SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MVIL:

Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para

desgasificar y eliminar partculas en suspensin de los disolventes que
interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin.



SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MVIL:
Se usan bombas para impulsar a la fase mvil y deben cumplir los siguientes
requisitos:
Deben vencer altas presiones.
Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.
Deben estar libres de pulsaciones y tener volmenes muertos pequeos.
Deben estar construidas de materiales resistentes a la presin y a las
agresiones qumicas.
Fcil manejo y mantenimiento.
Se utilizan tres tipos de bombas :
Bombas recprocas
Bombas de desplazamiento
Bombas neumticas.
INYECTORES:
Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de
forma reproducible y adecuada.
Hay dos tipos de inyectores
Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite
mucha presin.
Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en el
equipo cromatogrfico y existen bucles intercambiables que permiten la
eleccin de tamaos de muestra.
PRECOLUMNAS
Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensin y los
contaminantes de los disolventes. La composicin del relleno debe ser
semejante al de la columna. Aunque el tamao de partcula es mayor para
minimizar la cada de presin. En muchas ocasiones se usan para aumentar la
vida de la columna.
COLUMNA:
Normalmente son de acero inoxidable de dimetro interno uniforme aunque en
ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.
La mayora de las columnas de cromatografa de lquidos tienen una longitud
entre 10 y 30 cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es
necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas
es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms
comunes son 3, 5 y 10 m.
Los empaquetados ms comunes son de partculas de slice pero tambin se
usa la almina, polmeros porosos y resinas de intercambio inico.
La columna ms utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro
interno, empaquetada con partculas de 5 m. Estas
columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro.
Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin
ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente
descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1
y 4,6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m.A
menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Pueden tener hasta 100.000 platos/metro
y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente
caracterstica muy importante ya que los disolventes de alta pureza que se
requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.













DETECTORES:
A diferencia de la cromatografa de gases, en HPLC no existen detectores tan universalmente
aplicables, ni tan fiables tampoco. En lo que si coinciden cromatografa de gases y HPLC, son las
cualidades enumeradas en los detectores de cromatografa de gases.
En HPLC existen dos tipos bsicos de detectores:
Los basados en una propiedad de la disolucin: Que corresponden a una propiedad de la
fase mvil, como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, la densidad...
Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades
del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusin, que no son propias
de la fase mvil.
En la siguiente tabla se presentan los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas
de sus propiedades ms importantes:

Fig.5: Detectores ms comnmente usados en HPLC.
Paso a hacer una breve descripcin de algunos de ellos:
Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna
cromatogrfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los
haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para
comparar las intensidades de los dos haces se usan detectores fotoelctricos contrastados. En
cualquier caso, el cromatograma consiste en una representacin en funcin del tiempo del
logaritmo del cociente de las dos seales transducidas. Tambin se utilizan instrumentos de un
solo haz, en cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria
de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia.
Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector
fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms
sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la
radiacin fluorescente.
Detectores de ndice de refraccin: Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja
de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los
detectores de llama en cromatografa de gases. Se aade que son fiables, no dependen del
caudal, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una
temperatura constante. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros
detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elucin con gradiente.
Detector de dispersin de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se
convierte en una fina niebla gracias a un flujo de nitrgeno o aire. Estas finas gotitas pasan por
un tubo de conduccin a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase mvil y
se originan partculas de analito. Estas partculas pasan a travs de un lser y por un fotodiodo
de silicio se detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja
es que resulta ser ms sensible que el detector de ndice de refraccin.
Detectores Electroqumicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroqumicos,
que se basan en cuatro mtodos: amperometra, voltamperometra, coulombimetra,
conductimetra.
Detectores por espectrometra de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografa
de lquidos con la espectrometra de masas. De forma general se pueden obtener tanto
cromatogramas a tiempo real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los
picos eluidos.




4.1 Bomba
En la primera etapa del desarrollo del HPLC, la bomba fue la parte ms importante del sistema. El
desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo del sistema de bombeo. La bomba se
colocaba en lo ms alto del sistema CL y generaba un flujo del reservorio del disolvente al sistema. En
esta etapa el requisito ms importante del sistema era poder generar una alta presin. Sin embargo, hoy
en da, la generacin de alta presin es normal y lo que ms preocupa ms hoy en da es proporcionar
una presin constante en cualquier condicin, para proporcionar un caudal controlable y reproducible
dado que el cambio en la proporcin del flujo puede influir el anlisis en gran medida.
La mayora de las bombas utilizadas en los sistemas LC actuales generan el flujo con un movimiento de
vaivn de un pistn de motor (bombas de pistn). Debido a este movimiento del pistn, se produce
"pulsos". Ha habido grandes mejoras del sistema para reducir esta pulsacin y las bombas recientes
crean un pulso muy inferior a las antiguas bombas. Sin embargo, los anlisis actuales requieren una
sensibilidad muy alta para cuantificar una pequea cantidad de analitos, e incluso un pequeo cambio en
la velocidad del flujo puede influir en el anlisis. Por lo tanto, las bombas necesarias para el anlisis de
alta sensibilidad tienen que ser muy precisas.
4.2 Inyector
Un inyector se coloca al lado de la bomba. El mtodo ms simple es utilizar una jeringa, y la muestra se
introduce en el flujo de eluyente. Ya que la precisin de la medicin por CL tiene mucho que ver con la
reproducibilidad de la inyeccin de la muestra, el diseo de los inyectores es un factor importante. El
mtodo de inyeccin ms utilizado se basa en lazos de muestreo. El uso de muestreador automtico
(auto-inyector) del sistema tambin es ampliamente utilizado ya que permite una serie de inyecciones
repetitivas en un tiempo programado.
4.3 Columna
La separacin se lleva a cabo dentro de la columna, por lo tanto, se puede decir que la columna es el
corazn de un sistema de CL. La teora de la cromatografa en columna no ha cambiado desde la poca
de Tswett, sin embargo ha habido una continua mejora en el desarrollo de la columna. Las columnas
recientes suelen estar preparados en una carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio
utilizadas en el experimento de Tswett. En general, el material de relleno que se utiliza es de gel de slice
o de polmeros en comparacin con el carbonato de calcio utilizado por Tswett.
El eluyente utilizado para la CL vara de cido a solventes bsicos. La mayora de la cubierta de la
columna es de acero inoxidable y es tolerante a una gran variedad de disolventes. Sin embargo, para el
anlisis de algunos analitos como las biomolculas y los compuestos inicos, el contacto con el metal no
es deseable, por lo tanto columnas con cubierta de politer ter cetona (PEEK) se utiliza en su lugar.
4.4 Detector
La separacin de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que un detector se utiliza para
observar la separacin obtenida. La composicin del eluyente es consistente cuando no hay analito est
presente, en cambio la presencia del analito cambia la composicin del eluyente. Lo que el detector hace
es medir estas diferencias. Esta diferencia se observa como una forma de seal electrnica. Hay
diferentes tipos de detectores disponibles. Diferentes tipos detector y se explican en la leccin 6.
4.5 Registracin de Datos
El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de seal electrnica, y as no es visibles a
nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma- papel-registrador grfico se utilizaba muy popularmente. Hoy
en da, una computadora con un posesor de base de datos (integrador) es ms comn. Hay varios tipos
de procesadores de datos, e incluye un sistema simple que consiste en construir la impresora y el
procesador de textos, y un tipo de computadora personal que consta de monitor, teclado e impresora.
Tambin hay programas que estn diseados especficamente para el sistema LC. Ofrece no slo la
adquisicin de datos, pero tambin caterticas como mximo de ajuste, la correccin de lnea base, el
clculo automtico de la concentracin, la determinacin del peso molecular, etc.
Los componentes introducidos hasta el momento son los fundamentos del sistema LC. A continuacin se
presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema bsico de LC.
4.6 Desgasificador
El eluyente utilizado para anlisis con LC puede contener gases como oxgeno que son no visibles a
nuestros ojos. Cuando el gas est presente en eluyente, este se detecta como un ruido y causas una
lnea base inestable. Generalmente los mtodos que se utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas
inerte), uso de bomba de vacio, sistema destilacin, y / o calentamiento y agitacin. Sin embargo, estos
mtodos no son convenientes cuando el disolvente se deja por un perodo de tiempo determinado (por
ejemplo, durante un anlisis largo). El desgasificador usa unos tubos de membrana de polmero especial
para eliminar los gases. Los numerosos pequeos poros en la superficie del tubo de polmero permite que
el aire pase a travs mientras que previene cualquier otro lquido pasar a travs del poro. Mediante la
colocacin de esta tubera bajo el contenedor de baja presin, crea las diferencias de presin dentro y
fuera de la tubera (mayor en el interior del tubo). Esta diferencia hace que el gas disuelto se mueva a
travs de los poros y eliminar el gas. En comparacin con el tipo clsico de desgasificacin por lotes, el
desgasificador se puede utilizar on-line, es ms conveniente y eficiente. Muchos de los nuevos sistemas
HPLC contienen un desgasificador.
4.7 Horno de columna
La separacin con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la columna. Con el fin de
obtener resultados repetibles, es importante mantener una temperatura constante. Tambin para algunos
anlisis, como el azcar y los cidos orgnicos, se puede obtener mejor resolucin a temperatura elevada
(50 ~ 80 C). Tambin es importante mantener una temperatura estable para obtener resultados
repetibles, incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. Hay posibilidades de que los
diferentes cambios de temperatura haga que los resultados de la separacin sean diferentes.
Generalmente las columnas se mantienen dentro del horno de columna (calentador columna)


Filtracin.
Las partculas mayores de 0,4 0,5 m pueden causar problemas de aumento de presin por
acumulacin en filtros, columna y otros pasos estrechos.
Existe el peligro de error de apreciacin por la utilizacin de volmenes muy pequeos (de 1 a
5 L) en los que se observan estas partculas con dificultad y puede pensarse que el problema
no es de importancia, pero son muchas las inyecciones que se realizan y el fenmeno es
acumulativo.
Por otra parte, los slidos que se introducen como tales no se detectan ni cuantifican y son
impurezas presentes en futuros anlisis ya que, retenidos en algn filtro, puedensolubilizarseal
cambiar la naturaleza de la fase mvil y ponerse en movimiento.