Judul Penelitian : STUDI EFEK PEMBERIAN EKSTRAK CIPLUKAN
(Physalis angulata L.) TERHADAP JUMLAH SEL ENDOTEL PEMBULUH DARAH AORTA pada TIKUS (Rattus norvegicus) DM (Diabetes mellitus)
Pendahuluan Diabetes Mellitus (DM) adalah penyakit yang sangat sering terjadi dan dapat menyerang seluruh bagian tubuh manusia dimana angka kejadian dan penyebarannya selalu meningkat di seluruh dunia (Scobei, 1998). Diabetes melitus lebih dikenal dengan penyakit gula atau penyakit kencing manis adalah penyakit yang ditandai dengan hiperglikemia puasa atau respons glukosa plasma yang melebihi batas yang ditentukan selama uji toleransi glukosa oral (Stein, 1998). Diabetes mellitus saat ini merupakan penyakit yang banyak dijumpai dengan prevalensi diseluruh dunia mencapai angka 4% (Depkes, 2005). Pada tahun 1985 jumlah penderita dibetes mellitus hanya sekitar 30 juta jiwa namun pada tahun 2003, angka penderita diabetes mellitus di seluruh dunia telah bertambah hingga mencapai 194 juta jiwa dan jumlah penderita penyakit ini terus meningkat dan diperkirakan pada tahun 2030 akan mencapai 333 juta jiwa (Pdpersi, 2008). Di Indonesia, diabetes mellitus adalah salah satu penyakit yang paling sering diderita dan penyakit kronik yang serius. Setengah dari jumlah kasus diabetes mellitus tidak terdiagnosa karena pada umumnya diabetes tidak disertai gejala sampai terjadinya komplikasi. Berdasarkan survey WHO (World Health Organization), Indonesia menempati urutan ke-4 terbesar dalam jumlah penderita diabetes melitus dengan prevalensi 8,6% (Depkes, 2005). Pada tahun 2020 diperkirakan angka kejadian diabetes mellitus di Indonesia mencapai 8,2 juta penderita. Apabila diprosentasikan berdasarkan jumlah penderita dengan jumlah penduduk, maka pada usia sebelum 20 tahun angka kejadian diabetes mellitus diperkirakan 0,19% dan diatas usia 20 tahun diperkirakan mencapai 8,6%, sedang pada usia di atas 65 tahun 20,1 % (Wahyudi, 2009). Prevalensi penyakit diabetes mellitus terus meningkat karena terjadi perubahan gaya hidup, kenaikan jumlah kalori yang dimakan, kurangnya aktifitas fisik dan meningkatnya jumlah populasi manusia usia lanjut (Hiswani, 2008). Berbagai komplikasi dapat diakibatkan oleh rendahnya kontrol diabetes. Komplikasi tersebut antara lain berupa penyakit vaskular sistemik (percepatan aterosklerosis), penyakit jantung, penyakit mikrovaskular pada mata sebagai penyebab kebutaan dan degenerasi retina (retinopati diabetik), katarak, kerusakan ginjal sebagai penyebab gagal ginjal serta kerusakan saraf tepi (neuropati diabetik) (Halliwel, 1999). Luasnya komplikasi pada diabetes tampaknya berkorelasi dengan konsentrasi glukosa darah sehingga glukosa berlebih diduga menjadi penyebab utama kerusakan jaringan (Nobar, et al, 1999). Hal ini dapat disebabkan oleh kemampuan hiperglikemia secara in vivo dalam modifikasi oksidatif berbagai substrat. Selain itu, hiperglikemia juga terlibat dalam proses pembentukan radikal bebas (Droge, 2002). Hiperglikemia menyebabkan auto oksidasi glukosa, glikasi protein, dan aktivasi jalur metabolisme poliol yang mempercepat pembentukan senyawa oksigen reaktif. Pembentukan senyawa oksigen reaktif tersebut dapat meningkatkan modifikasi lipid, DNA, dan protein pada berbagai jaringan (Ueno, et al, 2002). Modifikasi molekuler pada berbagai jaringan tersebut mengakibatkan ketidakseimbangan antara antioksidan protektif (pertahanan antioksidan) dan produksi radikal bebas. Hal tersebut merupakan awal kerusakan oksidatif yang dikenal sebagai stres oksidatif (Nuttal, et al,1999) Peningkatan produksi radikal bebas menyebabkan jumlah sel endotel pada pembuluh darah pasien penderita diabetes mellitus menurun. Penurunan fungsi sel endotel dapat menyebabkan hilangnya vasodilatasi, dan mengarah pada vasokontriksi, thrombosis, dan inflamasi (Douglas, 1998). Endotel pembuluh darah berfungsi mengatur hemostasis vaskular dan pengaturan, hal ini sangat penting untuk mempertahankan aliran darah dan aktifitas anti trombotik. NO (Nitric oxide) yang dibentuk dari L-arginine melalui enzim NO synthase yang menyebabkan relaksasi pembuluh darah dan berhubungan dengan penghambatan adesi dan agregasi trombosit. Jika terjadi gangguan pembentukan NO atau peningkatan degradasi NO, maka terjadi disfungsi endotel pembuluh darah (anonymous, 2008). Disfungsi endotel memiliki peran yang sangat penting dalam patogenesa penyakit arteri. Penyakit arteri merupakan penyebab morbiditas (kerusakan jaringan dan kecacatan) dan mortalitas (kematian) di dunia barat. Bentuk yang paling umum dari penyakit ini adalah arteriosklerosis (McGeachie, 1998) dimana salah satu bentuk dari arteiosklerosis adalah atherosclerosis yang bertanggung jawab terhadap terjadinya sebagian besar penyakit kardiovaskuler (Smith, 2004). Dalam proses pengobatannya, penderita diabetes mellitus tidak hanya dapat dilakukan dengan medikamentosa saja namun juga dapat dilakukan dengan pengobatan tradisional. Suatu kenyataan yang tidak dapat dipungkiri bahwa cara pengobatan tradisional masih mendapat tempat di masyarakat awam dan juga pada kalangan tertentu termasuk kalangan intelektual (Santoso, 1998). Dalam hal ini peneliti menduga ciplukan (Physalis angulata L.) dapat dimanfaatkan sebagai salah satu alternative terapi pada penderita diabetes mellitus Ciplukan (Physalis angulata L.) adalah spesies tetraploid dan termasuk famili Solanaceae (Azlan, 2008). Ciplukan adalah tumbuhan asli Amerika yang kini telah tersebar secara luas di daerah tropis di dunia. Di Jawa tumbuhan tumbuh secara liar di kebun, tegalan, tepi jalan, kebun, semak, hutan ringan, tepi hutan (Latifah, et al, 2009). Tanaman ini banyak dicari dan ditemukan oleh anak-anak pedesaan pada saat musim panen palawija tiba. Biasanya pada saat musim panen kacang tanah. Begitu kacang tanah dipanen (dicabut), yang tinggal hanyalah rumput-rumput yang tumbuh di sela-sela kacang tanah, termasuk diantaranya pohon ceplukan (Anonymous, 2009) Sejak lama, ciplukan sebenarnya telah diteliti oleh para ahli dari berbagai negara. Penelitian tersebut biasanya terfokus pada aktivitas yang dimiliki oleh ciplukan. Dari penelitian yang telah dilakukan, baik secara in vitro maupun in vivo, didapatkan informasi bahwa ciplukan memiliki aktivitas sebagai antihiperglikemi, antibakteri, antivirus, imunostimulan dan imunosupresan (imunomodulator), antiinflamasi, antioksidan, dan sitotoksik (Latifah, et al, 2009). Dari beberapa penelitian, didapatkan data bahwa ciplukan mengandung 13, 14-seco-16, 24-cyclosteroid, dengan jenis antara lain: Physalin B (Matsura, et al, 1970); 5,6 -epoxyphysalin B (Row, et al, 1978); withaphysalin A (Mulchandani, et al, 1979); withaphysalin B (Kirson, et al, 1976; Glotter, et al, 1975); Physalin D (Mohana, et al, 1979). Withaphysalin A dan withaphysalin B tergolong dalam withanolides. Secara kimia, withanolides merupakan ergostan tipe steroids yang teroksidasi secara alami, mempunyai lactone pada tepi rantai (side chain) dan 2-en-1- one system pada cincin A. Withanolides terdapat pada semua bagian tanaman golongan Solanaceae, namun presentasi terbesar terdapat pada bagian daun (Singh, 2002). Menurut penelitian lainnya, kandungan physalin pada tanaman physalis angulata ini terbanyak terdapat pada kuncup bunga dan daunnya (Azlan, 2008). Oleh karena physalin juga memiliki struktur steroid yang juga bisa berfungsi sebagai antioksidan maka peneliti menduga bahwa pemberian ekstrak ciplukan tehadap tikus diabetes mellitus akan dapat meningkatkan jumlah sel endotel pada pembuluh darah tikus tersebut, dan diharapkan nantinya hasil dari penelitian ini dapat dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif terapi pada penderita diabetes.
Rumusan Masalah Apakah ekstrak ciplukan (Physalis angulata L.) mempunyai efek terhadap jumlah endotel pembuluh darah pada tikus (Rattus norvegicus) DM (Diabetes mellitus)?
Tujuan Penelitian Untuk mengetahui efek pemberian ekstrak ciplukan (Physalis angulata L.) dalam berbagai dosis mempunyai efek terhadap jumlah endotel pembuluh darah pada tikus (Rattus norvegicus) DM (diabetes mellitus).
Tujuan khusus 1. Untuk mengetahui jumlah sel endotel pada pembuluh darah tikus (Rattus norvegicus) dengan diabetes mellitus dalam berbagai dosis. 2. Untuk mengetahui efek pemberian ekstrak ceplukan terhadap jumlah sel endotel pembuluh darah tikus (Rattus norvegicus) DM (diabetes mellitus) dalam berbagai dosis. 3. Untuk mengetahui dosis optimum ekstrak ceplukan (Physalis angulata L.) terhadap jumlah sel endotel pembuluh darah tikus (Rattus norvegicus) DM (diabetes mellitus).
Manfaat Penelitian 1. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah khasanah ilmu pengetahuan mengenai bahan-bahan alami di lingkungan sekitar yang dapat dimanfaatkan dalam dunia kedokteran. 2. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi sumbangan terhadap ilmu pengetahuan tentang ciplukan (Physalis angulata L.) yang dapat digunakan sebagai acuan untuk penelitian-penelitian selanjutnya 3. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan penejelasan secara ilmiah mengenai efek ciplukan (Physalis angulata L.) sebagai alternatif terapi diabetes mellitus.
Manfaat Klinis Penelitian diharapkan menambah wawasan masyarakat umum mengenai manfaat ceplukan (Physalis angulata L.) sebagai alternatif terapi diabetes mellitus.
Kerangka Konsep
Keterangan : : Efek Inhibisi
Diabetes Mellitus Ekstrak ceplukan Radikal bebas meningkat Memicu stress oksidatif
Kerusakan Membran Sel, Mitokondria, Protein, DNA
Kerusakan Struktur Histologis Dinding Pembuluh Darah ( terutama Sel Endotel)
Kematian dan Lepasnya Sel Endotel dari Dinding Pembuluh Darah
Pada diabetes mellitus akan terjadi keadaan ketidakseimbangan antara antioksidan protektif (pertahanan antioksidan) dan produksi radikal bebas. Pada keadaan ini terjadi peningkatan radikal bebas dalam tubuh penderita. Apabila keadaan ketidakseimbangan antara antioksidan protektif (pertahanan antioksidan) dan produksi radikal bebas tersebut dibiarkan terus menerus akan mengarah kepada keadaan stress oksidatif. Stres oksidatif tersebut akan menyebabkan terjadinya kerusakan membran sel, mitokondria, protein, dan DNA. Hal ini menyebabkan kerusakan struktur histologis dinding pembuluh darah yang menyebabkan kematian dan lepasnya sel endotel dari dinding pembuluh darah. . Dengan pemberian ekstrak ciplukan yang merupakan antioksidan diharapkan dapat menurunkan radikal bebas dengan parameter yaitu meningkatnya jumlah sel endotel dalam pembuluh darah penderita diabetes mellitus.
Hipotesis Penelitian Pemberian Ekstrak Ciplukan dapat meningkatkan jumlah sel endotel pembuluh darah pada tikus (Rattus Norvegicus) DM (Diabetes mellitus).
Rencana Penelitian Penelitian ini dilakukan secara eksperimental di dalam laboratorium. Ranacangan peneitian yang digunakan adalah Randomized Post Test Only Control Group Design untuk mengetahui efek yang diinginkan dan setiap hewan coba mempunyai probabilitas yang sama untuk mendapatkan perlakuan, sehingga dapat menjaga validitas generalisasi ke populusi. Penelitian ini dilakukan untuk memenuhi tujuan penelitian yaitu untuk mengetahui efek ekstrak daun ciplukan (Physalis angulata l.) terhadap jumlah endotel pembuluh darah tikus (Rattus norvegicus) DM (Diabetes mellitus). Pada rancangan ini, efek ekstrak daun ciplukan diamati setelah pemberian ekstrak secara intragastric pada tikus DM. Pada penelitian ini sampel dibagi menjadi 5 kelompok berbeda yang terdiri dari 1 kelompok kontrol dan 4 kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 4 ekor tikus.
Pemilihan Sampel Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar, yang diperoleh dari Laboraturium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang, dengan ketentuan sebagai berikut: a. Jenis kelamin jantan b. Usia 2-3 bulan c. Berat badan 250-400 gr Tikus jenis ini dipilih sebagai sampel karena tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar karena tergolong jinak dan mudah perawatannya. Selain itu alasan tikus putih sebagai hewan coba adalah sebagai berikut : (Pagget and Barnes, 1971) a. Ukurannya kecil b. Memiliki sensitivitas yang tinggi terhadap obat c. Lebih terstandarisasi dibandingkan dengan binatang percobaan lainnya d. Dapat dibiakkan untuk menjaga keaslian dan keseragaman strain e. Sangat kuat jika digunakan percobaan dengan pemberian anastesi f. Tidak muntah karena memiliki pusat pengatur muntah g. Tikus putih merupakan mamalia sehingga mirip dengan manusia
Estimasi Besar Sampel Jumlah replikasi atau jumlah sampel (n) pada setiap perlakuan (p) dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut (Solimun, 2001): p(n-1) 15 pn-p 15 5n-5 15 5n 20 n 4 Dari perhitungan didapatkan n 4, jadi jumlah sample tiap perlakuan minimal 4 ekor tikus (4 kali replikasi). Pada penelitian ini digunakan 4 ekor tikus atau 4 kali replikasi untuk setiap control dan perlakuan. Cara pengambilan sample untuk tiap kelompok dilakukan dengan metode acak sederhana (simple random sampling) untuk mengurangi pengaruh dari variable pengganggu (confounding). Besar sample dalam penelitian ini adalah sebanyak 20 ekor tikus yang dibagi dalam 5 kelompok, masing-masing 4 ekor tikus.
Lokasi dan Waktu Penelitian Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakologi dan Laboraturium Anatomi-Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Waktu Penelitian Pada penelitian ini perlakuan dan pengambilan organ dilakukan mulai bulan oktober 2009 hingga bulan november 2009. Sedangkan pengamatan dan pengambilan data dilakukan pada bulan desember 2009.
Bahan Hewan Coba Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) strain Wistar, jenis kelamin jantan, berumur 2-3 bulan, berat badan 250- 400 gram, dengan kondisi umum sehat yang dapat ditandai dengan gerakan tikus yang aktif. Tikus percobaan diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Hewan coba tersebut dipelihara dalam kandang berukuran 20 cm x 30 cm x 40 cm dimana setiap kandang berisi 2 ekor tikus.
Bahan untuk Pemeliharaan Hewan Coba Makanan hewan coba adalah makanan ternak Confeed PAR-S dicampur dengan terigu dan air serta diberi minum yang berasal dari PDAM.
Bahan untuk Perlakuan a. Bahan Pembuat Tikus DM Bahan yang digunakan untuk membuat tikus menjadi tikus diabet adalah Streptozotosin yang dilarutkan dalam buffer sitrat 0,1 M dengan pH 4,5 yang diinjeksikan secara intra peritoneum (IP) dengan kadar jumlah 60 mg/kgBB. b. Bahan yang Diteliti Bahan yang diteliti adalah daun ciplukan yang sebelumnya sudah dicuci dulu kemudian dikeringkan dengan jalan mengangin-anginkanya di tempat yang teduh. Setelah kering diblender dan diayak dengan ayakan B40 untuk mendapatkan simplisia.
Bahan untuk Pengambilan Organ Bahan yang digunakan untuk pengambilan organ adalah : a. Eter b. Formalin 10%
Bahan untuk Pembuatan Histopatologi Pembuluh Darah Bahan untuk pembuatan sediaan histopatologi adalah : a. Pembuluh darah tikus b. Pewarna Hematoksilin Eosin (HE) c. Alkohol absolute dan alcohol berbagai konsentrasi d. Xilol e. Parafin lunak f. Parafin keras g. Alkohol asam h. Air i. Entelan
Bahan untuk Perhitungan Jumlah Endotel Pembuluh Darah Bahan yang digunakan untuk perhitungan jumlah endotel pembuluh darah tikus DM adalah preparat pembuluh darah tikus yang telah dilakukan pengecatan Hematoksilin Eosin (HE).
Alat untuk Pemeliharaan Hewan Coba Alat yang digunakan dalam pemeliharaan hewan coba adalah: a. Kandang Tikus b. Tempat Makan Tikus c. Tempat Minum tikus d. Kawat kasa e. Sekam
Alat untuk Pengukuran Berat Badan Hewan Coba Untuk mengukur berat badan hewan coba, alat yang digunakan adalah Neraca Ohaus.
Alat Pembuat Ekstrak Ciplukan Alat yang dibutuhkan untuk membuat ekstrak ciplukan adalah : a. Timbangan b. Corong pengestrak c. Etanol d. Rotator evaporator e. Oven
Alat Pemberian Ekstrak Ciplukan Untuk pemberian ektrak ciplukan kepada tikus DM digunakan spuit yang pada ujungnya dipasang sonde.
Alat Pembuat Tikus DM Alat yang digunakan untuk membuat tikus menjadi tikus Diabet adalah : a. Spruit b. Kapas c. Alkohol 70%
Alat Pengukur Kadar Gula Darah Alat yang digunakan untuk mengukur kadar gula darah tikus adalah Alat Pengukur Kadar Gula Digital dengan merk Optium Promega.
Alat Pengambilan Organ Hewan Coba Alat yang digunakan dalam pengambilan organ hewan coba adalah : a. Kotak Tertutup b. Kapas yang dibasahi eter c. Scapel d. Gunting e. Pinset f. Tabung plastik sebagai tempat penyimpanan organ sementara
Alat untuk Pembuatan Sediaan Histopatologi Alat yang digunakan untuk pembuatan sediaan histopatologis adalah : a. Mikrotom Rotate b. Object Glass dan Cover Glass c. Automatic Tissue Processor d. Pencetak Parafin
Alat untuk Perhitungan Jumlah Endotel Alat yang digunakan untuk menghitung jumlah endotel pembuluh darah tikus DM adalah : a. Mikroskop Elektrik Binokular jenis Labhopot b. Mikroskop Olympus Photo Slide BX51 dengan kamera Olympus DP71 12 Megapixel
Variabel Penelitian Variabel Tergantung - Jumlah endotel pembuluh darah tikus DM
Variabel Bebas - Ekstrak daun ceplukan tiga dosis. Skala yang digunakan adalah skala nominal.
Variabel Kendali - Jenis Kelamin Tikus : Jantan - Umur tikus : 2-3 bulan - Berat Badan Tikus : 250-400 gr - Waktu Pengujian : Lama pemberian ekstrak ciplukan - Faktor lingkungan laboraturium - Diet
Definisi Operasional Tikus DM Pada tikus percobaan disuntikkan Streptozotosin yang dilarutkan dalam buffer sitrat 0,1 M dengan pH 4,5 secara intra paritoneum (IP). Setelah itu, setiap 3 hari diukur kadar gula darahnya dengan alat pengukur gula darah digital. Setelah tikus dapat dikatagorikan mengalami diabet (kadar gula darah 300mg/dl) maka dapat segera diberikan ekstrak ceplukan.
Ekstrak daun ciplukan berbagai dosis Ciplukan yang digunakan adalah daun ceplukan yang didapat dari kota Batu yang telah disertifikasi oleh Materia Medika Batu, yang diekstraksi dengan pelarut etanol absolut memakai alat ekstraktor sokhlet dan dibagi menjadi 3 dosis
Jumlah Endotel Pembuluh Darah Jumlah endotel pembuluh darah adalah jumlah endotel yang dihitung pada 10 lapang pandang dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400x (lensa okuler 10, dan lensa obyektif 40). Sel yang dihitung adalah sel endotel yang menempel sebagian ataupun seluruhnya pada dinding pembuluh darah.
Cara Kerja Aklimatisasi Aklimatisasi hewan coba dilakukan pada kandang dalam laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang selama 7 (tujuh) hari.
Pembagian Kelompok Hewan Coba Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok yaitu 1 (satu) kelompok kontrol dan 4 (empat) kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 4 (empat) ekor tikus dengan rincian sebagai berikut: - Kelompok 1 : Tikus tidak DM dan tanpa pemberian ekstrak daun ciplukan (Kelompok Kontrol). - Kelompok 2 : Tikus DM tanpa pemberian ekstrak daun ciplukan selama 1 bulan - Kelompok 3 : Tikus DM + pemberian ekstrak daun ciplukan dosis 1 (500mg/kgBB) - Kelompok 4 : Tikus DM + pemberian ekstrak daun ciplukan dosis 2 (1500mg/kgBB) - Kelompok 5 : Tikus DM + pemberian ekstrak daun ciplukan dosis 3 (2500mg/kgBB)
Prosedur Pembuatan Tikus yang DM 1. Tikus yang telah dipersiapkan, diukur berat badan dan diukur kadar gula darah sewaktu. 2. Tikus diinjeksikan dengan Streptozotosin (STZ) 60mg/KgBB intra peritoneal (IP). Dilakukan perawatan tikus dan pemberian makanan seperti biasa. Kandang dan air minum diganti setiap harinya. 3. 1 x 24 jam setelah injeksi STZ, diberikan injeksi insulin 1 unit secara intra peritoneal pada beberapa tikus selama 1 minggu untuk pengadaptasiannya. 4. 2 x 24 jam setelah injeksi STZ, diukur kadar gula darah sewaktu . Tikus dinyatakan positif DM jika kadar gula darah 300mg/dl. 5. Setelah tikus dapat beradaptasi (1 minggu) injeksi insulin diberikan .
Prosedur Pengukuran Kadar Gula Darah Tikus Untuk mengukur kadar gula darah dari tikus dilakukan secara pengukuran gula darah sewaktu dengan cara mengambil darah dari ekor tikus kemudian darah tersebut diletakkan pada stick yang dihubungkan dengan alat pengukur gula darah digital lalu tunggu beberapa saat hingga muncul hasilnya pada layar alat.
Ekstraksi daun ciplukan Untuk mendapatkan ekstrak kasar daun ciplukan dilakukan proses ekstraksi. Proses ekstraksi tersebut adalah sebagai berikut: 1. Simplisia (bubuk kering) ciplukan yang telah ditimbang beratnya, dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan dalam corong pengekstrak. 2. Simplisia ciplukan direndam dengan pelarut etanol untuk mengeluarkan senyawa- senyawa yang terkandung dalam daun ceplukan. Perendaman dengan larutan etanol dilakukan minimal sehari semalam. Larutan hasil rendaman disisihkan dan simplisia dapat direndam kembali dengan pelarut etanol yang baru. Pekerjaan ini dilakukan berulang-ulang sampai didapatkan larutan yang cukup atau sampai larutan bewarna jernih. 3. Larutan hasil rendaman ditampung dan dibiarkan mengendap. Endapan dipisahkan dari larutan yang tidak mengendap. 4. Larutan yang tidak mengendap ditampung dan dikeringkan dengan rotary evaporator pada suhu 70-80 o C hingga diperoleh ekstrak kental. 5. Ekstrak kental dioven pada suhu 70 o C untuk menghilangkan pelarut etanol yang tersisa.
Pemberian Ekstrak Daun Ciplukan Pemberian ciplukan secara intragastric dengan menggunakan spuit yang pada ujungnya dipasang sonde yang dapat dimasukkan melalui mulut sampai ke lambung tikus.
Prosedur Pengambilan Organ Pembuluh Darah Tikus Tikus yang akan dibedah, dianastesi terlebih dahulu dengan cara dimasukkan ke dalam kotak tertutup yang didalamnya terdapat kapas yang telah dibasahi larutan eter. Tikus dibiarkan lemas, kemudian dibedah dan diambil pembuluh darahnya sepanjang 2 cm. Potongan ini kemudian di fiksasi dalam larutan formalin 10% untuk kemudian dibuat sediaan histopatologis dengan pengecatan HE.
Pembuatan preparat histopatologi Pembuatan preparat histopatologi dilakukan di laboratorium Anatomi- Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dengan metode iris yang kemudian dilakukan pengecatan Hematoksilin-Eosin (HE). 1. Dilakukan pencucian dengan aquadest untuk menghilangkan bahan fiksasi 2. Dilakukan dehidrasi untuk mengangkat air dari jaringan dengan merendam pada alkohol bertingkat, yaitu pada konsentrasi 70%, 80%, 85%, 90%, 96% masing- masing selama 1 jam. Setelah itu direndam dengan alkohol absolute selama 2x1 jam 3. Dilakukan clearing (penerawangan) untuk memisahkan alcohol dari jaringan dengan xilol 3 kali selama 1 jam. 4. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin lunak pada suhu 42-46 o C, 2 kali selama 1 jam. 5. Dilakukan blocking selama 1 jam dengan menggunakan paraffin keras pada suhu 46- 52 o C. 6. Dilakukan pemotongan blok paraffin menggunakan mikrotom rotate 7. Hasil sayatan blok paraffin diletakkan pada air dengan suhu 35 o C dan dibubuhi gelatin secukupnya kemudian dipasang pada kaca obyek. 8. Dilakukan deparafinisasi untuk memisahkan paraffin dari jaringan yaitu dengan perendaman xilol 3 kali selama 5 menit , kemudian pada alcohol bertingkat dengan urutan 80%, 85%, 90%, 96%, alcohol absolute, dan air mengalir masing-masing selama 3 menit. 9. Dilakukan pengecatan Hematoksilin-Eosin dengan prosedur : a. Pemberian hematoksilin selama 10 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 menit. b. Deparafinasi pada alkohol asam selam 3-10 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir hingga warnanya menjadi biru c. Sediaan dimasukkan ke dalam larutan eosin selama 3-5 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 menit. d. Dilakukan dehidrasi dengan lakohol bertingkat dengan konsentrasi 70%, 85%, 95%, dan alkohol absolute masing-masing selama 5 menit. e. Pemberian Xilol selama 2 x 5 menit. f. Mounting menggunakan entelan kemudian dipasang deck glass.
Prosedur Penghitungan Jumlah Endotel Jumlah endotel yang dihitung pada 10 lapang pandang dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400x (lensa okuler 10, dan lensa obyektif 40). Sel yang dihitung adalah sel endotel yang menempel sebagian ataupun seluruhnya pada dinding pembuluh darah. Hasil pada 10 lapang pandang tersebut kemudian di rata- rata.
Alur Penelitian
Keterangan : DM = Diabetes Mellitus EC = Ekstak Ciplukan 20 ekor tikus strain wistar Randomisasi tikus ke dalam 5 kelompok Perlakuan 3 DM (+) EC (+)dosis 2 (1500mg/kgBB) Perlakuan 4 DM (+) EC (+) dosis3 (2500mg/kgBB) Perlakuan 2 DM (+) EC (+) dosis 1 (500mg/kgBB) Kontrol DM (-) EC (-) Perlakuan 1 DM (+) EC (-) Tikus Dianastesi Pembuluh Darah diambil 2cm Dibuat sediaan Histoptologis Penghitungan sel Endotel pembuluh darah Hasil Analisis Data dan Kesimpulan Analisis Data Data yang diperoleh sesuai dengan pembagian kelompok dianalisa menggunakan : 1. Uji Homogenitas varian dan Distribusi normal Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah data yang telah diperoleh memenuhi syarat untuk uji ANOVA. 2. Uji statistik dengan metode one-way ANOVA (analisa varian satu arah) Bertujuan untuk menilai apakah terdapat perbedaan yang bermakna dalam jumlah endotel antara kelompok Kontrol dengan kelompok Perlakuan. 3. Analisis Post-Hoct LSD Bertujuan untuk menilai apakah terdapat perbedaan yang bermakna dari hasil tes ANOVA. 4. Uji korelasi Pearson Bertujuan untuk menilai apakah terdapat hubungn yang nyata antara perbedaan dosis dengan jumlah endotel pembuluh darah tikus. Seluruh proses analisa dilakukan dengan menggunakan program SPSS 12,0 for Windows pada taraf kepercayaan 95% (=0,05).