ESPECTROFOTOMETRIA

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ESPECTROFOTOMETRIA
La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones
biolgicas. Se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra,
en funcin de la longitud de onda. Cada componente de la solucin tiene su patrn de
absorcin de luz caracterstico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo
de absorcin de luz de una muestra versus soluciones standar, es posible determinar la
identidad y la concentracin de componentes disueltos en la muestra (solucin incgnita).
Las ventajas de la espectrofotometra sobre otros mtodos analticos de laboratorio son
varias: es rpida, precisa, verstil, fcil de usar y eficiente en costo. Los espectrofotmetros
se han mejorado en precisin y versatilidad en los ltimos aos con los avances de
tecnologa, y hoy se consideran indispensables en un laboratorio de qumica analtica.
Es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una
solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad
conocida de la misma sustancia.
Espectro
El Espectro Electromagntico es un conjunto de ondas que van desde las ondas con mayor
longitud como las ondas de radio, hasta los que tienen menor longitud como los rayos
Gamma. Entre estos dos limites estn: las ondas de radio, las microondas, los infrarrojos, la
luz visible, la luz ultravioleta y los rayos X. Las ondas con mayor longitud de onda tienen
menor frecuencia y viceversa.
Las caractersticas propias de cada tipo de onda no solo es su longitud de onda, sino
tambin su frecuencia y energa. Un espectro qumico es la imagen o registro grfico que
presenta una sustancia al ser excitada y posteriormente analizada.


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Puede ser de dos tipos:
- Emisin : Cuando el registro es producido por la muestra excitada.
- Absorcin : Cuando la muestra es irradiada con una banda de frecuencias adecuada
y se evalan, por defecto, las frecuencias que han sido absorbidas por la muestra.
FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA
FENMENO DE ABSORCIN
Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental
interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partcula en estado
excitado. La molcula absorbe la E de la onda y aumenta su energa, y ese aumento de
energa es igual a la E de la Radiacin Electromagntica absorbida (E = h.n). La partcula en
estado excitado tiende a volver de forma espontnea a su estado de reposo desprendiendo
la E absorbida en forma de calor.
Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno,
tiene un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde
se representa en ordenadas la Absorbancia y en abscisas la longitud de onda. La medida de
la cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la espectrofotometra de
absorcin.
Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe
la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

FENMENO DE EMISIN

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental
produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa
emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.
TRANSMITANCIA
La transmitancia se define como la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en
determinada cantidad de tiempo.
Existen varios tipos de transmitancia, dependiendo de qu tipo de energa consideremos.
La transmitancia ptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una
determinada longitud de onda.
Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido,
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una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fraccin de ese haz de luz atravesar
el cuerpo, segn su transmitancia. El valor de la transmitancia ptica de un objeto se puede
determinar segn la siguiente expresin:



I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I
0
es la cantidad total de luz incidente.
Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, segn la frmula:



Podemos hablar de transmitancia trmica como la cantidad de energa en forma de calor
que atraviesa un cuerpo, en cierta unidad de tiempo. Si tenemos en cuenta un cuerpo con
caras planas y paralelas, y entre sus caras hay una diferencia trmica, esta diferencia
constituye la transmitancia trmica del cuerpo. La transmitancia trmica es el inverso de la
resistencia trmica. Se puede definir segn la siguiente frmula:


En esta expresin tenemos que
U = transmitancia en W/m
2.
Kelvin.
S = superficie del cuerpo en m
2
.
K = diferencia de temperaturas en grados Kelvin.
El concepto de este tipo de transmitancia es aplicado en los clculos para construir
aislamientos trmicos y para calcular prdidas de energa en forma de calor.
Tambin se toman en cuenta estos conceptos al momento de calefaccionar una habitacin,
ya que hay que calcular qu potencia se necesitar en un determinado perodo, para lograr
una cierta temperatura en la habitacin, teniendo en cuenta la prdida de calor debido a la
transmitancia de las paredes de la habitacin.
Absorbancia
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Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esta luz es absorbida
por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz
absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser transmitida
por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del
mismo fenmeno. La absorbancia, a una determinada longitud de onda lambda, se define
como:




Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I
0
es la
intensidad de la luz incidente.
La medida de la absorbancia de una solucin es usada con mucha frecuencia en laboratorio
clnico, para determinar la concentracin de analitos tales como colesterol, glucosa,
creatinina y triglicridos en sangre. Cada uno de estos analitos se hace reaccionar
qumicamente con determinados compuestos, a fin de obtener una solucin coloreada. A
mayor intensidad de color, mayor ser la absorbancia de la solucin en una determinada
longitud de onda. La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentracin
del analito en sangre.
Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada intensidad y
longitud de onda, sobre la solucin, y se mide la luz transmitida al otro lado de la cubeta que
contiene dicha solucin. Estas tcnicas estn comprendidas en el rea de la
espectrofotometra.
ESPECTROFOTMETRO
Se distinguen dos tipos de aparatos:
Fotmetro o Colormetro: Se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el
paso de una determinada longitud de onda.

Espectrofotmetros: Utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz
monocromtico cuya longitud de onda se vara a voluntad. Los monocromadores
pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difraccin.

Monocromador de Prisma

COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO
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1. Fuente de luz: Proporciona energa radiante en forma de luz visible o no visible.
Tipos de lmparas:
- Lmparas de filamento de tungsteno: Se utilizan para longitudes de onda del espectro
visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa radiante
entre 360-950 nm.

- Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: Son de mayor duracin y emiten
energa radiante de mayor intensidad.

- Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: Producen un espectro continuo en la regin ultravioleta
entre 220-360 nm.

- Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas
que se utilizan para calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para
espectrofotmetros y cromatografa HPLC.
Precauciones:

- Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen sufrimiento de la lmpara y cambios en
las lecturas de la Absorbancia.

- La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato.
2. Rendija de entrada: Tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la
luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda.
3. Monocromadores: Pueden ser:
- Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que permite el paso de la luz.
Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.

- Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas situadas a distancias iguales
entre s y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas
hendiduras se comporta como un pequeo prisma.
4. Rendija de salida: Tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de
la muestra, que provocara desviaciones a la Ley de Beer.
5. Cubeta: Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin. Pueden ser de
distintos tipos y tamaos (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores
resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben
marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posicin. Suelen estar fabricadas en
vidrio o en plstico.
6. Detector: Puede ser de dos tipos:

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Fotoclulas o clulas fotovoltaicas:
Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de xido de Cobre.
A sto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal
transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y ste desprende
electrones, que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir
carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un
ampermetro que seala el paso de corriente.
Caractersticas: Son resistentes; econmicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000
nm. de longitud de onda; no se requiere batera externa, ni vaco; la corriente producida es
directamente proporcional a la Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir, que
presentan una subida inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el
equilibrio. Por eso hay que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.

Fototubos multiplicadores:
Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que emite electrones de forma
proporcional a la Energa que incide sobre l. Tiene un nodo que recoge los electrones y la
corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos nodos que van
teniendo un voltaje superior al precedente. La seal se amplifica en cientos o miles de veces.
Caractersticas: el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen efecto fatiga tan altos
como la anterior y son muy sensibles.

7. Medidor: Son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que
puede ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de
seal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura
digital y clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.






TIPOS DE APARATOS:
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ESPECTROFOTMETRO DE HAZ SIMPLE: Es igual que la descripcin dada para el
espectrofotmetro en general. Consta de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinmetro: para
determinar bilirrubina directa en capilar).
ESPECTROFOTMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: Todos los componentes
estn duplicados, menos la lmpara y el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo
por los distintos componentes separados en el espacio. Esto compensa las variaciones de
intensidad de luz y de absorbancia.
ESPECTROFOTMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO: Utilizan los mismos
componentes que el espectrofotmetro de haz simple. Dos haces de luz pasan por los
mismos componentes pero no al mismo tiempo. Emplean un Chopper consistente en un
interruptor rotativo del haz luminoso colocado a continuacin de la rendija de salida. Un
sistema de espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a travs de una cubeta
de referencia y de ah al detector comn. El detector lee alternativamente el haz procedente
de la muestra y el de la cubeta de referencia. Esto compensa la variacin de energa
radiante.
Aplicaciones de la Espectrofotometra
La espectrofotometra es de gran utilidad en el anlisis de especies qumicas sobre todo para
el qumico analtico, tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin
de sustancias y microorganismos.
En bioqumica se utiliza por ejemplo para:

1.-Identificar compuestos por su espectro de absorcin.
2.-Conocer la concentracin de un compuesto en una disolucin.
3.-Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de anlisis qumico.
4.-Seguir el curso de reacciones qumicas y enzimticos.
Ley de Beer
La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la
concentracin en la solucin.
Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar diluida y en otro tenemos un
vaso con la misma cantidad de agua pero con ms azcar diluida. El vaso es una celda
fotoelctrica, y la solucin de azcar es la que se mide su concentracin.




luz
luz
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Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad
de luz que saldra del otro lado sera mayor que si repitiramos esto en el segundo; ya que en
el segundo, las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y
molculas y son absorbidos por estos
* Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su
intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentracin del medio
absorbente aumenta
I = I
0
e
-ac

LEYES DE BEER LAMBERT
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert donde
la fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es proporcional a la
concentracin de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin
entre la luz incidente (I
0
) y la trasmitida (I) dar una idea de la cantidad de radiacin
que ha sido absorbida por la muestra