quelato respecto a la
metaloenzima. Por otra parte, los agentes quelantes son bastante sensibles al pH.


6.5.5 Reactivos especficos de grupo y marcadores de afinidad

Reaccionan con un grupo especfico que est en el centro activo o sus proximidades, sin
reaccionar con otros aminocidos iguales presentes en la misma protena.


6.5.5.1 Organofosfricos

Los inhibidores organofosforados forman un grupo muy interesante en el sentido de que
son capaces de reaccionar con la serina activa de muchas enzimas; es decir, reaccionan con
la serina especfica encargada de la formacin de acil-enzimas en el centro activo (ver
captulo 7), que forma parte de una trada cataltica (Ser-His-Asp, Cap. 7), y no con las
dems serinas que pudiera haber en el resto de la cadena polipeptdica. La accin inhibitoria
de los organofosfricos es ejercida a travs de una reaccin qumica con el centro activo que
remeda enteramente el mecanismo normal de catlisis. En este sentido, los inhibidores

organofosforados podran ser considerados como substratos suicidas (ver ms adelante). Si
no lo son, se debe a su carcter relativamente inespecfico, ya que actan sobre un
amplsimo grupo de enzimas.

El prototipo de estos inhibidores es el DFP (diisopropilfosfofluoridato), cuyo modo de accin
se presenta en la figura 6.16.

Existe una gran variedad de derivados organofosfricos, particularmente los empleados
como insecticidas (Parathion, Malathion) que operan por la inhibicin de la
acetilcolinesterasa de las uniones neuromusculares. Igualmente son derivados
organofosfricos los llamados neurogases, desarrollados con fines blicos y de extremada
toxicidad (Sarin, Soman, Tabun, etc.).

6.5.5.2 Marcadores de afinidad

Son agentes que en su estructura incluyen grupos qumicos susceptibles de reaccionar con
los residuos de aminocidos presentes en las proximidades del centro activo. El prototipo de
los marcadores de afinidad son los derivados clorometilcetona. Las halometilcetonas
reaccionan con los grupos tiol e imidazol cercanos al centro activo y pueden ser fcilmente
introducidas en compuestos con estructura anloga a substratos de enzima. En la figura
6.17, la estructura derivada de la reaccin de una histidina activa (esto es, perteneciente a
una trada Ser-His-Asp) con el marcador de afinidad tosil-L-fenilalanina clorometilcetona
(TPCK) (tosil es la abreviatura de 4-toluenosulfonil)


Los marcadores de afinidad se han empleado sobre todo en estudios estructurales del
centro activo.


6.6 Substratos suicidas

En la idea de unir la especificidad de los inhibidores competitivos o anlogos de estado de
transicin con la eficiencia de los inhibidores irreversibles, un paso ulterior es el de los
substratos suicidas o inhibidores activados enzimticamente. Se trata de substratos que se
unen al centro activo enzimtico y son transformados por ste en una especie qumica
altamente reactiva que inhibe irreversiblemente a la enzima. La diferencia con los
marcadores de afinidad es que en stos, el grupo reactivo va unido al substrato; en los
substratos suicidas, la especie reactiva es producida por la propia accin cataltica de la
enzima, y en ausencia de sta son totalmente incapaces de reaccionar. Ntese que decimos
"substrato suicida" en el mismo sentido que en "piloto suicida" (es decir, quiz fuera ms
descriptivo decir "substrato kamikaze"). El mecanismo cintico de los substratos suicidas
puede representarse as:

[13]

E EI
EI*
E'
I
k
-1
k
i
k
cat
k
+1





En donde:

(a) el inhibidor suicida I se fija a la enzima E con la misma especificidad que un substrato o
un inhibidor competitivo (con constantes k
+1
y k
-1
; la unin es reversible) dando lugar a un
complejo EI

(b) El inhibidor I as fijado es transformado a una especie qumica muy reactiva I* por accin
de la propia enzima, con constante cataltica k
cat
(igual que un substrato)

(c) I* reacciona con los grupos qumicos del centro activo con constante de velocidad k
i

(como los inhibidores irreversibles) dando paso a una forma inactivada de la enzima E,

En resumen: la propia enzima transforma el inhibidor en una especie qumica que la inactiva
irreversiblemente.

Los criterios para definir un compuesto como substrato suicida seran: (a) Debe fijarse con la
misma especificidad que un substrato o un inhibidor competitivo; (b) el inhibidor no debe
ser capaz de reaccionar en ausencia de enzima; (c) debe ser activado especficamente por la
enzima; (d) la presencia de substrato o de un inhibidor competitivo convencional a
concentracin alta dificulta o suprime la accin del inhibidor.

Como ejemplo veremos a continuacin la accin de los antibiticos -lactmicos (penicilinas
y cefalosporinas)


6.6.1 Modo de accin de los antibiticos -lactmicos

La teraputica antibacteriana utiliza muy ampliamente los antibiticos -lactmicos. Desde
la introduccin en Teraputica de la penicilina durante la dcada de 1940, se han sintetizado
nuevas molculas parecidas (penicilinas semisintticas) y se han introducido antibiticos
qumicamente afines a las penicilinas, las cefalosporinas. Las penicilinas semisintticas
eliminan o atenan varios de los inconvenientes de estos antibiticos (ampliacin del
espectro antibacteriano, supresin de resistencias, posibilidad de administracin por va
oral, etc.).

Todos ellos operan inhibiendo la ltima reaccin en la sntesis de peptidoglicano bacteriano,

catalizada por la enzima transpeptidasa, y ello es debido a su similitud qumica con el
terminal D-alanil-D-alanina del precursor de peptidoglicano. Esta enzima une el
pentapptido al puente pentaglicina convirtindose en tetrapptido y uniendo
covalentemente dicho tetrapptido a la pentaglicina. Se presenta la estructura de una
penicilina semisinttica, la ampicilina, en la figura 6.18.

Los antibiticos -lactmicos son inhibidores suicidas de la transpeptidasa. Una vez unidos
al centro activo, el ciclo -lactmico es atacado y roto por la enzima y reacciona con la
serina del centro activo, inactivando irreversiblemente a la transpeptidasa (figura 6.19). Se
impide as la sntesis normal del peptidoglicano. Al no disponer de pared celular, las fuerzas
osmticas del medio destruyen a la bacteria (son, por tanto, antibiticos bactericidas).


Estos antibiticos solamente operan a travs de su unin al centro activo de la
transpeptidasa, siendo transformados por sta en la especie qumica que inactiva la enzima
por reaccin con la serina activa. Son, por tanto, inhibidores suicidas.


6.6.2 Resistencia a los antibiticos -lactmicos: la -lactamasa

Las bacterias han desarrollado progresivamente resistencia a los antibiticos -lactmicos
desde el mismo momento de su introduccin en Teraputica. En principio este
inconveniente se elimin mediante el uso de derivados semisintticos de la penicilina (como
la ampicilina); pero poco a poco las resistencias se han desarrollado tambin frente a stas.
La razn de la resistencia estriba en la produccin por las bacterias de la enzima -
lactamasa, que rompe el anillo -lactmico para dar lugar a derivados del cido peniciloico
(inactivo), tal como se muestra en la figura 6.20.

Para potenciar el efecto de los antibiticos -lactmicos se han desarrollado inhibidores
suicidas de la -lactamasa, que aaden a las formulaciones convencionales de penicilinas
semisintticas activas por va oral. De esta manera se inhibe la enzima inactivadora de los
antibiticos -lactmicos. Un ejemplo de estos inhibidores es el cido clavulnico, que se fija
al centro activo de la -lactamasa, la cual rompe el anillo lactmico y da lugar a un producto
que reacciona covalentemente con la serina activa de la enzima, inactivndola (figura 6.21).

En resumen, hemos visto hasta aqu cmo unos inhibidores suicidas de una serin-enzima

(los antibiticos -lactmicos sobre la transpeptidasa) son potenciados por otro inhibidor
suicida que opera sobre otra serin-enzima (el cido clavulnico sobre la -lactamasa).






6.6.3 Otros inhibidores suicidas

El principio de la inhibicin suicida se utiliza muy ampliamente hoy da tanto en la
Teraputica establecida como en el diseo de nuevos frmacos.

As, se han desarrollado, entre otros muchos, inhibidores suicidas de la monoaminooxidasa
cerebral (antidepresivos y antiparkinsonianos); de la aromatasa (antiestrognicos); de las
serin-proteinasas (como la proteasa del VIH); de la ornitina descarboxilasa (antineoplsicos);
de las lipo- y ciclooxigenasas (antiinflamatorios, por ejemplo, los salicilatos); de la yoduro
peroxidasa (antitiroideos); de la dopamina -hidroxilasa (neurolpticos). Podemos decir que
la investigacin actual sobre frmacos parte del principio de la inhibicin suicida, unido a
mtodos informatizados de diseo molecular virtual.




CAPTULO 7: El Centro Activo enzimtico. Mecanismos de la
accin enzimtica




7.1 El centro activo


7.1.1 Concepto

Hemos visto en los captulos anteriores que todos los modelos aceptados hoy da para
explicar la accin enzimtica dan por sentado que las enzimas ejercen su accin a travs de
la formacin de un complejo ES (complejo enzima-substrato), de naturaleza estequiomtrica
y en muchos casos no covalente. Cuando a esta generalizacin aadimos el hecho de la
especificidad enzimtica, se llega a la conclusin de que la fijacin del substrato se hace a un
lugar especfico de la enzima, cuya configuracin espacial, determinada por las cadenas
laterales de los aminocidos que la integran o por la presencia de un grupo prosttico, es tal
que slo el substrato o compuestos anlogos del mismo pueden fijarse. Por otra parte, de

esta fijacin resulta la transformacin cataltica del substrato. Llamamos centro activo a esta
zona especfica de la molcula enzimtica. Hasta este momento hemos tratado del centro
activo en un sentido puramente cintico; los datos experimentales apuntan a la existencia
de un centro activo. En este captulo trataremos en primer lugar de la evidencia estructural
que nos lleva a esta conclusin. El conocimiento detallado de la estructura de muchos
centros activos permite que hoy da conozcamos asimismo multitud de mecanismos de
accin enzimtica, que tambin sern estudiados en el presente captulo.

La existencia del centro activo enzimtico presupone que cualquier descripcin del mismo
deba necesariamente explicar:

- La configuracin especfica de los grupos moleculares encargados de la fijacin del
substrato, dando cuenta de los fenmenos de especificidad y competicin por anlogos
estructurales.

- La configuracin especfica de los grupos moleculares encargados de la transformacin
cataltica del mismo. Estos grupos no coinciden necesariamente con los citados en el prrafo
anterior. La descripcin de estos grupos ha de ser coherente con el mecanismo cintico
conocido de la enzima y debe dar cuenta de los efectos de inhibidores irreversibles, del pH,
de la temperatura, etc., observados para la misma.

- Adems, cualquier descripcin del centro activo debe explicar la eficiencia cataltica de las
enzimas. Los nmeros de recambio tan enormes que encontramos a veces en la catlisis
enzimtica no encuentran una explicacin satisfactoria hasta que no se llega a conocer en
detalle la estructura del centro activo. En este sentido, el conocimiento del mismo puede
brindar claves extraordinariamente tiles en el diseo e implementacin de enzimas
artificiales, tema abordado por la moderna Biotecnologa.


7.1.2 Pruebas experimentales de la existencia del centro activo



1. El modelo cintico de Michaelis y Menten se fundamenta en la formacin de un complejo
estequiomtrico enzima-substrato, y ello explica la mayor parte de la fenomenologa
enzimtica. De esta interaccin resulta la transformacin cataltica del substrato y la
formacin de producto. Como se dijo ms arriba, si a este concepto aadimos el fenmeno
de la especificidad, se llega a concebir la existencia de un centro activo con capacidad de
fijar y transformar al substrato. Hasta el momento actual, no se ha descubierto ninguna
enzima cuya actividad no est de acuerdo con este modelo; todas las enzimas conocidas
hasta ahora dan lugar a cinticas saturantes (de orden cero a concentraciones altas del
substrato, de orden uno a bajas concentraciones) y presentan un mayor o menor grado de
especificidad.

2. Muchas enzimas son protenas conjugadas a un grupo prosttico, y en estos casos puede
demostrarse fcilmente que la actividad cataltica est en parte o en su totalidad ligada al

mismo. El grupo prosttico ocupa una parte especfica de la molcula, y su actividad est
condicionada por el entorno de la molcula proteica. Hoy sabemos que en la mayora de
estos casos el grupo prosttico no es capaz per se de llevar a cabo el proceso cataltico
completo. As, en las hemoenzimas (enzimas con grupo prosttico de tipo hemo) el entorno
proteico es absolutamente fundamental en la accin cataltica, y lo mismo podemos decir
de las flavoenzimas y de todas las dems.

3. El fenmeno de la inhibicin competitiva nos indica que compuestos con estructura
anloga al substrato pueden en ocasiones bloquear la accin enzimtica. La asociacin de
los conceptos "similitud estructural" con "inhibicin" lleva intuitivamente a pensar que la
accin del inhibidor consiste en que ste ocupa el lugar destinado al substrato, lo que ha
sido ampliamente corroborado por la investigacin.

4. Muchos de los inhibidores irreversibles conocidos (organofosfricos, reactivos -SH, etc.)
deben su actividad a una reactividad especfica frente a determinadas cadenas laterales de
aminocidos. El caso de los organofosfricos es particularmente ilustrativo dado que
reacciona con el hidroxilo de la serina, pero no con todas las serinas, sino slo con aqulla
implicada en la actividad cataltica. Para ello, sabemos que en la vecindad de la serina activa
tiene necesariamente que haber una cadena lateral de histidina y una de aspartato (trada
cataltica) con una orientacin precisa. Los organofosfricos reaccionan nicamente con las
serinas que presentan esta configuracin.

5. El estudio filogentico de las secuencias de aminocidos de enzimas homlogas (serin
proteinasas, por ejemplo) ha permitido ver la existencia de zonas altamente conservadas en
la estructura primaria de las mismas. Se muestran a continuacin algunos ejemplos de estas
secuencias:


Secuencias homlogas en torno a la serina activa en serin proteinasas

Tripsina bovina Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Val
Quimotripsina bovina A Cys.Met.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu
Quimotripsina bovina B Cys.Met.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu
Elastasa porcina Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu
Trombina bovina Cys.Glu.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly..Pro.Phe
Plasmina humana Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Ser.Trp
Proteinasa de Sorangium Gly.Arg.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Ser.Trp
Proteinasa de St. griseus Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Val


Secuencias homlogas en torno a la histidina activa en serin proteinasas

Tripsina bovina Ser.Ala.Ala.His.Cys.Tyr
Quimotripsina bovina A Thr.Ala.Ala.His.Cys.Gly
Quimotripsina bovina B Thr.Ala.Ala.His.Cys.Gly
Elastasa porcina Thr.Ala.Ala.His.Cys.Val

Trombina bovina Thr.Ala.Ala.His.Cys.Leu
Proteinasa de Sorangium Thr.Ala.Gly.His.Cys.Gly
Proteinasa de St. griseus Thr.Ala.Ala.His.Cys.Val

(En rojo, posiciones invariantes; en azul, sustituciones conservadoras)

Esta convergencia estructural en enzimas de muy diversa procedencia habla a favor de una
configuracin altamente especfica de la molcula enzimtica que, al conservarse, implica
una zona de la molcula fundamental para su actividad cataltica.

6. Los estudios de fijacin de substratos (o ms frecuentemente, anlogos de substrato) a
enzimas muestran inequvocamente un nmero entero y limitado de molculas del mismo
que se fijan a la enzima. Si en muchos casos hay ms de uno, ello indica la existencia de ms
de un centro activo, lo que es ms bien regla que excepcin en la catlisis enzimtica,
particularmente en lo que se refiere a enzimas intracelulares.

7. Por ltimo, podemos mencionar los estudios fsicos, estructurales, realizados sobre
complejos enzima-substrato (o una vez ms, anlogos de substrato). Entre ellos los ms
significativos son los realizados por cristalografa de rayos X. En 1965, Phillips public sus
resultados sobre la cocristalizacin de la lisozima con su substrato, y la estructura a alta
resolucin del complejo. Ya el hecho de que el complejo ES (o EI, en el caso de un anlogo
competitivo) pueda co-cristalizar indica que la fijacin del substrato tiene necesariamente
que hacerse a un grupo especfico, el mismo en todas las molculas enzimticas. Pero la
estructura resultante de estos estudios va an ms all; no slo se demuestra claramente la
existencia de un lugar de fijacin especfico del substrato, sino que explica con todo detalle
los pormenores de la actividad cataltica del mismo. En la actualidad se ha logrado la
cocristalizacin de muchos complejos ES y se ha podido estudiar su estructura por
cristalografa de rayos X, con el mismo resultado que en el caso de la lisozima.


7.1.3 Nmero de centros activos

1. Cuando la protena presenta un grupo prosttico o un metal esencial para la actividad
cataltica, el nmero de centro activos equivale obviamente al de stos. Tal es el caso, por
ejemplo, de las flavoenzimas, biotinil-enzimas, hemoenzimas, metaloenzimas, etc.

2. Los estudios convencionales de fijacin mediante anlogos de substrato debidamente
marcados (por radioactividad, fluorescencia, etc.) nos pueden dar una idea muy exacta del
nmero de molculas fijadas a la enzima as como de su afinidad intrnseca. En esencia,
estos mtodos consisten en la incubacin de la enzima con el anlogo marcado durante un
tiempo determinado, a diversas concentraciones del ligando y permaneciendo todas las
dems condiciones constantes, seguida de la separacin del ligando libre del complejo
protena-ligando por algn mtodo fsico-qumico. La determinacin cuantitativa de uno y
otro nos lleva, a travs de diversos procedimientos en los que no vamos a entrar, al
conocimiento del nmero de centros activos.


3. El centro activo de muchas enzimas contiene grupos qumicos que pueden reaccionar con
reactivos especficos. Por ejemplo:

- En las enzimas que contienen serinas reactivas en el centro activo podemos determinar el
nmero de stos mediante reaccin con organofosfricos (por ejemplo, DFP, diisopropil
fosfofluoridato, figura 7.1). Es obvio, en este caso, que el nmero de moles de DFP
consumidas equivaldr al nmero de centros activos de la enzima. En este caso es
importante hacer notar que los organofosfricos reaccionan nicamente con la serina
activa, sin hacerlo con las dems serinas que pudiera haber en el resto de la molcula
enzimtica.

- Lo mismo puede hacerse con otros inhibidores irreversibles, y muy particularmente con
substratos suicidas.

- En general, todas aquellas enzimas cuya accin proceda a travs de la formacin de
intermediarios covalentes (v.ms adelante) son susceptibles de este tipo de estudios.
Siempre se pueden encontrar condiciones experimentales en las que el intermediario
covalente sea suficientemente estable como para ser aislado y cuantificado.


7.1.4 Aminocidos y grupos qumicos implicados en el centro activo

La identificacin de las cadenas laterales implicadas en la actividad cataltica de la enzima no

es tarea fcil, aunque hoy da disponemos de mtodos cada vez ms poderosos que sern
tratados de forma general a continuacin. Como siempre, son los estudios estructurales,
cuyo paradigma es la cristalografa de rayos X, los que tienen por el momento la ltima
palabra en este contexto.

Cuando encontramos en una protena un aminocido que es fundamental en la actividad
cataltica, se ha de determinar cuidadosamente si lo es por pertenecer realmente al centro
activo o bien si su papel estriba en mantener una estructura terciaria o cuaternaria de vital
importancia para la correcta configuracin del mismo. Igualmente se debe determinar si el
aminocido forma parte del centro activo (a) contribuyendo a la correcta fijacin del
substrato; (b) suministrando un grupo reactivo para su transformacin cataltica; (c)
realizando ambas funciones a la vez. Por lo que sabemos actualmente, los aminocidos
implicados en la fijacin del substrato pueden ser prcticamente todos, a travs de
interacciones dbiles (hidrofbicas o polares) establecidas entre el substrato y sus cadenas
laterales. Pero los aminocidos que participan en la transformacin cataltica han resultado
ser un nmero mucho ms limitado (por ejemplo serina, histidina, cistena, lisina, aspartato,
glutamato) hasta el punto de que muchos mecanismos de accin enzimtica han resultado
ser muy similares a pesar de que corresponden a reacciones aparentemente muy distintas.

Histricamente, los primeros estudios se hacan observando el efecto del pH sobre la
fijacin del substrato o sobre su transformacin cataltica, tratando de localizar algn pH
especfico que diera lugar a un cambio en la actividad cataltica y que se correspondiera con
el pK
a
conocido de un aminocido concreto. Ahora bien, estos estudios slo podan tomarse
como orientativos, ya que el pK
a
de los grupos disociables presentes en las cadenas
laterales de los aminocidos vara en funcin del entorno, y nunca podemos llegar a
identificar inequvocamente un aminocido por este criterio.

1. Efecto de inhibidores irreversibles. Ya hemos visto la utilidad de este tipo de inhibidores
en el estudio de nmero de centros activos. Como es lgico, la accin de este tipo de
inhibidores nos informa sobre determinados aminocidos. As, la sensibilidad a
organofosfricos es caracterstica de las serin-enzimas (es decir, las que presentan una
configuracin serina-histidina-aspartato en el centro activo); la sensibilidad a reactivos de
grupos -SH informa sobre la presencia de cistena; el efecto de agentes quelantes (EDTA,
EGTA) o de ligandos de coordinacin (CN
-
, CO, etc.) indica la presencia de iones metlicos.

2. Marcaje de afinidad. Esta tcnica, descrita en el captulo 6, ha sido ampliamente utilizada
para determinar los aminocidos situados en o en las proximidades del centro activo.
Consiste en tratar a la enzima con un compuesto formado por la unin del substrato, o un
anlogo del mismo, a un grupo qumico suficientemente reactivo como para marcar, en el
momento de la unin ES, a grupos de la protena que estn en el entorno del centro activo.

El ejemplo clsico de marcador de afinidad ha sido el marcaje de histidinas activas mediante
la toluenosulfonil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK), que vimos en el captulo 6, y cuya
accin se presenta en la figura 7.2. Este marcaje opera sobre las serin-enzimas.


3. Substratos suicidas. El concepto de substrato suicida, que vimos en el captulo anterior,
vale tambin para la identificacin de residuos presentes en el centro activo. Precisamente,
estos inhibidores fueron diseados por Konrad Bloch para estudiar la inactivacin de la
-hidroxi decanoil deshidratasa (enzima implicado en la sntesis de cidos grasos
insturados). Para ello dise un derivado que en el curso de la actividad cataltica era
transformado a un producto altamente reactivo con la consiguiente modificacin e
inactivacin de la protena. Desde entonces se han desarrollado una gran cantidad de
substratos suicidas, empleados tanto en Teraputica como en la identificacin de
aminocidos presentes en el centro activo.

4. Estudios filogenticos. La comparacin de estructuras primarias de enzimas, segn vimos
antes, nos brinda informacin muy til en la identificacin de aminocidos presentes en el
centro activo (aunque tambin muchos invariantes estn implicados en el mantenimiento
de la estructura global de la molcula, y no en el centro activo propiamente dicho).

5. Mutagnesis dirigida. Se trata de una poderossima tcnica mediante la cual se pueden
introducir mutaciones a voluntad en secuencias peptdicas de enzimas cuyos genes hayan
podido ser clonados con anterioridad. Para ello, se sintetiza un oligonucletido de 10-12
residuos complementarios a la secuencia nucleotdica en torno al codon del aminocido que
se pretende variar. Precisamente en este codon, en lugar del aminocido que ocupa la
posicin en la enzima nativa, se introduce el del aminocido que queramos poner en su
lugar. Veamos esta tcnica con un ejemplo concreto:

(a) Supongamos que se desea sustituir la serina activa de la quimotripsina por otro

aminocido. Para ello, se sintetiza un oligonucletido de unos 15 nucletidos de secuencia
complementaria al DNA original, excepto en una sola base, correspondiente a la segunda del
codon de serina (TCT, cuyo complementario sera AGA y sin embargo hemos puesto AAA).
Por ello, serina (TCT) se ver sustituda por TTT (fenilalanina) (figura 7.3). Es obvio que el
apareamiento Watson-Crick entre la secuencia del oligonucletido y la del gen clonado que
se pretende mutar no es perfecto; pero llevando a cabo la hibridacin en condiciones de
alta concentracin salina se obtiene el apareamiento a pesar de la zona imperfecta.



(b) Se procede a entonces a tratar el hbrido con DNA polimerasa, con lo que producimos
DNA con la secuencia mutante deseada. Este DNA, propagado por la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) se transcribe a un mRNA que expresado en un sistema de sntesis de
protena dar lugar a la enzima con el aminocido mutado (figura 7.4).



6. Estudios fsicos. Se conoce hoy da la estructura tridimensional de miles de enzimas. En
muchos casos se puede obtener la cocristalizacin de las mismas con su substrato o un
anlogo del mismo, con lo que se hace accesible al estudio por difraccin de rayos X, lo cual
supone el estudio ms completo que cabe hacer tanto del centro activo como del
mecanismo cataltico de las enzimas. Ms adelante en este mismo captulo estudiaremos a
modo de ejemplo una serie de mecanismos determinados por esta y otras tcnicas.




7.2 Mecanismos de la accin enzimtica


Uno de los problemas ms interesantes que plantea la enzimologa es determinar las causas
de la gran eficiencia cataltica de las enzimas. La catalasa, por ejemplo, transforma substrato
en el orden de 10
8
molculas de substrato por segundo y centro activo. Estas velocidades
corresponden a una disminucin de la energa de activacin (v.cap.1) de varios rdenes de
magnitud. La explicacin de estas activaciones tan intensas no radica en una sola causa.
Muy esquemticamente podemos cifrar la accin enzimtica en los siguientes mecanismos:

(a) Yuxtaposicin en un sentido estereoqumicamente correcto de todos los grupos

reactivos sobre una superficie especfica: efectos de proximidad y orientacin

(b) Presentacin de grupos con reactividades especficas (cido, base, nuclefilo, electrfilo,
etc.) presentes en la molcula enzimtica y que determinan la accin cataltica.

(c) Disminucin de la estabilidad del estado basal de las molculas e incremento de la misma
en el estado de transicin.

(d) Formacin de intermediarios covalentes entre el substrato y la enzima que favorecen la
accin cataltica.

(e) Otros muchos efectos; por ejemplo, efectos mecanocunticos.

Si bien estos efectos, uno por uno, no llegan a explicar las enormes velocidades de la accin
enzimtica, en conjunto pueden dar una idea relativamente aproximada de los mecanismos
intrnsecos de la accin enzimtica.



7.3.1 Efectos de proximidad y orientacin


La catlisis enzimtica tiene en comn con la catlisis heterognea en general el hecho de
que los reactivos se renen sobre una superficie; en nuestro caso, una zona especfica de la
molcula proteica conocida como centro activo. Por tanto, lo primero que hemos de
suponer es que la accin enzimtica tiene lugar (entre otras cosas) por la proximidad que se
establece entre los distintos reactivos (con el consiguiente aumento de la concentracin
local de los mismos). Hay clculos tericos que cifran la aceleracin de una reaccin debido
a este factor de proximidad en alrededor de un factor de 5 para reacciones monosubstrato;
pero este factor puede incrementarse enormemente al aumentar la molecularidad de la
reaccin (reacciones multisubstrato).

Igualmente, el factor de aceleracin se incrementa de manera notoria si al efecto de
proximidad unimos el efecto de orientacin. En el caso de las reaccin en solucin libre, sin
catalizadores presentes, podemos suponer que la colisin entre molculas solamente es
productiva en el caso de que las molculas participantes lleguen al choque en una
orientacin correcta, tal y como se indica en la figura 7.5. En el centro activo de la enzima
los substratos se fijan desde el principio en la orientacin correcta.




7.3.2 Catlisis cido-base

Existen muchos aminocidos en las protenas cuyas cadenas laterales son susceptibles de
disociacin cido-base, pudiendo actuar como catalizadores generales cidos o bsicos.
Pero adems, el entorno en el interior de la molcula altera el pK
a
de los grupos disociables,
llevndolos a zonas de pH ms cercanas al del interior celular, de forma que grupos
qumicamente idnticos pueden actuar como cido y como base en la misma molcula.

En muchas enzimas es habitual el mecanismo de sustraccin protnica (ingl. proton
abstraction). Ilustraremos este mecanismo detallando la accin cataltica de la ribonucleasa
pancretica.

En el mecanismo de la ribonucleasa pancretica, la accin cataltica se desarrolla gracias a
los estados alternantes de protonacin de dos histidinas presentes el centro activo, la His 12
(libre) y las His 119 (protonada), a cuyo conjunto se une el substrato, un polirribonucletido
(figura 7.6, 1). La catlisis comienza con la sustraccin de un protn del grupo 2-OH del
substrato por el par electrnico del imidazol de la His 12 y una cesin del protn de la His
119 al substrato. Esto da lugar a un estado de transicin inestable con fosfato
pentacovalente, que es estabilizado por otros grupos presentes en el centro activo (figura
7.6, 2).


Este estado se resuelve quedando la His 119 libre (no protonada), liberndose el fragmento
3 del polinucletido y con el fragmento 5 en estado de nucletido 2,3 cclico (figura 7.7, 3)


Al centro activo accede una molcula de agua (figura 7.7, 4) a la que la His 119 sustrae un
protn, produciendo un grupo OH
-
libre que ataca al nucletido cclico (figura 7.8, 5). Esto
produce un nuevo estado de transicin pentacovalente (figura 7.8, 6)

el cual es roto por el protn de la His 12, liberndose as el fragmento 5 del polinucletido
primitivo y volviendo el centro activo a su configuracin original (figura 7.9, 7)


Reacciones de sustraccin y cesin protnicas como la citada, llevadas a cabo por bases
(generalmente por el par electrnico de la histidina), tienen una enorme importancia no
slo en esta enzima, sino en toda la catlisis enzimtica en general.


7.3.3 Grupos nuclefilos y electrfilos

Se llaman grupos nuclefilos aqullos que tienen abundancia de electrones (por ejemplo,
grupos con N, O y S) y por lo tanto presentan afinidad hacia los ncleos (y de ah el nombre).
Los ataques nuclefilos tienen una gran importancia en multitud de mecanismos
enzimticos. Nuclefilos muy potentes son el -OH de la serina (cuando est en las
proximidades de una histidina que tiende a retirar un protn H
+
del grupo alcohlico y se
transforma en grupo enolato O
-
de gran reactividad), el N de la histidina (en estado de base
conjugada, es decir, con el par electrnico libre) y el -SH de la cistena (en presencia
asimismo de un grupo bsico que induzca en sta una sustraccin protnica y lo transforme
en tiolato, S
-
).

Son grupos electrfilos los que con pocos electrones tienen afinidad por stos; no hay en las
protenas grupos electrfilos potentes; pero s lo son los tomos e iones metlicos (Zn
2+
,
Cu
2+
, etc.) que con mucha frecuencia aparecen formando parte en las molculas enzimticas
con diversas geometras de coordinacin y mucha importancia en el mecanismo de catlisis.


7.3.4 Formacin de intermediarios covalentes con la enzima

En general, todas las serin-enzimas actan mediante la formacin de un intermediario
covalente en el curso del proceso de catlisis. A veces este intermediario es suficientemente
estable como para que podamos encontrar condiciones especficas para su aislamiento y
caracterizacin.

El caso mejor estudiado, que ya hemos tenido ocasin de examinar, es el de las serin
proteinasas. La accin cataltica en estas enzimas consiste en una sustraccin protnica
llevada a cabo por la histidina activa y que convierte al -OH sernico en un fuerte nuclefilo
que ataca al grupo carbonilo del enlace amida con formacin de una acil-enzima que puede
aislarse fcilmente. Se describe al final de este captulo el mecanismo detallado de accin de
una serinproteinasa, la quimotripsina.


Los intermediarios covalentes no slo se forman a partir de serina. Un intermediario
covalente de gran importancia en la catlisis enzimtica, adems de otros muchos, es
la formacin de bases de Schiff. El grupo carbonilo -CO- de aldehidos o cetonas
reacciona con aminas primarias (por ejemplo, la cadena lateral de la lisina) con prdida
de agua para formar las llamadas bases de Schiff. Tal es el caso de la aldolasa, enzima
que ataca a la fructosa 1,6 bisfosfato para dar dos triosa-fosfatos en la glicolisis (figura
7.10).




7.3.5 Efectos mecanocunticos

Las reacciones enzimticas tienen lugar en unas dimensiones comparables a la longitud
de onda del electrn (2.7 nm) o del protn (0.063 nm) considerados ambos desde el
punto de vista de la dualidad onda-partcula. Por tanto, podemos esperar que la accin
cataltica de las enzimas presente en ocasiones efectos cunticos, como por ejemplo el
efecto tnel; dado que la longitud de onda asociada es comparable a las dimensiones
fsicas de los sistemas en los que tiene lugar la transferencia de protones y electrones
en las reacciones enzimticas, podr existir una incertidumbre apreciable en la
posicin de estas dos partculas dentro de un centro activo. Para nosotros tiene gran
inters la incertidumbre asociada al protn, dada la frecuencia con que los
mecanismos de catlisis enzimtica implican sustraccin protnica, tal como hemos
visto. Ello hace que a esta escala dimensional (nm) el protn pueda oscilar entre dos
grupos moleculares con una cierta probabilidad, obviando la barrera energtica.


Los efectos mecanocunticos son objeto de muy activa investigacin en la actualidad.



7.4 Estudio del centro activo de la quimotripsina


A lo largo de esta discusin hemos podido comprobar que las serin proteinasas son
quiz las enzimas cuyo mecanismo conocemos mejor. Para terminar este captulo,
estudiaremos el mecanismo reactivo de la quimotripsina (EC 3.4.21.1), que es el
prototipo de las serin proteinasas. Se presenta su estructura en la figura 7.11.

La quimotripsina hidroliza los enlaces peptdicos del interior de una protena
establecidos de la siguiente manera: Tyr-X, Trp-X, Phe-X y Leu-X, siendo X cualquier
aminocido. Es una enzima producida en las clulas acinares del pncreas en forma de
quimotripsingeno (precursor inactivo) y al ser segregada a la luz intestinal se
convierte en quimotripsina activa, participando muy activamente en el proceso de
digestin de las protenas.

El centro activo de la quimotripsina est formado por una trada cataltica serina-
histidina-aspartato (figura 7.12, 1), propio de las serinproteinasas y de muchas otras
enzimas. La presencia de esta trada la hace sensible a inhibidores organofosfricos,
entre otros.


La investigacin sobre inhibidores de serin proteinasas es un campo muy activo, dada
la importancia que tienen las roturas proteolticas mediadas por estas enzimas en
multitud de procesos celulares y fisiolgicos (desde la apoptosis hasta la coagulacin
de la sangre, pasando por la formacin de protenas de cubierta vricas).

A este centro activo accede el substrato (figura 7.12, 2). En el caso de la quimotripsina,
se trata del interior de un pptido, fijndose con la especificidad propia de esta enzima
(ver ms arriba).

La accin cataltica comienza con la sustraccin de un protn por parte del par
electrnico libre de la histidina activa (figura 7.13, 3) cuyo grupo imidazol pasa a
imidazolio, con carga positiva, y el OH de la serina se convierte en enolato O
-
. El
enolato, un nuclefilo potente, ataca al enlace peptdico dando lugar a un primer
estado de transicin, con el grupo carbonilo C=O del enlace convertido
transitoriamente en un carbono tetradrico (figura 7.13, 4). La carga negativa del
aspartato estabiliza al grupo imidazolio de la histidina.


La histidina, a continuacin, cede el protn captado previamente al estado de
transicin, rompindose el enlace y liberndose el primer producto (el fragmento C-
terminal del pptido atacado), mientras que el fragmento C-terminal queda unido
covalentemente a la serina, dando lugar al complejo acil-enzima (figura 7.14, 5).

A continuacin entra en el centro activo una molcula de agua (figura 7.14, 6) que es

atacada a su vez por el par electrnico de la histidina libre, que sustrae un protn del
agua para dar un hidroxilo reactivo (figura 7.15, 7) y nuevamente un imidazolio,
estabilizado por el aspartato. El hidroxilo ataca al enlace acil-enzima. Este ataque
produce un segundo estado de transicin con carbono tetradrico (figura 7.15, 8).

Este estado de transicin se resuelve liberndose el segundo producto (figura 7.16, 9)
que es el fragmento N-terminal del pptido. El centro activo vuelve a su estado inicial
gracias a la cesin del protn del grupo imidazolio de la histina a la serina (figura 7.16,
10).







CAPITULO 8: Regulacin de la actividad enzimtica, 1





8.1 Generalidades


Una elemental consideracin de las capacidades de los seres vivos nos lleva a admitir
sin gnero de dudas la necesidad de un control de sus funciones, tanto a nivel
fisiolgico como a nivel celular. El concepto de homeostasis de Cannon, heredero de la
fixit du milieu intrieur de Claude Bernard lleva implcito la existencia de mecanismos
de control que mantengan todas las funciones a un nivel fijo y de referencia. Pero an
hay ms: una de las caractersticas ms notables de los seres vivos es su capacidad de
adaptacin a circunstancias ambientales cambiantes; y as como determinadas
funciones deben mantenerse a su nivel de referencia homeosttico, otras deben

necesariamente alterarse en respuesta a un ambiente en cambio y potencialmente
hostil. Los varios millares de reacciones metablicas que pueden tener lugar en un ser
vivo no han de estar necesariamente siempre en funcionamiento; es obvio que el
escenario ambiental ha de determinar en ltimo trmino las capacidades metablicas.
No es lo mismo, por ejemplo, un cultivo bacteriano creciendo en un medio mnimo que
el mismo cultivo en un medio completo; ni un animal herbvoro paciendo
tranquilamente que el mismo animal sometido al ataque de un predador; ni la
actividad de una planta iluminada que la misma en la oscuridad. En todos estos casos
podemos desentraar una cadena de acontecimientos fisiolgicos que en ltimo
trmino vienen determinados por variaciones en el metabolismo; y como son las
enzimas la condicin necesaria y suficiente de ste, encontraremos que es
precisamente la variacin de la actividad y la concentracin de enzimas el causante
ltimo de todas las adaptaciones fisiolgicas. Actividad y concentracin enzimticas,
pues, estn sometidas a mltiples controles relacionados con la adaptabilidad del ser
vivo a su entorno.


8.1.1 Tipos de regulacin enzimtica

El incremento o disminucin de la actividad enzimtica puede hacerse de dos maneras
distintas, no necesariamente excluyentes entre s. Por una parte, puede variar la
concentracin de enzima: estos sistemas de control actuarn, preferentemente, sobre
la biosntesis o degradacin de enzimas. Pero tambin existen controles sobre la
actividad intrnseca de la enzima. A su vez, las variables controladas en este ltimo
caso pueden ser la funcin de fijacin del substrato o la de su transformacin
cataltica, o ambas. En los seres vivos encontramos un amplio repertorio de
regulaciones de todos estos tipos.


Podemos intentar una clasificacin de los distintos tipos de regulacin enzimtica de la
forma siguiente:


I. Controles sobre la concentracin enzimtica

(a). Controles sobre la expresin gentica

Este tipo de controles se ejerce sobre el aparato de expresin gentica de la clula,
incrementando o disminuyendo la intensidad de la transcripcin del DNA en forma de
mRNA en genes y sistemas genticos especficos.

Las enzimas celulares pueden ser clasificadas en dos grandes grupos: (a) Enzimas
constitutivas, que se mantienen siempre al mismo nivel independientemente de las
variaciones ambientales. El ejemplo tpico de estas enzimas son las de la va glicoltica.
(b) Enzimas inducibles, que slo son producidas en respuesta a estmulos del medio
ambiente. A stas ltimas se refiere esencialmente este tipo de control. Por ejemplo,
una bacteria puede utilizar varias fuentes de carbono. En un momento dado la bacteria

est creciendo en glucosa y sbitamente se le cambia a un medio con lactosa. Existen
sistemas que inducen la sntesis de las enzimas implicadas en la degradacin de la
lactosa. Anlogamente, una clula bacteriana creciendo en un medio mnimo debe
sintetizar todos los aminocidos proteicos. Si en un momento dado suplementamos el
medio con un determinado aminocido, por ejemplo, histidina, existen sistemas que
reprimen la sntesis de enzimas encargadas de la produccin de histidina. En los
eucariotas existen sistemas de induccin y represin mucho ms complejos, pero que
ejercen su accin asimismo sobre el aparato de transcripcin de la clula. No hay que
olvidar que, en este caso, los controles trascienden del mbito restringido del
metabolismo, dando paso a la accin de seales qumicas tales como hormonas,
neurotransmisores, factores de crecimiento, etc.

(b). Controles sobre la degradacin enzimtica

Este tipo de controles, mucho peor conocidos que los anteriores, se ejercen
acelerando o enlenteciendo el ritmo de degradacin proteoltica de las enzimas
celulares.

Aqu no vamos a tratar estos tipos de controles, puesto que se suelen estudiar
formando parte de la Gentica Molecular, ya que estn todos ellos ntimamente
relacionados con los procesos de expresin gentica.



II. Controles sobre la actividad enzimtica

Van a ser el objeto principal de estudio en este captulo y en el siguiente. Este tipo de
controles se ejerce sobre la actividad intrnseca de la enzima, e implican por lo general
alteraciones conformacionales de la molcula enzimtica. Los controles sobre la
actividad enzimtica pueden a su vez realizarse sobre (a) la funcin de fijacin del
substrato, haciendo variar la K
m
aparente hacia el mismo; (b) la funcin de
transformacin cataltica del substrato, lo que lleva a alteraciones en la k
cat
de la
enzima; (c) ambas funciones.

La clasificacin de estos controles la hacemos en funcin del mecanismo molecular de
control .
Podemos clasificarlos as:


(a). Control alostrico o alosterismo

Consiste en la regulacin de la actividad enzimtica a travs de cambios
conformacionales inducidos en la molcula de enzima por distintos efectores positivos
o negativos. No hay en este caso modificacin covalente de la enzima. Se trata de un
tipo de control de ajuste fino de la actividad enzimtica, ejercido en el interior de la
propia clula. Toma la forma de retroalimentacin negativa.



(b). Modificacin covalente de las enzimas

En muchos casos las enzimas pueden ser modificadas covalentemente por otros
sistemas enzimticos, resultando variaciones en su actividad con significado
regulatorio, y que muchas veces son activaciones on-off, es decir, todo o nada. Se van
conociendo cada da ms y ms modificaciones covalentes de esta naturaleza. Las ms
generalizadas, aunque ni mucho menos las nicas, consisten en fosforilacin o
defosforilacin de la protena enzimtica. Las modificaciones covalentes suelen darse
en respuesta a seales fisiolgicas, y son frecuentes las activaciones "en cascada" de
estos sistemas. El cambio en actividad enzimtica puede variar en rdenes de
magnitud, a diferencia del control alostrico, que induce variaciones relativamente
pequeas en la actividad del sistema.

Dentro del control por modificacin covalente podemos incluir la activacin por
modificacin proteoltica. Algunas enzimas son producidas como zimgenos, es decir,
precursores inactivos que pueden ser activados por la rotura de un enlace peptdico
especfico. En estos sistemas es regla la activacin o inactivacin en cascada, y suelen
aparecer en aquellos procesos que en un momento dado deben ponerse en
funcionamiento rpida e intensamente, como por ejemplo la coagulacin sangunea.

Estudiaremos en este captulo la regulacin alostrica y en el siguiente la regulacin
por modificacin covalente. Controles que se ejercen todos ellos sobre la actividad
intrnseca de la enzima.

Antes de pasar a la descripcin detallada de los sistemas de control, conviene
familiarizarnos con una idea central en este estudio. La ciencia experimental siempre
ha tratado de explicar los fenmenos naturales con el mnimo posible de variables y de
modelos (principio conocido como navaja de Occam). La regulacin de la actividad
enzimtica no ha sido excepcin a esta regla y desde siempre se ha tratado de
encontrar una explicacin unitaria a los fenmenos de regulacin. Ya desde ahora
debemos saber que estos intentos han sido, hasta el momento, vanos. El panorama
que emerge de los estudios actuales sobre regulacin enzimtica es que hay una gran
cantidad de sistemas posibles; no tanto como para llegar a decir que cada enzima tiene
su propio y peculiar sistema de regulacin, pero s que podemos constatar una gran
variedad entre los mismos. Las grandes ideas que se han vertido con considerable
esfuerzo e ingenio sobre el campo de la regulacin enzimtica, como alosterismo,
modificacin covalente, cooperatividad, teora del operon, histresis enzimtica, etc.
etc. han resultado ser aspectos parciales del control enzimtico. Y en la descripcin de
los mismos tenemos necesariamente que bajar a los ejemplos concretos. El o los
modelos postulados para un determinado sistema de control pierden muchas veces su
validez cuando se intentan trasladar a otro. Hay, no obstante, algunos principios
generales; pero se trata de principios ms cibernticos que mecansticos, y que son
vlidos no slo en el mundo del control enzimtico, sino en la teora de control
considerada en abstracto, como hace la Ingeniera. El ms general de estos principios
es, sin lugar a dudas, el control por realimentacin negativa (negative feedback
control)



8.2 Control por retroalimentacin negativa

El mundo tecnolgico en el que vivimos es tal gracias al control por retroalimentacin
negativa (Ingl., negative feedback). Con este nombre conocemos sistemas que en
abstracto pueden ser descritos mediante el esquema de la figura 8.1.

Por ejemplo, la mquina de vapor fue posible cuando James Watt invent un
dispositivo que regulaba la presin del vapor en funcin de la velocidad de la mquina,
y al que dio el nombre de gobernador (governor). El trmino gobernador o
gobierno procede de la misma raz griega (, kybernetes, el piloto de una
nave) que Ciberntica, ciencia que estudia el comportamiento de los sistemas de
control en abstracto.

En la figura 8.1, vemos que el efector o planta transforma una entrada en una salida.
Esta salida, a travs del lazo de retroalimentacin, se compara a una seal de
referencia en el comparador. Para ello se requiere que exista un transductor que
convierta la seal de salida a una magnitud directamente comparable a la seal de
referencia. Como resultado de la comparacin se enva una seal de control a un
regulador que aumenta o disminuye la entrada en respuesta a la seal de control. El
trayecto entre la salida y el regulador se conoce como lazo de retroalimentacin (Ingl.,
feedback loop).

Veamos este mismo esquema con un ejemplo concreto: un bao termostatizado de
laboratorio (figura 8.2).


La entrada es el suministro elctrico. El efector, una resistencia elctrica que calienta el
agua. La salida, la temperatura del agua del bao. La seal de referencia es la propia
temperatura. El transductor convierte la temperatura en una seal elctrica (puede
ser, por ejemplo, un par termoelctrico). El comparador, la seal de control y el
regulador, un circuito electrnico que dependiendo de la seal de referencia (el nivel
de temperatura previamente programado) corta (mediante un interruptor) o en otros
casos modifica (mediante un reostato) la corriente elctrica que llega a la resistencia.

Como veremos, este mismo esquema, con las oportunas modificaciones, puede ser
aplicado al control de la actividad enzimtica en muchas ocasiones.



8.2.1 Retroalimentacin negativa en sistemas enzimticos

Durante la dcada de los 50 del siglo pasado se descubrieron diversos sistemas
enzimticos controlados por retroalimentacin negativa. Umbarger, por una parte, y
Yates y Pardee, por otra, demostraron la existencia de este tipo de control en cadenas
metablicas.

Un caso bien documentado desde el principio fue la biosntesis del aminocido
isoleucina en bacterias. La isoleucina se produce a travs de la va metablica que
aparece esquematizada en la figura 8.3.


Puede observarse que la sntesis de este aminocido tiene lugar a partir de otro, la
treonina. La primera enzima de esta transformacin es la treonina deshidratasa
(tambin llamada treonina desaminasa, EC 4.2.1.16) que cataliza la reaccin de
formacin de -cetobutirato a partir de treonina.

Se observ que esta enzima es fuertemente inhibida por el producto final de la va
metablica en cuestin, la isoleucina, sin que ningn otro aminocido se comportara
como inhibidor y siendo el fenmeno perfectamente reproducible in vitro. El objetivo
de esta va metablica no es otro que mantener una determinada concentracin de
isoleucina para que pueda tener lugar la sntesis proteica. Por lo tanto, un aumento en
la concentracin de isoleucina conduce a la inhibicin de la primera enzima de su
cadena biosinttica; la disminucin de la misma retira lgicamente esta inhibicin y
favorece la sntesis del aminocido. El control de la sntesis de isoleucina podra
describirse como en la figura 8.4 en los mismos trminos que hemos sealado en las
figuras anteriores.



Otra de las primeras observaciones de regulacin por retroalimentacin negativa en
vas metablicas fue la sntesis de pirimidinas. Esta va est sometida a un control
similar a travs del producto final, el nucletido CTP (5-Citidintrifosfato). En este caso,
la primera reaccin propia de la biosntesis de pirimidinas es la unin de
carbamilfosfato al aminocido aspartato para dar lugar a carbamilaspartato, proceso
catalizado por la aspartato transcarbamilasa (EC 2.1.3.2).,

Esta reaccin se ve fuertemente inhibida por CTP, nucletido que bien puede
considerarse uno de los productos finales de esta concreta va metablica.
Nuevamente el nivel de producto final es el determinante ltimo de su biosntesis (es
decir, CTP se comporta como la isoleucina en el caso anterior, inhibiendo su propia
biosntesis). Pero en este caso concreto, hay otro hecho de importancia: el ATP,
nucletido purnico, se comporta como un activador de esta misma reaccin (figura
8.5). El significado fisiolgico de este hecho es claro: la sntesis de pirimidinas debe
necesariamente estar concertada con la de purinas; en el caso concreto del DNA,
conforme a las reglas de Chargaff, la cantidad de purinas debe ser exactamente igual
que la de pirimidinas.


Estos descubrimientos fueron los primeros de toda una serie que condujo al
establecimiento de ciertas generalizaciones sobre el control enzimtico por
realimentacin, y que veremos seguidamente.




8.2.2 Caractersticas generales del control enzimtico por retroalimentacin negativa


1. En general, la prctica totalidad de las rutas metablicas estn controladas por
retroalimentacin negativa mediada por el producto final de las mismas. La tabla I
muestra algunos ejemplos.

Tabla I

Rutas metablicas controladas por realimentacin negativa
















Proceso

Primera enzima Inhibidor
Glicolisis Fosfofructokinasa ATP
Neoglucognesis Fructosa bisfosfato fosfatasa AMP
Biosnt. cidos grasos Acetil-CoA carboxilasa Acil-CoA
Biosnt. colesterol HMG-CoA reductasa Colesterol
Biosnt. de isoleucina Treonina deshidratasa Isoleucina
Biosnt. de metionina Homoserina deshidrogenasa Metionina
Biosnt. de purinas PRPP sintetasa AMP, GMP, IMP
AMP Adenilosuccinato sintetasa AMP
GMP IMP deshidrogenasa GMP
Biosnt. de pirimidinas Aspartato transcarbamilasa CTP



2. El control consiste en una inhibicin de la primera enzima o enzima limitante de la
va metablica, siendo el producto final el inhibidor. Por lo general, las enzimas
sometidas a regulacin son aqullas que catalizan pasos limitantes, por lo que el flujo
total a travs de la va depende de la velocidad con que funciona dicha enzima.

3. Los tipos de inhibicin observados, desde el punto de vista cintico pueden ser
competitivos, no competitivos y mixtos, aunque los primeros suelen aparecer con ms
frecuencia. Por las razones que veremos ms adelante, y siguiendo a Monod, Wyman
y Changeux, se prefiere denominar efectos K y efectos V las inhibiciones de tipo
competitivo o no competitivo, respectivamente, en este contexto.

4. En muchos casos, las enzimas sometidas a regulacin por retroalimentacin
negativa exhiben cinticas no-michaelianas; en muchos casos se trata de cinticas de
tipo sigmoide, que sugieren la presencia de cooperatividad positiva. En la figura 8.6
puede apreciarse la dependencia sigmoide (crculos azules) de la velocidad de reaccin
respecto a la concentracin de substrato que aparece en algunas enzimas regulatorias.
Comprese con la dependencia hiperblica de una enzima michaeliana (cuadrados
blancos). Ambas curvas son comparables, asimismo, con la saturacin de oxgeno en la
hemoglobina y en la mioglobina.

5. Al lado de la inhibicin por el producto final aparecen asimismo fenmenos de
activacin mediados por otros metabolitos. Por ejemplo, el ATP activa a la aspartato
transcarbamilasa (biosntesis de pirimidinas), o el AMP que activa a la
fosfofructokinasa (glicolisis).

La dificultad estriba, a veces, en discernir qu es lo que se entiende por producto final
de una va metablica. Por ejemplo, tal y como estudiamos sistemticamente la
glicolisis en un curso de Bioqumica General, consideramos a la glucosa como producto
de partida y al lactato como producto final. Pero no es el lactato el inhibidor fisiolgico
de la glucolisis, sino el ATP. Aqu la interpretacin es obvia; la glucolisis es una va
metablica productora de energa, en la que el lactato es un producto de desecho; y
por lo tanto, es la energa libre utilizable, en forma de ATP, lo que es el verdadero
producto final de la glicolisis. En otros casos, sin embargo, el reparto de papeles
regulatorios no es tan claro.

Algo parecido ocurre con el concepto de "primera enzima" de una va metablica. En el
caso de la biosntesis de isoleucina, la treonina desaminasa abre una ruta que por lo
que sabemos est nicamente comprometida en la sntesis de isoleucina. Sin embargo,
en otros casos no est tan claro este concepto. En el ya mencionado de la glucolisis, la
"primera enzima" tal y como la estudiamos, sera la hexokinasa; sin embargo, la
enzima regulada por el producto final es la fosfofructokinasa. Lo que ocurre es que
esta ltima enzima cataliza el primer paso que de verdad compromete al substrato a
su degradacin; los intermediarios anteriores pueden ser origen de otros destinos
metablicos, como por ejemplo, las interconversiones de hexosas. Por ello hay quien
prefiere hablar de "punto de ramificacin metablica" en lugar de "primera enzima".

En resumen, muchas vas metablicas estn reguladas por su producto final, que se
comporta como inhibidor de una enzima de la misma que por lo general tiene un papel
limitante en el flujo a su travs, y que muchas veces puede fcilmente etiquetarse
como "primera enzima" o como primer paso comprometido o como enzima
limitante. A continuacin trataremos de estudiar los mecanismos moleculares que
determinan estos fenmenos. El mecanismo mejor estudiado y ms generalizado en
este contexto es el alosterismo.




8.3 Alosterismo


8.3.1 Definicin


En 1959, Jacob, Monod y Changeux elaboraron una teora sobre la regulacin
enzimtica que pretenda explicar con un modelo unitario el tipo de regulacin
enzimtica visto en el apartado anterior. En muchos de los casos estudiados el
comportamiento del inhibidor se traduca en un aumento aparente de la K
m
. Sin
embargo, estos autores constataron que no poda hablarse de inhibicin competitiva
dado que el inhibidor, en muchos casos, no era anlogo estructural del substrato. Tal
es el caso, por ejemplo, de la inhibicin ejercida por la isoleucina sobre la treonina
desaminasa. Estos dos compuestos (treonina e isoleucina) tienen en comn el grupo

-aminocido, pero este grupo no era obviamente el responsable de la inhibicin
puesto que ningn otro -aminocido produca este efecto; y por lo dems, las
cadenas laterales son estructuralmente muy distintas. An ms acentuada era esta
disimilitud en el caso de la aspartato transcarbamilasa; el inhibidor, CTP, se
comportaba como competidor del substrato normal aspartato. Este hecho llev a la
idea de que los efectores negativos (inhibidores), as como los efectores positivos
(activadores), se fijaban a un lugar de la molcula enzimtica distinta del centro activo,
en contraste con los inhibidores competitivos clsicos. Por ello, preferan hablar de un
efecto K en lugar de una competicin.

Surgi as el concepto de efectores alostricos, palabra esta ltima derivada de races
griegas que dan a entender un significado de "distinto relieve, distinta geometra" en
contraposicin a los inhibidores convencionales, que al actuar sobre el propio centro
activo, seran efectores isostricos. Los efectores alostricos se fijan, segn esta teora,
a un centro alostrico distinto del centro activo. Las enzimas sometidas a este tipo de
control seran enzimas alostricas, y el conjunto de todos estos fenmenos,
alosterismo. En resumen, la teora del alosterismo podra ser expresada as:

1. Las enzimas sometidas a regulacin por producto final poseen dos tipos de sitios
para la fijacin de substratos y efectores: el centro activo, lugar de la fijacin normal de
substratos y efectores isostricos, y un centro alostrico responsable de la fijacin de
efectores reguladores, como la isoleucina en el caso de la treonina deshidratasa y el
CTP en el de la aspartato transcarbamilasa.

2. La fijacin del efector alostrico a su correspondiente centro induce un cambio
conformacional en la protena enzimtica de tal modo que altera la fijacin del
substrato al centro activo, bien sea dificultndola (en el caso de inhibidores) o
facilitndola (en el de los activadores). Este efecto se presenta esquemticamente en
la figura 8.7 (inhibicin) y en la figura 8.8 (activacin).




3. Aun cuando la teora fue postulada sobre el comportamiento "competitivo" de
algunos inhibidores alostricos (es decir, de la presencia de efectos K), los autores no
excluan la posibilidad de efectos V, esto es, que la fijacin al centro alostrico y el

cambio conformacional subsiguiente de la protena enzimtica diera lugar a un cambio
en la eficiencia cataltica de la enzima, que se traducira en un efecto "no competitivo"
(disminucin de la V
max
aparente) o "mixto" (alteracin simultnea de K
m
y V
max
).



8.3.2 Pruebas experimentales

A favor de la teora del alosterismo estaban los siguientes datos experimentales:

1. Las enzimas alostricas pueden mediante manipulaciones experimentales
"insensibilizarse" a la accin de los efectores sin perder su actividad cataltica. Esto
indica que substrato y efectores alostricos se fijan a sitios distintos de la enzima.

2. Pueden obtenerse formas mutantes de la enzima en las que se conserva intacta la
actividad cataltica de la misma y sin embargo se atena o desaparece la sensibilidad a
efectores.

3. Las enzimas alostricas son por lo general difciles de purificar; en el curso de las
maniobras de purificacin es bastante frecuente que se pierda la sensibilidad a
efectores mientras que la actividad cataltica permanece intacta.

4. Por estudios directos de fijacin se ha comprobado en muchos casos que substrato y
efectores se fijan a zonas diferentes de la protena enzimtica. En el caso de la
aspartato transcarbamilasa, la fijacin de los efectores tiene lugar incluso sobre una
subunidad de la enzima distinta de la que porta el centro activo cataltico.

5. En ocasiones, el efector protege a la actividad cataltica frente a la accin de agentes
desnaturalizantes, indicando este hecho la accin del efector sobre la estructura de la
protena enzimtica.

El modelo alostrico as propuesto ha resultado ser una idea muy fecunda en el campo
de la regulacin de la actividad enzimtica y sus extensiones naturales a la regulacin
de las interacciones protena-ligando en general. No han tenido la misma suerte los
distintos modelos que se han propuesto para explicar el comportamiento alostrico.
Ahora bien, la idea de efectores fijndose a un lugar distinto del centro activo e
induciendo con ello cambios conformacionales en la protena enzimtica que resultan
en variaciones de su actividad sigue siendo un modelo plenamente aceptado por la
Enzimologa actual.


8.3.3 Alosterismo y cooperatividad


8.3.3.1 Concepto de cooperatividad



Muchas enzimas sometidas a control alostrico presentan cinticas no michaelianas
cuando representamos la curva de velocidad en funcin de la concentracin de
substrato. En particular algunos sistemas alostricos presentan una cintica sigmoide
(figura 8.6), que traduce la existencia de un fenmeno de cooperatividad en la fijacin
de substrato. No es sta la nica ocasin en que aparecen cinticas sigmoides en la
Bioqumica. Recordemos, a este respecto, la desnaturalizacin de protenas y del DNA;
y en un contexto que como veremos est muy prximo al que estamos discutiendo, la
fijacin de oxgeno a la hemoglobina. En todos estos casos se trata de fenmenos
cooperativos. La cooperatividad en la desnaturalizacin de macromolculas consiste
en que la rotura de una interaccin dbil que mantiene la estructura de la misma
favorece o facilita la rotura de la siguiente, y as de forma sucesiva hasta que llegamos
a la rotura de todas las interacciones dbiles que conforman la estructura de orden
superior.


Cuando hablamos de cooperatividad en la cintica enzimtica, nos referimos a que la
fijacin de una molcula de substrato al centro activo favorece la fijacin de otra
molcula del mismo a otro centro activo, lo que facilita an ms la fijacin siguiente, y
as hasta que la molcula enzimtica llega a estar plenamente saturada. En el caso de
la hemoglobina, la fijacin de oxgeno a uno de los cuatro grupos hemo de la molcula
favorece la fijacin al siguiente, y as hasta que la molcula presenta sus cuatro sitios
ocupados. En otras palabras, la K
m
vara en funcin de las molculas de substrato
fijadas por la enzima.


La cooperatividad as descrita corresponde a lo que recibe el nombre de
cooperatividad positiva, es decir, aqulla en la que una fijacin favorece a la siguiente.
Puede darse el caso (y de hecho se da en algunos sistemas) de cooperatividad
negativa, en la que la fijacin de una molcula de ligando dificulta la fijacin del
siguiente. En la presente discusin trataremos nicamente de la cooperatividad
positiva.



8.3.3.2 Implicaciones estructurales de la existencia de cooperatividad

Tal como lo hemos descrito, el fenmeno de cooperatividad implica, desde el punto de
vista molecular, lo siguiente:

1. Que en la misma molcula hay ms de un sitio de fijacin de substrato.

2. Que la afinidad de la enzima por el substrato no puede ser descrita por una simple
constante como la K
m
en las condiciones de Michaelis-Menten, sino que en todo caso
habra que describir tantas constantes como sitios de fijacin haya en la molcula; en
el caso de la hemoglobina, cuatro.


3. Que necesariamente tiene que haber un mecanismo de interaccin entre sitios de
manera que la fijacin a uno de ellos repercuta en la fijacin a otro; excludas las
acciones a distancia, hemos de pensar en enzimas con mltiples sitios para el
substrato; y por lo tanto, en enzimas con estructura cuaternaria, es decir, compuestas
por varias subunidades.



8.3.3.3 Efectores positivos y negativos y cooperatividad

En los sistemas alostricos en los que la fijacin del substrato es cooperativa se ha
podido constatar que la accin de los efectores (positivos o negativos) consiste en
alterar el grado de cooperatividad en la fijacin de substrato. As, tenemos:

- Los efectores negativos, o inhibidores, aumentan el grado de cooperatividad en la
fijacin.

- Los efectores positivos, o activadores, disminuyen dicho grado de cooperatividad, de
tal manera que en algunos casos la presencia de un activador a concentraciones
saturantes del mismo "normaliza" el comportamiento de la enzima hacindola
plenamente michaeliana (figura 8.9).

En esta figura se ilustran los efectos de inhibidores y activadores alostricos sobre la
dependencia de la velocidad respecto a la concentracin de substrato. La ausencia de
efectores (0) muestra la cooperatividad positiva en la fijacin de substrato. La
presencia de inhibidor (-) acenta el carcter sigmoide de la curva. La accin del

activador (+) hace desaparecer este carcter sigmoide, haciendo que la enzima se
comporte como michaeliana. Para una misma concentracin de substrato S, la enzima
presenta velocidades distintas v
+
, v
0
y v
-
segn est en presencia de activador, en
ausencia de efectores o en presencia de inhibidor, respectivamente.

De esta manera, a sugerencia de Monod, Wyman y Changeux, se distinguen en las
enzimas alostricas con comportamiento cooperativo dos tipos de efectos:

- Efectos homotrpicos, que aluden a la influencia que un ligando (substrato o efector)
tiene sobre la fijacin de s mismo, y que en el caso del substrato se traduce en
cinticas sigmoides (caso de cooperatividad positiva).

- Efectos heterotrpicos, que son los ejercidos por los distintos ligandos sobre la
fijacin de otros ligandos, y que se traduce en incrementos (inhibidores) o
disminuciones (activadores) de la cooperatividad del sistema.

Esta distincin es til cuando se constata en muchos casos que la fijacin es
cooperativa no slo en el caso del substrato, sino tambin de los efectores.


8.3.3.4 Modelo alostrico restringido

Teniendo en cuenta los efectos cooperativos en la fijacin de ligandos a las enzimas
alostricas, el modelo alostrico restringido (a diferencia del generalizado que se
present ms arriba) queda establecido as:

1. Las enzimas sometidas a regulacin alostrica tienen no slo un centro activo, sino
que disponen de otros tantos sitios para la fijacin de efectores (centros alostricos).

2. La fijacin de un efector a su centro alostrico altera la conformacin tridimensional
de la enzima, y por tanto, de su centro activo, facilitando (en el caso de los
activadores) o dificultando (en el caso de los inhibidores) la fijacin del substrato al
mismo.

3. La fijacin de ligandos (substrato o efectores) a sus sitios respectivos es cooperativa.
La fijacin cooperativa del substrato se traduce en cinticas sigmoides.

4. La cooperatividad en la fijacin requiere necesariamente la interaccin entre sitios,
y por ello, las enzimas alostricas deben tener ms de un centro activo (en el caso de
substrato) y ms de un centro alostrico (para cada uno de los efectores). Lo ms
probable es pensar que todas las enzimas alostricas poseen subunidades, es decir,
tienen estructura cuaternaria. A su vez, esto explica:

- El fenmeno de desensibilizacin que veamos antes; es obvio que la prdida de la
estructura cuaternaria destruira las interacciones entre sitios, y por tanto, la
cooperatividad en la fijacin de ligandos.


- La dificultad de purificacin de las enzimas alostricas; al tener estructura
cuaternaria, esta puede fcilmente destruirse con las manipulaciones experimentales
de la purificacin; as el enzima quedara desensibilizado a los efectores.

5. La accin de los efectores consiste en modificaciones de la cooperatividad en la
fijacin del substrato. Los inhibidores alostricos aumentan este grado de
cooperatividad; los activadores alostricos lo disminuyen; en algunos casos la
presencia de activador a concentracin alta puede llegar a hacer michaeliana la
cintica de fijacin del substrato.

Aunque el modelo as propuesto es bastante restrictivo (excluye la posibilidad de
efectos V y no habla para nada de la cooperatividad negativa); y que por otra parte hoy
sabemos que no todas las enzimas regulatorias se comportan de esta manera, explica
bastante satisfactoriamente el comportamiento de muchas enzimas o sistemas de
fijacin de ligandos.



8.3.4 Interpretacin cuantitativa del alosterismo


Es obvio que toda teora que trate de dar una interpretacin mecanstica de los
fenmenos alostricos, en el sentido restringido discutido hasta aqu, debe explicar,
por una parte, los fenmenos comunes a todas las enzimas (cinticas saturantes y
efectos isostricos) al tiempo que por otra parte ha de dar cuenta asimismo de la
fenomenologa especfica de aqullos (cooperatividad, cintica sigmoide, efectos
homotrpicos y heterotrpicos, etc.). Se han propuesto muchos modelos para la
explicacin del alosterismo; pero el nico que ha ofrecido hasta ahora concordancia
con los datos experimentales es el que se expone resumidamente a continuacin.


8.3.4.1 El modelo de Monod, Wyman y Changeux

El modelo propuesto por estos autores, pretende explicar globalmente el
comportamiento de los sistemas alostricos segn las siguientes suposiciones:

1. Las protenas con comportamiento alostrico son oligmeros formados por varios
protmeros, y existiendo en la estructura cuaternaria resultante al menos un elemento
de simetra. La palabra protmero alude no estrictamente a subunidad, sino al menor
elemento de la estructura que puede fijar substrato y efectores (ntese que un
protmero puede constar de varias subunidades, aunque no necesariamente).

2. El sistema puede estar en dos estados diferentes, llamados R (de relajado) y T (de
tenso). Entre las protena en forma R y la protena en forma T se establece un
equilibrio cuya constante es L, definida de esta forma (ec.[1]):

[1]

| |
| |
0
0
R
T
L =

Siendo R
0
y T
0
las concentraciones de enzima en formas R y T, respectivamente, en
ausencia de ligandos.

3. Los elementos de simetra que hay en la molcula se conservan en las transiciones
entre R y T. La transicin es concertada, es decir, todo o nada, no existiendo estados
intermedios.

4. El substrato y los efectores positivos o activadores tienen afinidad preferente por el
estado R, mientras que los efectores negativos o inhibidores tienen afinidad
preferente por T. Puede darse el caso de afinidades no slo preferentes, sino
exclusivas.


5. La accin de substratos y efectores tiene lugar a travs de los desplazamientos del
equilibrio a que dan lugar por su afinidad preferente o exclusiva por los diferentes
estados de la protena. De esta manera, la presencia de substrato o activador hace que
el equilibrio se desplace hacia el estado R, mientras que el inhibidor lo desplaza hacia
T, segn se indica en la figura 8.10. En ella la protena en forma R se representa
mediante crculos; la forma T, como cuadrados. El substrato (s) tiene solamente
afinidad por la forma R; el inhibidor (i) por la forma T.

A partir de estas premisas, llegan a una expresin para la funcin de saturacin y

(cociente [sitios ocupados]/[sitios totales])que es la siguiente (ec. [2]):

[2]
( )
( )
n
n
L
y
o
o o
+ +
+
=

1
1
1


En la que L es la constante de equilibrio entre los estados R y T que vimos arriba; es
la concentracin normalizada de substrato [s/K
R
] (esto es, expresada en unidades de
su constante de disociacin K
R
) y n, el nmero de protmeros del sistema. Esta
ecuacin es una forma simplificada en la que suponemos que el substrato slo tiene
afinidad por el estado R.


Para los efectos heterotrpicos, la constante alostrica L quedara alterada, en caso de
fijacin exclusiva, dando lugar a una constante L' cuyo valor sera (ec. [3]):

[3]
( )
( )
n
n
L L

|
+
+
=
1
1
'


En la que representa la concentracin normalizada de inhibidor, [i/K
I
] y la
concentracin normalizada de activador [a/K
A
].

De las caractersticas del modelo se deduce que el comportamiento del sistema ser
tanto ms cooperativo cuanto mayor sea el valor de la constante alostrica L, lo que
indicara que en ausencia de substrato y efectores, prcticamente todo el sistema est
en forma T. Al calcular los valores de estas constantes para la aspartato
transcarbamilasa y la hemoglobina se ha encontrado un acuerdo prcticamente
perfecto con los datos experimentales. A continuacin veremos con cierto detalle la
aplicacin del modelo a estos sistemas.




8.3.5 La aspartato transcarbamilasa


La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza el primer paso comprometido de la
biosntesis de pirimidinas (figura 8.5) y el sistema mejor estudiado hasta el momento
es el de la enzima de Escherichia coli, gracias a los estudios de Lipscomb y
colaboradores. Como ya vimos ms arriba, est sometida a una regulacin por
retroalimentacin negativa mediada por los productos finales de la va metablica
(UTP y CTP) y otra positiva por ATP, trmino de la biosntesis de purinas.



8.3.5.1 Comportamiento alostrico de la aspartato transcarbamilasa


En trminos del modelo alostrico restringido antes citado, tenemos para esta enzima
los siguientes datos:

1. La enzima muestra una curva sigmoide de saturacin para ambos substratos,
carbamilfosfato y aspartato, por lo que en los trminos definidos ms arriba, se trata
de un sistema con cooperatividad homotrpica positiva.

2. Por estudios de fijacin y por estudios estructurales de la enzima, se sabe que los
substratos y los efectores se fijan a sitios distintos. Tiene, pues, centro activo y centros
alostricos.

3. La enzima es asimismo afectada heterotrpicamente por CTP y UTP (productos
finales de la biosntesis de pirimidinas), por una parte, y ATP, producto final de la
biosntesis de purinas. Los nucletidos pirimidnicos producen una disminucin de la
velocidad, mientras que el ATP lleva a un aumento de la misma.



8.3.5.2 Adecuacin de la aspartato transcarbamilasa al modelo MWC

Gracias a los estudios citados de Lipscomb y colaboradores conocemos la estructura
de esta enzima a alta resolucin mediante cristalografa de rayos X.

1. La holoenzima de la ATCasa tiene un peso molecular de 310 kDa y est compuesta
por doce subunidades, 6 catalticas iguales entre s (c) y 6 regulatorias tambin iguales
entre s (r). Las catalticas se disponen formando dos trmeros (2c
3
) y las regulatorias
forman tres dmeros (3r
2
), de manera que la estructura cuaternaria puede ser
representada como (3r
2
+ 2c
3
). La estructura tridimensional de la enzima se presenta
en la figura 8.11 (enzima completa); la estructura global presenta un eje ternario de
simetra y tres ejes binarios perpendiculares al ternario.



Las figuras 8.12 y 8.13 presentan el trmero cataltico y el dmero regulatorio,
respectivamente. En este ltimo se aprecia el lugar de fijacin del CTP.

2. Comparando la cintica de las subunidades aisladas con la de la holoenzima, se
comprueba que (a) la actividad especfica del trmero cataltico aislado es
aproximadamente un 50 % superior que la de la holoenzima; (b) la curva de saturacin
del substrato en el caso del trmero cataltico aislado es hiperblica (michaeliana) en
lugar de sigmoide.




3. La ATCasa puede existir en dos conformaciones diferentes. En ausencia de substrato
o en presencia de CTP, la enzima tiene la estructura general que se presenta en la
figura 8.11. La unin del anlogo de substrato PALA (fosfonoacetil-L-aspartato) induce

un cambio conformacional en la molcula que se ilustra en la figura 8.14.

- De las dos formas, una de ellas (forma R) corresponde a la presencia de un
ligando en el centro cataltico (no se ve en la imagen) y un activador (ATP) en el
centro alostrico; y la otra a la ausencia de substrato y a la presencia de CTP en
el correspondiente centro alostrico de la subunidad regulatoria (forma T).

- Todos los elementos de simetra que existen en la molcula (un eje ternario y
tres ejes binarios) se conservan en la transicin, y no han podido ser detectados
estados intermedios.

4. La fijacin de substrato o anlogo determina cambios en la disposicin de las
subunidades regulatorias de tal manera que CTP no puede fijarse a la estructura. De
ah se deduce que el efector alostrico negativo slo tiene afinidad por el estado T.

5. A su vez, la fijacin de CTP en ausencia de otros ligandos determina cambios en la
disposicin de la subunidades catalticas de manera que impiden la fijacin de
substrato.

Por todo ello se considera que este sistema sigue casi al pie de la letra el modelo de
Monod, Wyman y Changeux.






8.3.6 La hemoglobina


La hemoglobina es un transportador de oxgeno que aparece en el interior de clulas
especializadas, los hemates o glbulos rojos. Es una de las protenas mejor estudiadas
y presenta un comportamiento alostrico clsico respecto a la fijacin de su
"substrato", el oxgeno molecular. La afinidad de la hemoglobina hacia el oxgeno se ve
afectada por determinados ligandos, particularmente el protn H
+
, el CO
2
y el 2,3
bisfosfoglicerato (2,3-BPG). Todos ellos producen una disminucin en la afinidad de la
hemogobina por el oxgeno. Gracias a los estudios pioneros de Max Perutz conocemos
con gran detalle la anatoma molecular de esta protena y sus relaciones
estructura-funcin.


8.3.6.1 Comportamiento alostrico de la hemoglobina

La hemoglobina es un sistema alostrico clsico, que puede interpretarse segn el
modelo restringido expresado ms arriba de la siguiente forma:


1. Tanto las subunidades aisladas como la mioglobina se diferencian de la molcula
completa
2

2
en que la curva de saturacin de oxgeno no es sigmoide, sino
hiperblica (figura 8.15).

2. La fijacin de oxgeno sigue una curva sigmoide caracterstica de un efecto
homotrpico positivo (cooperatividad positiva), y esta curva se afecta por los efectores

negativos en la forma indicada en la figura 8.16. En ella representamos el efecto del pH
sobre la curva de disociacin de la hemoglobina.(A), pH 7.8; (B), pH 7.2; (C), pH 6.8; el
protn es un efector negativo en el sistema de la hemoglobina. Un efecto similar
puede ser apreciado con concentraciones crecientes de 2,3 bisfosfoglicerato o de CO
2

(no representados). La accin de dichos efectores consiste en un incremento en el
carcter sigmoide de la curva. se trata, pues, de inhibidores alostricos que
incrementan la cooperatividad en la fijacin del substrato (O
2
)

3. El "centro activo" de la hemoglobina sera el lugar de fijacin del oxgeno molecular,
que es la sexta posicin de coordinacin del ion ferroso que ocupa el centro del grupo
hemo. Los efectores H
+
, CO
2
y 2,3-BPG se fijan a sitios distintos de la molcula.

4. Los efectores H
+
, CO
2
y 2,3-BPG afectan heterotrpicamente a la fijacin del O
2
.
Todos ellos se comportan como inhibidores alostricos, disminuyendo la afinidad de la
hemoglobina por el oxgeno, provocando un incremento en la P
50
. Recurdese que la
P
50
representa la presin parcial de oxgeno con la que se alcanza un 50 % de
saturacin de la hemoglobina, siendo por tanto un parmetro comparable a la K
m
de
los sistemas enzimticos michaelianos.



8.3.6.2 Adecuacin de la hemoglobina al modelo MWC


Los estudios de Perutz sobre la estructura de la hemoglobina a alta resolucin, han
mostrado que:


1. La hemoglobina posee estructura cuaternaria. La hemoglobina A
1
, la ms abundante
en el organismo humano adulto, consta de cuatro subunidades, iguales dos a dos,
llamadas y ; la estructura cuaternaria de la misma se puede representar, pues,
como
2

2
. Estas subunidades poseen una gran similitud estructural y a los efectos que
nos interesan, se pueden considerar idnticas.

2. La hemoglobina presenta dos formas distintas, segn la naturaleza del ligando
coordinado a la sexta posicin del ion ferroso. La forma llamada "oxi" (estado R)
aparece cuando en esta posicin existe un ligando de campo fuerte, como el oxgeno
molecular, el ligando fisiolgico, o el monxido de carbono. La forma llamada "desoxi"
(estado T) se presenta ante la ausencia de ligandos en esta sexta posicin de
coordinacin del ion ferroso o ante ligandos de campo dbil. (figura 8.17)

3. Las dos subunidades estn en la forma T bastante ms separadas que en la forma
R. Lo contrario, aunque en menor medida, ocurre con las subunidades Esta
separacin entre las subunidades en la forma T permite que se fije el ligando 2,3 BPG
(efector negativo) (figura 8.17)

4. Faltan en la forma R (oxi-) determinados enlaces inicos presentes en la forma T
(desoxi). Estos enlaces se presentan en las figuras 8.18 (contacto -), 8.19 (contacto
-) y 8.20 (contacto -). El cambio estructural de la hemoglobina, al pasar de forma
desoxi- a oxi-, induce la rotura de todos estos enlaces mostrados.





5. El ion ferroso ocupa el centro geomtrico del plano de la porfirina en la forma R
(oxi), y aparece ligeramente desplazado del mismo en la forma T (desoxi). Este
fenmeno tiene que ver con la naturaleza del ligando que ocupa la sexta posicin de
coordinacin: el dimetro del ion es un 20 % mayor en el caso de ligandos de campo
dbil o ausencia de los mismos (forma T, desoxi) que en la forma R (oxi), segn se
puede apreciar en el esquema de la figura 8.21.








CAPTULO 9: Regulacin de la actividad enzimtica, 2.
Modificacin covalente de las enzimas. Activaciones
proteolticas







9.1 Introduccin


9.1.1 Modificacin covalente: su importancia biolgica


Veamos en el captulo anterior que el fenmeno de la regulacin de la actividad
enzimtica se desarrolla a varios niveles. En el nivel intracelular, una gran cantidad de
reacciones metablicas se regulan a travs de retroalimentacin negativa, mediante
mecanismos alostricos. Esto supone un control de ajuste fino que mantiene las
actividades enzimticas dentro de mrgenes relativamente estrechos. Ahora bien, en
ocasiones una clula, sobre todo en los sistemas pluricelulares, tiene que responder
con la puesta en marcha de una ruta metablica o la supresin de otra en respuesta a
estmulos ambientales cuya magnitud puede perfectamente desbordar los niveles de
respuesta obtenida ante estmulos alostricos. Muy frecuentemente esta respuesta es

de una enorme complejidad y abarca no una sino muchas rutas metablicas,
transcripcin y traduccin de DNA, interacciones intercelulares, etc. Los procariotas,
por lo general, responden en este caso con variaciones en el nivel de sntesis
enzimtica ejercidos normalmente sobre la transcripcin (induccin o represin
enzimtica); los eucariotas, por su parte, han desarrollado adems todo un intrincado
sistema de respuestas ante estmulos externos que en su mayor parte se manifiestan
como modificaciones covalentes de las enzimas, de lo que resultan sus variaciones en
actividad. La investigacin actual est comenzando a comprender la extrema
complejidad de estos sistemas de modificacin covalente. A travs de la misma, por
citar slo algunos ejemplos, se encuentra la respuesta celular a

1. Neurotransmisores. Son sustancias liberadas por los terminales presinpticos de una
neurona en respuesta al paso a su travs de un potencial de accin. Los
neurotransmisores ejercen su funcin sobre receptores postsinpticos especficos
determinando una respuesta en la clula postsinptica. En ocasiones, los
neurotransmisores operan asimismo sobre receptores presinpticos, modulando la
actividad de la sinapsis. En uno y otro caso la accin puede mediar a travs de
modificaciones covalentes de enzimas o alteraciones en la permeabilidad de canale
inicos en la membrana.

2. Hormonas. Podemos tomar el concepto de hormona en un sentido amplio, en cuyo
caso es hormona todo tipo de seal qumica que ejerce su accin a travs de la
interaccin con un receptor especfico. En ese caso, tanto el apartado anterior como
todos los siguientes deberan esta refundidos en ste. Pero aqu daremos al trmino su
sentido restringido, denominando hormona a la seal qumica generada dentro del
conjunto de rganos que constituyen el sistema endocrino, y que actan a travs de la
interaccin con un receptor especfico. En lneas generales podemos decir que la
prctica totalidad de hormonas que operan desde el exterior de la clula ejercen su
accin por medio de la modificacin covalente de enzimas. Aun cuando no se
produzcan en rganos endocrinos concretos, podemos considerar como hormonas a
los mediadores locales, del tipo de las kininas, eicosanoides, etc., producidos in situ
ante diversos estmulos y cuya accin se traduce asimismo con mucha frecuencia en la
modificacin covalente de sistemas enzimticos.

3. Factores de crecimiento. El estudio de los requerimientos de clulas eucariticas
cultivadas in vitro nos ha llevado al conocimiento de multitud de factores de
naturaleza proteica o peptdica, llamados factores de crecimiento, que inducen en la
clula estmulos de reproduccin y diferenciacin (o des-diferenciacin), operando
sobre el ciclo celular y todas las actividades qumicas normalmente asociadas al mismo
(como por ejemplo, sntesis de DNA); o bien, en algunos casos, induciendo apoptosis
(muerte regulada y programada de las clulas). El catlogo de factores de crecimiento
aumenta de da en da (p.e., factor de crecimiento neural o NGF; factor de crecimiento
epidrmico o EGF; factor de crecimiento plaquetario o PDGF; factores de crecimiento
seudoinsulnicos o ILGF, etc.etc.) y su accin, en trminos generales, y en la medida
que nos es conocida, se ejerce por modificacin covalente de enzimas u otros
efectores (receptores, canales inicos, etc.). En este mismo apartado podemos citar la
accin de mitgenos, que estimulan la entrada de la clula en ciclos de divisin (tal es

el caso de determinadas lectinas, por ejemplo), as como la accin de determinados
efectores celulares como las citokinas.

4. Estmulos morfogenticos y de diferenciacin. La accin de los llamados genes
hometicos, que consiste en la determinacin ontognica de clulas no diferenciadas
hacia formas plenamente diferenciadas constituyendo una forma adulta, consiste en la
puesta en marcha de otros genes a nivel transcriptivo. Los factores proteicos que
median estas acciones pueden verse modificados covalentemente en respuesta a la
accin de estos genes.

5. Estmulos antignicos. La compleja respuesta del sistema inmunitario ante la
aparicin de un antgeno, con activacin de diversas estirpes celulares,
diferenciaciones, ciclos de reproduccin clonal, produccin de mediadores especficos,
etc., est en gran parte determinada por la modificacin covalente de protenas
efectoras, enzimticas o no.

6. Interacciones protena-protena o protena-clula. Hoy da sabemos que una gran
parte de funciones orgnicas se establecen gracias a la interaccin entre protenas,
bien sea entre s o actuando sobre superficies celulares o sobre matrices
intercelulares. Todas estas interacciones pueden verse afectadas por la modificacin
covalente de las mismas.

6. Luz y otros agentes fsico-qumicos. La respuesta de los fotorreceptores retinianos al
estmulo lumnico se traduce en modificaciones covalentes de determinados canales
inicos. Asimismo tiene lugar modificacin covalente de protenas en la respuesta a
estmulos sensoriales olfatorios y gustativos.

Obsrvese que a medida que progresaba esta sucinta descripcin, hemos ido
abandonando el trmino enzima para sustiturlo por el de protena efectora. El
fenmeno de la modificacin covalente se extiende, por lo que sabemos, a todo tipo
de interaccin entre ligando y protena, enzimtica o no.

Resulta as una trama enormemente intrincada de acciones de unos sistemas sobre
otros; pues no slo cabe la posibilidad de modificacin covalente del efector final, sino
que el propio receptor a la seal puede ser modificado por el mismo u otros sistemas;
y todos los pasos intermedios hasta el efector final pueden ser asimismo asiento de
modificaciones covalentes. El conjunto de todos estos fenmenos constituye en s una
disciplina aparte dentro de la Bioqumica, conocida como Transduccin de seales, en
el mismo orden de importancia con el que estudiamos las Biomolculas, la
Enzimologa, el Metabolismo y la Informacin Gentica; y que a no dudar, en unos
pocos aos representar, por su carcter integrador, una disciplina diferenciada cuyas
ramificaciones se extendern a la Clnica y a la Biotecnologa. Dentro de los fenmenos
de transduccin de seales hay una serie de conceptos que requieren un estudio
previo y que pasaremos a discutir a continuacin: las diversas formas de modificacin
covalente, el concepto de segundo mensajero y el concepto de activacin en cascada.



9.1.2 Formas de modificacin covalente

En muchos casos, la modificacin covalente consiste en la fosforilacin de residuos
hidroxlicos de la protena: cadenas laterales de serina, treonina, tirosina y al parecer
tambin histidina. Esta fosforilacin est catalizada por enzimas especficas, llamadas
protein kinasas, que catalizan la trasferencia del fosfato de ATP o GTP al grupo
hidroxilo en cuestin. Para el caso de la serina, tenemos:

ATP ADP
CH
C
HN
CH
C
NH
CH
CH
2
OH
O
R
O
R CH
C
HN
CH
C
NH
CH
CH
2
O
R
O
R
O P
O
O
-
O
-


La fosforilacin de estos residuos determina en la protena cambios conformacionales
que alteran, normalmente de forma drstica, su funcin. Es decir, a diferencia de las
interacciones alostricas, que modulan la respuesta de la enzima de forma gradual y
continua, la fosforilacin resulta en la activacin de una forma previamente inactiva o
viceversa, con una respuesta de tipo todo o nada (on-off). En otros sistemas hay una
cierta gradacin puesto que las dos formas (fosforilada o defosforilada) son activas,
pero una mucho ms que otra.

Como es lgico, tan modificacin covalente es la fosforilacin como la defosforilacin.
Y existen igualmente enzimas que catalizan este proceso, las protein fosfatasas.
Catalizan reacciones hidrolticas del tipo expuesto a continuacin:

H
2
O Pi
CH
C
HN
CH
C
NH
CH
CH
2
OH
O
R
O
R
CH
C
HN
CH
C
NH
CH
CH
2
O
R
O
R
O P
O
O
-
O
-


y que son el objeto de influencias de tipo regulatorio de la misma manera que las
protein kinasas, por lo que su estudio es tan importante como el de stas.

La extraordinaria variedad de respuestas mediadas por protein kinasas o protein
fosfatasas se refleja en los siguientes hechos: (a) podemos estimar en un 3 % del

genoma las secuencias destinadas a la sntesis de protein kinasas y protein fosfatasas;
(b) de los miles de protenas distintas presentes en la clula, aproximadamente un
tercio estn sometidas a fosforilacin/defosforilacin; y (c) en la actualidad conocemos
las secuencias de unos miles de protein kinasas y protein fosfatasas, y estos nmeros
van constantemente en aumento.

El fenmeno de fosforilacin/defosforilacin no es la nica forma de modificacin
covalente de la actividad enzimtica. Encontramos, por ejemplo, la adenilacin de
residuos de serina, con ATP como donador de adenilo y produccin de pirofosfato
inorgnico:

ATP PPi
CH
C
HN
CH
C
NH
CH
CH
2
OH
O
R
O
R CH
C
HN
CH
C
NH
CH
CH
2
O
R
O
R
O
OH OH
N
N
N
N
NH
2
O P
O
O
-
O CH
2



o en otros casos, uridilacin (con UTP como donador) o ADP-ribosilacin (con NAD+
como donador de ADP-ribosa)

Pero el otro orden de modificaciones covalentes de importancia generalizada es el de
proteolisis especfica. Muchas enzimas son producidas por la clula en estado de
zimgenos, formas inactivas de las mismas que son activadas por una rotura
proteoltica especfica. Un caso bien documentado es la produccin de enzimas
digestivas (pepsina, tripsina, quimotripsina, etc.), que son segregadas por las clulas
productoras en forma de los respectivos zimgenos, activndose por proteolisis una
vez llegadas a la luz intestinal. La regulacin por proteolisis especfica se hace
especialmente llamativa en fenmenos como la coagulacin de la sangre, la fibrinolisis
y la activacin del complemento, procesos en los que se necesita una activacin de
varios rdenes de magnitud en tiempos muy cortos, y que tienen lugar a travs del
fenmeno de activacin en cascada (v. ms adelante).

9.1.3 Concepto de segundo mensajero

La gran mayora de seales qumicas producidas en organismos eucariticos ejercen su
accin a travs de la interaccin con receptores situados en la cara externa de la
membrana celular. La excepcin a esta regla general est constituda por la accin de
hormonas de tipo poliprenoide (esteroides, calciferoles, retinoides, etc.) y las
hormonas tiroideas, que actan a travs de la interaccin con receptores
intracelulares, citoslicos y/o nucleares, dando lugar a alteraciones en la transcripcin

del DNA. En el resto de seales qumicas conocidas, dicha seal no entra en la clula
sino que desencadena su accin a travs de la interaccin con un receptor de
membrana.

Esta interaccin determina en el interior de la clula la alteracin en las
concentraciones de determinadas molculas o iones que son las que realmente
desencadenan la respuesta intracelular a la seal. Estas molculas reciben el nombre
de segundos mensajeros (el primer mensajero sera la propia seal qumica que queda
fuera de la clula). El concepto de segundo mensajero se representa
esquemticamente en la figura 9.1.

El segundo mensajero representa, por tanto, la seal qumica intracelular producida
en respuesta a la seal qumica extracelular. Los segundos mensajeros determinan la
activacin de sistemas de modificacin covalente, en particular de
fosforilacin/defosforilacin. Conocemos hoy da una serie de segundos mensajeros
producidos en respuesta a seales qumicas. Los ms importantes son los nucletidos
cclicos (cAMP y en menor medida cGMP), productos de degradacin de fosfolpidos de
membrana (diacil glicerol, inositol fosfatos y otros), el ion Ca
2+
e incluso radicales libre
como el xido ntrico (NO
.
), sin descartar la posibilidad de muchos otros. A su vez, el
concepto de segundo mensajero debe matizarse en el sentido de que en determinados
casos, la respuesta a una seal qumica en la clula supone la aparicin de varios
segundos mensajeros. El panorama se complica cuando se constata que los sistemas
enzimticos de produccin de segundos mensajeros pueden ser asimismo asiento de
modificaciones covalentes; por lo tanto, la respuesta a seales qumicas en la clula
eucaritica muestra una intrincadsima red de influencias de unas seales sobre otras,
dndose todo tipo de fenmenos de aditividad, sinergismo y antagonismo de seales

que hacen difcil la sistematizacin de acciones concretas. Asimismo, observamos en
estas redes de regulacin todo tipo de fenmenos de realimentacin negativa y
positiva, lo que conduce a sistemas complejos, obviamente no lineales, en los que cabe
todo tipo de comportamiento dinmico (estabilidad, estabilidad marginal,
metaestabilidad, oscilaciones e incluso dinmica catica).

9.1.3 Concepto de activacin en cascada

En la modificacin covalente de las enzimas hay un concepto central: el de activacin
en cascada. Como tal conocemos la activacin producida a travs de una serie de
pasos enzimticos sucesivos y encadenados de tal manera que una enzima activa a la
siguiente en la cadena, sta a la siguiente, sta a la siguiente, etc. Dado que la
actividad enzimtica presenta una dependencia lineal respecto a la concentracin de
enzima, cada paso representar, pues, una multiplicacin sobre el anterior, dando
lugar a una dinmica exponencial (y no lineal) en el proceso de activacin.

Supongamos que la enzima E1 activa a la E2, sta a la E3 y as sucesivamente. Una
molcula de E1 activar a muchas E2; cada una de stas a muchas E3; cada E3 a
muchas E4 y as sucesivamente. El proceso de activacin en cascada es tal que una sola
molcula de E1 podr dar lugar a una activacin en rdenes de magnitud; por ejemplo,
una molcula de E1, segn esta misma dinmica, podra llegar a una activacin de 10
7

molculas de E8 suponiendo un modesto ritmo de activacin de 10 a cada paso. Se
consigue as una enorme amplificacin de la seal primitiva. No es de extraar, por
tanto, que los sistemas de regulacin por modificacin covalente acten, por lo
general, a escala de organismo y no meramente de clula. Asimismo sa es la razn
por la cual los sistemas de modificacin covalente son de gran complejidad, tal como
veremos en el caso de la glucgeno fosforilasa y de la coagulacin de la sangre, que
son los ejemplos que estudiaremos ms detenidamente en este captulo (figura 9.2)








9.2 Regulacin de la glucgeno fosforilasa


9.2.1 Reaccin catalizada y formas moleculares de la glucgeno fosforilasa


Histricamente, el primer sistema sometido a modificacin covalente que se descubri
fue el de la glucgeno fosforilasa (EC 2.4.1.1) de hgado y msculo, descubierto por
Sutherland en el ao 1969. La glucgeno fosforilasa es una enzima esencial en los
animales pluricelulares ya que permite un aporte fijo de glucosa segn las necesidades
de cada momento y en particular en los perodos interalimentarios. Cataliza la
fosforolisis de un extremo no reductor de la molcula de glucgeno liberando
glucosa-1-fosfato, y requiere como cofactor esencial el piridoxal fosfato:


O
O
CH
2
OH
OH
OH
OH
O
O
CH
2
OH
OH
OH
O
O
CH
2
OH
OH
OH
O
O
CH
2
OH
OH
OH
Pi
O
CH
2
OH
OH
OH
OH
O P
O
O
-
O
-
O
O
CH
2
OH
OH
OH
OH
O
O
CH
2
OH
OH
OH
O
CH
2
OH
OH
OH
O
Glucgeno (n-1)
Glucgeno (n)
Glucosa-1-fosfato


La enzima es un punto importantsimo del metabolismo, dado que regula la cantidad
de glucosa circulante a partir de la reserva heptica de glucgeno, as como la cantidad
de glucosa a disposicin del msculo esqueltico. Ante situaciones de emergencia, el
organismo requiere un aporte de glucosa constante para hacer frente a cualquier
peligro potencial. Por ello esta enzima ha de ser capaz de activarse en lapsos de
tiempo muy cortos, razn por la cual est sometida a una regulacin en cascada, como
tendremos ocasin de estudiar.

Se trata de una enzima muy grande y muy compleja. Normalmente se presenta como
un homotetrmero (cuatro subunidades iguales), pero la forma funcional es el
homodmero: dos subunidades iguales, cada una de 842 aminocidos y un P.M. de
alrededor de 96 kDa. Gracias a los trabajos del grupo de L.N.Johnson, de la universidad
de Oxford, conocemos muy detalladamente las relaciones estructura-funcin de esta
enzima.

La fosforilasa existe en dos formas diferentes: la fosforilasa a y la fosforilasa b. La
primera es una forma muy activa de la misma y se distingue de la fosforilasa b por
tener fosforilado el residuo Ser 14. La forma b, mucho menos activa, se convierte en
forma a a travs de fosforilacin mediada por ATP y una enzima especfica, la
fosforilasa kinasa, que cataliza la siguiente reaccin:

Fosforilasa b (dmero) + 2 ATP Fosforilasa a (dmero) + 2 ADP

Con lo que se consigue un incremento sustancial de actividad. La fosforilasa a, a su vez,
puede ser convertida en fosforilasa b por hidrlisis mediada a travs de otra enzima, la
protein fosfatasa 1 (PP1):


Fosforilasa a (dmero) + 2 H
2
O Fosforilasa b (dmero) + 2 Pi

De esta forma, la accin de la fosforilasa kinasa equivale a la activacin de la enzima y
la de la protein fosfatasa 1 a la inactivacin.

Ahora bien, la forma b, que es la forma menos activa, est, adems, regulada
alostricamente. Presenta, por una parte, cooperatividad positiva en la fijacin de
substratos (glucgeno y fosfato inorgnico). La enzima tambin presenta efectos
heterotrpicos. As, la enzima muscular es activada por AMP (que a concentracin
elevada indica que existe un bajo nivel energtico en la clula, al ser producto de la
hidrlisis de ATP) mientras que es inhibida por indicadores de un alto nivel energtico
(ATP y glucosa-6-fosfato). El comportamiento de la fosforilasa b se aproxima bastante
al modelo de Monod-Wyman-Changeux que vimos en el captulo 8 (con sus estados R y
T, como veremos). La fosforilasa a, fosforilada en el residuo Ser 14, puede ser
considerada como una fosforilasa b bloqueada en el estado R (mucho ms activo) e
insensible a efectores alostricos.

Pero la fosforilasa es el punto de control del metabolismo energtico en todo el
organismo, en particular la enzima heptica, y est sometida a controles que regulan
su actividad a partir de seales generadas sistmicamente. As, las hormonas
adrenalina (producida por la mdula adrenal ante estados de alerta del organismo) o
glucagon (producido por las clulas A del islote de Langerhans en el pncreas ante un
descenso de la glucemia) estimulan la actividad de la glucgeno fosforilasa a travs de
un mecanismo en cascada que concluye con la fosforilacin de la enzima, y que
analizaremos a continuacin.

9.2.2 Cascada de activacin en la glucgeno fosforilasa

La figura 9.3 ilustra la primera parte de la cascada de activacin covalente de la
glucgeno fosforilasa. Las primeras etapas de dicha activacin son otras tantas
fosforilaciones de enzimas. estas etapas son las siguientes:

1. El glucgeno es degradado por la accin de la fosforilasa. En estado fosforilado, es
decir, bajo la forma de fosforilasa a, degrada activamente al glucgeno.

2. La fosforilasa a es el producto de la fosforilacin, en el residuo Ser 14, de la
fosforilasa b. Esta reaccin es dependiente de ATP y est catalizada por la forma activa
de la fosforilasa kinasa, como hemos visto antes.

3. La forma activa de la fosforilasa kinasa se produce asimismo por fosforilacin
dependiente de ATP de una forma inactiva de misma. La enzima responsable de esta
fosforilacin es la forma activa de la protein kinasa A.




4. La protein kinasa A es activada por un segundo mensajero, el AMP cclico (cAMP),
producto a su vez de la adenilato ciclasa, enzima que produce cAMP a partir de ATP
(figura 9.4).


La activacin de la protein kinasa, a diferencia de las tres etapas anteriores, no se
produce por fosforilacin de la enzima. En estado inactivo, la protein kinasa A consta
de cuatro subunidades iguales dos a dos: dos catalticas (C) y dos regulatorias (R) de
modo que la estructura cuaternaria puede ser descrita como R
2
C
2
. En presencia de
cAMP, ste se une a las subunidades en razn de dos molculas de cAMP por cada
subunidad R, dando lugar al complejo [(cAMP)
2
R]
2
. Esta unin resulta en la disociacin
de las dos subunidades catalticas (2C) que son activas en la fosforilacin de la
fosforilasa kinasa.

5. El cAMP es producido por la forma activada de la adenilato ciclasa, enzima asociada
a la membrana celular y que es activada por protenas G. Las protenas G representan
un sistema muy difundido en la transduccin de seales (ver ms adelante) y que
opera como amplificador y temporizador de la seal. En el caso del sistema de la
fosforilasa, las protenas G son el puente entre el receptor externo y la adenilato
ciclasa.

En la figura 9.5 se esquematiza el funcionamiento de las protenas G. Se trata de una
protena heterotrimrica compuesta de tres subunidades, , y . La subunidad es
capaz de fijar nucletidos de guanina (GDP o GTP) con muy alta afinidad.

En estado de reposo, las tres subunidades estn unidas y la subunidad est ocupada
por GDP. Cuando un ligando L se une al receptor R (1), la subunidad intercambia GDP
por GTP (2). Al fijarse el GTP a la subunidad sta se disocia de las otras dos, que
quedan formando un dmero (3) mientras que -GTP se une a la adenilato ciclasa
(AC), activndola de manera que convierte ATP en cAMP (4). Esta activacin dura

mientras el nucletido unido a la subunidad sea GTP. Ahora bien, esta subunidad
tiene actividad GTPasa, de manera que el GTP fijado va convirtindose en GDP poco a
poco (5). Cuando esto ocurre, la subunidad -GDP se disocia de la adenilato ciclasa y
vuelve a unirse al dmero (6), con lo que se restablece la situacin de reposo. Si el
ligando L persiste unido al receptor R, se producira un nuevo ciclo de activacin.

Recapitulemos ahora la cascada de activacin de la glucgeno fosforilasa pero en
sentido inverso:

1. El ligando L (puede ser, por ejemplo, adrenalina o glucagon) se une al receptor R.

2. La unin ligando-receptor determina el intercambio de GDP por GTP en la subunidad
de la protena G.

3. La subunidad de la protena G, unida a GTP, se disocia de las otras dos (). la
subunidad -GTP, por su parte, se une a la adenilato ciclasa (AC) y la activa,
producindose cAMP a partir de ATP.

4. La adenilato ciclasa funcionar mientras persista el GTP unido a la subunidad . sta
tiene actividad GTPasa que va hidrolizando poco a poco el GTP para dar GDP. En ese
momento, la subunidad se disocia de la AC y vuelve a unirse al dmero .

5. El cAMP provoca la disociacin de las subunidades regulatorias de las catalticas en
la protein kinasa A. stas, una vez separadas, promueven la activacin por fosforilacin
de la fosforilasa kinasa.

6. La fosforilasa kinasa fosforila a la Ser 14 de la fosforilasa, que queda as bloqueada
en su estado R, plenamente activada e insensible a efectores alostricos.



9.2.3 Mecanismos moleculares en el sistema de la glucgeno fosforilasa


9.2.3.1 Glucgeno fosforilasa

Ya vimos antes que cuando la enzima es aislada de fuentes naturales se presenta
normalmente en la forma de homotetrmero. Ahora bien, se cree que la forma
plenamente activa en la clula es el homodmero, esto es, dos subunidades iguales
relacionadas a travs de un eje binario de simetra. Cada subunidad tiene 842
aminocidos y un peso molecular en torno a los 96 kDa. Vimos tambin que la enzima
tiene dos formas: la fosforilasa a, fosforilada en el residuo Ser 14, y fosforilasa b,
defosforilada. Esta ltima, por su parte, es una enzima alostrica, con cooperatividad
en la fijacin de substratos y efectos heterotrpicos mediados por AMP (activador) e
as como por ATP y glucosa-6-fosfato (inhibidores). La fosforilasa b sigue el modelo de
Monod-Wyman-Changeux y se presenta por tanto en dos formas: la forma T, inactiva,
que fija efectores negativos, y la forma R, activa, capaz de fijar activadores.


Por los estudios del grupo ya citado de L.N.Johnson, tenemos una visin bastante clara
de la estructura y funcin de esta enzima. Los resuminos a continuacin.

1. La figura 9.6 muestra la comparacin entre la fosforilasa b al estado T y la fosforilasa
a. El cambio conformacional se aprecia en la posicin de los residuos Ser 14 y Arg 43,
muy separados en la fosforilasa b (estado T). La fosforilacin de la serina introduce un
grupo fuertemente electronegativo (el fosfato) y se produce un cambio
conformacional de tal manera que Arg 43, con carga electropositiva, pasa a estar
adyacente al grupo negativo del fosfato.

2. Este mismo cambio conformacional se puede apreciar (aunque no entraremos en
detalles) en el sitio del substrato (figura 9.7), con piridoxal fosfato fijado al mismo en la
fosforilasa a, y sobre todo, en el sitio alostrico (figura 9.8), cuya configuracin es
completamente distinta en la fosforilasa b que en la fosforilasa a.




3. Cuando la fosforilasa b es activada alostricamente por AMP, sufre un cambio

conformacional y pasa al estado R. En ese estado, la estructura molecular es
prcticamente idntica a la de la fosforilasa a, tal como se ilustra para el sitio de
fosforilacin (figura 9.9), para el de fijacin de substrato (figura 9.10) o el sitio
alostrico (figura 9.11).





9.2.3.2 Fosforilasa kinasa


La fosforilasa kinasa es una protena muy grande. La enzima muscular tiene una
estructura cuaternaria ()
4
y est sometida a dos tipos de control:

- Por una parte, la propia fosforilasa kinasa puede ser fosforilada por una protein
kinasa (protein kinasa A), siendo esta reaccin dependiente de cAMP, como veremos a
continuacin. La forma fosforilada es de alta actividad frente a la defosforilada.

- La actividad enzimtica radica en la subunidad (figura 9.12) En condiciones de
defosforilacin, las subunidades y ejercen un efecto inhibitorio sobre la subunidad
cataltica . Cuando la protein kinasa fosforila a las subunidades y se elimina esta
influencia inhibitoria.


- La enzima puede tambin ser activada por el sistema Ca
2+
-calmodulina (en concreto,
la subunidad es la protena conocida como calmodulina). Esta activacin tiene
particular importancia en el caso de la enzima muscular (figura 9.13). Recurdese, a
este respecto, que es el Ca
2+
quien desencadena la contraccin muscular a nivel
intracelular. Asimismo, el ion Ca
2+
es segundo mensajero en muchos otros sistemas de
transduccin de seal.





9.2.3.3 Protein kinasa A

De entre las aproximadamente mil protein kinasas conocidas hasta ahora, reciben el
nombre de protein kinasas A las que son activadas por cAMP (3'5' adenosin
monofosfato cclico, figura 9.4).

Esta enzima se mantiene en estado inactivo en ausencia de cAMP. La holoenzima
inactiva es un tetrmero que consta de cuatro subunidades, iguales dos a dos, que son
las subunidades R (regulatorias) y las subunidades C (catalticas), por lo que podemos
representar su estructura cuaternaria como R
2
C
2
. En presencia de cAMP la enzima se
disocia segn la reaccin

R
2
C
2
+ 4 cAMP [(cAMP)
2
R]
2
+ 2C


siendo las subunidades C liberadas las formas catalticamente activas de la enzima.
Estas subunidades son capaces de fosforilar, en una reaccin dependiente de ATP, a la
fosforilasa kinasa. Los estudios cristalogrficos de la protein kinasa A nos han
permitido conocer su estructura, que se presenta en la figura 9.14. La subunidad C
(cataltica) aparece con un substrato fijado (ATP) y el ion Mn
2+
. La subunidad R
(regulatoria) aparece con dos molculas de cAMP (activador) fijadas a la misma.




9.2.3.4 Adenilato ciclasa

Cataliza la reaccin de formacin del nucletido cclico cAMP a partir de ATP, tal como
se presenta en la figura 9.4.

La adenilato ciclasa es una protena integral de membrana, y se activa a travs de la
interaccin con el sistema de protenas G, en concreto con la subunidad de las
mismas unidas a un GTP, tal y como se describe en el apartado siguiente. Conocemos
la estructura molecular de la adenilato ciclasa, que se presenta en la figura 9.15.
Consta de dos dominios (C1A y C2A). El centro activo est localizado en la unin de los
dos dominios, y se presenta cocristalizado con AMP y Pi (fosfato inorgnico) y con la
subunidad de las protenas G con un anlogo de GTP fijado (ver a continuacin), que
es el elemento activador de la enzima.


9.2.3.5 Protenas G

Las protenas G son una familia de protenas heterotrimricas, constitudas por tres
subunidades distintas: subunidad (39-46 kDa), subunidad (37 kDa) y subunidad (8
kDa). La subunidad puede fijar con gran afinidad nucletidos de guanina (GDP o
GTP). La estructura se presenta en la figura 9.16. Las subunidades y funcionan
normalmente como si fueran una sola. El estado inactivo de la protena G consiste en
la asociacin de las tres subunidades, hecho que se da cuando el sitio de alta afinidad
de la subunidad est ocupado por GDP. El funcionamiento del sistema est descrito
en la figura 9.5.


Se conocen muchas otras protenas G cuyo funcionamiento es bsicamente el mismo,
aunque los efectos desencadenados pueden ser muy diferentes (por ejemplo, los
impulsos nerviosos ligados a la visin o a la olfacin, la reproduccin sexual de las
levaduras, los movimientos del hongo Dyctiostelium, etc.). En general, suele ser la
subunidad la que determina los diversos tipos conocidos de protenas G. Entre los
sistemas efectores activados o inhibidos por protenas G, tenemos la adenilato ciclasa
(el caso que estamos estudiando), canales inicos (de Na
+
, K
+
y Ca
2+
), fosfolipasas A
2
y
C, cGMP fosfodiesterasa, etc. Otras protenas G caracterizadas hasta la fecha son las G
i

(siendo el prototipo la presente en los fotorreceptores retinianos, que recibe el
nombre especfico de G
t
, transducina), las G
q
(presentes en linfocitos B y T) y las G
12

(de amplia distribucin). Como es lgico, en una misma clula pueden coexistir
diversos tipos de protenas G, asociados al mismo o a distintos receptores de
membrana.

De forma caracterstica, la actividad de las protenas G se ve alterada por ciertas
toxinas bacterianas. As, la toxina colrica (de Vibrio cholerae, agente productor del
clera) cataliza una ADP-ribosilacin de un residuo de Arg especfico en la subunidad
. La subunidad modificada queda activada constitutivamente (es decir, de forma
continua), puesto que la actividad GTPasa queda inhibida. La toxina pertussis (de
Bordetella pertussis, agente causal de la tosferina) afecta asimismo a las protenas G
promoviendo la ADP-ribosilacin de un residuo de Cys, lo cual impide la activacin del
sistema mediada por el receptor.

Las protenas G estn encuadradas en una superfamilia de protenas fijadoras de GTP,
como por ejemplo el factor de elongacin EF-T
u
y las protenas oncognicas ras.


La actividad de las protenas G est asociada a la ocupacin o no de receptores
especficos de membrana. En el caso que nos ocupa, existen protenas G asociadas
tanto al receptor de adrenalina (receptor -adrenrgico) como al receptor de
glucagon.


9.2.4 Otras actividades ligadas al sistema de la glucgeno fosforilasa


No daramos una idea cierta de la verdadera complejidad del mecanismo descrito
hasta ahora si no mencionramos otros sistemas enzimticos que participan en la
regulacin de la actividad de la glucgeno fosforilasa. En concreto hemos de estudiar
las protein fosfatasas y la cAMP fosfodiesterasa. Pero adems, el sistema de
degradacin de glucgeno posee muchos puntos de regulacin comunes al sistema de
sntesis; por tanto, la descripcin del sistema sera incompleta si no analizramos
asimismo la regulacin de la glucgeno sintetasa.


9.2.4.1 Protein fosfatasas

Con niveles de especificidad y respuesta a seales similares a las de las protein kinasas,
existen en la clula multitud de protein fosfatasas especficas. Las protein fosfatasas
catalizan la defosforilacin hidroltica de los residuos hidroxlicos de protenas
fosforiladas por protein kinasas. Se conocen varios tipos de protein fosfatasas (PP1,
PP2A, PP2B, PP2C y tirosin fosfatasas) y en el caso que nos ocupa, la glucgeno
fosforilasa puede ser defosforilada por la protein fosfatasa propia de este sistema,
conocida como PP1. En condiciones de receptores desocupados, la protein fosfatasa es
activa y mantiene prcticamente a cero los niveles de fosforilasa activada. Cuando el
receptor se ocupa por las seales fisiolgicas que hemos visto (adrenalina y glucagon),
la propia protein kinasa A inactiva a la PP1.

La PP1, por su parte, es activada por la insulina, hormona que a este nivel presenta
efectos antagnicos a los de adrenalina y glucagon. Esta activacin de la insulina est
mediada por protein tirosin kinasas.


9.2.4.2 cAMP fosfodiesterasa

La accin de esta enzima consiste en el ataque hidroltico al cAMP para dar 5'-AMP:


O
H
2
C
O
P
O
O
O
-
OH
N
N
NH
2
O
OH
N
N
NH
2
OH
CH
2
O P
O
-
O
O
-
H
2
O


Por lo tanto, el nivel intracelular de cAMP es la resultante de dos acciones enzimticas
contrapuestas: por una parte, la adenilato ciclasa que lo sintetiza a partir de ATP; por
otra, la cAMP fosfodiesterasa que lo degrada a 5'-AMP con la consiguiente prdida de
actividad. A su vez, la fosfodiesterasa puede tambin ser inhibida a travs de
fosforilacin mediada por protein kinasa A (PKA).

De manera caracterstica, la cAMP fosfodiesterasa es inhibida por las metil xantinas
(cafena, teofilina y teobromina), de donde deriva la actividad farmacolgica de estos
compuestos, consistente en el mantenimiento de niveles altos de cAMP al estar
inhibida la cAMP fosfodiesterasa, causante de su hidrlisis.




9.2.4.3 Glucgeno sintasa

La glucgeno sintasa cataliza la transferencia de un residuo de glucosa desde UDPG
(uridin difosfato glucosa) al extremo no reductor de una cadena de glucgeno:


O
O
OH
OH
OH
CH
2
HO
O
O
OH
OH
CH
2
HO
O
O
OH
OH
CH
2
HO
O
O
OH
OH
OH
CH
2
HO
O
O
OH
OH
CH
2
HO
O
O
OH
OH
CH
2
HO
O
O
OH
OH
CH
2
HO
UDP
O
OH OH
CH
2
O P
O
O
O
-
P O
O
O
-
O
OH
OH
OH
CH
2
HO
N
HN
O
O


Sntesis de glucgeno mediada por la glucgeno sintasa

Esta enzima se presenta en dos formas, que por analoga con la glucgeno fosforilasa
denominamos glucgeno sintasa a y glucgeno sintasa b. La forma b presenta una
actividad muy reducida y es activada alostricamente por glucosa-6-fosfato. Esta
forma de la enzima se presenta fosforilada en un residuo de serina, siendo la protein
kinasa A la responsable de esta fosforilacin. La glucgeno sintasa a, por su parte,
tiene niveles muy altos de actividad y no est fosforilada. Puede observarse aqu cmo
las diferentes seales tienen efectos antagnicos: la fosforilacin mediada por protein
kinasa A activa a la fosforilasa e inactiva a la sintasa. Esta es la respuesta normal a
adrenalina y glucagon; por el contrario, la respuesta a insulina consiste en la
inactivacin de la fosforilasa y la activacin de la sintasa, gracias al efecto estimulador
de esta hormona sobre la protein fosfatasa 1 (PP1).

Un resumen de estas actividades coordinadas se presenta en la figura 9.17. La
activacin por protein kinasa mediada por cAMP activa a la fosforilasa e inhibe a las
protein fosfatasas y a la glucgeno sintasa.






9.3 Otros sistemas de fosforilacin de protenas


Como ya se dijo anteriormente, la fosforilacin de residuos especficos en la protena
(enzimtica o no) es el modo preferente de regulacin de actividad por modificacin
covalente. En el apartado anterior hemos estudiado con cierto detalle el sistema de la
glucgeno fosforilasa. Este sistema fue histricamente el primero en ser descrito y nos
ha valido para la introduccin de muchos conceptos tiles en la regulacin por
modificacin covalente y en la transduccin de seales. Ahora bien, no es, ni mucho
menos, el nico. A lo largo de los apartados que siguen analizaremos los principales
sistemas conocidos de fosforilacin de protenas, con la advertencia previa de aunque
sean presentados por separado, las interacciones entre los mismos son
extremadamente frecuentes y por tanto difciles de sistematizar.

9.3.1 Protein kinasas A

Las protein kinasas A (PKA) son enzimas que responden caractersticamente a la accin
del cAMP, y la fosforilasa estudiada en el apartado anterior es el ejemplo clsico de las
mismas.



9.3.2 Protein kinasas G

Son un tipo de protein kinasas que responden a la elevacin intracelular del segundo
mensajero cGMP (3',5' Guanosina monofosfato cclico). El sistema mejor estudiado es
el del msculo liso. La guanilato ciclasa existente en el msculo liso (en particular el
vascular) es activada por el radical libre xido ntrico (NO
.
); el cGMP producido
entonces induce la relajacin muscular (y de ah el efecto hipotensor del NO
.
)

El sistema de la protein kinasa G participa asimismo en la transduccin del estmulo
visual. En condiciones basales, el cGMP mantiene abierto un canal inico de Na
+
. La
activacin por la rodopsina excitada de un sistema de protenas G (conocida en este
caso como transducina) da lugar a la activacin de una fosfodiesterasa que hidroliza el
cGMP a 5'-GMP. De esta manera baja el nivel intracelular de cGMP y se cierra el canal
de Na
+
, dando lugar al impulso nervioso. (Ver Biomolculas, cap. 6, Retinoides)


9.3.3 Protein kinasas C


La protein kinasa C es una enzima de 77 kDa, y fosforila residuos de serina y treonina
en muchas protenas diana. Consta de un dominio cataltico y otro regulatorio.
Responden a una gran variedad de seales, entre las que destacan el estmulo a la
proliferacin celular, y de ah su potencial oncognico (productor de cncer). La
actividad de la PKC queda enmarcada en un sistema complejo de regulacin en el que
participan varios segundos mensajeros, especialmente DAG (diacilglicerol),
inositolfosfatos y calcio.

La interaccin de la seal primaria con el receptor de membrana extracelular estimula
la accin de la fosfolipasa C, que al actuar sobre fosfoinostidos de membrana libera
diacilglicerol, por un lado, e inositol-1,4,5-trisfosfato (IP
3
), por otro. Este ltimo acta
liberando iones de calcio a partir de sus depsitos intracelulares.

El DAG activa directamente a la protein kinasa C, siendo esta accin mimetizada por
los steres de forbol, compuestos carcingenos presentes en el aceite de crotn y que
se emplean experimentalmente para inducir una activacin sostenida de la protein
kinasa C, ya que no se degradan con la rapidez del DAG, del que actan como
anlogos.

La actividad de la protein kinasa C sobre la diferenciacin y proliferacin celular se
comprende precisamente por la accin de estos compuestos.


9.3.4 Protein kinasas dependientes de calcio-calmodulina

La unin de calcio a la protena calmodulina activa la funcin de diversas protein
kinasas, entre otras muchas enzimas. Las protein kinasas activadas por calcio

fosforilan a un gran nmero de protenas intracelulares. Aqu estudiaremos
brevemente las funciones de dos sistemas muy relacionados: el sistema
calcio-calmodulina y los inositolfosfatos.

9.3.4.1 El sistema calcio-calmodulina

Los niveles intracelulares de calcio inico (Ca
2+
) son bajos por la abundancia de steres
fosfricos en el interior de la clula, ya que el producto de solubilidad de fosfatos
clcicos tiene un valor muy reducido. Todas las clulas poseen bombas de Ca
2+
, esto es,
sistemas de transporte encargados del mantenimiento del nivel intracelular de este
ion. Las bombas de Ca
2+
operan tanto en la membrana plasmtica como en las
membranas organelares (mitocondrial, sarcoplsmica, etc.).

Muchas funciones celulares pueden activarse a travs de un incremento en la
concentracin intracelular de Ca
2+
causado por (a) la apertura de canales en la
membrana plasmtica o (b) La movilizacin del calcio secuestrado en las vesculas del
retculo endoplsmico. El ejemplo clsico de la modalidad (a) es la liberacin de
neurotransmisores inducida por Ca
2+
en los terminales sinpticos de las neuronas. La
contraccin del msculo esqueltico, por su parte, es un ejemplo del segundo de los
mecanismos citados.

El Ca
2+
participa como segundo mensajero en muchos otros procesos: movilizacin de
glucgeno y lpidos, liberacin de neurotransmisores, contraccin muscular y motilidad
de cilios y flagelos. La concentracin de Ca
2+
libre en el citoplasma es del orden de 10
-7

M; pero unido a lo que est en reservorios sube a 1 mM. Muchos mensajes
hormonales inducen la liberacin de este calcio secuestrado.

El Ca
2+
se fija con gran afinidad a grupos de oxgeno cargados (p.e. aniones
carboxlicos) y no cargados (carbonilos), lo que le permite inducir cambios
conformacionales importantes en las protenas. Gran parte de las acciones
desencadenadas por el Ca
2+
se deben a su unin con una protena especfica, la
calmodulina (figura 9.13) Bien sea como entidad aislada o formando parte de protenas
oligomricas (como el caso ya visto de la fosforilasa kinasa), la calmodulina sufre un
importante cambio conformacional al fijar Ca
2+
del que resultan sus diversas acciones.
La calmodulina es una protena fijadora de calcio de 17 kDa; consiste en dos dominios
globulares unidos por un tramo largo en -helicoide; cada dominio tiene dos manos
EF, motivo estructural propio de muchas protenas fijadoras de Ca
2+
. La mano EF
consiste en dos tramos en -helicoide separados por un tracto de 12 aminocidos,
cinco de los cuales son dicarboxlicos (Asp o Glu). La calmodulina consta de cuatro
manos EF, formando dos lbulos con dos manos cada uno separados de una tracto
largo en -helicoide. La unin del Ca
2+
a los aminocidos dicarboxlicos de cada una de
las cuatro manos EF induce un importante cambio conformacional en el calmodulina
que de esta manera transmite el mensaje a otras protenas (figura 9.13).


9.3.4.2 Inositolfosftidos


Los inositolfosftidos de la membrana plasmtica participan de forma muy activa en la
transduccin de seales hormonales a travs de la membrana plasmtica. El fosfatidil
inositol 4,5 bisfosfato (PIP
2
), que constituye hasta un 8 % de los lpidos de membrana
da lugar a travs de hidrlisis a tres segundos mensajeros hormonales (figura 9.18): (a)
Inositol 1,4,5 trisfosfato (IP
3
); (b) diacilglicerol (DAG); y eventualmente tambin a (c)
cido araquidnico, presente en la posicin sn-2, que puede ser substrato de la
ciclooxigenasa (dando lugar a prostaglandinas y tromboxanos) o de la lipooxigenasa
(con formacin de leucotrienos) (v. Biomolculas, cap. 4).

El IP3 liberado se une a una receptor especfico del retculo endoplsmico, segn
hemos visto ms arriba, lo que conduce a una liberacin de iones Ca
2+
desde el mismo
hacia el citoplasma, los cuales llevan a cabo diferentes efectos, entre ellos la activacin
de protein kinasas calcio-calmodulina dependientes. El DAG, por su parte, activa a la
protein kinasa C segn hemos visto anteriormente.


9.3.5 Protein tirosin kinasas


Otro tipo de protein kinasas son las protein tirosin kinasas (PTK), que se caracterizan
precisamente porque la fosforilacin dependiente de ATP se lleva a cabo sobre
residuos fenlicos de tirosina y no sobre serina o treonina como los vistos hasta ahora.
Una caracterstica distintiva de estas protein kinasas es su capacidad de
autofosforilacin. Las protein tirosin kinasas son activadas por factores de crecimiento

e insulina, y responden por autofosforilacin en mltiples residuos de Tyr.

Varios experimentos han demostrado un papel de las protenas ras (producto del
protooncogen del mismo nombre) en la transduccin de seales ligada a receptores
PTK. Se requiere activacin de stas para la mitognesis inducida por diversos factores
de crecimiento (y de ah su potencial oncognico)

Son receptores PTK asimismo muchos productos genticos asociados a la ontogenia de
Drosophila y del nematodo Coenorhabditis elegans.




9.4 Otras formas de modificacin covalente


9.4.1 ADP-ribosilacin

Se trata de un proceso de modificacin covalente de enzimas y protenas en general
que consiste en la transferencia de ADP-ribosa desde NAD
+
a grupos aceptores
presentes en las protenas, liberndose el anillo de nicotinamida en el proceso, y que
est catalizada por las llamadas ADP-ribosil transferasas, segn se indica en la figura
9.19. En el proceso se libera nicotinamida.

El grupo transferido se une a diversos grupos de la protena: cadenas laterales de
glutamato, arginina o cistena o bien al carboxilo terminal de la protena, y la

transferencia se hace normalmente de forma mltiple, apareciendo molculas de
poli(ADP-ribosa)-protena. Parece ser que esta forma polimrica es la habitual; la
enzima modificada puede aparecer unida hasta un total de ms de 1000 residuos de
ADP-ribosa.

Las ADP-ribosil transferasas se encuentran en el ncleo y en el citoplasma de clulas
eucariticas, como componentes de toxinas bacterianas y como parte de un
mecanismo que inactiva la sntesis proteica en ciertas bacterias infectadas por fagos.
Los procesos que son objeto de ADP-ribosilacin son suficientemente importantes y
bsicos en la clula como para asignar una gran relevancia al proceso de
ADP-ribosilacin; no obstante, la significacin fisiolgica de este proceso, salvo algunas
excepciones, es por hoy desconocida. Vamos a ver brevemente alguna de las
reacciones modificadas por ADP-ribosilacin.

1. La reparacin del DNA. Los mecanismos de reparacin de anomalas en la molcula
de DNA son un proceso importantsimo, que tiene lugar de forma constante en la
clula debido a la relativa fragilidad de la molcula. Estos mecanismos tienen que ver
tambin con los procesos de envejecimiento. La ADP-ribosilacin forma parte de los
mismos.

2. Se ha comprobado asimismo que la ADP-ribosilacin de histonas produce cambios
en el estado de consensacin de la cromatina; parece ser que la ADP-ribosilacin
disminuye el grado de interaccin entre histonas y DNA en el nucleosoma, haciendo as
que aqul sea accesible a enzimas de reparacin u otros procesos.

3. La ADP-ribosilacin de protenas citoplsmicas parece ser un mecanismo ms de
control de la sntesis proteica ribosmica.

4. La accin de toxinas bacterianas est en muchos casos ligados a procesos de ADP-
ribosilacin. As, la toxina diftrica (de Corynebacterium diphteriae) promueve la
ADP-ribosilacin del factor de elongacin EF-2 en eucariotas y EF-G en bacterias,
inactivando de esta forma la sntesis proteica en la clula atacada. Ya vimos
anteriormente tambin la accin de la toxina colrica y de la toxina pertussis.


9.4.2 Adenilacin y Uridilacin

La enzima glutamina sintetasa (EC 6.3.1.2, Glutamato-amonio ligasa) cataliza la
incorporacin de amonaco NH
3
al grupo carboxilo de la cadena lateral de cido
glutmico en una reaccin dependiente de ATP, dando lugar a glutamina:

COO
-
CH
2
CH
2
C NH
3
+
H
COO
-
ATP ADP
NH
4
+
Pi
CO NH
2
CH
2
CH
2
C NH
3
+
H
COO
-
Glutamato Glutamina

Accin de la Glutamina sintetasa

Esta reaccin es central en el metabolismo del nitrgeno, ya que el aminocido
glutamina opera como donador de nitrgeno en una gran cantidad de reacciones
metablicas, por lo que el papel biosinttico de esta reaccin es importantsimo. A
ttulo de ejemplo, y entre otras, la glutamina participa en los siguiente procesos:

- Biosntesis del anillo purnico, incorporando el N3 y N9 del anillo.

- Biosntesis de GMP a partir de IMP, en la va de sntesis de nucletidos purnicos.

- Biosntesis de carbamilfosfato en el ciclo de la urea y en la formacin del anillo
pirimidnico

- Formacin de CTP a partir de UMP en la biosntesis de nucletidos pirimidnicos.

- Biosntesis de diversos aminocidos, en las que participa directa o indirectamente:
histidina, triptfano, alanina, serina y glicina.

- Biosntesis de glucosamina-6-fosfato en el proceso de formacin de oligo- y
polisacridos complejos.

Igualmente, la reaccin de la glutamina sintetasa tiene un papel fundamental en la
destoxificacin del NH
3
. El dficit de esta actividad enzimtica contribuye de manera
decisiva al desarrollo del coma heptico en las insuficiencias terminales de este
rgano.

No es de extraar, pues, que el papel central de esta enzima en el metabolismo
nitrogenado requiera un control muy estricto de su actividad. La enzima es muy
compleja y est formada por doce subunidades idnticas, cada una con una masa
molecular de 51 kDa, que se agrupan en dos hexmeros apilados uno sobre otro
(figura 9.20).


Adems de diversos controles alostricos, la glutamina sintetasa est asimismo
sometida a un control covalente de su actividad. Por accin de la enzima glutamina
sintetasa adenil transferasa (GSATasa) se transfiere el grupo adenil (AMP) desde el ATP
al residuo de Tyr 397 presente en cada una de las subunidades, segn la reaccin que
se presenta en la figura 9.21. La enzima adenilada se hace mucho ms sensible a los
efectores alostricos, por lo que esta modificacin se traduce en un descenso
significativo de su actividad.


A su vez, la accin de la GSATasa est controlada por otra protena, la protena P, cuya
accin est regulada a su vez por modificacin covalente. Esta protena existe en dos
estados, P
A
y P
D
.
La forma P
A
estimula la adenilacin, y consiguiente inactivacin, de la glutamina
sintetasa. La diferencia entre las dos formas de esta ltima protena estriba en que P
D

contiene un residuo de cido uridlico (UMP) unido a una cadena lateral de Tyr en cada
una de sus cuatro subunidades. Es decir, otra modificacin covalente que en este caso
es una uridilacin.




9.5 Activaciones proteolticas: Zimgenos digestivos



Muchos sistemas enzimticos del organismo deben permanecer en estado de
inactividad por diversas razones. Tal es el caso de las enzimas proteolticas digestivas
que se producen en el estmago (pepsina) y en el pncreas (tripsina, quimotripsina,
elastasa y carboxipeptidasas A y B), as como los diversos factores de la coagulacin de
la sangre. De no ser as se correra el riesgo de una destruccin generalizada de los
tejidos, en el primer caso, y de una coagulacin intravascular diseminada en el

segundo. Pero al mismo tiempo estos sistemas deben poder ser activados rpidamente
ante diversas seales, y a una escala fisiolgica, superior en magnitud a la celular. Por
ello se trata, particularmente en el segundo caso, de complejos sistemas en cascada
capaces de pasar al estado activo en perodos de tiempo muy cortos. En uno y otro
sistema las formas inactivas corresponden a proenzimas o zimgenos, protenas de
mayor tamao que la enzima activa. El fenmeno de activacin consiste en una rotura
proteoltica del zimgeno, altamente especfica, que expone al exterior un centro
activo que estaba oculto, y acompaada a veces de un reordenamiento molecular
bastante considerable.



9.5.1 Pepsina

La pepsina es una enzima digestiva producida por las clulas principales de la mucosa
gstrica en forma de un zimgeno inactivo, el pepsingeno. La pepsina es el prototipo
de las proteasas cidas, caracterizadas por tener varios residuos cidos en el centro
activo y tener ptimos de pH muy bajos. A este respecto, la pepsina es excepcional por
cuanto su pH ptimo de accin est alrededor de 2. En su centro activo hay dos
residuos de aspartato.

El pepsingeno, por su parte, contiene toda la secuencia de aminocidos de la pepsina
y un segmento precursor N-terminal de 44 aminocidos. Este segmento debe ser
eliminado para dar lugar a la enzima activa. La eliminacin es espontnea a pH menor
de 5. El centro activo enzimtico aparece en la conformacin correcta en el
pepsingeno, pero queda oculto por el segmento precursor. En ste encontramos seis
cadenas laterales de aminocidos dibsicos (Lys y Arg) en interaccin salina con
residuos de asprtico y glutmico presentes en el segmento enzimtico de la molcula.
Al disminuir el pH los grupos cidos se protonan, pierden carga y cesan las
interacciones salinas; en ese momento, el propio centro activo hidroliza un enlace
peptdico especfico separando al precursor del segmento enzimtico. Este mecanismo
explica la activacin espontnea de la pepsina a pH cido.


9.5.2 Tripsina

La tripsina y el resto de las enzimas digestivas pancreticas se producen en las clulas
acinares de este rgano, muchas de ellas en forma de zimgenos inactivos y
almacenados en grnulos de zimgeno que se sitan en la porcin apical de la clula
acinar. Ante un estmulo adecuado (como la hormona gastrointestinal
colecistoquinina/pancreozimina), los grnulos son secretados al duodeno, donde se
activan los distintos zimgenos. De la necesidad del almacenamiento en forma inactiva
de las enzimas proteolticas da idea la destruccin del pncreas que puede tener lugar
en las pancreatitis agudas.

La activacin de las enzimas pancreticas corre a cargo de la propia tripsina, para lo

cual sta debe ser activada previamente por un mecanismo distinto. El tripsingeno
secretado a la luz intestinal sufre un ataque proteoltico por parte de la enzima
enteropeptidasa que producen las clulas de la mucosa duodenal. La activacin
consiste en una rotura altamente especfica entre los residuos Lys 6 e Ile 7 del
tripsingeno, con lo cual se libera el hexapptido N-terminal VDDDDK. Es precisamente
la carga negativa de este pptido quien atrae a la enteropeptidasa. La tripsina liberada,
por su parte, activa a todos los dems zimgenos pancreticos, includo el propio
tripsingeno.

En los tejidos existen asimismo otros mecanismos de defensa contra la proteolisis
inducida por serinproteasas. Tal es el caso de la
1
-antitripsina, protena de 53 kDa
producida por los granulocitos neutrfilos. A pesar de su nombre, esta enzima protege
a la elastina de los tejidos conjuntivos de su digestin por elastasa. Se conocen
deficiencias genticas diversas en la molcula de
1
-antitripsina; una consecuencia
caracterstica de todas ellas es la presencia de enfisema pulmonar al no poderse
prevenir la accin de las elastasa sobre los alvolos pulmonares. La
1
-antitripsina
pertenece a la superfamilia de las serpinas, inhibidores naturales de las serinproteasas.


9.5.3 Quimotripsina

El quimotripsingeno es una protena de 245 aminocidos y cinco disulfuros producida
en el pncreas y es activada (como todos los zimgenos pancreticos) por la tripsina.
En este caso, la activacin es bastante compleja, en pasos sucesivos que culminan en la
forma -quimotripsina y comprende un importante reagrupamiento de la cadena
polipeptdica.



9.6 Activaciones proteolticas: Coagulacin de la sangre


Para terminar este resumen sobre la regulacin covalente, consideramos a
continuacin un proceso de suma importancia para la integridad del organismo, la
coagulacin de la sangre. Est organizada en gran parte sobre la base de activacin en
cascada de los llamados factores de la coagulacin, que no son sino zimgenos de
otras tantas serin proteinasas. En el proceso participan otras protenas cuya accin por
el momento no se conoce con certeza, as como otros factores y unas clulas
especializadas, las plaquetas. En esta discusin nos centraremos sobre todo en los
aspectos puramente enzimticos de la coagulacin.

Existen en el organismo otros procesos organizados asimismo como cascadas de
activacin proteoltica, en los que no entraremos: La fibrinolisis (proceso de
destruccin del cogulo una vez formado) y la activacin del complemento, proceso
desencadenado a partir de reacciones antgeno-anticuerpo cuyo objeto es la
destruccin del antgeno.



9.6.1 El proceso de coagulacin: generalidades


La integridad fsica del sistema vascular de los animales es una condicin indispensable
para el mantenimiento de su homeostasis. Tanto las grandes arterias y venas como en
particular los capilares estn sometidos continuamente a una gran cantidad de
traumas mecnicos que de no solventarse daran lugar a una prdida irreversible de
presin en el sistema vascular incompatible con la vida. Pero por otra parte, la
formacin intravascular de cogulos puede representar asimismo un grave peligro,
sobre todo en rganos con vascularizacin terminal como el miocardio o en rganos
que a pesar de poder desarrollar vascularizacin alternativa tienen funciones tan
crticas como para no poder interrumpir su actividad, como es el caso del cerebro y del
tejido nervioso en general. Por todo ello, tanto los fenmenos de coagulacin de la
sangre como de fibrinolisis (destruccin del cogulo) son sistemas de modificacin
covalente (ataque proteoltico) organizados como activaciones en cascada. Ello
permite su rpida puesta en marcha y su actuacin en dimensiones espaciales muy
superiores a las celulares.

Bsicamente, la coagulacin de la sangre consiste en las siguientes fases (presentadas
en sentido cronolgico inverso):

1. Formacin de una trama polimrica covalente llamada fibrina formada por la
aposicin de monmeros de fibrina. A su vez, los monmeros de fibrina se forman por
la accin de una serinproteinasa, la trombina, que acta sobre una protena plasmtica
denominada fibringeno, que es incapaz de polimerizarse per se.

2. Formacin de trombina a partir de su precursor inactivo, la protrombina. Este paso
est catalizado por el llamado complejo protrombinasa, que como veremos no es una
nica actividad enzimtica.

3. Formacin del complejo protrombinasa. El complejo protrombinasa puede formarse
por dos vas distintas, denominadas Ruta de Activacin por Contacto (va intrnseca) y
Ruta del Factor Tisular (va extrnseca). La va intrnseca se produce
intravascularmente, cuando la sangre entra en contacto con una superficie anmala.
La va extrnseca se activa cuando la sangre se extravasa, y es significativamente ms
rpida que la va intrnseca. Ambas vas convergen en las reacciones finales de esta
fase, dando lugar al complejo protrombinasa.

En todas estas fases existen activaciones en cascada de enzimas proteolticas. En la
coagulacin de la sangre, los distintos factores proteicos que intervienen se
denominan (entre otras formas) con nmeros romanos: factor I, factor II, factor III, etc.
Los factores activados proteolticamente reciben el mismo nmero con el aadido de
la letra a; as, el factor XIIa, por ejemplo, representa la forma activada
proteolticamente del factor XII.


Un esquema general del proceso de coagulacin se presenta en la figura 9.22. Hay que
hacer notar que el esquema completo de la coagulacin presenta interacciones entre
las tres fases a travs de factores comunes. Esta distincin se hace, sobre todo, a
efectos didcticos.


9.6.2 Polimerizacin del fibringeno

El fibringeno (o factor I) es una protena fibrosa cuyo p.m. es de 340 kDa. Al
microscopio electrnico presenta forma de bastn con una longitud de 46 nm. Su
estructura cuaternaria consiste en seis subunidades, iguales dos a dos, llamadas A, B
y ; por ello el fibringeno puede representarse como (A)
2
(B)
2

2
, estando estas
subunidades unidas por puentes disulfuro. La molcula consta de dos dominios
globulares en ambos extremos y otros dos en el centro. Estos dominios estn unidos
por tramos elongados en forma de -helicoide. Las subunidades A y B reciben estos
nombres porque tras el ataque por la trombina A da lugar al fibrinopptido A y la
subunidad , mientras que la B rinde fibrinopptido B y subunidad :

(A)
2
(B)
2

2
2A + 2B +
2

2


En la molcula intacta, los fibrinopptidos A y B aparecen en el dominio globular
central. Estos dos fibrinopptidos son ricos en residuos aninicos (Asp y Glu) as como
residuos de tirosina sulfatada, lo que confiere a los mismos una importante densidad
de carga electronegativa. Al estado nativo, esta carga negativa del fibringeno es la

que impide la agregacin intermolecular del mismo por repulsin electrosttica de
unas molculas a otras.

La molcula de fibringeno, en el curso del proceso de coagulacin, es atacada por la
enzima trombina (llamada tambin factor IIa), una serinproteinasa que escinde cuatro
enlaces Arg-Gly, situados en las subunidades A y B, de manera que se separan dos
fibrinopptidos A (de 18 residuos cada uno) y otros dos fibrinopptidos B (de 20
residuos cada uno), quedando la molcula de fibringeno convertida en monmero de
fibrina (factor Ia), cuya estructura es
2

2
, y cuya estructura tridimensional (figura
9.23) se ha podido resolver por cristalografa de rayos X.

La separacin de los fibrinopptidos elimina la repulsin electrosttica que se da entre
las molculas nativas de fibringeno. Los monmeros forman entonces agregados no
covalentes, segn se indica en la figura 9.24.


La formacin definitiva del cogulo de fibrina tiene lugar cuando se establecen enlaces
covalentes entre los distintos monmeros de fibrina. Estos enlaces se establecen entre
cadenas laterales de Lys y Gln, en un proceso catalizado por la transglutaminasa,
tambin llamada factor XIIIa o factor estabilizador de la fibrina. La transglutaminasa es
asimismo activada por la trombina, que acta sobre el factor XIII, zimgeno precursor
de la transglutaminasa, para dar lugar al factor XIIIa. La estabilizacin del cogulo se
representa en la figura 9.25.





9.6.3 Formacin de trombina

La trombina o factor IIa se forma por activacin proteoltica de la protrombina (factor
II) catalizada por el complejo protrombinasa. La protrombina es una protena de 582
aminocidos y un peso molecular de 66 kDa. 10 de los 33 aminocidos N-terminales de
la protrombina son residuos de cido -carboxiglutmico. La presencia de estos
residuos permite la fijacin de Ca
2+
a la protrombina, que de esta manera interacciona
con el complejo protrombinasa, formado en la superficie de las plaquetas (cuyos
fosfolpidos son indispensables en el proceso) y que consta adems de los factores Va y
Xa. El complejo protrombinasa escinde la molcula de protrombina dando lugar a la
trombina (figura 9.26) y exponiendo el centro cataltico. La trombina, de esta forma,
activa no slo al fibringeno, sino tambin a otros factores.

El cido -carboxiglutmico presente en 10 residuos del segmento N-terminal de la
protrombina se forma mediante modificacin postraduccional de residuos de cido
glutmico presentes en la protena mediante una reaccin compleja, no del todo
conocida, en la que participan las naftoquinonas o vitaminas K. La accin
anticoagulante de los derivados cumarnicos se debe precisamente a su actuacin
como anlogos competitivos de las vitaminas K. En presencia de estos compuestos, no
se forma cido -carboxiglutmico. La falta de ste en la porcin N-terminal de la
protrombina impide la fijacin de calcio, lo que a su vez imposibilita la unin de la
protrombina al complejo protrombinasa en la superficie plaquetaria. La presencia de

cido -carboxiglutmico es asimismo esencial para la accin de los factores VII, IX y X.

El complejo protrombinasa se forma en la superficie de las plaquetas y presenta como
elementos esenciales el factor Xa, una serinproteinasa, el factor Va (que no tiene
actividad enzimtica pero acelera unas 10000 veces la activacin de protrombina), los
fosfolpidos de la superficie plaquetaria y el complejo protrombina-Ca
2+
. El factor Va se
produce por la activacin del factor V catalizada por la trombina y el factor Xa. El factor
Xa, a su vez, por los mecanismos que veremos a continuacin.



9.6.4 Formacin del complejo protrombinasa


El factor Xa, como hemos visto, es un elemento fundamental en la activacin de la
protrombina. La activacin del mismo a partir de su zimgeno, el factor X, puede tener
lugar de dos maneras distintas, que son las dos vas a que antes aludamos, la
extrnseca y la intrnseca.

9.6.4.1 La va extrnseca

Recibe este nombre por desarrollarse fuera de los vasos sanguneos, y es
significativamente ms rpida que la va intrnseca (y en general tiene mayor
importancia en el mecanismo hemosttico). La activacin del factor X tiene lugar
mediante el VIIa, Ca
2+
y el factor III (tambin llamado factor tisular; es una lipoprotena

del endotelio vascular). La activacin del factor VII requiere calcio y una superficie
fosfolipdica. A este respecto recordemos que tambin los factores VII y X poseen
residuos de cido -carboxiglutmico. Un esquema de la va extrnseca se presenta en
la figura 9.27.


9.6.3.2 La va intrnseca

Es la que se tiene lugar cuando se producen discontinuidades en el endotelio vascular.
Esta discontinuidad expone el colgeno del tejido vascular. El colgeno fija las
plaquetas circulantes a travs de una glicoprotena especfica. La adhesin plaquetaria
es a su vez activada por el factor von Willebrand, que forma enlaces entre la superficie
plaquetaria y el colgeno. Las plaquetas activadas liberan factores que reclutan a otras
plaquetas hacia el tapn primario, y exponen su fosfolpido para la formacin del
complejo protrombinasa. en este complejo formado sobre el colgeno interviene
tambin otra serinproteinasa, la kalicrena, y de esta manera se produce la activacin
del factor XII.

El factor XIIa activa al XI; el XIa al IX; el IXa, junto con el VIIIa, activan al factor X. El
factor VIII (o factor antihemoflico), es activado en un proceso que tambin requiere
Ca
2+
, una superficie plaquetaria y trombina. La carencia congnita de factor VIII da
lugar a la enfermedad conocida como hemofilia A, que se transmite de forma ligada al
sexo. El resumen de la va intrnseca se presenta en la figura 9.28.


Resumiendo, la coagulacin de la sangre presenta las siguientes particularidades:



- Son enzimas proteolticas la trombina (IIa), y los factores Xa, VIIa, IXa, XIa, XIIa, y
kalicrena. Todas ellas son serinproteinasas y activan proteolticamente a sus
substratos.


- Presentan restos de cido -carboxiglutmico los factores II (protrombina), VII, IX y X.

- Se requiere Ca
2+
y al parecer una superficie fosfolipdica en la activacin de la
protrombina, del factor VII en la va extrnseca y del factor VIII en la intrnseca.

- Adems de promover la polimerizacin del fibringeno, la trombina (IIa) acta en la
activacin del factor XIII (estabilizador de la fibrina), del V y del VIII.


9.6.5 Anticoagulantes fisiolgicos

Todos los factores activados tienen una vida media muy corta. Adems de las
actividades antiserinproteinasa existentes en el medio plasmtico (
1
-antitripsina,
etc.), existen otros sistemas anticoagulantes:

1. La antitrombina III es una protena que se une irreversiblemente al sitio cataltico de
la trombina tras unos pocos ciclos catalticos. Tiene una estructura parecida a la

1
-antitripsina (pertenecen ambas a la superfamilia de las serpinas). Inhibe asimismo a
los factores IXa, Xa, XIa y XIIa. De manera caracterstica, la antitrombina III es activada
por la heparina, glicosaminoglicano sulfatado presente en las granulaciones de los
mastocitos o clulas cebadas.


2. La protena C es una proteinasa que ataca especficamente a los factores
estimuladores de la coagulacin (Va y VIIIa).

3. Existe tambin todo un sistema de activacin en cascada, la fibrinolisis, encargada
de la destruccin del cogulo una vez formado, en el que no entraremos, pero que
presenta una complejidad parecida a la coagulacin de la sangre.



CAPTULO 10: Enzimas en Medicina




10.1 Las enzimas en el diagnstico clnico



Los grandes avances en los mtodos de determinacin de la actividad enzimtica que
tuvieron lugar en la segunda mitad del siglo pasado permitieron estudiar la presencia
de enzimas en una gran cantidad de fluidos biolgicos. De todos ellos nos interesan las
determinaciones enzimticas llevadas a cabo en el suero sanguneo, dada su
trascendencia en el diagnstico de muchas enfermedades. Hasta tal punto que
podemos decir que aproximadamente un 20 % de las determinaciones analticas
rutinarias en el laboratorio clnico son determinaciones enzimticas.

De la relacin

v= k
cat
e

vista en el captulo 5 de este compendio se deduce que la velocidad de una reaccin
enzimtica es directamente proporcional a la concentracin de enzima. Por esta razn,
las concentraciones enzimticas en fluidos biolgicos como el suero se miden como

actividad por unidad de volumen, es decir, UI.L
-l
o bien kat.L
-1
. En el suero existe una
gran cantidad de actividades enzimticas, aunque slo un nmero limitado de las
mismas tiene aplicaciones diagnsticas.



10.1.1 Procedencia de las enzimas sricas


Las enzimas presentes en el suero proceden siempre del interior de las clulas, donde
son sintetizadas. Ahora bien, la diferenciacin de clulas y tejidos hace que la
concentracin intracelular de enzimas vare segn el tejido de procedencia. Por
ejemplo, la fosfatasa cida es mucho ms abundante en la prstata que en otros
rganos o tejidos; la creatin kinasa es propia del tejido muscular; la alanina
aminotransferasa, aunque presente en muchos tejidos, es francamente abundante en
el hepatocito. Por ello, aumentos constatables en suero de dichas enzimas son
indicativos de alteraciones en los respectivos tejidos de procedencia, y de ah el inters
general de las determinaciones enzimticas en suero.

Asimismo, la diferenciacin celular se manifiesta muchas veces en diferentes formas
moleculares de enzimas (isoenzimas, ver cap. 2) lo cual hace que muy a menudo no
valga la mera determinacin de actividad, sino que son necesarias pruebas ulteriores
para ver el patrn de isoenzimas. As, un aumento en la fosfatasa alcalina puede ser
debido, entre otras cosas, a una alteracin hepatobiliar o a una alteracin sea. La
discriminacin de estas actividades ha de hacerse por otros mtodos. En este caso, una
simple prueba de termolabilidad a 56 C puede discriminar la procedencia, ya que la
isoenzima sea es mucho ms termosensible que la heptica.





10.1.2 Alteraciones en la concentracin enzimtica en suero

Podemos considerar dos casos: aumentos de la actividad enzimtica y disminuciones
de la misma (mucho menos frecuentes).


10.1.2.1 Aumentos de la concentracin enzimtica

Las enzimas pueden estar aumentadas en el suero por alguna de las siguientes razones
(en orden de importancia):


(a) Incremento patolgico de la permeabilidad de membrana


Cuando existe un dao celular, una de las primeras consecuencias es la alteracin de la
permeabilidad de la membrana. sta, que en condiciones normales es impermeable,
ante una alteracin, y por diversas causas, puede ver aumentada su permeabilidad de
tal manera que componentes como las protenas pueden abandonar la clula. Tal es el
caso, por ejemplo, de la elevacin de la alanina aminotransferasa en las hepatitis
agudas. El incremento en permeabilidad es anterior a la muerte y destruccin celular
(necrosis). Por ello, un aumento en permeabilidad se traduce primeramente en la
aparicin de enzimas de procedencia citoslica en el suero, no apareciendo las
enzimas ligadas a fracciones celulares como mitocondrias, ncleos, etc.

(b) Muerte y destruccin celular

Si el dao celular es grande, la clula puede morir y todo su contenido pasa al medio
extracelular y de ah al plasma. En este caso, a diferencia del anterior, podemos
encontrar en el suero enzimas ligadas a fracciones particuladas (mitocondrias,
membranas, etc.) a veces ligadas a fracciones de muy alta masa molecular.

Tanto en el caso anterior como en ste, la magnitud del aumento refleja la extensin
del dao celular.

(c) Induccin enzimtica

Muchas enzimas del organismo son inducibles, esto es, su sntesis aumenta ante
determinados estmulos ambientales. Y por ello puede aumentar su concentracin en
el suero. Tal es el caso de las enzimas hepticas relacionadas con diversos mecanismos
de desto -glutamil transferasa es inducible por multitud de drogas
que han de ser metabolizadas por el hgado, como por ejemplo alcohol, antidepresivos
tricclicos, fenitona, etc.


(d) Proliferacin celular

En algunas circunstancias, tanto fisiolgicas como patolgicas, la proliferacin de un
tejido hace que determinadas enzimas especficas del mismo aumenten su
concentracin en suero. As en individuos jvenes en los que tiene lugar un proceso
activo de proliferacin sea (actividad osteoblstica) es habitual un valor elevado de
fosfatasa alcalina sea.

Igualmente, en proliferaciones patolgicas celulares (neoplasias) pueden aparecer
aumentos de la actividad de determinadas enzimas. Por ejemplo, la fosfatasa cida
prosttica ve aumentada su actividad en suero ante la presencia de un carcinoma
prosttico.


10.1.2.2 Disminuciones en la actividad enzimtica


Se ven con menor frecuencia que los aumentos. No obstante, en muchos casos tienen
inters diagnstico. Se citan a continuacin las principales causas de disminucin de la
actividad enzimtica.

(a) Intoxicaciones

La intoxicacin por organofosfricos (normalmente insecticidas utilizados en
Agricultura) produce una disminucin de la colinesterasa srica (tambin llamada
seudocolinesterasa). Al tener esta enzima un centro activo con la trada cataltica
serina-histidina-asprtico es sensible a los organofosfricos (ver cap. 6)

(b) Enfermedades crnicas

Muchas enfermedades crnicas cursan con una actividad celular disminuida, lo que se
refleja en un descenso en determinadas actividades enzimticas del suero. Tal es el
caso, por ejemplo, de las aminotransferasas en la cirrosis heptica. Estas
disminuciones tienen poco valor diagnstico.

(c) Alteraciones del estado nutritivo

En ocasiones, un descenso en el aporte diettico (ayuno, por ejemplo) o un
incremento en las necesidades nutritivas del organismo (crecimiento, embarazo, etc.),
causa la disminucin de algunas actividades enzimticas. A veces esto es debido a una
disminucin en la sntesis (por ejemplo, el descenso en -amilasa pancretica ante el
ayuno) y otras por carencia de coenzimas ante un aumento de necesidades (el caso de
la disminucin en las aminotransferasas en el embarazo por carencia de piridoxal).


10.1.3 Estudio de las principales enzimas con inters diagnstico


10.1.3.1 Aminotransferasas

Las aminotransferasas (antiguamente llamadas transaminasas) catalizan una reaccin
fcilmente reversible de interconversin entre cetocidos y aminocidos. Son enzimas
de una extraordinaria importancia metablica puesto que representan un punto
central del metabolismo de aminocidos y de ah su amplia distribucin en todos los
tejidos y clulas. Utilizan como coenzima el piridoxal fosfato.

Las aminotransferasas que habitualmente se determinan en suero son dos: la
aspartato aminotransferasa (AST, antiguamente conocida como GOT, o glutamato-
oxalacetato transaminasa) y la alanina aminotransferasa (ALT, conocida igualmente
como GPT o glutamato-piruvato transaminasa). Las reacciones respectivas son las
siguientes:


COO
-
C NH
3
+
H
CH
2
COOH
+
COO
-
C O
CH
2
CH
2
COO
-
COO
-
C
CH
2
COOH
O
COO
-
C
CH
2
CH
2
COO
-
H NH
3
+
+
COO
-
C NH
3
+
H
CH
3
+
COO
-
C O
CH
2
CH
2
COO
-
COO
-
C
CH
3
O
COO
-
C
CH
2
CH
2
COO
-
H NH
3
+
+
Aspartato o-Cetoglutarato Oxalacetato
Glutamato
Alanina o-Cetoglutarato Glutamato
Piruvato
AST
ALT


Las aminotransferasas son enzimas abundantes en todos los tejidos, pero lo son
particularmente en aqullos muy activos metablicamente, como el hgado y el
msculo. La AST est repartida indistintamente en los compartimentos citoslico y
mitocondrial; la ALT, por su parte, aparece casi exclusivamente en el citosol.

Los aumentos en actividad aminotransferasa del suero aparecen cuando hay
alteraciones del parnquima heptico o de las clulas miocrdicas. En este sentido,
suele haber un aumento de AST en el infarto de miocardio y en menor medida, en las
hepatitis. La ALT, por su parte, se considera casi especfica de la clula heptica. Por
ello es un excelente marcador de lesin hepatocelular y su nivel no slo tiene valor
diagnstico, sino tambin como ndice de seguimiento de la evolucin de la
enfermedad. No lo es tanto la AST en el infarto de miocardio, puesto que su elevacin
es bastante ms tarda que la de otras enzimas, en especial la creatin kinasa (CK).

Se han descrito (aunque con mucho menos inters diagnstico) disminuciones en la
actividad de las aminotransferasas. Al ser enzimas dependientes de piridoxal fosfato,
en casos de alteracin del estado nutritivo (embarazo, malnutricin, alcoholismo, etc.)
el nivel srico de estas enzimas puede caer debido a falta relativa del cofactor.


10.1.3.2 Creatinkinasa

La creatin kinasa (CK, tambin llamada creatin fosfokinasa o CPK) cataliza la
fosforilacin dependiente de ATP de la creatina para dar lugar a fosfocreatina, un
fosfgeno de alta energa utilizado como reservorio energtico sobre todo en el tejido
muscular. La reaccin catalizada es la siguiente:



HN C
N
CH
3
CH
2
COO
-
NH
2
ATP
ADP
HN C
N
CH
3
CH
2
COO
-
NH O P
O
O
-
O
-
Creatina Creatinfosfato
CK



Se trata de un dmero de dos polipptidos que pueden pertenecer a dos clases,
llamadas M y B (de muscle, msculo y brain, cerebro). As, las tres formas moleculares
(isoenzimas) de la creatin kinasa podrn ser MM, MB y BB. La forma BB predomina en
cerebro e hgado, y la forma MM en el msculo esqueltico. En el msculo miocrdico
existe la forma MM y la forma MB. Esta ltima es bastante caracterstica de este
tejido.

En los infartos agudos de miocardio, el contenido de las clulas musculares muertas
pasa a la sangre y en sta se puede detectar la presencia de una actividad creatin
kinasa muy aumentada de manera muy precoz (se hace patente entre 2 y 4 horas, y
alcanza un mximo a las 24 horas). Adems, la presencia de la isoenzima MB (entre un
6 y un 25 % de la actividad CK total) es fuertemente indicativa de lesin miocrdica, y
tiene asimismo valor pronstico (la evolucin del infarto es tanto ms grave cuanto
mayor sea la actividad ligada a la isoenzima MB).

La isoenzima MM aparece asimismo en enfermedades que cursan con afectacin de
las clulas musculares esquelticas (miopatas, traumatismos), pero tiene menor valor
diagnstico que la isoenzima MB en el infarto miocrdico agudo.


10.1.3.3 Fosfatasa alcalina


La fosfatasa alcalina, aunque descrita habitualmente como una fosfomonoesterasa de
baja especificidad, es en realidad una enzima que cataliza transfosforilaciones entre un
dador y un aceptor. Cataliza la siguiente reaccin:

O P
O
O
-
O
-
R
+ R' OH O P
O
O
-
O
-
R' OH R +


Cuando el aceptor es agua, la actividad evidenciada es una hidrlisis de un ster
fosfato. Esta enzima posee un ptimo de actividad a un pH alto (aproximadamente 10)
y de ah su nombre, a diferencia de la fosfatasa cida. Se trata de una enzima de muy
amplia distribucin en la naturaleza, aunque su funcin exacta no es del todo clara.

Existen en el organismo humano varias isoenzimas de la misma, conocidas por el
nombre de su rgano de procedencia: heptica, sea, renal, intestinal y placentaria.
Estas isoenzimas pueden diferenciarse por electroforesis, por su sensibilidad al calor o
por la inhibicin ejercida por la fenilalanina.

Desde el punto de vista diagnstico tienen especial importancia las isoenzimas
heptica y sea. La isoenzima heptica (mejor la llamaramos hepatobiliar) es una
enzima ligada a las membranas de las clulas del rbol biliar, de las que se desprende
caractersticamente en las colestasis u obstrucciones biliares. Por lo tanto, la fosfatasa
alcalina aparece aumentada en las ictericias obstructivas; y la elevacin de la misma en
otras enfermedades hepticas (como hepatitis) indica el grado de afectacin del rbol
biliar. La isoenzima hepatobiliar de la fosfatasa alcalina es ms termorresistente que la
isoenzima sea. El calentamiento a 56 C provoca la inactivacin de la isoenzima
heptica con un semiperodo de unos 8 minutos, mientras que la isoenzima sea tiene
un semiperodo de menos de dos minutos.

La isoenzima sea aparece aumentada (a) de forma fisiolgica en los individuos
jvenes, por una actividad osteoblstica aumentada; y (b) en enfermedades del hueso
que cursan con neoformacin sea: enfermedad de Paget, metstasis seas de
neoplasias, etc.



10.1.3.4 -Glutamil transferasa


La -glutamil transferasa (-GT, GGT, tambin llamada -glutamil transpeptidasa) es
una enzima que cataliza la transferencia de restos de glutamilo desde un dador
(normalmente glutatin reducido) a un aceptor (normalmente otro aminocido).

-Glu-Cys-Gly + aa -Glu-aa + Cys-Gly

Esta enzima tiene un importante papel en el transporte de aminocidos a travs de
membranas. Por ello, al igual que la fosfatasa alcalina hepatobiliar, aparece unida a
fracciones de membrana, y en especial a las del rbol biliar, por lo que se presenta
elevada, al igual que aqulla, en las colestasis, pero con la ventaja de ser bastante ms
especfica ya que no presenta isoenzimas.

La -glutamil transferasa es una enzima inducible, cuya sntesis se ve aumentada en
respuesta a xenobiticos (txicos externos) como el alcohol y otras drogas
(barbitricos, fenitona, antidepresivos tricclicos, clofibrato, gestgenos de sntesis,
etc.)



10.1.3.5 -Amilasa


La -amilasa es una glicosidasa que hidroliza enlaces -1,4 situados en el interior de
las cadenas polisacridas de almidn y glucgeno. Se trata de una enzima de gran
importancia digestiva, ya que el almidn es uno de los principales contingentes de la
dieta, tanto animal como humana. La -amilasa est presente en la saliva y en el jugo
pancretico, dando lugar a dos formas moleculares distintas, S (de saliva) y P (de
pncreas), distinguibles por electroforesis. En ambos casos, la -amilasa es una
protena de pequeo tamao, y por ello puede fcilmente pasar a la orina, donde es
posible detectar actividad amilsica (amilasuria) en enfermedades que cursan con
incremento srico de esta actividad.

De manera caracterstica, la -amilasa aumenta varios rdenes de magnitud en las
pancreatitis agudas, donde su presencia casi puede considerarse diagnstica de esta
afeccin. Asimismo, vemos aumentos de la amilasemia en la cetoacidosis diabtica, en
el alcoholismo y en la insuficiencia renal crnica.

Por el contrario, las afecciones crnicas del pncreas, como las pancreatitis crnicas y
la fibrosis qustica del pncreas cursan con disminuciones de la amilasemia.

Algunas afecciones de las glndulas salivares cursan con aumentos de la isoenzima S.



10.1.3.6 Fosfatasa cida


La fosfatasa cida es una fosfomonoesterasa que cataliza la hidrlisis de
fosfomonosteres de la misma manera que la fosfatasa alcalina; pero, a diferencia de
aqulla, su pH ptimo de actividad est del lado cido (pH 5-6). Esta enzima tiene una
amplia distribucin, ya que aparece tpicamente asociada a los lisosomas celulares. No
obstante, es muy abundante en hemates y sobre todo, en la prstata, rgano del que
esta enzima puede considerarse como marcador especfico, dada la existencia de una
isoenzima prosttica.

Por ello, la fosfatasa cida aparece aumentada en las afecciones prostticas
(prostatitis, adenomas y neoplasias malignas de prstata, etc.).




10.1.3.7 Lactato deshidrogenasa


La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima de muy amplia distribucin; por ello
sus elevaciones son poco especficas de rgano. Cataliza la siguiente reaccin:

COO
-
C O
CH
3
NAD
+
NADH + H
+
COO
-
C HO H
CH
3
Piruvato L-Lactato


Esta enzima presenta un interesante patrn isoenzimtico. La molcula consta de
cuatro polipptidos que pueden pertenecer a dos tipos, H (de Heart, corazn) y M (de
Muscle, msculo) dando lugar a cinco isoenzimas diferentes llamadas LDH-1 (H
4
, LDH-2
(H
3
M). LDH-3 (H
2
M
2
,) LDH-4 (HM
3
) y LDH-5 (M
4
), distribuidas de tal manera que la LDH-
1 predomina en el msculo cardiaco y la LDH-5 en el msculo esqueltico, teniendo los
dems rganos un patrn intermedio. Las isoenzimas pueden ser separadas muy
fcilmente por electroforesis.

La LDH-1 puede.utilizar como substrato el cido 2-hidroxibutrico adems del cido
lctico, por lo que esta isoenzima tambin recibe el nombre de hidroxibutirato
deshidrogenasa o HBDH.

Su valor diagnstico es relativo, y nicamente ayuda a corroborar los datos puestos de
manifiesto por otras enzimas ms especficas, como la CK.




10.2 Enzimas en Teraputica


La reposicin o incremento de una actividad metablica insuficiente puede ser, en
muchos casos correctora de una determinada patologa o al menos coadyuvante. Por
ello se ha intentado el empleo de enzimas en la teraputica prcticamente desde su
mismo descubrimiento. Sin embargo el progreso en este campo ha sido bastante lento
debido a las peculiares caractersticas de las molculas enzimticas. En primer lugar, la
enzima que se pretende inyectar puede muy bien ser una protena extraa al
organismo que la recibe, y por lo tanto, antignica; dado el origen bacteriano o fngico
de muchas de las enzimas que hemos visto en el presente captulo, y sobre todo al
producirse gran cantidad de enzimas por tecnologa de DNA recombinante, se puede
suscitar en el receptor una reaccin inmune que neutraliza la actividad de las mismas.
Adems, un problema central en la teraputica enzimtica es hacer llegar a la enzima
all donde se necesita, lo cual no siempre es posible. Otro inconveniente radica en la
insuficiente purificacin de algunas de las enzimas utilizadas. As, en el tratamiento de
la hemofilia por factor VIII "purificado" a partir de plasma humano, una trgica
consecuencia fue la infeccin por VIH (virus de inmunodeficiencia humana causante
del SIDA) de una gran nmero de hemoflicos. Por ltimo, las enzimas inyectadas a un

organismo pierden rpidamente actividad debido, entre otras cosas, a las actividades
proteolticas de enzimas endgenas; y en el caso de proteinasas, a las actividades
antienzimticas de muchas protenas, y muy abundantes, en el organismo (por
-antitripsina).

Por todo ello, la teraputica enzimtica ha avanzado ms lentamente que otras
aplicaciones tecnolgicas de las enzimas. Quiz una de las aplicaciones ms
interesantes estriba en las teraputicas sustitutivas, en las que se pretende suministrar
un enzima para paliar una actividad defectuosa o inexistente en el organismo. Pero
an as, el porvenir no parece estar en la administracin de enzimas, sino en la
reposicin de los genes encargados de sintetizarlas, por tcnicas de ingeniera gentica
que quedan fuera del contexto de este resumen.


10.2.1 Teraputicas sustitutivas


La reposicin de actividades enzimticas deficientes es el objetivo bsico de las
teraputicas sustitutivas. En ellas se debe hacer una distincin clara consistente en si
las enzimas se dirigen al espacio extracelular o bien han de ir al interior de las clulas.
En el primer caso, contamos con algunas enfermedades en las que se han obtenido
buenos resultados. En el segundo, los problemas mencionados en el prrafo anterior
se hacen particularmente agudos y el resultado de estas teraputicas no est tan claro,
sobre todo por la dificultad de dirigir especficamente las enzimas hacia las clulas
diana. En este apartado veremos fundamentalmente este segundo caso.

Se conocen muchas enfermedades causadas por la deficiencia en determinadas
actividades enzimticas, lo que da lugar a los llamados errores congnitos del
metabolismo. Existen bsicamente dos clases de errores metablicos: errores
anablicos, en los que falta una enzima imprescindible para la sntesis de un
determinado compuesto o proceso (hemofilia, albinismo, hipotiroidismos congnitos,
etc.) y catablicos, en los que la falta de una enzima perteneciente a una va
degradativa conduce a la acumulacin anmala de determinados compuestos que en
condiciones normales aparecen a concentraciones mucho menores. En uno y otro caso
se ha intentado la teraputica sustitutiva por enzimas.

La inyeccin sin ms de la enzima deficiente en el sistema vascular del sujeto no tiene
aplicacin ms que en muy contados casos (como la coagulacin de la sangre, v.ms
adelante), debido a los problemas inmunolgicos y proteolticos que vimos ms arriba.
En la mayora de los errores congnitos de metabolismo interesa llevar la enzima
deficiente a clulas muy especficas del organismo de tal manera que se sean
"invisibles" para el sistema inmunolgico o las proteinasas. De forma experimental se
han ensayado los siguientes sistemas:

1. Liposomas. Son vesculas mono- o multilamelares de fosfolpidos, de manera que
cada vescula est formada por una estructura en bicapa y que pueden estar

contenidas unas en otras de manera concntrica.

Los liposomas pueden formarse en presencia de la enzima que queremos dirigir hada
las clulas afectadas. Una vez inyectados en el organismo, la bicapa del liposoma se
funde con la de la clula, liberando al interior de sta el contenido del mismo. El
problema principal en el empleo de liposomas estriba en alcanzar las clulas
especficas a las que va dirigida la enzima. Una lnea muy prometedora en este sentido
radica en el estudio de los marcadores de superficie, oligosacridos complejos
presentes como glicolpidos o glicoprotenas en la superfde celular y que en muchos
casos son especificos de la clula objetivo. Intercalando en los liposomas ligandos
complementarios de estos oligosacridos (anticuerpos, lectinas, etc.) se puede
conseguir la interaccin especfica de aqullos con las clulas diana.

2. Hemates. Mediante maniobras osmticas, podemos hacer que la membrana de los
hemates se rompa y libere al medio todo el contenido celular. Aislando las clulas
vaciadas (que reciben el nombre de ghosts, espectros) pueden volver a "sellarse" en
una solucin que contenga la enzima que se pretende dirigir a una clula determinada.
La fusin de la membrana del hemate con estas clulas liberar su contenido al
interior. Como es obvio, en este caso pueden utilizarse tambin marcadores de
superficie como en el caso de los liposomas.

3. Enzimas inmovilizadas. En cepas de ratn acatalasmicas (que carecen de actividad
catalasa y no destoxifican el H
2
O
2
) se ha intentado con cierto xito la inyeccin en la
cavidad peritoneal de microcpsulas conteniendo catalasa.


En cualquier caso, los avances en la manipulacin gentica permiten prever un gran
progreso en el tratamiento de estas enfermedades a travs de la reposicin del gen, y
no de la enzima, como ya sealbamos antes.

Cuando la reposicin ha de hacerse en un medio extracelular (como la luz del tubos
digestivo, por ejemplo), muchos de los problemas asociados a la teraputica sustitutiva
desaparecen. Por ejemplo, en la insuficiencia pancretica se han empleado preparados
de enzimas digestivas en cpsulas entricas, particularmente amilasa, lipasa, tripsina y
quimotripsina. En estos casos se han empleado asimismo enzimas de procedencia
vegetal o fngica: papana, bromelana y extractos de Aspergillus oryzae (Taka-
diastasa). Todas estas preparaciones estn indicadas en la insuficiencia pancretica
completa, y no en trastornos digestivos menores.



10.2.2 Enzimas en Ciruga


Se han empleado enzimas proteolticas (plasmina bovina, tripsina y colagenasa) para el
desbridamiento de heridas, combinadas con antibiticos, en preparados de uso tpico.

Son particularmente tiles en la eliminacin del tejido necrtico en quemaduras,
asiento muy frecuente de infecciones.






10.2.3 Trastornos de la circulacin

El preparado Ancrod
R
, es una preparacin proteoltica obtenida de veneno de
serpiente. Su accin consiste en romper la molcula de fibringeno, pero de forma
diferente a como lo hace la trombina, con lo cual no queda en condiciones de
polimerizacin. Con ello mejora la reologa de la sangre. Como es obvio, sus efectos
secundarios (hemorragias) pueden llegar a ser graves.

En las enfermedades de las arterias perifricas se emplea kalicrena.


10.2.4 Trastornos de la coagulacin sangunea

La plasmina es una enzima que degrada proteolticamente la fibrina, en un proceso
fisiolgico conocido como fibrinolisis o trombolisis. Se produce por activacin de un
zimgeno, el plasmingeno. Este sistema se utiliza en aquellos trastornos producidos
por una coagulacin intravascular, extraordinariamente frecuentes en Patologa
humana (infarto de miocardio, accidentes cerebrovasculares). Para la trombolisis se
emplean generalmente activadores del plasmingeno. Se trata de enzimas naturales
con actividad serinproteinasa. Los ms utilizados actualmente son la estreptokinasa, la
urokinasa y el activador tisular del plasmingeno (PTA) obtenido por ingeniera
gentica.

La estreptokinasa es un activador del plasmingeno obtenido a partir de estreptococos
-hemolticos. Activa el plasmingeno formando un complejo 1:1 que genera plasmina
a partir del plasmingeno residual. El principal inconveniente que plantea es que se
trata de un potente antgeno que genera anticuerpos muy rpidamente y su empleo
requiere por lo general pretratamiento con corticoides. Es efectivo en infartos de
miocardio antes de las tres primeras horas.

La urokinasa es un activador de plasmingeno obtenido a partir de orina humana o de
cultivos celulares. No presenta, como es obvio, los problemas antignicos de la
estreptokinasa. Hoy da se obtiene tambin mediante ingeniera gentica por clulas
de Escherichia coli recombinantes.

En ocasiones la teraputica ha de ir dirigida en sentido contrario, es decir, a promover
la coagulacin de la sangre en tratamientos antihemorrgicos o en la teraputica de
enfermedades genticas de la coagulacin como la hemofilia. Para ello se utilizan

trombina y otros factores de la coagulacin producidos hoy da casi exclusivamente
por ingeniera gentica.



10.2.5 Enzimas en teraputica antineoplsica


En la quimioterapia de la leucemia lnfoctica se emplea L-asparraginasa. Esta
aplicacin se fundamenta en el hecho de que la L-asparragina es un aminoddo
esencial para clulas tumorales de esta estirpe.


10.2.6 Otros usos teraputicos de enzimas

Hoy da se est intentado el tratamiento incruento de la hernia discal mediante la
digestin por quimopapana en inyeccin directa al ncleo pulposo de los discos
intervertebrales.

Tambin se ha utilizado experimentalmente a la superxido dismutasa como
antiinflamatorio.