ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

OBJETIVO

Separar mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa molculas de ADN
obtenidas de diferentes tipos de muestras.

ALCANCE

Este documento se debe tomar como referencia nica para la separacin de ADN por
medio de electroforesis horizontal en geles de agarosa en el Laboratorio de Biologa
Molecular.

RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad del director del laboratorio verificar la aplicacin y cumplimiento
de este documento por parte de profesores, estudiantes y pasantes.

FRECUENCIA

Este documento se debe tomar como referencia nica cada vez que se requiera
separar ADN por medio de electroforesis horizontal en geles de agarosa.


CONDICIONES GENERALES

BIOSEGURIDAD

Este protocolo debe realizarse con elementos de proteccin tales como bata, gafas
contra luz ultravioleta (U.V) y doble guante.
Bromuro de Etidio: Mutgeno. Nocivo si se ingiere o se inhala. Irritante para la piel,
ojos y vas respiratorias.








MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos de reactivos qumicos y sus empaques deben ser pesados y entregados a
la empresa encargada de su inactivacin. Todos los elementos contaminados con
bromuro de etidio deben pasar por un proceso de descontaminacin con carbn
activado.

CONDICIONES ESPECFICAS

El bromuro de etidio es una sustancia cancergena, por lo cual su manipulacin
requiere entrenamiento previo.
Se debe evitar tiempos largos de exposicin a la luz U.V, aun cuando se disponga de
las gafas apropiadas.

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Luque J & Herrez A. Texto ilustrado de biologa molecular e ingeniera gentica.
Conceptos, tcnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Primera Edicin.
Editorial Harcourt S.A. Madrid. Espaa. 2001.
Puerta C & Urea C. Prcticas de Biologa Molecular. Primera Edicin. Editorial
Coleccin Biblioteca del Profesional. Pontificia Universidad Javeriana. Colombia.
2005.
Sambrook JF & Rusell DW. Molecular Cloning: a laboratory manual. Tercera
Edicin. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York. USA. 2001.

CONTENIDO

FUNDAMENTO

La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo bastante utilizado para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN (Sambrook, Rusell, 2001). La agarosa es un
polmero lineal extrado de algas marinas, en el cual las molculas de ADN de doble
cadena migran de manera inversamente proporcional al logaritmo en base 10 (log 10)
de sus tamaos moleculares. Dado que el ADN est cargado negativamente debido a
los grupos fosfato de la molcula, la migracin en la cmara de electroforesis ocurre
del polo negativo al polo positivo (Puerta, Urea, 2005).




Entre los factores que afectan la tasa de migracin del ADN en los geles de agarosa se
incluyen: el tamao del fragmento, concentracin de agarosa, la conformacin del
ADN, voltaje aplicado y amortiguador utilizado (Puerta, Urea, 2005).

Las molculas de ADN de 50 pares de bases (pb) a varias megabases en longitud
pueden ser separadas en geles de agarosa de varias concentraciones y
configuraciones. Fragmentos pequeos de ADN (50 20000 pb) son separados en
geles de agarosa corridos en configuracin horizontal en un flujo elctrico de fuerza y
direccin constante. Bajo estas condiciones, la velocidad de los fragmentos de ADN
decrece a medida que incrementa la longitud de estos y es proporcional a la fuerza del
flujo elctrico (Sambrook, Rusell, 2001).

DEFINICIONES

ADN: cido desoxirribonucleico, polmero de nucletidos unido por un esqueleto de
fosfato - desoxirribosa. El material gentico de la clula.

Electroforesis: es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos
nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica.

Gel de agarosa: polmero inerte que se usa para separar macromolculas, por
ejemplo cidos nuclecos y protenas por electroforesis.

MATERIALES

Reactivos
Agarosa grado biologa molecular.
Agua destilada.
Amortiguador de muestra 6x (0,25 % (p/v) azul de bromofenol 0,25 % (p/v)
Xilene cianol FF 30% (v/v) glicerol).
Amortiguador TAE 50x (2 M Tris base 0,9 M cido actico 50 mM EDTA pH
8,0).
Amortiguador TAE 1x.
Bromuro de etidio (0,5 g/ml).

Equipos
Balanza
Cmara de electroforesis.
Fuente de poder.



Horno microondas.
Micropipetas.
Transiluminador.

Materiales
Peines.
Puntas azules y amarillas para micropipetas.

PROCEDIMIENTO

1. Para la preparacin del gel: Pesar la cantidad de agarosa adecuada dependiendo
del porcentaje y volumen del gel que se va utilizar. Por ejemplo, para un gel de 100
ml al 1%, pesar 1 g de agarosa y diluir en 100 ml de amortiguador TAE 1x (98 ml
de agua destilada y 2 ml de amortiguador TAE 50x).
2. Calentar la solucin en horno microondas durante 1 minuto y medio hasta que la
agarosa se disuelva bien, dejar enfriar un poco y servir en el soporte del gel
colocando los peines adecuados.
3. Esperar de 40 a 60 minutos para la gelificacin de la agarosa y colocar en la
cmara de electroforesis.
4. Adicionar el amortiguador TAE 1x a la cmara de electroforesis cubriendo la
totalidad del gel.
5. Sembrar las muestras usando amortiguador de muestra 1x (si la muestra tiene 10
l se le adicionan 2 l de amortiguador de muestra 6x).
6. Conectar la fuente de poder y correr a 100 voltios.
7. Desconectar la fuente de poder una vez el frente de corrido haya alcanzado el polo
positivo.
8. Colorear el gel con bromuro de etidio (Colocar el gel en un recipiente con bromuro
de etidio a 0,5 g/ml y dejar en agitacin durante 15 minutos).
9. Visualizar en transiluminador de luz U.V (302 nm).
10. Tratar tanto la solucin de bromuro de etidio y el gel con carbn activado.




ELECTROFORESIS DE RNA EN GEL DENATURANTE CON
FORMALDEHIDO

OBJETIVO

Separar los distintos RNA celulares segn su tamao molecular.

ALCANCE

Este documento se debe tomar como referencia nica para la separacin de ARN de
las clulas eucariotas empleando para tal fin una electroforesis en gel de agarosa
denaturante con formaldehido en el Laboratorio de Biologa Molecular.

RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad del director del laboratorio verificar la aplicacin y cumplimiento
de este documento por parte de profesores, estudiantes y pasantes.

FRECUENCIA

Este documento se debe tomar como referencia nica cada vez que se requiera
separar ARN mediante electroforesis en gel de agarosa denaturante.


CONDICIONES GENERALES

BIOSEGURIDAD

Este protocolo debe realizarse con elementos de proteccin tales como bata, gafas de
seguridad y guantes.
Formaldehido: Evitar la generacin de vapores/aerosoles. Trabajar en cabina
extractora. No inhalar.
Bromuro de Etidio: Mutgeno. Nocivo si se ingiere o se inhala. Irritante para la piel,
ojos y vas respiratorias.







MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos de reactivos qumicos y sus empaques deben ser pesados y entregados a
la empresa encargada de su inactivacin. Todos los elementos contaminados con
bromuro de etidio deben pasar por un proceso de descontaminacin con carbn
activado.

CONDICIONES ESPECFICAS

Todo el material empleado debe estar libre de ARNasa y todos los reactivos deben
ser exclusivos para la electroforesis de ARN y preparados con agua tratada con
DEPC (Diethylpyrocarbonate).
No utilizar el DEPC con Tris o Hepes, estos inhiben su atenuacin.


DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Harwood A. Basic DNA and RNA protocols. Primera Edicin. Editorial Humana
Press Inc. 1996.
Sambrook JF & Rusell DW. Molecular Cloning: a laboratory manual. Tercera
Edicin. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York. USA. 2001.
Gmez JE, Gonzlez A, Castao JC, Patarrollo MA. Biologa Molecular: principios y
aplicaciones. Primera Edicin. Corporacin para Investigaciones Biolgicas, CIB.
Medelln. 2011.

CONTENIDO

FUNDAMENTO

El trmino electroforesis se utiliza para describir la migracin de una molcula o
partcula cargada ya sea de cidos nucleicos o aminocidos, bajo la influencia de un
campo elctrico. Esta tcnica permite identificar y separar fragmentos de
macromolculas de diferentes tamaos y se basa en la aplicacin de voltaje en los
extremos de un gel (soporte) generado por un campo elctrico con una fuerza definida
por el tamao del gel y la diferencia de potencial en los extremos (V/cm).

Una de las caractersticas de los cidos nucleicos es que estn cargados negativamente
(debido a los grupos fosfato). Una vez el cido nucleico es expuesto al campo elctrico
y en soluciones taponadas migran hacia el nodo (positivo). La velocidad de migracin



de la molcula est limitada por las fuerzas de friccin ejercidas por el gel. Cada
molcula aporta una carga negativa y la relacin carga/masa de cada molcula es la
misma independiente del tamao, por lo tanto, la migracin o movilidad de los cidos
nucleicos en un gel va a depender del tamao o conformacin, as como del poro del
gel, el que a su vez depende de la concentracin de polmero utilizada (agarosa).
Basados en lo anterior, la electroforesis de cidos nucleicos es el mtodo ms utilizado
para separar, identificar y purificar molculas o fragmentos de ADN y ARN (Tomado
de Gmez et al. 2011).

DEFINICIONES

ARN: cido ribonucleco, polmero lineal de nucletidos formando una larga cadena.
El eje de la cadena lo forman grupos fosfato y azcares ribosa.

Electroforesis: es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos
nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica.


MATERIALES

Reactivos
Agua tratada con DEPC.
Agarosa grado biologa molecular.
Formaldehido 37% (12,3 M).
Amortiguador de muestra 6x (0,25 % (p/v) azul de bromofenol 0,25 % (p/v)
Xilene cianol FF 30% (v/v) glicerol).
Amortiguador de carga (1 vol. de amortiguador de muestra 1/2 vol. de
bromuro de etidio (1 mg/ml)).
Amortiguador de corrido 1x (20 mM MOPS 5 mM Acetato de sodio pH 6.25
1 mM EDTA pH 8).
Gel denaturante con formaldehido (1% (p/v) agarosa 20 mM MOPS pH 7 5
mM Acetato de sodio pH 6,25 1 mM EDTA pH 8 2 M formaldehido).

Equipos
Balanza
Cmara de electroforesis.
Fuente de poder.
Horno microondas.
Micropipetas.



Transiluminador.

Materiales
Puntas azules y amarillas para micropipeta.
Tubos ependorff.

PROCEDIMIENTO

Preparacin del gel

1. Disolver 1 gr de agarosa en 81 ml de agua y calentar hasta ebullicin.
2. Aadir 4 ml de MOPS (0,5 M pH 7), 0,167 ml de Acetato de sodio (3 M pH 6,25) y
0,2 ml de EDTA (0,5 M pH 8) en agitacin a temperatura ambiente.
3. Aadir el formaldehido 37% (16,7 ml) momentos antes de verter el gel sobre el
molde, ya que este se degrada con el calor.
4. Dejar gelificar.
5. Colocar el gel en la cmara de electroforesis (tener en cuenta que se debe colocar
momentos antes de servir las muestras).
6. Adicionar el amortiguador de corrido (tener cuidado de no cubrir totalmente el gel
para evitar la dilucin del formaldehido).

Preparacin de las muestras de ARN

1. Prepara las muestras de ARN en tubos eppendorff (10 g ARN total + 15 l de
formamida desionizada + 6 l de formaldehido 37%).
2. Mezclar
3. Denaturar durante 8 min a 65C.
4. Aadir a cada muestra 1 l de amortiguador de carga.
5. Cargar las muestras en el gel y aplicar una corriente de 100 120 voltios.
6. Visualizar en transiluminador de luz U.V (302 nm).









EXTRACCIN DE ARN DE PARSITOS CON TRIZOL

OBJETIVO

Extraer ARN de clulas eucariotas empleando para tal fin trizol.

ALCANCE

Este documento se debe tomar como referencia nica para la extraccin de ARN de
clulas eucariotas empleando para tal fin trizol en el Laboratorio de Biologa
Molecular.

RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad del director del laboratorio verificar la aplicacin y cumplimiento
de este documento por parte de profesores, estudiantes y pasantes.

FRECUENCIA

Este documento se debe tomar como referencia nica cada vez que se requiera extraer
ARN de clulas eucariotas empleando para tal fin trizol.

CONDICIONES GENERALES

BIOSEGURIDAD

Este protocolo debe realizarse con elementos de proteccin tales como bata, gafas de
seguridad y guantes.
DEPC: Es un detergente extremadamente toxico. Manipular nicamente con guantes y
mascara. La vida media es de 30 minutos, despus de autoclavado el DEPC es
hidrolizado a etanol y CO2.

MANEJO DE RESIDUOS

Los desechos de cultivo de clulas deben ser inactivados con solucin de hipoclorito
de sodio al 10% durante 30 minutos y posteriormente recolectados en recipientes
plsticos de color rojo rotulados con riesgo biolgico para su eliminacin. Los



residuos de reactivos qumicos y sus empaques deben ser pesados y entregados a la
empresa encargada de su inactivacin.

CONDICIONES ESPECFICAS

Todo el material empleado debe estar libre de ARNasa y todos los reactivos deben
ser exclusivos para la extraccin de ARN y preparados con agua tratada con DEPC
(Diethylpyrocarbonate).
El etanol debe ser diludo con agua DEPC.
El trizol debe permanecer a pH entre 4,0 y 5,0.

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Devlin T. Bioqumica. Cuarta Edicin. Editorial Reverte. Barcelona. Espaa. 2000.
Harwood A. Basic DNA and RNA protocols. Primera Edicin. Editorial Humana
Press Inc. 1996.
Invitrogen. Trizol Reagent. 2007.
Sambrook JF & Rusell DW. Molecular Cloning: a laboratory manual. Tercera
Edicin. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York. USA. 2001.
Gmez JE, Gonzlez A, Castao JC, Patarrollo MA. Biologa Molecular: principios y
aplicaciones. Primera Edicin. Corporacin para Investigaciones Biolgicas, CIB.
Medelln. 2011.

CONTENIDO

FUNDAMENTO

El cido ribonucleico (ARN) es una macromolcula de cido nucleico sintetizado por la
enzima ARN polimerasa a partir de una cadena de ADN. Est compuesto por los
nucletidos guanina, citosina, adenina y uracilo, un azcar ribosa y un grupo fosfato
que mediante enlaces fosfodister forman el esqueleto del ARN. La estructura
primaria es similar a la del ADN, pero a diferencia de este el ARN contiene en el
carbono 2 de la ribosa un tomo de oxigeno, que le confiere la propiedad de ser
qumicamente mas reactiva (Gmez et al, 2011).

Hay tres tipos principales de ARN en la clula, el ARN ribosmico (ARNr) que se
encuentra en los ribosomas (estructuras especializadas situadas en los puntos de
sntesis de protenas); el ARN de transferencia (ARNt) que lleva los aminocidos a los
ribosomas para incorporarlos a las protenas y el ARN mensajero (ARNm) que lleva
una copia del cdigo gentico obtenida a partir de la secuencia de bases del ADN



celular y que se encarga de especificar la secuencia de aminocidos de las protenas.
Los tres tipos de ARN se forman a medida que son necesarios, utilizando como
plantilla secciones determinadas del ADN celular (Devlin, 2000).
El trizol es un reactivo para el aislamiento del ARN total de clulas y tejidos. Es una
solucin monofsica de fenol e isotiocianato de guanidina. Durante la homogenizacin
o lisis de las muestras el trizol mantiene la integridad del ADN, mientras se destruyen
las clulas y se disuelven los componentes celulares. La adicin de cloroformo seguida
por centrifugacin separa la solucin en una fase acuosa y una fase orgnica. El ARN
resultante queda exclusivamente en la fase acuosa. Despus de recoger la fase acuosa
el ARN es recuperado por precipitacin con alcohol isopropilico (Invitrogen, 2007).

DEFINICIONES

ARN: cido ribonucleco, polmero lineal de nucletidos formando una larga cadena.
El eje de la cadena lo forman grupos fosfato y azcares ribosa.

MATERIALES

Reactivos

Agua tratada con DEPC (1:1000).
Cloroformo.
Etanol al 75%.
Isopropanol.
Trizol.

Equipos

Centrfuga refrigerada.
Congelador.
Micropipetas.

Materiales

Puntas azules y amarillas para micropipeta.
Tubos ependorff.






PROCEDIMIENTO

1. Partir de un cultivo crecido (fase exponencial) entre 50x10
6
parsitos/ml y
5x10
8
parsitos/ml. (El volumen de la muestra no debe exceder el 10% del
volumen de trizol).
2. Centrifugar el cultivo a 2500 rpm durante 15 minutos, descartar el
sobrenadante y resuspender el "pellet" en 1 ml de trizol.
3. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Adicionar 0,2 ml de cloroformo por cada ml de trizol adicionado.
5. Agitar las muestras por inversin e incubar por 3 minutos a temperatura
ambiente.
6. Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos a 4C.
7. Tomar el sobrenadante (incoloro), tener cuidado de no tomar la interfase
blanca (tejidos) ni el precipitado de color rosado (ADN).
8. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo (aproximadamente 600 l).
9. Adicionar 500 l de isopropanol por cada ml de trizol utilizado y mezclar por
inversin.
10. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
11. Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos a 4C.
12. Remover el sobrenadante (el ARN se encuentra en el fondo).
13. Lavar el ARN con 1 ml de etanol al 75% por cada ml de trizol utilizado.
14. Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos a 4C.
15. Descartar el sobrenadante.
16. Dejar secar el ARN con el tubo abierto durante 10 minutos a temperatura
ambiente.
17. Disolver el ARN en 50 l de agua de agua tratada con DEPC.
18. Cuantificar por espectrofotometra.
19. Almacenar a -70C.




EXTRACCION DE ARNm DE L. braziliensis USANDO Dynabeads
Oligo dT(25)


OBJETIVO
Capturar ARNm, por afinidad con la cola de poli A.

ALCANCE
Este documento se debe tomar como referencia nica para la captura de ARNm a
partir de promastigotes de cultivo de L. braziliensis en el Laboratorio de Biologa
Molecular.

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

http://wk.veritastk.co.jp/veritas_web/attached/923/61002_05_50DynabeadsOlig
o(dT)25(rev006).pdf.
RNA Methodologies, Fourth Edition: Laboratory Guide for Isolation and
Characterization By Robert E. Farrell Jr. Publisher: Academic Press 2009-10-08 |
744 Pages | ISBN: 0123747279 | PDF

CONTENIDO
FUNDAMENTO

La cola de poli (A), es una extensin de nucletidos de adenosina que caracteriza al
extremo 3 de la mayora, pero no todas las molculas de ARN mensajero (ARNm)
eucariota. La longitud de la cola poli (A) es variable entre los ARNm, incluso entre las
molculas de ARN que fueron sintetizados por la transcripcin del mismo locus. El
promedio de la cola de poli (A) en mamferos es de 200 nucletidos (nts) de largo,
aunque esta puede variar desde 50 a 300 nts. Todas las molculas de ARN que poseen
cola de poli (A) se conocen colectivamente como ARNm poly (A
+
) o ARNm
poliadenilado.

Con el fin de separar ARN poliadenilado de ARN no poliadenilado, se aprovecha la
ocurrencia natural de puentes de hidrgeno entre las bases adenina y timina. Aislando
fracciones relativamente pequeas de ARNm poli (A
+
) del ARN celular total o
citoplasmtico.

La separacin se realiza con oligo (dT) covalentemente unido a una variedad de
matrices de soporte, en este caso Dynabeads utiliza para la captura perlas



superparamagnticas, de 2,8 mm de dimetro, con una capa de poliestireno que
encierra las partculas de xido de hierro (Fe2O3). Estas partculas forman un dipolo
magntico cuando se exponen a un campo magntico. Cadenas de deoxitimidina de 25
nucletidos de longitud, se han unido covalentemente a la superficie de las perlas por
su extremo 5.

Una mezcla de ARN total agregada a las perlas en condiciones de alta fuerza inica
favorecer la hibridacin entre ARN poliadenilado y el oligo (dT) (Fig. 1). Una Alta
fuerza inica (concentracin de sal) es necesaria para eliminar la repulsin
electrosttica que se produce de forma natural entre el ARNm poli (A
+
) y los residuos
de timidilato que estn unidos a las perlas. En condiciones de alto contenido de sal, un
catin monovalente acta como contra-in, neutralizando la carga negativa neta
intrnseca al esqueleto de enlaces fosfodister del ARN.





Figura 1. Tomada de RNA Methodologies.

Las partculas magnticas y el ARNm poli (A
+
) unido, se recogen colocando el tubo en
la proximidad de un imn. Se realizan lavados, y en seguida la elucin utilizando una
combinacin estndar de temperatura y un bfer con muy bajo contenido de sales. A
falta de un medio de alta concentracin de sal, la repulsin electrosttica es
suficiente para evitar el apareamiento de bases y de esta manera se logra la
purificacin del mRNA poli (A
+
). Las principales ventajas de esta tcnica son el
aislamiento rpido de ARNm poli (A
+
) de alta pureza, intacto y concentrado.

Por qu purificar ARNm? Hay que recordar que slo una pequea fraccin de todos
los transcritos maduros en el citoplasma es ARNm, por lo general en el orden de dos a



tres por ciento. La razn para la purificacin del ARNm, es quitar el ARN ribosomal
(ARNr) y el ARN de transferencia (ARNt), para aumentar la proporcin estadstica de
uno o varios de los ARNm en una muestra en funcin de la cantidad total de ARN
purificado. Cualquier enfoque de esta naturaleza se conoce como una estrategia de
enriquecimiento. Razones a favor del enriquecimiento de ARNm es aumentar la
sensibilidad de los ensayos de transcripcin como el anlisis de Northern blot, el
ensayo de proteccin de nucleasas, o de la RT-PCR, (2) producir un ADNc altamente
representativo. Al aumentar la representacin estadstica se incrementa la
probabilidad de identificar ARNm raros en una membrana, en una librera de ADNc, o
por RT-PCR.


DEFINICIONES
Adenina: Una purina que normalmente hace pares de bases con la timina en el ADN o
uracilo en el ARN.
Adenosina: Un nuclesido que contiene la base de adenina.
Anin: Un tomo o molcula que tiene una carga negativa. Aniones se forman por la
adquisicin de electrones de un tomo.
ADNc (ADN complementario): ADN sintetizado in vitro por la transcripcin reversa
de una plantilla de ARN. ADNc puede ser de cadena sencilla o de doble cadena.

MATERIALES

Reactivos

H2O Milli-Q (agua destilada, des-ionizada y esterilizada).
Dietil Pirocarbonato (DEPC).
Inhibidor de ARNasas.
Dynabeads oligo (dT) 25
Tampn de unin
Tampn de Lisis/unin
Tampn de lavado A
Tampn de lavado B
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
Solucin de reacondicionamiento:
Tampn de almacenamiento Oligo (dT)25




Equipos

Bao seco
Horno de hibridacin
Micropipetas
Gradilla magntica

Materiales

Puntas azules y amarillas para micropipetas
Tubos falcon de 1.5 ml.


PREPARACIN DE SOLUCIONES Y TAMPONES

Todos los tampones comunes para la purificacin de ARNm y el aislamiento se pueden
utilizar con Dynabeads oligo (dT)25. Sin embargo para sacar el mximo provecho de
las propiedades nicas de las perlas, se describen a continuacin los tampones
recomendados. Todos los amortiguadores deben estar a temperatura ambiente antes
de usarlos, excepto el 10 mM Tris-HCl.

Tampn de unin:

20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA

Tampn de Lisis/unin:

100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol
(DTT). Si se observa cualquier precipitacin, calentar a temperatura
ambiente y agitar hasta que todos los componentes se resuspendan totalmente. (En el
momento de ser usado, adicionar inhibidor de ARNasas a concentracin final de 100
U/ml).

Tampn de lavado A:

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS.

Tampn de lavado B:

10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ,0.15 M LiCl, 1 mM EDTA.




Solucin de re-acondicionamiento:

0.1 M NaOH


Tampn de almacenamiento Oligo (dT)25:

250 Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM EDTA, 0.1% Tween-20, 0.02% NaN3.


PROCEDIMIENTO

LAVADO

Este procedimiento dura aproximadamente 10 minutos

1. Resuspender las perlas (Dynabeads oligo (dT)25) en el vial para obtener una
suspensin uniforme de color marrn, y transfiera 100 l (0.5 mg) a un tubo
eppendorf de 1.5 ml.

2. Se coloca el tubo en un imn (Dynal MPC) por 1-2 min. Las perlas
(Dynabeads (dT)25) migrarn hacia el lado del tubo ms cercano al imn.

3. Eliminar el sobrenadante con una pipeta, mientras que el tubo permanece en el
imn.

4. Retire el tubo del imn y aada 100 l de bffer de unin para resuspender las
perlas. Una vez ms colocar el tubo en el imn durante 1 min.

5. Eliminar el sobrenadante, mientras que el tubo permanece en el imn.

6. Resuspender las perlas en 100 l de tampn de unin.


PREPARACIN DE LISADO A PARTIR DE CULTIVO CELULAR

1. Lave la suspensin de clulas en solucin (PBS) y centrifugue para obtener un
pellet de clulas. El sedimento celular se puede utilizar inmediatamente o se
almacenan a -80 C para su uso posterior.




2. Aadir 1,0 ml de tampn de lisis/unin (100u/ml RNAse out) al pellet de
clulas (1-4 x 10
6
clulas). Pipetear suavemente durante 5 minutos. La
liberacin de ADN durante la lisis resulta en una solucin viscosa que confirma
la lisis completa.
3. El lisado ya est listo para el aislamiento del ARNm o puede ser congelado
y almacenado a -80 C para su uso posterior.


AISLAMIENTO DEL ARNm A PARTIR DE LISADO CRUDO

1. Eliminar el tampn de unin de las perlas (Dynabeads oligo (dT)25 )
previamente lavadas y aadir el lisado obtenido anteriormente.

2. Mezclar las perlas y el lisado. Permitir el alineamiento de los ARNm
poliadenilados al poli T25 que esta covalentemente unido a las perlas,
mezclando por inversin durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Coloque el vial en el imn durante 2 minutos y retire el sobrenadante.

4. Lave las perlas dos veces, usando el imn para separarlas del sobrenadante,
primero con tampn de lavado A (1 ml) y luego con Tampn de Lavado B (1
ml). El lavado se realiza a temperatura ambiente. Las perlas se deben mezclar a
fondo en el tampn de lavado para eliminar los contaminantes. Asegurar que
se elimine el sobrenadante completamente entre lavados.

5. Si el ARNm aislado se va a utilizar en aplicaciones enzimticas (por ejemplo, la
sntesis en fase slida ADNc), lavar una vez ms con Tampn de Lavado B (1
mL l), a 37C.

6. Para eluir el ARNm de las perlas, primero eliminar el buffer B y agregar 20 l
de H2O MQ DEPC. Incubar a 80 C durante 3 minutos, luego colocar el tubo en
el imn y transferir rpidamente el sobrenadante que contiene el ARNm a
un nuevo tubo libre de RNasas. El rendimiento final puede variar entre tejidos
y clulas en funcin de la abundancia de ARNm.


Regeneracin y re-uso de Dynabeads Oligo (dT)25

El oligo (dT)25 esta covalentemente unido a la superficie de la Dynabeads. Esto
permite la hibridacin en un solo paso, y tambin permite la regeneracin de las



perlas para su uso mltiple. Las perlas se pueden reutilizar cuatro veces sin prdida
de rendimiento. Cuando el ARNm es aislado de la misma muestra, las perlas se pueden
reutilizar sin regeneracin.

Para evitar el arrastre de ARNm entre diferentes muestras las perlas deben ser
lavadas tres veces en 200 l de solucin de reacondicionamiento.

Incubar a 65 C durante 2 minutos en el primer lavado. Luego lavar con 200 l de
bffer oligo (dT)25 de almacenamiento y continuar con los lavados hasta que el pH este
por debajo de 8.0. Volver a suspender las perlas en el volumen deseado de bffer oligo
(dT)25 de almacenamiento. Las perlas son regeneradas y listas para el aislamiento de
ARNm. Almacenar las perlas de 2 a 8 C. No mezclar perlas regeneradas con la
originales.




REACCIN EN CADENA DE LA ADN POLIMERASA (PCR)
CONVENCIONAL

OBJETIVO

Amplificar molculas de ADN in vitro empleando para tal fin la reaccin en cadena de
la ADN polimerasa (PCR), convencional.

ALCANCE

Este documento se debe tomar como referencia nica para la amplificacin de
molculas de ADN por clonacin in vitro empleando para tal fin la reaccin en cadena
de la ADN polimerasa (PCR) el Laboratorio de Biologa Molecular.

RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad del director del laboratorio verificar la aplicacin y cumplimiento
de este documento por parte de profesores, estudiantes y pasantes.

FRECUENCIA

Este documento se debe tomar como referencia nica cada vez que se requiera
amplificar molculas de ADN por clonacin in vitro empleando para tal fin la reaccin
en cadena de la ADN polimerasa (PCR).

CONDICIONES GENERALES

BIOSEGURIDAD

Este protocolo debe realizarse con elementos de proteccin tales como bata, gafas de
seguridad y guantes.

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos de reactivos qumicos y sus empaques deben ser pesados y entregados a
la empresa encargada de su inactivacin.





CONDICIONES ESPECFICAS

Utilizar material nuevo y estril de uso exclusivo para PCR.
Utilizar agua Milli-Q (destilada, des-ionizada y esterilizada).
Hacer alcuotas de las soluciones, mantenerlas en un congelador de uso exclusivo
para PCR o en su defecto en una caja de plstico a -20C separada del resto de
reactivos.
Antes de montar la reaccin, las pipetas, puntas y tubos se deben exponer a U.V
durante 20-30 minutos como mnimo.
Preparar la mezcla de reaccin bajo condiciones de absoluta esterilidad, en cmara
de flujo laminar (si est disponible), teniendo en cuenta cambiarse de bata antes
de entrar, usar guantes nuevos y limpiar la superficie de la cabina con hipoclorito
de sodio y alcohol al 70%. Adems tener en cuenta que los reactivos y pipetas se
mantienen en sus cajas y slo se destapan en el rea para tal fin.
El volumen de ADN en la reaccin depende de la concentracin del mismo. Tener
en cuenta siempre ajustar con agua el volumen final de la reaccin.
Usar un control negativo de la reaccin en el que se remplace el ADN con agua.
Tener en cuenta que los reactivos y materiales son exclusivos de cada rea y no
deben ser transportados entre las mismas.

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Luque J, Herrez A. Texto ilustrado de biologa molecular e ingeniera gentica:
conceptos, tcnicas y aplicaciones en ciencia de la salud. Primera Edicin. Editorial
Harcourt, S.A. Madrid. Espaa. 2001.
Puerta C, Uruea C. Practicas de biologa molecular. Primera Edicin. Editorial
Coleccin Biblioteca del Profesional. Pontificia Universidad Javeriana. 2005.
Sambrook J,Rusell D. Molecular cloning a laboratory manual. Tercera Edicin.
Editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. USA.2001.
Singer M, Berg P.Genes y genomas: una perspectiva cambiante. Primera Edicin.
Ediciones Omega S.A. Barcelona. Espaa.1993.

CONTENIDO

FUNDAMENTO

La reaccin en cadena de la ADN polimerasa (PCR) es una metodologa resultante de
la simulacin in vitro del proceso de replicacin del ADN celular, la cual permite la
sntesis especifica y exponencial de una regin determinada de ADN. La amplificacin
de una secuencia diana se realiza en varios ciclos, los cuales consisten de tres pasos:



desnaturalizacin (por lo general a 95C), hibridacin (dependiente de la temperatura
de fusin de los oligonucletidos a usar) y replicacin (a 72C, temperatura de accin
de la enzima Taq polimerasa), con el fin de obtener la duplicacin del nmero de
molculas que se desean copiar. Adems de las tres etapas de cada ciclo, comnmente
se aade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. La previa, a
elevada temperatura (incluso superior a las etapas de desnaturalizacin), sirve
bsicamente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra, as como para
asegurar la desnaturalizacin completa del ADN de partida, especialmente si este es
de gran tamao o posee regiones muy compactas. La etapa final, por su parte, consiste
en una prolongacin de la ltima elongacin para permitir que se completen todos los
fragmentos que se desean amplificar (Luque, Herraez, 2001).

En una reaccin de PCR es necesario incluir el ADN blanco, oligonucletidos
especficos del fragmento de ADN que desea copiar, los cuatro deoxiribonucletidos
trifosfato, iones magnesio y ADN polimerasa.

DEFINICIONES

ADN: cido desoxirribonucleico, polmero de nucletidos unido por un esqueleto de
fosfato - desoxirribosa. El material gentico de la clula.

ADN polimerasa: enzima encargada de la sntesis de una hebra complementaria
de ADN en direccin 5 3usando un molde de cadena sencilla, pero comenzando en
una regin de doble cadena.

PCR: reaccin en cadena de la ADN polimerasa.

MATERIALES

Reactivos
Agua Milli-Q (agua destilada, des-ionizada y esterilizada).
Oligonucletido sentido
Oligonucletidos antisentido
Mezcla de PCR (Amortiguador de PCR, cloruro de magnesio, dNTPs, taq
polimerasa).

Equipos
Cabina de flujo laminar.
Incubadora.
Microcentrfuga.



Micropipetas.
Nevera.
Termociclador para PCR convencional.

Materiales
Hielo o bloque de refrigeracin.
Puntas para micropipeta blancas y amarillas.
Tubos ependorff 1,5 ml estriles.
Tubos ependorff 0,2 ml estriles.

PROCEDIMIENTO

1. Descongelar por completo los reactivos en hielo y mezclar antes de su uso.
2. Limpiar con hipoclorito de sodio al 10% la superficie de trabajo.
3. Las pipetas, puntas y tubos se deben exponer a la luz ultravioleta (U.V) durante
20-30 minutos. Preparar la mezcla bajo condiciones de absoluta esterilidad, en
cmara de flujo laminar, teniendo en cuenta cambiarse de bata antes de entrar,
usar guantes nuevos.
4. Preparar la mezcla de reaccin segn las condiciones indicadas en la tabla 1,
teniendo en cuenta que la pre-mezcla con todos los componentes a excepcin
del ADN blanco, se debe preparar en un rea dispuesta solo para este fin, con
un juego de pipetas de uso exclusivo para PCR y de ser posible, usar puntas con
filtro. Finalmente se debe tener en cuenta que los reactivos y materiales de la
reaccin de PCR se mantienen separados de los dems elementos del
laboratorio y solo se destapan en el cuarto de pre-PCR.










Tabla 1. Concentracin final de los reactivos en el protocolo de PCR.

Reactivo Concentracin
final
Observaciones
Amortiguador PCR 1x
La concentracin de
cada uno de los
reactivos, son
ideales. Pero deben
y pueden ser
estandarizadas para
cada reaccin de
PCR particular.
dNTPS 200 M
Oligonucletido sentido 20 pmol
Oligonucletido antisentido 20 pmol
Cloruro de Magnesio 1,5 mM
Taq polimerasa 1 unidad
ADN 50-100 ng
Agua -
Volumen Final -

5. Repartir la cantidad necesaria de la mezcla en cada tubo de PCR y llevar
cerrado al siguiente cuarto para adicionar el ADN.
6. Adicionar el agua al control negativo en el cuarto de pre-PCR y no volver a
abrir este tubo.
7. Adicionar el ADN blanco a la reaccin, utilizando para ello una pipeta exclusiva
para cada tipo de ADN y puntas con filtro, en un rea diferente y separada de
la anteriormente usada para la preparacin de la pre-PCR.
8. Dirigirse al cuarto de los termocicladores para poner los tubos en el equipo
con el programa especfico a utilizar.
9. Analizar los resultados por electroforesis en el rea para este procedimiento.









PULL DOWN PARA CAPTURAR ARNm ESPECFICOS DE L. braziliensis


OBJETIVO

Capturar ARNm por afinidad con secuencias complementarias especficas de
mensajeros particulares.


ALCANCE

Este documento se debe tomar como referencia nica para la captura de ARNm a
partir de promastigotes de cultivo de L. braziliensis en el Laboratorio de Parasitologa
Molecular.


BIOSEGURIDAD
Este protocolo debe realizarse con elementos de proteccin tales como bata, guantes y
careta, est ltima cuando sea necesario.


MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos de reactivos qumicos y sus empaques deben ser pesados y entregados a
la empresa encargada de su inactivacin.


DOCUMENTOS DE REFERENCIA

MagneSphere

Magnetic Separation Products, Technical Bulletin. Promega

Madison, WI 53711-5399 USA. Revised 6/09.
http://www.promega.com/tbs/tb246/tb246.pdf
RNA Methodologies, Fourth Edition: Laboratory Guide for Isolation and
Characterization By Robert E. Farrell Jr. Publisher: Academic Press 2009-10-08 |
744 Pages | ISBN: 0123747279 | PDF









CONTENIDO

FUNDAMENTO

Con el fin de separar ARNm especficos del ARN total, se aprovecha la ocurrencia
natural de puentes de hidrgeno entre las bases adenina/timina (A:T) y
citosina/guanina (C:G), aislando fracciones relativamente pequeas de ARNm
(mediante el uso de un oligonucletido complementario al ARNm) del ARN celular
total o citoplasmtico.

Para el fraccionamiento se disea un oligonucletido complementario (por lo general
cerca del codn de inicio o sobre una regin conservada) biotinilado en su extremo 3,
el cual es unido a micro perlas magnticas recubiertas de estreptavidina.

Una mezcla de ARN total agregada a las perlas en condiciones de alta fuerza inica
favorecer la hibridacin entre ARNm y el oligonucletido complementario (Fig. 1). La
alta fuerza inica (concentracin de sal) es necesaria para eliminar la repulsin
electrosttica que se produce de forma natural entre las cadenas de cido nucleico
cargadas negativamente. En condiciones de alto contenido de sal, un catin
monovalente acta como contra-in, neutralizando la carga negativa neta intrnseca al
esqueleto de enlaces fosfodister del ARN.

Las partculas magnticas y el ARNm unido, se recogen colocando el tubo en la
proximidad de un imn. Se realizan lavados, y en seguida la elucin utilizando una
combinacin estndar de temperatura y un bffer con muy bajo contenido de sales. A
falta de un medio de alta concentracin de sal, la repulsin electrosttica es suficiente
para evitar el apareamiento de bases y se logra la purificacin del ARNm especfico de
esta manera. Las principales ventajas de esta tcnica son el aislamiento rpido de
ARNm especfico de alta pureza, intacto y concentrado.

Por qu purificar ARNm? Hay que recordar que slo una pequea fraccin de todos
los transcritos maduros en el citoplasma es ARNm, por lo general en el orden de dos a
tres por ciento. El escenario es aun ms complejo, cuando el gen que queremos aislar
es de baja abundancia. La razn para la purificacin del ARNm especfico, es aumentar
la representacin estadstica del ARNm en una muestra en funcin de la cantidad total
de ARN purificado. El enriquecimiento consiste en la manipulacin de una muestra de
ARN purificado para eliminar la mayor cantidad de ARN no mensajero posible. Una
razn a favor del enriquecimiento de las muestras de ARNm es producir ADNc con alta
proporcin del transcrito especfico. Al aumentar la representacin estadstica se
incrementa la probabilidad de identificar ARNm raros.






Figura 1. Esquema de la captura de mensajeros especficos de la -tubulina.


DEFINICIONES

Adenina: Una purina que normalmente hace pares de bases con la timina en el ADN o
uracilo en el ARN.

Guanina: Una purina que por lo general de pares de bases con la citosina.

Anin: Un tomo o molcula que tiene una carga negativa. Aniones se forman por la
adquisicin de electrones de un tomo.

ADNc (ADN complementario): ADN sintetizado in vitro por la transcripcin reversa
de una plantilla de ARN. ADNc puede ser de cadena sencilla o de doble cadena,

MATERIALES

Reactivos
H2O MQ.
Dietil Pirocarbonato (DEPC).
Inhibidor de ARNasas.
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles
20X SSC; 0,5X SSC.
Tampon de unin



Tampon de Lisis/unin
Tampon de lavado A
Tampon de lavado B

Equipos
Bao seco
Horno de hibridacin
Micropipetas
Gradilla magntica
Centrfuga
Vrtex

Materiales
Puntas azules y amarillas para micropipetas
Tubos eppendorf de 1.5 ml.


PREPARACIN DE SOLUCIONES Y TAMPONES

20x SSC

3M NaCl, 300 mM Na3Citrato x 2H2O.

Tampn de unin

20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA

Tampn de Lisis/unin

100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol
(DTT). Si se observa cualquier precipitado, calentar a temperatura ambiente y agitar
hasta que todos los componentes se resuspendan totalmente. (En el momento de ser
usado, adicionar inhibidor de ARNasas a concentracin final de 100 U/ml).

Tampn de lavado A

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS.

Tampn de lavado B

10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ,0.15 M LiCl, 1 mM EDTA.




PROCEDIMIENTO

LAVADO DE LAS STREPTAVIDIN MAGNESPHERE

PARAMAGNETIC PARTICLES

Este procedimiento dura aproximadamente 10 minutos

Resuspender las perlas hasta obtener una solucin uniforme (color caf), dejar en
reposo 2 minutos y tomar 600 L (0.6 mg). Usar 1 tubo por muestra (a-tubulina o
RPA1 o SL). Coloque los tubos marcados en la gradilla magntica por 2 minutos para
separar las perlas del lquido, y retire el sobrenadante.

Lavar las perlas 3 veces con 500 L de solucin 0.5 x SSC.

ALINEAMIENTO DEL OLIGONUCLEOTIDO COMPLEMENTARIO O SONDA

Denaturar 300 g de ARN total por 10 minutos a 80C en volumen final de 500 l de
solucin 0.5 X SSC (12,5 l de 20 X SSC + x l ARN total + H2O DEPC ((24,5 l + X l de
ARN total) - 500 l) y adicionar 12 l de la sonda biotinilada (concentracin del stock
25 mM).

Reactivo Ci Volumen Cf
H2O DEPC
SSC DEPC 20 X 12.5 l 0.5 X
ARN g/l l 0,6 g/l
Oligo Biotinilado 25 mM 12 l 0.625 mM
Volumen Total 500 l

Enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

UNION A LAS PERLAS Y AISLAMIENTO DEL ARNm ESPECFICO A PARTIR DE ARN
TOTAL

1. Eliminar el sobrenadante de las perlas previamente lavadas y adicionar la mezcla
anterior, mezclar por inversin a temperatura ambiente por 10 minutos.

2. Colocar el vial en el imn hasta que la solucin se aclare y retirar el sobrenadante.

3. Lavar durante 5 minutos a 37C las perlas, con 1 ml de tampn de unin.




4. Colocar el vial en el imn hasta que la solucin se aclare y retirar el sobrenadante.

5. Lavar durante 5 minutos a 37C las perlas, primero con 1 ml de tampn de lavado
A y luego con 1 ml de Tampn de Lavado B. Las perlas se deben mezclar por
inversin para eliminar los contaminantes. Asegrese de eliminar el sobrenadante
completamente entre lavados.

Para aumentar la astringencia de la captura hacer dos lavados ms con 1 ml de
tampn de lavado B cada uno, mezclando por inversin a 37 C por 5 minutos.

A. Para eluir el ARNm de las perlas, primero eliminar el buffer y agregar 20 l de H2O
MQ DEPC precalentada a 80C. Incubar a 80C durante 3 minutos, luego colocar el
tubo en el imn y transferir rpidamente el sobrenadante que contiene el ARNm a
un nuevo tubo libre de RNasas. El rendimiento final puede variar entre tejidos o
clulas en funcin de la abundancia de ARNm.




ESTIMACIN DE LA CONCENTRACIN DE ADN

OBJETIVO

Estimar la concentracin de ADN obtenido.

ALCANCE

Este documento se debe tomar como referencia nica para la estimacin de la
concentracin de ADN en el Laboratorio de Biologa Molecular.

RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad del director del laboratorio verificar la aplicacin y cumplimiento
de este documento por parte de profesores, estudiantes y pasantes.

FRECUENCIA

Este documento se debe tomar como referencia nica cada vez que se requiera
estimar la concentracin de ADN.


CONDICIONES GENERALES

BIOSEGURIDAD

Este protocolo debe realizarse con elementos de proteccin tales como bata, gafas de
seguridad y guantes.

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos de reactivos qumicos y sus empaques deben ser pesados y entregados a
la empresa encargada de su inactivacin.







CONDICIONES ESPECFICAS

Utilizar material nuevo y estril de uso exclusivo para el laboratorio de Biologa
molecular.
Utilizar agua Milli-Q (destilada, des-ionizada y esterilizada).

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Puerta C, Uruea C. Practicas de biologa molecular. Primera Edicin. Editorial
Coleccin Biblioteca del Profesional. Pontificia Universidad Javeriana. 2005.
Sambrook J,Rusell D. Molecular cloning a laboratory manual. Tercera Edicin.
Editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. USA.2001.

CONTENIDO

FUNDAMENTO

La concentracin de ADN ARN se puede estimar utilizando un espectrofotmetro de
luz ultravioleta (U.V) a una longitud de onda de 260 nm debido a que las bases pricas
y pirimidnicas tienen la propiedad de absorber la luz U.V a esta longitud de onda. Es
importante tener en cuenta que dado el emparejamiento de sus bases (puentes de
hidrgeno), el ADN bicatenario absorbe menos que el monocatenario (Puerta, Urea,
2005).

Para determinar la concentracin de ADN tener en cuenta que una unidad de densidad
ptica (DO) a 260 nm equivale a 50 g/ml de ADN de doble cadena, a 40 g/ml de
ARN y ADN de cadena simple, y a 20 g de oligonucletidos (Puerta, Urea, 2005).

La determinacin de la pureza del ADN se establece mediante la relacin de las
lecturas de las absorbancias a 260 y 280 nm. Es as como las preparaciones puras de
ADN y ARN tienen una relacin de DO 260/280 nm de 1,8-2,0 (Puerta, Urea, 2005).

DEFINICIONES

ADN: cido desoxirribonucleico, polmero de nucletidos unido por un esqueleto de
fosfato - desoxirribosa. El material gentico de la clula.




Bases nitrogenadas: son compuestos orgnicos cclicos, que incluyen dos o ms
tomos de nitrgeno. Son parte fundamental de los nuclesidos, nucletidos y
cidos nuclecos. Biolgicamente existen cinco bases nitrogenadas
principales, que se clasifican en dos grupos, bases pricas (derivadas
de la estructura de la purina) y bases pirimidnicas (derivadas de la
estructura de la pirimidina).

Espectrofotmetro: es un instrumento usado en la fsica ptica que sirve para
medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma
magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones.


MATERIALES

Reactivos
Agua Milli-Q (agua destilada, des-ionizada y esterilizada).

Equipos
Microcentrfuga.
Micropipetas.
Espectofotometro.

Materiales
Celdas de cuarso
Puntas para micropipeta blancas y amarillas.
Tubos ependorff 1,5 ml estriles.
Tubos ependorff 0,2 ml estriles.

PROCEDIMIENTO

1. Diluir el ADN o ARN en agua destilada en un volumen final de 1 ml 100 l,
teniendo en cuenta el volumen de la celda de cuarzo. La cantidad de acido
nucleico a tomar depender de la intensidad de la banda observada en el gel de
agarosa.
2. Utilizar agua destilada como blanco y realizar las mediciones a 260 y 280 nm,
utilizando celdas de cuarzo.



3. Determinar la concentracin teniendo en cuenta la dilucin de la muestra. Por
ejemplo para un ADN diluido 1/100 en un volumen final de 1 ml y una lectura
de 0,050 a 260 nm, se tiene que 0,050 (DO) x 50 g/ml x 100 (factor de
dilucin) = 250 g/ml = 0,25 g/l =250 ng/l.





PROGRAMA CURSO PRE-CONGRESO
PULL DOWN ASSAY
23, 25, 26 y 27 DE SEPTIEMBRE DE 2011
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FECHA HORA ACTIVIDAD PROFESOR SALON

Septiembre 23

I. Introduccin
8:008:30 Inauguracin
Concepcin
Puerta
Csar Ramrez
Claudia Cuervo
52-511
8:3010:00
Diseo de
Oligonucletidos
Anlisis In silico de
secuencias
Claudia Cuervo
50-309
(Sala de
computo)
10:00-10:30 Caf
10:30-12:30
Pull-down assay - Sesin
terica
Csar Ramrez 52 - 511
12:30 1:00 Almuerzo

II. Extraccin de
ARN
1:30 4:00
Extraccin de RNA total
de parsitos
Trizol
Kit Poli-A
Csar Ramrez 50 - Lab 220
4:00 4:30 Caf
4:30 6:00
Cuantificacin
Electroforesis
Csar Ramrez 50 - Lab 220

Septiembre 24

III. Pull-Down Assay

IV. Transcripcin
reversa
8:00 10:00
Captura de ARNm
con oligonucletidos
SL
Captura de ARNm
especficos de un gen
(RpaI, -tubulina)
Csar Ramrez

50 - Lab 210
10:00-10:30 Caf
10:302:30 RT-PCR Csar Ramrez 50 - Lab 210
12:301:30 Almuerzo



FECHA HORA ACTIVIDAD PROFESOR SALON

Septiembre 26

V. PCR y anlisis de
productos
amplificados
8:00 10:00 PCR convencional Claudia Cuervo 50 - Lab 220
10:00-10:30 Caf
10:30-12:30
Preparacin
Electroforesis
Claudia Cuervo 50 - Lab 220
12:301:30 Almuerzo
1:304:00
Anlisis de productos
amplificados
Claudia Cuervo 50 - Lab 220
4:004:30 Caf
4:306:00

Conferencias:

Generalidades de la expresin gnica en
tripanosomtidos
Dr. Manuel Carlos Lpez

Caracterizacin del promotor Pr77 de
Trypanosoma cruzi e identificacin de los
factores de transcripcin asociados a l:
estrategias para su estudio
Dra. Maria del Carmen Thomas

51-336

Septiembre 27

VI. Discusin de
resultados y
conclusiones
8:0010:00
Anlisis y discusin de
resultados
Concepcin
Puerta
Csar Ramrez
Claudia Cuervo
52-511
10:00-10:30 Caf
10:30-12:00
Conclusiones
Presentacin de los
estudiantes Cierre del
curso
Concepcin
Puerta
Csar Ramrez
Claudia Cuervo
52-511
12:001:00 Almuerzo




TRANSCRIPCIN REVERSA

OBJETIVO

Generar ADNc a partir del ARN obtenido durante procesos de extraccin y/o captura.

ALCANCE

Este documento se debe tomar como referencia nica para la generacin de molculas
de ADNc utilizando Transcripcin reversa en el Laboratorio de Parasitologa
Molecular.

RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad del director del laboratorio verificar la aplicacin y cumplimiento
de este documento por parte de profesores, estudiantes y pasantes.

FRECUENCIA

Este documento se debe tomar como referencia nica cada vez que se requiera
generar molculas de ADNc utilizando transcripcin reversa en el Laboratorio de
Parasitologa Molecular.


CONDICIONES GENERALES

BIOSEGURIDAD

Este protocolo debe realizarse con elementos de proteccin tales como bata, gafas de
seguridad y guantes.

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos de reactivos qumicos y sus empaques deben ser pesados y entregados a
la empresa encargada de su inactivacin.







CONDICIONES ESPECFICAS

Utilizar material nuevo y estril de uso exclusivo para PCR.
Utilizar agua Milli-Q (destilada, des-ionizada y esterilizada).
Hacer alcuotas de las soluciones, mantenerlas en un congelador de uso exclusivo
para PCR o en su defecto en una caja de plstico a -20C separada del resto de
reactivos.
Antes de montar la reaccin, las pipetas, puntas y tubos se deben exponer a U.V
durante 20-30 minutos como mnimo.
Preparar la mezcla de reaccin bajo condiciones de absoluta esterilidad, en cmara
de flujo laminar (si est disponible), teniendo en cuenta cambiarse de bata antes
de entrar, usar guantes nuevos y limpiar la superficie de la cabina con hipoclorito
de sodio y alcohol al 70%. Adems tener en cuenta que los reactivos y pipetas se
mantienen en sus cajas y slo se destapan en el rea para tal fin.
El volumen de ADN en la reaccin depende de la concentracin del mismo. Tener
en cuenta siempre ajustar con agua el volumen final de la reaccin.
Usar un control negativo de la reaccin en el que se remplace el ADN con agua.
Tener en cuenta que los reactivos y materiales son exclusivos de cada rea y no
deben ser transportados entre las mismas.

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Puerta C, Uruea C. Practicas de biologa molecular. Primera Edicin. Editorial
Coleccin Biblioteca del Profesional. Pontificia Universidad Javeriana. 2005.
Sambrook J,Rusell D. Molecular cloning a laboratory manual. Tercera Edicin.
Editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. USA.2001.

CONTENIDO

FUNDAMENTO

La transcripcin reversa es un mtodo utilizado para generar ADNc usando ARN como
molde. En trminos generales, se basa en la generacin de ADNc de cadena sencilla a
partir de RNA por medio de una reaccin enzimtica. Un primer oligodeoxinuclotido
se hibrida con el mARN y la cadena de ADN es generada por una ADN polimerasa
dependiente de ARN para crear una copia de ADN que puede ser amplificada por PCR
convencional.

Segn el objetivo de la transcripcin reversa, pueden utilizarse tres tipos de
oligonucletidos: un Oligo(dT) que se une a la cola poli(A)
+
endgena de todos los



mensajeros maduros eucariotas, un primer antisentido especfico de un gen o una
mezcla de hexanucletidos random hexanucleotides que son capaces de hibridar
durante la sntesis de ADNc en varios puntos del molde de RNA, generando copias de
fragmentos diversos de la poblacin entera de molculas de RNA.

DEFINICIONES

ADN: cido desoxirribonucleico, polmero de nucletidos unido por un esqueleto de
fosfato - desoxirribosa. El material gentico de la clula.

ARN: es un cido nuclico formado por una cadena de ribonucletidos

ADN polimerasa: enzima encargada de la sntesis de una hebra complementaria
de ADN en direccin 5 3usando un molde de cadena sencilla, pero comenzando en
una regin de doble cadena.

PCR: reaccin en cadena de la ADN polimerasa.

MATERIALES

Reactivos
Agua Milli-Q (agua destilada, des-ionizada y esterilizada).
Oligonucletido (dT)
Mezcla de PCR (Amortiguador de PCR, cloruro de magnesio, dNTPs,
Transcriptasa reversa, inhibidor de ARNasas)

Equipos
Cabina de flujo laminar.
Incubadora.
Microcentrfuga.
Micropipetas.
Nevera.
Termociclador para PCR convencional.

Materiales
Hielo o bloque de refrigeracin.
Puntas para micropipeta blancas y amarillas.
Tubos ependorff 1,5 ml estriles.
Tubos ependorff 0,2 ml estriles.




PROCEDIMIENTO

1. Descongelar por completo los reactivos en hielo y mezclar antes de su uso.
2. Limpiar con RNAse away la superficie de trabajo.
3. Las pipetas, puntas y tubos se deben exponer a la luz ultravioleta (U.V) durante
20-30 minutos. Preparar la mezcla bajo condiciones de absoluta esterilidad, en
cmara de flujo laminar, teniendo en cuenta cambiarse de bata antes de entrar,
usar guantes nuevos.
4. Preparar la transcripcin reversa segn las tablas 1 y 2, teniendo en cuenta que
se deben preparar dos pre-mezclas, una conteniendo el ARN, el oligo de
eleccin y el agua; y una que contenga el buffer de la retrotranscriptasa, el
inhibidor de ARNasas, los dNTPs y la enzima retrotranscriptasa. Dichas
mezclas deben ser preparadas en un rea dispuesta solo para este fin, con un
juego de pipetas de uso exclusivo para PCR y de ser posible, usar puntas con
filtro. Finalmente se debe tener en cuenta que los reactivos y materiales de la
reaccin de PCR se mantienen separados de los dems elementos del
laboratorio y solo se destapan en el cuarto de pre-PCR.

Tabla 1. Premezcla 1 con base en el kit: Transcriptor First Strand
cDNA Synthesis Kit de Roche

Componente Concentracin
final
Volumen para una
reaccin
Observaciones
ARN 1g Depende de la
cuantificacin
La concentracin
de cada uno de los
reactivos, son
ideales. Pero deben
y pueden ser
estandarizadas
para cada reaccin
de PCR particular
Oligo (dT)18 2.5M 1L
Agua --- Completar
Volumen final 6.5 L




Calentar a 85C por 10 minutos, durante ese tiempo de incubacin, preparar la pre-
mezcla 2.

Tabla 2. Premezcla con base en el kit: Transcriptor First Strand
cDNA Synthesis Kit de Roche

Componente Concentracin
final
Volumen para una
reaccin
Observaciones
Buffer de reaccin
5x
1x; 8mM MgCl2 2 L La concentracin
de cada uno de los
reactivos, son
ideales. Pero deben
y pueden ser
estandarizadas
para cada reaccin
de PCR particular
Inhibidor de
RNAsas 40U/ L
20U 0.25 L
Mezcla de
deoxinucletidos
10mM cada uno
1mM cada uno 1 L
Transcriptasa
reversa 20U/ L
10U 0.25
Volumen final 3.5 L

5. Unir las dos pre-mezclas y repartir la cantidad necesaria de la mezcla en cada
tubo de PCR .
6. Adicionar el agua al control negativo en el cuarto de pre-PCR y no volver a
abrir este tubo.
7. Dirigirse al cuarto de los termocicladores para poner los tubos en el equipo
con el programa especfico (tabla 3).
8. Almacenar el ADNc a -20C hasta su utilizacin.
Tabla 3. Programa de transcripcin reversa

Temperatura (C) Tiempo (min)
Extensin 50 60
Inactivacin de
retrotranscriptasa
85 15
Almacenamiento 4 Forever