ABSTRACT

Recalcitrant seeds show wide variation in water content at shedding and post-harvest
physiology, particularly response to desiccation. But all are metabolically active and show
germination-associated changes in storage - it is these properties that underlie the phenomenon
of recalcitrance. Three types of damage on drying are envisaged: mechanical damage associated
with reduction of cellular volume; aqueous-based oxidative degradation, consequent upon
unregulated metabolism, which occurs at intermediate water contents; and biophysical damage to
macromolecular structures that occurs on removal of water at low water contents.
The first type of damage probably occurs only in seeds with highly vacuolated cells, such
as Avicennia marina, and so is probably not common. Under normal slow-drying conditions it is
the second type of damage that kills recalcitrant seeds, thus the response to dehydration depends
upon the metabolic activity of the seed and the rate of drying. This makes it difficult to measure
desiccation tolerance - there is no such thing as a critical water content that is characteristic of
a species (except the absolute minimum water content that can be tolerated on the most rapid
drying possible).
Probably it is the third type of damage that kills tissues that have been dried very rapidly.
Desiccation sensitivity is probably the ancestral state, with tolerance having evolved
independently a number of times, and recalcitrance does place constraints on the regeneration
niches open to species producing such seeds.












INTRODUCTION
PENDAHULUAN
Orthodox seeds are seeds that acquire desiccation tolerance during development, can dry
to low water contents (generally less than 5%), and retain viability in the dry state for predictable
periods. Recalcitrant seeds, on the other hand, are shed at high water contents, ranging from 0.4
to 4.0 g water per g dry matter (g/g), are sensitive to desiccation, and are also metabolically
active on shedding.
(Benih ortodok merupakan benih yang memiliki daya tahan terhadap desikasi,
kadar air pada benih jenis ini dapat diturunkan hingga <5% tanpa menurunkan
viabilitasnya, sedangkan benih rekalsitran merupakan jenis benih yang saat matang
fisiologis memiliki kadar air yang relatif tinggi yaitu berkisar antara 0.4 4.0 gram/bahan
kering (g/g) serta peka terhadap desikasi.)
A characteristic of recalcitrant seeds is the variability they show among species and
within a species. They vary in the water content at shedding, the extent of dehydration they
tolerate, their response to drying rate, storage life span in the hydrated state (from a week or two,
to two or three years), and their response to low temperatures (for some examples see King and
Roberts, 1980; Farrant et al., 1985, 1986, 1989; Hong and Ellis, 1990; Pritchard, 1991; Berjak
et al., 1992, 1993; Finch-Savage, 1992; Tompsett, 1992; Xia et al., 1992; Tompsett and
Pritchard, 1993, 1998).
(Karakteristik benih rekalsitran berbeda-beda tergantung dari spesiesnya,
perbedaan tersebut biasanya terdapat pada kadar air saat matang fisiologis, daya tahan
terhadap kehilangan air, respon terhadap pengeringan, umur simpan benih saat terjadi
pengurangan kadar air serta respon terhadap suhu rendah.)
This means that it is not simply a case of classifying a seed as orthodox or recalcitrant,
but within the recalcitrant group there is a wide spectrum of behaviours, from minimally
recalcitrant seeds with a relatively long lifespan and quite tolerant of desiccation, to maximally
recalcitrant, with short lifespans and very sensitive to desiccation (Farrant et al., 1988).
(Berdasarkan perilakunya, benih rekalsitran dapat dibagi menjadi 2 kelompok
yaitu minimally recalcitrant seed dengan umur simpan yang relatif panjang dan cukup
toleran terhadap pengeringan serta maximally recalcitrant seed dengan umur simpan yang
relatif singkat dan peka terhadap pengeringan.)



PROPERTIES OF WATER IN SEEDS
SIFAT AIR DALAM BENIH
Before considering the response of recalcitrant seeds to the loss of water, we should
consider the properties of water in seed tissue (see Vertucci, 1990; Vertucci and Farrant, 1995;
Walters, this volume). Based on calorimetric properties, Vertucci (1990) has identified five types
of water or levels of hydration in seed tissues. The different hydration levels correspond roughly
to the water contents shown in Table 1, and the water potentials at the boundaries are also
indicated. At the different hydration levels the tissue water has different physical properties. At
high water contents and high water potential the water has the properties of water in dilute
solution.
(.......................)

Sebelum mempertimbangkan respon benih bandel hilangnya air, kita harus mempertimbangkan sifat air
dalam jaringan benih (lihat Vertucci, 1990; Vertucci dan Farrant, 1995; Walters, buku ini). Berdasarkan
sifat kalorimetrik, Vertucci (1990) telah mengidentifikasi lima jenis air atau tingkat hidrasi dalam jaringan
benih. Tingkat hidrasi yang berbeda sesuai kira-kira dengan kadar air ditunjukkan pada Tabel 1, dan
potensi air pada batas juga ditunjukkan. Pada tingkat hidrasi yang berbeda air jaringan memiliki sifat fisik
yang berbeda. Pada kadar air yang tinggi dan potensi air yang tinggi air memiliki sifat-sifat air dalam
larutan encer.

As the water content is decreased the water takes on the properties of water in
concentrated solution, where the interaction between water and solutes becomes stronger, and
the system deviates from "ideal" behaviour. On the removal of more water, the solution becomes
so concentrated that it becomes viscous and has the properties of a glass. Finally, at very low
water contents, those characteristic of orthodox seeds, all the remaining water is tightly
associated with macromolecular surfaces; its mobility is reduced and it constitutes the so-called
'bound' water. At the different hydration levels, because the thermodynamic properties of
water change, different metabolic processes can take place (Vertucci and Leopold, 1986;
Vertucci, 1989; Vertucci and Farrant, 1995).
(......................................)

Sebagai kadar air menurun air mengambil sifat-sifat air dalam larutan terkonsentrasi, di mana interaksi
antara air dan zat terlarut menjadi lebih kuat, dan sistem menyimpang dari "ideal" perilaku. Pada
penghapusan lebih banyak air, solusinya menjadi begitu terkonsentrasi sehingga menjadi kental dan
memiliki sifat gelas. Akhirnya, pada kadar air sangat rendah, karakteristik mereka benih ortodoks, semua
air yang tersisa erat terkait dengan permukaan makromolekul; mobilitas berkurang dan hal itu
merupakan apa yang disebut 'terikat' air. Pada tingkat hidrasi yang berbeda, karena sifat termodinamika
perubahan air, proses metabolisme yang berbeda dapat terjadi (Vertucci dan Leopold, 1986; Vertucci,
1989; Vertucci dan Farrant, 1995).

At the high water contents, full normal metabolism occurs and seeds can germinate. In
hydration level IV, protein and nucleic acid synthesis, together with respiration, is possible, but
there is inadequate water for cell growth and germination. At lower water contents protein and
nucleic acid synthesis are not possible, but some respiration can be detected. At even lower water
contents only low level catabolic events occur slowly.
(Pada kadar air yang tinggi, proses metabolisme berjalan secara normal sehingga
benih dapat berkecambah, selain itu terjadi sintesis protein dan asam nukleat yang
menyebabkan proses respirasi. Pada kadar air yang rendah tidak terjadi sintesis protein
dan asam nukleat, selain itu proses katabolik berjalan secara lambat.)














DEVELOPMENT IN ORTHODOX AND RECALCITRANT SEEDS
PERKEMBANGAN BENIH ORTODOX DAN REKALSITRAN
Before considering the response of recalcitrant seeds to water loss, it would be useful to
consider the processes occurring when orthodox seeds undergo maturation drying. As the seeds
dry, insoluble reserves accumulate, the volume of water-filled vacuoles is reduced, and
protective molecules are synthesized. These modifications are followed, or accompanied, by the
de-differentiation of highly structured organelles, particularly mitochondria, and a general
'switching-off' of metabolism, until finally the protective mechanisms such as vitrification and
the deployment of Late Embryogenic Abundant (LEA) proteins become operative. Throughout
the drying process, presumably, anti-oxidant mechanisms are operative. There are limited data
from orthodox seeds, but certainly anti-oxidant activity is important during drying of
desiccation-tolerant resurrection" plants (reviewed by Oliver and Bewley, 1997).
(......................)

Sebelum mempertimbangkan respon benih bandel kehilangan air, akan sangat berguna untuk
mempertimbangkan proses yang terjadi ketika benih ortodoks menjalani pematangan pengeringan.
Sebagai biji kering, cadangan larut menumpuk, volume vakuola berisi air berkurang, dan molekul
pelindung disintesis. Modifikasi ini diikuti, atau disertai, dengan de-diferensiasi organel sangat
terstruktur, terutama mitokondria, dan seorang jenderal 'switching-off' metabolisme, sampai akhirnya
mekanisme pelindung seperti vitrifikasi dan penyebaran Akhir embriogenik Berlimpah (LEA) protein
menjadi operasi. Selama proses pengeringan, mungkin, mekanisme anti-oksidan yang operatif. Ada data
terbatas dari biji ortodoks, tapi pasti aktivitas anti-oksidan penting selama pengeringan kebangkitan
"tanaman toleran kekeringan (terakhir oleh Oliver dan Bewley, 1997).









To summarise, during the later stages of development of orthodox seeds the processes of
reserve accumulation, reduction of vacuolar volume, de-differentiation and shut-down of
metabolism accompany the acquisition of desiccation tolerance. The question then is whether
these processes are necessary for the acquisition of tolerance, and whether and to what extent
they occur in recalcitrant seeds. To answer this question we studied the development of three
very different seed types: Avicennia marina, which is a mangrove, a tropical wetland species
which produces highly recalcitrant seeds; Aesculus hippocastanum, a temperate terrestrial
species producing recalcitrant seeds; and Phaseolus vulgaris, an agricultural species that
produces orthodox seeds (Farrant et al., 1997). We studied these seeds at three developmental
stages: immediately post histodifferentiation (stage 1), in the middle of the reserve accumulation
phase (stage 2), and at the end of reserve accumulation (stage 3; P . vulgaris seeds were still at a
high water content at this stage; it was before maturation drying).
(...............................)

Untuk meringkas, selama tahap akhir perkembangan benih ortodoks proses akumulasi cadangan,
pengurangan volume vacuolar, de-diferensiasi dan menutup-down metabolisme menemani akuisisi
toleransi kekeringan. Pertanyaannya kemudian adalah apakah proses ini diperlukan untuk akuisisi
toleransi, dan apakah dan sejauh mana mereka terjadi pada biji bandel. Untuk menjawab pertanyaan ini
kita mempelajari pengembangan tiga jenis benih yang sangat berbeda: Avicennia marina, yang
merupakan pohon bakau, spesies lahan basah tropis yang menghasilkan benih yang sangat bandel;
Aesculus hippocastanum, spesies darat beriklim memproduksi benih bandel; dan Phaseolus vulgaris,
spesies pertanian yang menghasilkan benih ortodoks (Farrant et al., 1997). Kami mempelajari benih
tersebut pada tiga tahap perkembangan: segera posting histodifferentiation (tahap 1), di tengah fase
akumulasi cadangan (tahap 2), dan pada akhir akumulasi cadangan (stadium 3; P biji vulgaris yang masih
tinggi. kadar air pada tahap ini, itu sebelum pematangan pengeringan).








Table 2 shows the desiccation sensitivity of seeds of the three species at the three
developmental stages (measured as the water content at which the viability of rapidly dried
excised axes was lost). Avicennia marina is very sensitive and tolerance did not change from
stage 2 to stage 3. Aesculus hippocastanum showed an increase in tolerance with development,
but at shedding was still sensitive. Phaseolus vulgaris increased in tolerance with development,
and during maturation drying became even more tolerant, achieving water contents of less than
0.08 g/g without viability loss. Thus there is a sequence of sensitivities: Avicennia > Aesculus >
Phaseolus. Figure 1a shows the contribution of vacuoles to cell volume for the three stages
averaged over the cotyledon, hypocotyl and root meristem. We see quite clearly that Avicennia
marina, the most sensitive species, was highly vacuolated, and this did not change with
development, while the more tolerant species showed a decline in vacuolation with development.
(.............................)

Tabel 2 menunjukkan sensitivitas pengeringan benih dari tiga spesies di tiga tahap perkembangan
(diukur sebagai kadar air di mana kelangsungan hidup dikeringkan dengan cepat sumbu dipotong
hilang). Avicennia marina sangat sensitif dan toleransi tidak berubah dari stadium 2 sampai stadium 3
Aesculus hippocastanum menunjukkan peningkatan toleransi dengan perkembangan, tetapi pada
shedding masih sensitif. Phaseolus vulgaris meningkat toleransi dengan pembangunan, dan selama
pematangan pengeringan menjadi lebih toleran, mencapai kadar air kurang dari 0.08 g / g tanpa
kehilangan viabilitas. Jadi ada urutan sensitivitas: Avicennia> Aesculus> Phaseolus. Gambar 1a
menunjukkan kontribusi vakuola volume sel untuk tiga tahap rata-rata selama kotiledon, hipokotil dan
akar meristem. Kita melihat dengan jelas bahwa Avicennia marina, spesies yang paling sensitif, itu
sangat vakuolisasi terutama, dan ini tidak berubah dengan pembangunan, sedangkan spesies yang lebih
toleran menunjukkan penurunan vacuolation dengan pembangunan.

The inverse pattern is seen with insoluble reserves (Figure 1b): Avicennia marina, the
most sensitive species, stores its reserves as soluble sugars, while the more tolerant species
accumulated insoluble reserves during development. The metabolic activity of the seeds is also
pertinent. In the orthodox Phaseolus vulgaris there was a decline in the contribution of
mitochondria to cell volume with development, and by the end of reserve accumulation,
mitochondria were virtually absent (Figure 1c). Although there was a decline in seeds of
Aesculus hippocastanum, by the time the seeds were shed mitochondria still contributed
significantly to cell volume. However, it is not only the quantitative contribution of mitochondria
that is important to metabolic activity, it is also the qualitative degree of differentiation.
(.............................)

Pola terbalik terlihat dengan cadangan larut (Gambar 1b): Avicennia marina, spesies yang paling sensitif,
menyimpan cadangan gula sebagai larut, sedangkan spesies yang lebih toleran akumulasi cadangan larut
selama pengembangan. Aktivitas metabolik dari benih ini juga berhubungan. Dalam Phaseolus vulgaris
ortodoks ada penurunan kontribusi mitokondria volume sel dengan perkembangan, dan pada akhir
akumulasi cadangan, mitokondria yang hampir tidak ada (Gambar 1c). Meskipun ada penurunan biji
Aesculus hippocastanum, pada saat benih gudang mitokondria masih memberikan kontribusi signifikan
terhadap volume sel. Namun, tidak hanya kontribusi kuantitatif mitokondria yang penting bagi aktivitas
metabolik, juga tingkat kualitatif diferensiasi.

Transmission electron microscopy showed that the mitochondria of the root meristem
cells of Aesculus hippocastanum were highly differentiated and had the appearance of active
mitochondria, while those in Phaseolus were de-differentiated and appeared inactive (see
Berjak and Pammenter, this volume). Measured respiration rates support the ultrastructural
observations, remaining high in the recalcitrant seeds Avicennia marina and Aesculus
hippocastanum throughout development, while the respiration rates of the orthodox seeds of
Phaseolus vulgaris were low, even though the seeds had not gone through maturation drying
and were still hydrated (Table 3).
(...................................)

Mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa mitokondria dari sel-sel akar meristem dari Aesculus
hippocastanum yang sangat berbeda dan memiliki penampilan mitokondria aktif, sedangkan di
Phaseolus itu de-dibedakan dan muncul tidak aktif (lihat Berjak dan Pammenter, buku ini). Tingkat
pernapasan diukur mendukung pengamatan ultrastruktur, tetap tinggi dalam biji bandel Avicennia
marina dan Aesculus hippocastanum seluruh pembangunan, sedangkan tingkat respirasi benih ortodoks
Phaseolus vulgaris yang rendah, meskipun benih tidak melewati pematangan pengeringan dan masih
terhidrasi (Tabel 3).






Thus, the most desiccation sensitive species is the one that remained highly vacuolated,
supporting the concept that drying of highly vacuolated material leads to mechanical damage.
Also, reduction in metabolic rate and de-differentiation appear to be prerequisites for survival of
dehydration. A characteristic of all recalcitrant seeds we have studied is that they are
metabolically active; they show high rates of respiration relative to orthodox seeds, and have
ultrastructure that is characteristic of metabolically active tissue.
(..............................)

Dengan demikian, sebagian besar spesies sensitif pengeringan adalah salah satu yang tetap sangat
vakuolisasi terutama, mendukung konsep bahwa pengeringan bahan yang sangat vakuolisasi terutama
menyebabkan kerusakan mekanis. Juga, penurunan tingkat metabolisme dan de-diferensiasi tampaknya
prasyarat untuk kelangsungan hidup dehidrasi. Sebuah karakteristik dari semua benih bandel yang telah
kita pelajari adalah bahwa mereka aktif secara metabolik; mereka menunjukkan tingginya tingkat
respirasi relatif terhadap benih ortodoks, dan memiliki ultrastruktur yang merupakan karakteristik dari
jaringan aktif secara metabolik.

In summary, orthodox seeds show a fixed developmental pattern in that, after reserve
accumulation, they acquire desiccation tolerance and undergo maturation drying. During the
development of most recalcitrant seeds there is some decline in water content (but mostly
because dry matter accumulates faster than water, rather than water loss) and some increase in
desiccation tolerance. It has been suggested that recalcitrant seeds show an indeterminate
developmental pattern in that development is truncated and the seeds are shed before desiccation
tolerance is fully acquired (e.g. Finch-Savage and Blake, 1994). Certainly, the lethal water
content that one measures depends upon the developmental status of the seed. Post-shedding
development also has an effect on desiccation sensitivity. The longer seeds are stored, the more
sensitive they become (Farrant et al., 1986; Berjak et al., 1992, 1993).
(...............................)

Singkatnya, benih ortodoks menunjukkan pola perkembangan tetap dalam hal itu, setelah akumulasi
cadangan, mereka memperoleh toleransi pengeringan dan menjalani pematangan pengeringan. Selama
pengembangan sebagian benih bandel ada beberapa penurunan kadar air (tetapi sebagian besar karena
bahan kering terakumulasi lebih cepat daripada air, daripada kehilangan air) dan beberapa peningkatan
toleransi kekeringan. Ia telah mengemukakan bahwa benih bandel menunjukkan pola perkembangan
tak tentu dalam pembangunan yang terpotong dan benih adalah gudang sebelum toleransi pengeringan
sepenuhnya diperoleh (misalnya Finch-Savage dan Blake, 1994). Tentu saja, kadar air mematikan yang
satu tindakan tergantung pada status perkembangan benih. Post-shedding pembangunan juga memiliki
efek pada sensitivitas pengeringan. Benih lama disimpan, semakin sensitif mereka menjadi (Farrant et al,
1986;.. Berjak et al, 1992, 1993).

We attribute this observation to the fact that germination is initiated during storage (thus
metabolism is increasing), and suggest that the effect of developmental stage on desiccation
sensitivity is related to metabolic rate. Throughout pre-and post-shedding development,
desiccation sensitivity changes in parallel with metabolic rate.
(....................)

Kami atribut pengamatan ini dengan fakta bahwa perkecambahan dimulai selama penyimpanan
(sehingga metabolisme meningkat), dan menyarankan bahwa efek dari tahap perkembangan pada
sensitivitas pengeringan berhubungan dengan tingkat metabolisme. Sepanjang pra-dan pasca-shedding
pengembangan, sensitivitas pengeringan berubah secara paralel dengan tingkat metabolisme.















OTHER PROTECTION MECHANISMS
MEKANISME PERLINDUNGAN LAINNYA
During the final stages of development of orthodox seeds there is the reduction in the
volume of water-filled vacuoles, the de-differentiation of organelles and the shut down of
metabolism that are necessary for desiccation tolerance. However, other processes, involving
particularly Late Embryogenic Abundant (LEA) proteins and sugars, also occur. LEA proteins
accumulate during the later stages of embryogenesis in orthodox seeds (Galau et al., 1986, 1991).
(Pada tahap akhir perkembangan benih ortodox, terjadi pengurangan volume air
yang mengisi vakuola sehingga proses metabolisme terhenti dan mencegah terjadinya
proses desikasi. Akan tetapi, proses lain yang khusus melibatkan protein dan gula Late
Embryogenic Abundant (LEA) juga terjadi. Protein LEA menumpuk selama tahap
embriogenesis pada biji ortodoks.
Selama tahap akhir pengembangan benih ortodoks ada pengurangan volume vakuola berisi air, de-
diferensiasi organel dan menutup dari metabolisme yang diperlukan untuk toleransi kekeringan. Namun,
proses lainnya, yang melibatkan terutama Akhir embriogenik Berlimpah (LEA) protein dan gula, juga
terjadi. Protein LEA menumpuk selama tahap embriogenesis pada biji ortodoks (Galau et al., 1986,
1991).

These proteins are similar to the dehydrins produced on drying of vegetative tissue. In
fact, dehydrins are a subset of LEAs. These proteins are thought to have a protective role in
the dry state, or certainly to contribute in some way to desiccation tolerance (reviewed by Oliver
and Bewley, 1997; Kermode, 1997), although details of their mode of action are not yet clear.
LEAs have been shown to be present in quite a wide range of recalcitrant seeds, mostly
temperate (Bradford and Chandler, 1992; Finch- Savage et al., 1994a), but also some tropical
species (Gee et al., 1994; Farrant et al., 1996).
(Protein ini mirip dengan dehydrins yang diproduksi pada saat pengeringan
jaringan vegetatif, bahkan dehydrins ini merupakan bagian dari protein LEA. Protein ini
diduga memiliki peranan untuk melindungi benih dari keadaan kekeringan serta dalam
beberapa hal memiliki pengaruh terhadap toleransi pengeringan.
Protein ini mirip dengan dehydrins diproduksi pada pengeringan jaringan vegetatif. Bahkan, dehydrins
adalah subset dari LEA. Protein ini diperkirakan memiliki peran protektif dalam keadaan kering, atau
tentu memberikan kontribusi dalam beberapa cara untuk pengeringan toleransi (terakhir oleh Oliver
dan Bewley, 1997; Kermode, 1997), meskipun rincian dari modus tindakan belum jelas. LEA telah
terbukti untuk hadir dalam cukup berbagai benih bandel, sebagian besar beriklim (Bradford dan
Chandler, 1992; Finch- Savage et al, 1994a.), Tetapi juga beberapa spesies tropis (Gee et al, 1994;.
Farrant et al., 1996).

However, they are not universally present in all recalcitrant seeds; they are certainly
absent from the axes of several tropical wetland species (Farrant et al., 1996). It is possible that
the presence of LEAs can contribute to the slightly greater desiccation tolerance and chilling
tolerance of some recalcitrant species. If sucrose and oligosaccharides such as raffinose are
present in the correct ratios, then a glass can be formed as water is lost. This state is highly
viscous, which should slow down any chemical processes occurring in the seed, thus providing
protection on desiccation (Williams and Leopold, 1989; Leopold et al., 1994). Sugars, possibly
in the appropriate mass ratios, occur in many recalcitrant seeds (Farrant et al., 1993; Finch-
Savage and Blake, 1994; Lin and Huang, 1994; Steadman et al., 1996), and it is possible that
glasses may form on dehydration. However, these glasses, if they do form, are obviously not
effective protectants, as dehydration does kill recalcitrant seeds.
(Secara umum protein LEA tidak terdapat di semua jenis benih rekalsitran,
contohnya pada beberapa benih asal daerah lahan basah tropis. Pada beberapa spesies
benih ada kemungkinan bahwa protein LEA memiliki peranan untuk melindungi dari
proses desikasi dan kerusakan akibat suhu rendah (Chilling I njury). Jika perbandingan
antara sukrosa, oligosakarida serta rafinosa tepat, maka kondisi glassy state akan
terbentuk, rafinosa berperan dalam stabilisasi glassy state yang diinduksi oleh sukrosa
sehingga dapat memperpanjang daya simpan benih. Pada metabolisme karbohidrat, gula
merupakan stabibilizing agent, sukrosa terlibat dalam mencegah liquid crystalline menjadi
transisi fase gel, dan oligosakarida bertindak sebagai pencegah pengaruh kristalisasi
(Corbineau et al. 2000).


Namun, mereka tidak universal hadir dalam semua benih bandel; mereka dipastikan absen dari sumbu
beberapa spesies lahan basah tropis (Farrant et al., 1996). Ada kemungkinan bahwa kehadiran LEA
dapat berkontribusi untuk toleransi kekeringan sedikit lebih besar dan toleransi dingin dari beberapa
spesies bandel. Jika sukrosa dan oligosakarida seperti rafinosa yang hadir dalam rasio yang benar, maka
gelas dapat dibentuk sebagai air hilang. Keadaan ini sangat kental, yang harus memperlambat setiap
proses kimia yang terjadi dalam benih, sehingga memberikan perlindungan pada pengeringan (Williams
dan Leopold, 1989; Leopold et al, 1994.). Gula, mungkin dalam rasio massa yang tepat, terjadi di banyak
biji bandel (Farrant et al, 1993;. Finch-Savage dan Blake, 1994; Lin dan Huang, 1994;. Steadman et al,
1996), dan ada kemungkinan bahwa kacamata bisa terbentuk pada dehidrasi. Namun, kacamata ini, jika
mereka membentuk, jelas tidak protectants efektif, seperti dehidrasi tidak membunuh bibit bandel.










To summarise, some species of recalcitrant seeds do have the appropriate sugars and
some have dehydrins. However, it should be pointed out that these mechanisms are thought to
operate and to provide protection at low water contents. On dehydration recalcitrant seeds die at
water contents higher than those at which these protective measures are thought to operate.
Whatever the role of LEAs and sugars may be in orthodox seeds, they are not pertinent to
recalcitrant seeds. It is now relatively well established that treatments which disturb normal
metabolism can generate free radicals, and protection against these free radicals by anti-oxidant
systems is essential for survival. Highly active anti-oxidant systems are certainly very important
in the protection mechanisms of resurrection plants, both on drying and during rehydration
(Oliver and Bewley, 1997). Although not a lot of work has been done, these mechanisms are
present in orthodox seeds.
(.............................)

Untuk meringkas, beberapa spesies benih bandel yang memiliki gula yang sesuai dan beberapa memiliki
dehydrins. Namun, harus dicatat bahwa mekanisme ini diperkirakan beroperasi dan memberikan
perlindungan pada kadar air rendah. Pada dehidrasi benih bandel mati pada kadar air lebih tinggi
daripada di mana langkah-langkah perlindungan diperkirakan beroperasi. Apapun peran LEA dan gula
mungkin dalam biji ortodoks, mereka tidak berhubungan dengan benih bandel. Sekarang relatif mapan
bahwa pengobatan yang mengganggu metabolisme normal dapat menghasilkan radikal bebas, dan
perlindungan terhadap radikal bebas oleh sistem antioksidan sangat penting untuk kelangsungan hidup.
Sangat sistem antioksidan aktif tentu sangat penting dalam mekanisme perlindungan tanaman
kebangkitan, baik pengeringan dan selama rehidrasi (Oliver dan Bewley, 1997). Meskipun tidak banyak
pekerjaan yang telah dilakukan, mekanisme ini hadir dalam biji ortodoks.

During the drying of recalcitrant seeds, stable free radicals do accumulate (Hendry et al.,
1992; Finch-Savage et al., 1993, 1994b). There is evidence that anti-oxidant systems also fail
(Hendry et al., 1992; Finch-Savage et al., 1993), or they may not be present at sufficient levels.
Oxidative damage probably does occur during drying. There have been some new suggestions
concerning the mechanisms of desiccation tolerance (Hoekstra et al., 1997; Golovina et al.,
1998).
(............)

Selama pengeringan biji bandel, radikal bebas stabil yang menumpuk (Hendry et al, 1992;.. Finch-Savage
et al, 1993, 1994b). Ada bukti bahwa sistem anti-oksidan juga gagal (Hendry et al, 1992;.. Finch-Savage
et al, 1993), atau mereka mungkin tidak hadir pada tingkat yang cukup. Kerusakan oksidatif mungkin
tidak terjadi selama pengeringan. Ada beberapa saran baru tentang mekanisme toleransi kekeringan
(Hoekstra et al, 1997;. Golovina et al, 1998.).

These authors postulate the existence of amphipathic molecules that become integrated
into the membrane as water is lost. It is suggested that these molecules lower the water content at
which lipid phase changes occur and thus possibly stabilize the integral proteins in the
membranes. This is recent work and so far no information is available with regard to the
presence of these molecules in recalcitrant seeds. It is apparent that there is a suite, a collection,
of mechanisms that are thought to protect against desiccation damage. Some of these protective
mechanisms probably also operate during rehydration, as well as during drying. The different
protective mechanisms seem to operate in different water content ranges. All these mechanisms
must be operational for desiccation tolerance. Recalcitrant seeds lack some or all of these
mechanisms. It is not apparent whether there is any relationship between the degree of
recalcitrance of a seed and the extent to which it has or expresses some of these mechanisms.
(......................)

Para penulis ini mendalilkan adanya molekul amphipathic yang menjadi terintegrasi ke dalam membran
sebagai air hilang. Disarankan bahwa molekul-molekul ini menurunkan kadar air di mana perubahan fasa
lipid terjadi dan dengan demikian mungkin menstabilkan protein integral dalam membran. Ini adalah
karya terbaru dan sejauh ini tidak ada informasi yang tersedia berkaitan dengan kehadiran molekul-
molekul dalam biji bandel. Hal ini jelas bahwa ada suite, koleksi, mekanisme yang dianggap untuk
melindungi terhadap kerusakan pengeringan. Beberapa mekanisme perlindungan ini mungkin juga
beroperasi selama rehidrasi, serta selama pengeringan. Mekanisme perlindungan yang berbeda yang
beroperasi dalam rentang kadar air yang berbeda. Semua mekanisme ini harus operasional untuk
toleransi kekeringan. Benih bandel kekurangan beberapa atau semua mekanisme ini. Hal ini tidak jelas
apakah ada hubungan antara tingkat kekeraskepalaan benih dan sejauh mana ia memiliki atau
mengungkapkan beberapa mekanisme tersebut.






THE IMPORTANCE OF DEHYDRATION RATE
Dehydration rate is perhaps one of the most confusing issues in recalcitrant seed
physiology. When whole seeds are dried relatively slowly - over several days - viability is
generally lost at embryonic axis water contents in the range of 1.0 - 0.5 g water/g dry mass (50 -
35% wet mass basis). However, if isolated embryonic axes are dried rapidly (minutes to hours)
they survive to much lower water contents - 0.45 to 0.25 g/g and possibly even lower (e.g.
Pammenter et al., 1991). Thus the effect of dehydration depends upon the rate of dehydration.
This makes it extremely difficult to assess or measure desiccation tolerance - the response
depends upon how the tissue is dried.
(......................)

Tingkat Dehidrasi mungkin salah satu masalah yang paling membingungkan dalam fisiologi benih bandel.
Ketika seluruh biji kering relatif lambat - selama beberapa hari - kelangsungan hidup umumnya hilang
pada embrio kadar air sumbu dalam kisaran 1,0-0,5 g air / g berat kering (50-35% basis massa basah).
Namun, jika sumbu embrio terisolasi dikeringkan dengan cepat (menit sampai beberapa jam) mereka
bertahan untuk kadar air jauh lebih rendah - 0,45-0,25 g / g - dan mungkin bahkan lebih rendah
(misalnya Pammenter et al, 1991.). Jadi efek dehidrasi tergantung pada tingkat dehidrasi. Hal ini
membuat sangat sulit untuk menilai atau mengukur toleransi pengeringan - respon tergantung pada
seberapa jaringan dikeringkan.

However, this approach could be criticized because of the experimental protocol; the
effect could be due to different drying rates, or it could be due to the fact that different tissues
were used to achieve the different drying rates (embryonic axes for rapid drying and whole seeds
for slow drying); thus for rapid drying the embryonic axis has been removed from the influence
of the rest of the seed. To resolve this question we undertook studies on whole seeds of
Ekebergia capensis (Pammenter et al., 1998). This species produces seeds about the size of a
peanut with a hard endocarp. If the endocarp is removed the seeds can be dried by burying in
silica gel to an axis water content of around 0.2 g/g (dry mass basis) in about 48 h (Figure 2a). If
the endocarp is left intact it takes about 10 d for axis water content to reduce to 0.5 g/g
(Figure 2b). We also manipulated the drying technique to achieve what we describe as an
intermediate drying rate.
(......................)

Namun, pendekatan ini dapat dikritik karena protokol eksperimental; efeknya bisa disebabkan tingkat
pengeringan yang berbeda, atau bisa juga karena fakta bahwa jaringan yang berbeda digunakan untuk
mencapai tingkat yang berbeda pengeringan (sumbu embrio untuk pengeringan cepat dan biji utuh
untuk pengeringan lambat); sehingga untuk pengeringan cepat sumbu embrio telah dihapus dari
pengaruh sisa benih. Untuk mengatasi pertanyaan ini kita melakukan studi secara keseluruhan biji
Ekebergia capensis (Pammenter et al., 1998). Spesies ini menghasilkan benih seukuran kacang dengan
endocarp keras. Jika endocarp akan dihapus benih dapat dikeringkan dengan cara mengubur dalam
silika gel ke kadar air sumbu sekitar 0,2 g / g (basis massa kering) di sekitar 48 jam (Gambar 2a). Jika
endocarp dibiarkan utuh dibutuhkan sekitar 10 d kadar air sumbu untuk mengurangi sampai 0,5 g / g
(Gambar 2b). Kami juga dimanipulasi teknik pengeringan untuk mencapai apa yang kita gambarkan
sebagai laju pengeringan menengah.

The response of final germination to water content using the three drying treatments is
seen in Figure 3. Seeds that were dried slowly started to lose viability at an axis water content of
about 1.3 g/g and were all dead at 0.6 g/g. Seeds that were dried rapidly retained 90% viability to
a water content of 0.5 g/g, and were all dead at 0.2 g/g. Seeds dried at an intermediate rate
showed an intermediate response to desiccation. The rate of drying does have a marked effect on
the water content tolerated; the effect is not one of removing the axis from the seed. Why should
this be the case?
(......................)

Respon perkecambahan akhir untuk kadar air menggunakan tiga perlakuan pengeringan terlihat pada
Gambar 3 Biji yang kering perlahan-lahan mulai kehilangan viabilitas pada kadar air sumbu sekitar 1,3 g /
g dan semua mati pada 0,6 g / g. Biji yang dikeringkan dengan cepat ditahan 90% viabilitas ke kadar air
0,5 g / g, dan semua mati pada 0,2 g / g. Benih dikeringkan pada tingkat menengah menunjukkan respon
menengah untuk pengeringan. Tingkat pengeringan memang memiliki efek yang ditandai pada kadar air
ditoleransi; pengaruhnya tidak salah menghapus sumbu dari benih. Mengapa ini harus terjadi?

The cells of embryonic axes of the seeds dried at different rates showed very different
ultrastructural responses to dehydration (see Berjak and Pammenter, this volume). In seeds that
were dried slowly to the extent that considerable viability loss occurred, there was advanced
degradation of membrane structures, particularly in the plastids, and an abnormal appearance
of the lipid bodies, particularly a darkening of the surface. Seeds that had been dried rapidly
to a slightly lower water content, but still were mostly viable, generally showed well preserved
membranes and nuclei. Although membrane damage did ultimately occur on rapid drying, there
was very marked degradation at high water contents in slowly dried material. This ultrastructural
evidence suggests that different deteriorative processes may be occurring at the different drying
rates.
(......................)


Sel-sel embrio sumbu dari biji kering pada tingkat yang berbeda menunjukkan respon ultrastructural
sangat berbeda dengan dehidrasi (lihat Berjak dan Pammenter, buku ini). Dalam benih yang dikeringkan
perlahan-lahan sampai-sampai kehilangan viabilitas cukup terjadi, ada degradasi maju struktur
membran, khususnya di plastida, dan penampilan abnormal dari tubuh lipid, khususnya gelap
permukaan. Biji yang telah dikeringkan dengan cepat untuk kadar air sedikit lebih rendah, tapi masih
sebagian besar layak, umumnya menunjukkan membran terawat dan inti. Meskipun kerusakan
membran itu akhirnya terjadi pada pengeringan yang cepat, ada penurunan yang sangat nyata pada
kadar air yang tinggi dalam bahan perlahan-lahan kering. Bukti ultrastructural ini menunjukkan bahwa
proses kerusakan yang berbeda dapat terjadi pada tingkat pengeringan yang berbeda.

To understand the effect of drying rate we have to appreciate that some damaging
processes are aqueous based. Slowly dried material will spend a long time at the intermediate
water contents where damage from these aqueous based processes can accumulate. However, if
material is dried rapidly, only a short time is spent at these intermediate water contents, so little
damage accumulates. Thus the faster the drying, the less damage that accumulates and the lower
the water content that can be tolerated. However, there is a lower limit - no matter how fast
recalcitrant seeds are dried, they cannot tolerate the low water contents typical of orthodox seeds.
(......................)

Sel-sel embrio sumbu dari biji kering pada tingkat yang berbeda menunjukkan respon ultrastructural
sangat berbeda dengan dehidrasi (lihat Berjak dan Pammenter, buku ini). Dalam benih yang dikeringkan
perlahan-lahan sampai-sampai kehilangan viabilitas cukup terjadi, ada degradasi maju struktur
membran, khususnya di plastida, dan penampilan abnormal dari tubuh lipid, khususnya gelap
permukaan. Biji yang telah dikeringkan dengan cepat untuk kadar air sedikit lebih rendah, tapi masih
sebagian besar layak, umumnya menunjukkan membran terawat dan inti. Meskipun kerusakan
membran itu akhirnya terjadi pada pengeringan yang cepat, ada penurunan yang sangat nyata pada
kadar air yang tinggi dalam bahan perlahan-lahan kering. Bukti ultrastructural ini menunjukkan bahwa
proses kerusakan yang berbeda dapat terjadi pada tingkat pengeringan yang berbeda.

We visualise two types of damage that can occur during drying. As a consequence of
disturbed metabolism, free radical-mediated oxidation processes can proceed. These reactions
are aqueous-based and occur at intermediate water contents. The protection mechanisms against
this type of damage are the switching-off of metabolism, de-differentiation of organelles, and
efficient anti- oxidant systems. The second type of damage we envisage is due to the biophysical
disruptions caused by the removal of water from macromolecular and membrane surfaces. These
occur at low water contents. Protection mechanisms against this type of damage include LEAs,
vitrification by sugars, and possibly the amphipathic molecules suggested to migrate between
cytosol and membranes on dehydration and rehydration.
(......................)

Kami memvisualisasikan dua jenis kerusakan yang dapat terjadi selama pengeringan. Sebagai
konsekuensi dari metabolisme terganggu, proses oksidasi radikal-dimediasi gratis dapat melanjutkan.
Reaksi-reaksi ini adalah air berbasis dan terjadi pada kadar air menengah. Mekanisme perlindungan
terhadap jenis kerusakan yang switching-off metabolisme, de-diferensiasi organel, dan efisien sistem
oksidan anti. Tipe kedua kerusakan kita membayangkan ini disebabkan oleh gangguan biofisik
disebabkan oleh penghapusan air dari permukaan makromolekul dan membran. Ini terjadi pada kadar
air rendah. Mekanisme perlindungan terhadap jenis kerusakan termasuk LEA, vitrifikasi oleh gula, dan
mungkin molekul amphipathic disarankan untuk bermigrasi antara sitosol dan membran pada dehidrasi
dan rehidrasi.













EVOLUTIONARY STATUS OF RECALCITRANT SEEDS
In vegetative tissue desiccation sensitivity is probably the ancestral state, but tolerance
evolved independently a number of times, including more than once in the angiosperms (Oliver
and Bewley, 1997). Any attempt at a similar phylogenetic analysis using seed desiccation
response as a character state fails - both tolerance and sensitivity occur in all major clades of
extant seed plants. However, it is probable that sensitivity is the ancestral state, but tolerance
evolved independently a number of times (von Teichman and van Wyk, 1994; Pammenter and
Berjak, 2000). This raises the interesting question as to whether the mechanisms of tolerance are
necessarily the same in all seed species.
( ............................)
kedua sifat kepekaan dan sensitivitas terjadi pada semua klade utama dari benih tanaman
yang masih ada.
Dalam sensitivitas pengeringan jaringan vegetatif mungkin adalah keadaan leluhur, tetapi toleransi
berkembang secara independen beberapa kali, termasuk lebih dari sekali dalam angiosperma (Oliver
dan Bewley, 1997). Setiap usaha pada analisis filogenetik serupa dengan menggunakan benih respon
pengeringan sebagai negara gagal karakter - baik toleransi dan sensitivitas terjadi pada semua clades
utama bibit tanaman yang masih ada. Namun, besar kemungkinan bahwa sensitivitas adalah keadaan
leluhur, tetapi toleransi berkembang secara independen beberapa kali (von Teichman dan van Wyk,
1994; Pammenter dan Berjak, 2000). Hal ini menimbulkan pertanyaan menarik, apakah mekanisme
toleransi yang tentu sama pada semua spesies benih.












ECOLOGICAL CONSIDERATIONS
A characteristic of recalcitrant seeds is their limited lifespan, and this will place
constraints on the range of environmental conditions in which regeneration via seeds can occur.
However, when we try to get detailed information on the seed ecology of species producing
recalcitrant seeds, we have a major problem in the past ecologists and seed scientists have not
often communicated. Ecologists study the composition of soil seed banks, the lifespan of seeds in
these banks, and environmental conditions initiating germination, but often have no information
as to the water content of the seeds of interest. Seed physiologists, on the other hand, have a
good knowledge of only a few species, mostly economically important ones (either crop species
or weedy invaders), and only occasionally become involved in ecological considerations.
( Karakteristik benih rekalsitran adalah umur simpannya yang pendek dan
terkendala terhadap kondisi lingkungan, dimana benih bisa saja berkecambah saat
penyimpanan. )
Karakteristik biji bandel adalah umur yang terbatas, dan ini akan menempatkan kendala pada kisaran
kondisi lingkungan di mana regenerasi melalui benih dapat terjadi. Namun, ketika kita mencoba untuk
mendapatkan informasi rinci tentang ekologi benih spesies memproduksi benih bandel, kami memiliki
masalah besar - dalam ekologi masa lalu dan ilmuwan benih belum sering dikomunikasikan. Para ahli
ekologi mempelajari komposisi bank benih tanah, umur benih di bank-bank, dan kondisi lingkungan
memulai perkecambahan, tetapi sering tidak memiliki informasi mengenai kadar air benih bunga.
Fisiologi benih, di sisi lain, memiliki pengetahuan yang baik dari hanya beberapa spesies, sebagian besar
yang ekonomis penting (baik spesies tanaman atau penjajah naga), dan hanya kadang-kadang terlibat
dalam pertimbangan ekologi.










Recalcitrant seeds are common in mesic tropical forests. These conditions generally
would be favourable for germination and seedling establishment, and so there has been no
pressure driving the evolution of desiccation tolerance, or the characteristic has been secondarily
lost. Seed ecologists will tell us that seeds of climax species of these ecosystems are not often
found in the soil seed bank their lifespans are low, whereas seeds of gap specialists are well
represented in the soil seed bank. The seeds of climax species generally show no dormancy,
germinate rapidly (unless they have a hard covering), are absent from the soil seed bank and
these species persist as a seedling bank. They are generally large and not wind dispersed. These
are the characteristics that one would expect from recalcitrant seeds, and it is highly probable
that most of these seed species are indeed recalcitrant, although this has been confirmed for only
a limited number of species.
( Benih reklsitran umumnya berasal dari hutan tropis, kondisi lingkungan di
tempat ini umumnya menguntungkan bagi proses perkecambahan dan perkembangan
bibit karena resiko terjadinya proses desikasi/kehilangan air pada benih dapat
diminimalkan. Karakteristik dari benih-benih jenis ini umumnya tidak memiliki masa
dormansi kecuali pada benih yang memiliki kulit penutup yang keras, selain itu ukuran
dari benih rekalsitran relatif besar dan tidak dapat tersebar oleh tiupan angin.)

Benih bandel yang umum di hutan tropis mesic. Kondisi ini umumnya akan menguntungkan bagi
perkecambahan dan pembentukan bibit, sehingga belum ada tekanan yang mendorong evolusi toleransi
kekeringan, atau karakteristik telah sekunder hilang. Ekologi benih akan memberitahu kita bahwa benih
spesies klimaks dari ekosistem ini tidak sering ditemukan di bank benih tanah - rentang hidup mereka
rendah, sedangkan benih spesialis gap terwakili dengan baik di bank benih tanah. Benih-benih spesies
klimaks umumnya tidak menunjukkan dormansi, berkecambah cepat (kecuali mereka memiliki penutup
keras), yang absen dari bank benih tanah dan spesies ini bertahan sebagai bank bibit. Mereka umumnya
besar dan tidak angin tersebar. Ini adalah karakteristik yang diharapkan dari biji bandel, dan sangat
mungkin bahwa sebagian besar spesies benih ini memang bandel, meskipun hal ini telah dikonfirmasi
untuk hanya sejumlah spesies.

Although recalcitrant seeds are common in mesic tropical forests, they are by no means
confined to these systems. Species producing recalcitrant seeds do occur in more seasonal
habitats, and a number of strategies have evolved to permit successful seedling establishment.
Many temperate recalcitrant seeds are shed in autumn and over-winter as seeds. A necessary
prerequisite for this, of course, is chilling tolerance. Because of the low temperatures, rates of
germination will be slow, and will not be completed before the arrival of spring. In fact some
species such as Aesculus hippocastanum actually have a chilling requirement for germination
(Pritchard et al., 1996). Low temperatures and general dampness will also slow water loss,
reducing the risk of death by desiccation. As a generalisation, recalcitrant species of temperate
regions are generally more desiccation tolerant and have longer life spans than those of tropical
origin.
( Meskipun benih rekalsitran umumnya dijumpai di daerah hutan tropis, tetapi ada
beberapa spesies yang dapat memproduksi benih rekalsitran saat musim gugur atau saat
akhir musim dingin, sebagai contoh benih dari spesies tanaman Aesculus hippocastanu.
Benih ini memiliki toleransi terhadap kerusakan akibat suhu rendah (Chilling injury,
bahkan beberapa spesies dari tanaman ini memerlukan suhu yang rendah untuk bisa
berkecambah. Saat suhu dan kelembaban rendah, kehilangan air benih serta laju
perkecambahan akan berjalan lambat sehingga akan mengurangi resiko terjadinya proses
desikasi. Secara umum benih rekalsitran dari daerah yang beriklim rendah memiliki umur
hidup yang lebih lama dibandingkan dengan benih rekalsitran yang berasal dari daerah
tropis.)

Meskipun biji bandel yang umum di hutan tropis mesic, mereka tidak berarti terbatas pada sistem ini.
Spesies memproduksi benih bandel memang terjadi lebih habitat musiman, dan sejumlah strategi telah
berevolusi untuk memungkinkan keberhasilan pembentukan bibit. Banyak benih bandel beriklim adalah
gudang di musim gugur dan musim dingin over-sebagai bibit. Sebuah prasyarat yang diperlukan untuk
ini, tentu saja, adalah toleransi dingin. Karena suhu rendah, tingkat perkecambahan akan lambat, dan
tidak akan selesai sebelum datangnya musim semi. Bahkan beberapa spesies seperti Aesculus
hippocastanum benar-benar memiliki persyaratan dingin untuk perkecambahan (Pritchard et al., 1996).
Suhu rendah dan kelembaban umum juga akan memperlambat kehilangan air, mengurangi resiko
kematian karena pengeringan. Sebagai generalisasi, spesies bandel dari daerah beriklim umumnya lebih
toleran dan pengeringan memiliki rentang hidup lebih lama dibandingkan dengan asal tropis.