Efeitos da testosterona sobre a homeostase do clcio dos

cardiomicitos e funo contrtil em ratas

Ronald D. Beesley 1 , Bradley M. Palmer 2 , Peter R. Casson 1 e Michael J.
Toth 1,2,3

1. Departamentos de uma Obstetrcia e Ginecologia , 2 Fisiologia Molecular e 3 Medicina
da Universidade de Vermont College of Medicine, Burlington, VT, EUA
1. MJ Toth: Universidade de Vermont, Health Science Research Facility 126B, 149
Beaumont Avenue, Burlington, VT 05405, EUA. Email: michael.toth@uvm.edu

Novas Descobertas
Qual a questo central deste estudo?
Excesso de andrgenos em mulheres est associada a um risco elevado de doena
cardaca. Se alguma parte deste risco elevado est relacionada a um efeito de
andrognios sobre a funo cariomyoctye, no entanto, no foi examinado. Para o nosso
conhecimento, este o primeiro estudo a abordar diretamente o papel dos andrgenos
na regulao dinmica cardiomicitos contrteis e homeostase do clcio.
Qual a principal concluso e sua importncia?
Nossos resultados sugerem efeitos agudos ou crnicos mnimas de testosterona sobre a
dinmica dos cardiomicitos encurtamento, homeostase do clcio ou miosina expresso
da cadeia pesada, o que sugere que o efeito prejudicial do excesso de andrgenos no
risco cardiovascular no mediada por alteraes na biologia dos cardiomicitos.


Abstract
O papel da testosterona (T) na regulao da funo cardiovascular em mulheres no
bem compreendido. Nosso objetivo foi examinar o efeito do T sobre a biologia dos
cardiomicitos medindo sarcmero encurtamento / relaxamento e ciclismo de clcio
intracelular na fmea adulta ratos Sprague-Dawley. Os ratos foram divididos em quatro
grupos: (1) sham; (2) a ovariectomia (OVX); (3) OVX alm de T; e (4) OVX + T mais
de um inibidor da aromatase (IA). O ltimo grupo foi adicionado para descartar efeitos
de bioconverso de T para o estradiol.Sarcmero dinmica / clcio foram medidas ao
fim de 4 semanas a 2 e 6 Hz, 6 Hz, em seguida, a seguir a exposio a 300
n M isoprenalina. Alm disso, a aguda (isto , no-genmica) efeitos da T foram
avaliados em ratos sham-operados e OVX + T + AI. No houve diferenas entre os
grupos, nem havia evidncia para um efeito de T em freqncia ou resposta
isoprenalina. Alm disso, no houve resultados que indicam um efeito T aguda, no-
genmica. Alm disso, o - e -miosina de cadeia pesada isoforma complemento
relativo no foi alterado pela substituio ou T OVX. Nossos resultados argumentam
contra efeitos agudos ou crnicos de T sobre a dinmica dos cardiomicitos de
encurtamento, ciclismo de clcio ou miosina expresso da cadeia pesada, argumentando
contra qualquer efeito direto da T em funo de cardiomicitos em fmeas adultas.
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O papel da testosterona (T) na regulao da funo cardiovascular e subsequente
desenvolvimento de doenas cardiovasculares em mulheres no bem compreendida. A
maioria dos estudos que tm explorado o efeito de T no desenvolvimento do risco de
doena cardiovascular em mulheres tm-se centrado sobre o seu papel na regulao do
sistema vascular, os nveis de lipoprotenas de lipdios e / ou adiposidade ( Mendelsohn
& Karas, 2005 ).Estudos epidemiolgicos mostram efeitos adversos dos nveis de
andrognios elevados em risco de doena cardiovascular ( Kritz-Silverstein et al .,
1997 ). No entanto, os efeitos do T sobre a funo dos cardiomicitos , por si s tm
recebido menos ateno, apesar de os primeiros estudos que demonstram um papel para
a deficincia de T e excesso na regulao do tamanho e funo cardaca em mulheres
( Koenig et al 1982. ; Schaible & Sheuer de 1984 ; Schaibleet al . 1.984 ; Scheuer et
al 1987. ). Do ponto de vista clnico, androgenaemia freqentemente alterada em
mulheres ps-menopusicas secundrias a tratamentos cirrgicos e clnicos ( Casson et
al 1997. ; Meldurm et al 1981. ). Por exemplo, aproximadamente 75% das mulheres na
ps-menopausa que se submetem histerectomia so feitas hypoandrogenaemic por
ooforectomia bilateral (OVX; Agncia de Investigao de Sade e Qualidade de
2003 ). Alm disso, as mulheres que se submetem a OVX bilateral no momento da
histerectomia tm um risco aumentado de desenvolvimento de doena arterial
coronariana ( Parker et al . 2.009 ). Assim, apesar do fato de que sabemos muito pouco
sobre os efeitos do T sobre a funo cardaca, h vrios casos em que intervenes
clnicas alteram os nveis circulantes de andrgenos com o potencial para alterar o risco
para a doena cardaca.
Uma quantidade considervel se sabe sobre os efeitos dos andrognios sobre a estrutura
e funo cardaca em homens. Receptores de andrognio est espalhada por todo o
sistema cardiovascular, tendo sido encontrados dentro da aorta, vascular perifrica,
fibrilao ventricular e clulas ( McGill & Sheridan, 1981 ;Marsh et al 1998. ). No
surpreendente, portanto, que os andrognios tm sido mostrados para afectar a estrutura
e a funo cardaca ( Schaible et al 1984. ;Scheuer et al 1987. ; Roca et
al 1996. ; dourado et al 2002, 2003. ; Onda et al . 2,009 ; Tsang et
al 2009. ). Gonadectomy em ratos machos diminui o tamanho do ventrculo, por grama
de peso corporal e prejudica sistlica e da funo cardaca diastlica, tal como
evidenciado pela diminuio da fraco de ejeco, o enchimento deficiente e um
deslocamento para baixo em relao fora-velocidade ( Schaible et
al 1984. ; Scheuer et al . 1,987 ). Em adio a estes efeitos de rgo inteiro, andrgenos
regular a expresso funcional do tipo L de Ca 2 + e o canal de sdio de Ca 2 + no
permutador de cardiomicitos ( dourado et al 2003. ;Tsang et al . 2,009 ), e diminui a
gonadectomia Ca 2 + atividade da miosina ATPase estimulada por. Quase todos estes
efeitos so invertidos pela substituio de testosterona ( Scheuer et al . 1,987 ). Embora
estes efeitos tm sido historicamente atribudo capacidade de T para modificar a
transcrio de genes atravs de vias de receptores de hormona esteride clssica, no
existe evidncia de que pelo menos alguns efeitos podem ser mediados atravs de vias
no clssico / no genmicos ( Vicncio et al . 2,006 ) .

Em contraste com o corpo considervel de trabalho em animais machos, relativamente
pouco se sabe sobre como andrgenos afetam biologia cardiomicitos nas fmeas. H
alguma evidncia para os efeitos sobre o tamanho ea funo cardaca ao nvel de rgos
inteiro ( Koenig et al 1982. ; Schaible et al ., 1984 ; Scheuer et al ., 1987 ), mas, at
onde sabemos, nenhum estudo avaliou oin vivo efeitos dos andrgenos sobre a biologia
dos cardiomicitos. Talvez to importante, os estudos que avaliaram o papel dos
andrgenos no tamanho e funo em animais fmeas cardaca no conseguiram explicar
o fato de que os andrgenos podem ser bioconvertida aos estrognios a nvel tecidual
( Grohe et al1998. ; Geisler, 2003 ) . Assim, muitos dos efeitos anteriormente descritos
de andrognios sobre a estrutura e funo cardaca em animais do sexo feminino pode
ser mediada atravs de vias estrognicos, em vez de andrognicos,.

No presente estudo, examinamos os efeitos do T sobre cardiomicitos Ca 2 +ciclismo e
encurtamento do sarcmero para testar a hiptese de que T regula ciclismo micitos
clcio e / ou dinmicas de gordura em ratas adultas. Existem trs mecanismos potenciais
que procuramos examinar em que T pode exigir o controle sobre a biologia dos
cardiomicitos, da seguinte forma: (1) atravs da regulao clssica da transcrio de
genes atravs do receptor de andrgeno; (2) por meio de expresso no-clssica ou
regulamento no-genmico de sinalizao celular / protena ( Vicencio et al 2006. ); ou
(3) por meio de bioconverso perifrica de T para o estradiol (E 2 ) por meio de enzimas
que metabolizam esterides presentes em cardiomicitos ( Grohe et al 1998. ; Geisler,
2003 ). Nossos estudos foram orientadas a abordar todos estes potenciais mecanismos
de ao dos andrgenos. Alm disso, medimos variao miosina de cadeia pesada
(MHC) a expresso da protena para determinar se os efeitos (ou falta dela) do T sobre a
dinmica encurtamento pode ser explicada por mudanas na distribuio de
isoformas. Optamos por avaliar ratas adultas (16 semanas de idade) para eliminar a
possibilidade de que as intervenes experimentais projetadas para manipular os nveis
de esterides sexuais alteraria biologia cardiomicitos atravs dos efeitos sobre o
crescimento / desenvolvimento normal do corao e do sistema cardiovascular ( Zhu et
al 2002. ; MacLean et al2010. ), bem como outros sistemas do corpo ( Toth et
al 2001. ). A nossa anlise deste potencial mecanismo de ao T contrasta com todos os
outros estudos at agora avaliar os efeitos do T sobre a estrutura cardaca / funo em
animais fmeas, que tm avaliado jovem, que cresce rapidamente fmeas e / ou micitos
cultivadas a partir de animais recm-nascidos ( Schaible et al . 1.984 ; Scheuer et
al 1987. ; Er et al 2007. ). Esta considerao experimental tambm foi escolhido para
fazer os nossos dados mais relevantes para cenrios clnicos, porque a maioria dos casos
de privao de andrgeno / excesso so encontrados em mulheres durante a adulto / a
vida adulta tardia.


Mtodos
tico informao
Cuidados com os animais e usam protocolos foram conduzidos de acordo com as
diretrizes aceitas pela American Physiological Society e aprovados pelo Comit de
Cuidados e Uso de Animais Institucional da Universidade de Vermont.

Animais
Foram utilizados dois grupos de animais. No primeiro grupo, examinamos o efeito
crnico de depleo de clulas T e de substituio. Para estes experimentos, adultos (16
semanas de idade) ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Stone Ridge,
NY, EUA) foram divididos em quatro subgrupos seguintes ( n = 6 por grupo): (1)
operado simulada animais do grupo controle; (2) Os animais ovariectomizadas
(OVX); (3) animais OVX com reposio de testosterona (OVX + T; 5 mg, 30 dias pellet
subcutneo); e (4) OVX + T e do anastrozol inibidor da aromatase (OVX + T + AI; 1
mg, 30 dias pellet subcutneo e investigao inovadora da Amrica, Sarasota, FL,
EUA). A justificativa para esta dose de AI foi obtido a partir de dados de Lea &
Flanagan (1998) , que mostraram que uma dose semelhante da mesma AI foi suficiente
para evitar a hipertrofia do tero em resposta administrao de andrgenos em ratos de
volta aos nveis falsos, sugerindo a supresso completa de bioconverso perifrica de
andrognios em estrognios. O grupo controle foi encenada para o ciclo estral atravs da
visualizao de clulas epiteliais e do contedo de leuccitos de esfregao vaginal,
como descrito anteriormente ( Westwood, 2008 ), para verificar as condies normais
de ciclismo durante o perodo experimental para garantir que o procedimento cirrgico
sham no perturbar a funo reprodutiva normal, .Ns no padronizar o ciclo do estro
para este grupo de animais durante as avaliaes ps-tratamento, porque no h
evidncia de variao em funo cardaca durante o ciclo ( Yang et al . 2,006 ). Alm
disso, isso consistente com outros estudos que avaliaram os efeitos dos esterides
sexuais ovarianos sobre a estrutura e funo cardaca em ratos fmeas, os quais tambm
no controlados para a fase do ciclo estral em animais sham-operados ( Onda et
al 2003. ;Thaworn- kaiwrong et al ., 2003 ; Bupha-Intr & Wattanapermpool de
2006 ; Chu et al 2006. ; Paigel et al . 2.011 ). Quatro semanas aps a cirurgia e a
colocao da pelota, os coraes foram excisados para os procedimentos experimentais.
No segundo grupo, foram examinados os potenciais efeitos agudos de T. Os animais
foram divididos em dois subgrupos seguintes ( n = 6 por grupo): (1) Os animais controle
simulado; e (2) OVX + T + AI, para representar os extremos do espectro
androgenicidade de estrognio elevado, baixo T (sham) para baixo estrognio, alta T
(OVX + T + AI). Nossa justificativa para a escolha destes dois grupos que os animais
fundamentado OVX + T + AI seria a mais propensos a responder a quaisquer efeitos
agudos de T, assumindo que a estimulao T persistente seria upregulate resposta
celular, um fenmeno bem caracterizado com esterides sexuais hormnios e que temos
documentado em cardiomicitos com E 2 administrao ( Goldstein et al ., 2004 ),
enquanto um grupo experimental com o menor nvel de androgenicidade e maior
estrogenicidade (ie animais sham-operado) serviria como o melhor grupo de controle,
porque eles teria a menor probabilidade de demonstrar resposta administrao aguda
T, devido aos efeitos antagnicos de estrognios nos nveis de receptor andrognico e
seus efeitos ( Tivesten et al . 2.006 ). Neste contexto, o presente experimento foi
projetado para maximizar a possibilidade de deteco de um efeito agudo do T sobre a
dinmica dos sarcmeros e Ca 2 + ciclismo. Animal envelhece, os procedimentos
cirrgicos e tempos de exposio hormonais eram idnticos aos descritos para a
primeira experincia. Para cada animal, a metade dos cardiomicitos foram incubadas
com 1 u M testosterona dissolvido em etanol, a outra metade das clulas com veculo
(etanol), para um mnimo de 15 minutos antes da experimentao. A exposio contnua
a T ou veculo, respectivamente, foi apresentada durante a estimulao eltrica.

Isolamento dos micitos do ventrculo
Cardiomicitos ventriculares foram obtidos utilizando os mtodos anteriormente
descritos ( Palmer et al . 2,006 ). Em resumo, os animais foram anestesiados por
inalao de isoflurano, o trax foi aberto e heparina (500 U; Americana Pharmaceutical
Partners, Schaumburg, IL, EUA) foi injectado para dentro do trio esquerdo. O corao
foi rapidamente excisados, pesados e colocados em soluo de gelado de Krebs-Ringer
contendo 30 m M 2,3-butanodiona monoxime (BDM). A aorta foi canulada, e o leito
coronria foi perfundida com um tampo base de bicarbonato com nominal livre de
Ca 2 + e uma soluo contendo colagenase (0,57 mg ml -1 ) e de tripsina (0,25 mg ml -
1 ) usando uma perfuso de Langendorff modificado aparelhos. Todas as solues
foram mantidas a pH 7,4 e 37 C e borbulhada com 95% de O 2, 5% de CO 2 . Depois
que o corao tornou-se palpvel flcida (~30-40 min), os trios e grandes vasos foram
retirados e pesados para fornecer o peso ventricular final. Os ventrculos foram picados,
e cardiomicitos isolados foram suspensos em tampo de bicarbonato-base, filtrada para
remover o tecido fibroso e detritos, lavada trs vezes por centrifugao e ressuspenso
em 15 m M de tampo de bicarbonato de BDM com 1,2 m M Ca 2 + at sua
utilizao. A dinmica de encurtamento do sarcmero foram investigados aps o
isolamento dos micitos, e os Ca 2 + experimentos de sinalizao foram realizadas
imediatamente aps a concluso dos estudos de contrao.

Protocolo experimental
Para experincias que investigam o efeito de T crnica, os cardiomicitos foram
colocadas numa cmara de fluxo de passagem aquecido a 37 C (Warner Instruments,
Hamden, CT, EUA), montada num microscpio invertido (Nikon Diaphot) circulado
com uma soluo isenta de RCA. De notar que os cardiomicitos foram banhadas em
saudao livre-BDM por pelo menos 10-15 minutos antes de experimentos iniciais, que
prev mais de tempo suficiente para permitir a dissipao dos efeitos BDM, conforme
relatado por pesquisadores em nosso laboratrio e outros ( Mulieri et al . 1.989 ; Huang
& McArdle, 1992 ;Biermann et al 1998. ). Cardiomicitos foram electricamente
estimulado com uma durao de 0,5 ms e a tenso de 1,5 vezes o seu limiar de
estimulao (Grass Instruments, Boston, MA, EUA). Encurtamento do sarcmero ea
dinmica de clcio intracelular foram registrados aps a realizao da funo contrtil
do estado de equilbrio durante 2 min a cada freqncia de estimulao de 2 e 6 Hz. A
estimulao eltrica, seguida de 6 Hz, e as dinmicas foram registrados aps 1 min de
exposio a 300 n M isoprenalina (ISO). O protocolo para os experimentos de efeito T
agudos era idntico, com a exceo de que no foi utilizado nenhum isoprenalina. A
dinmica de encurtamento e medies de sinal de clcio intracelular foram realizadas
em diferentes clulas, de cada animal, para evitar potenciais efeitos de confuso por o
corante indicador de clcio de fura-2 AM.

Dinmica sarcmero encurtamento
Cardiomicitos entre 1,60 e 1,90 mM foram examinados para a dinmica do sarcmero
encurtamento. Os transientes registradas foram analisadas para determinar o
comprimento diastlica ( L dias ), encurtamento de pico, pico de reduo em
percentagem do comprimento diastlica (% L dias ), tempo-pico-encurtamento,
velocidade relengthening mxima (velocidade de retorno), o tempo para 50 %
relengthening (tempo para 50% L dias ) eo tempo total de relengthening (hora
de L dias ).

Dinmica de clcio intracelular
Dinmica de clcio intracelulares foram avaliados utilizando Ca 2 + corantes
indicadores, tal como descrito por Palmer et al . (2006) . Resumidamente, os
cardiomicitos foram carregadas com 1 M de fura-2 AM (Molecular Probes, Eugene,
OR, EUA) durante 15 min. A fluorescncia foi monitorizada a 510 nm e animado com
um sistema (Ionoptix, Milton, MA, EUA), equipado com filtros pticos de 405 e 365
nm, proporcionando uma relao linear entre a taxa de fluorescncia ( I ) e livre de Ca 2
+ de concentrao. O valor para o fundo de cardiomicitos fluorescncia foi medida
depois de superfuso com 2 M de digitonina para 1 min, o que libertado citoslica
com fura-2. Antecedentes e compartimentalizao intracelular de fura-2 para cada um
dos cardiomicitos foram, assim, incorporada no clculo de R .
Os cardiomicitos registrados R transientes foram analisados para determinar a
diastlica R ( R dias ), o pico R , tempo para o pico R , o tempo para 50% de diminuio
de R dias (tempo para 50% de R dias ) e taxa de decaimento do sinal ( R). Dado que
existe uma relao linear entre R e [Ca 2 + ], os valores relativos e caractersticas
temporais para R refletem diretamente os valores relativos para o transiente do sinal de
clcio ( Palmer et al ., 2006 ).

Miosina de cadeia pesada isoforma
Miosina de cadeia pesada de distribuio isoforma de protena foi determinada por
SDS-PAGE e colorao com prata, como descrito anteriormente ( Toth et al . 2005 ),
com modificaes menores. Msculo ventricular (-15 ug) foi homogeneizado analisadas
quanto ao contedo total de protena (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), e 0,2
ug de protena foi carregada. O gel de empacotamento continha 4% de acrilamida-bis e
5% de glicerol. O gel de resoluo continha 7% de acrilamida-bis e 5% de glicerol. O
gel foi corrido a 200 V durante 30 h a 9 C. As intensidades das bandas de MHC foi
determinada por densitometria (Quantity One, Bio-Rad Laboratories) e expressa em
relao ao sinal total de MHC.

Ensaios hormonais sricos
Para os ensaios de esterides, o soro foi armazenado a -80 C e ensaiadas em lotes para
a androstenediona, total T e E 2 usando radioimunoensaios validado (Goebelsmann et
al . 1974, 1979 ). Padres internos tituladas apropriados foram adicionados a cada
amostra a seguir perdas processuais. Uma nica alquota de amostra foi feita para extrair
t, androstenediona e E 2 utilizando acetato de etilo: hexano (3: 2). Isto foi seguido por
separao dos esterides por cromatografia de partio em coluna de Celite usando
etileno glicol como a fase estacionria.Androstenediona foi eluda com isooctano
sozinho, e T com 25% de tolueno em isooctano, enquanto o e 2 foi fluido com 40%
acetato de etilo em isooctano. Aps a secagem de cada fraco, o resduo foi
reconstitudo em tampo de ensaio. Uma alquota de cada uma foi feita para determinar
a perda de procedimento, e alquotas duplicadas foram levados para o radioimunoensaio
de cada hormona.Cada radioimunoensaio utilizado um radioligando iodado em conjunto
com um anti-soro especfico. Aps uma incubao de um dia para o outro, esteride
ligada ao anticorpo foi separado do esteride no ligado por precipitao do primeiro
anticorpo com um segundo anticorpo e subsequente centrifugao.Amostras de controle
de qualidade contendo baixos, mdios e altos nveis de andrgenos e estradiol foram
utilizados em cada ensaio. Os coeficientes de variao varia entre 8,0 e 13%. As
sensibilidades ensaio para androstenediona, T e E 2 foram 0,03 ng ml -1 , 1,5 ng dl -1 e
3 mg ml -1 , respectivamente.

A anlise estatstica
As diferenas nas caractersticas fsicas, MHC de distribuio isoforma e hormnios
sexuais foram determinadas por ANOVA one-way. Encurtamento do sarcmero e Ca 2
+ dados dinmicos foram analisados por meio de medidas repetidas ANOVA usando
um mtodo de mxima verossimilhana restrita. Esta abordagem analtica foi necessria
para dar conta da aglomerao de observaes dentro de cada animal. Neste modelo, os
efeitos do grupo esto includos, juntamente com um efeito aleatrio para explicar o
agrupamento de observaes nos indivduos. Isto necessrio porque o modelo linear
geral assume que cada medio independente, o que no o caso para as clulas
avaliadas a partir de diferentes animais (por exemplo clulas do mesmo animal esto
relacionados e no pode ser considerada como sendo independente). A no representam
o agrupamento de clulas dentro de animais resultaria em uma taxa de erro tipo I
inflado. importante notar que quase todos os estudos realizados at data neste campo
fizeram esta suposio incorreta, polarizao, assim, os seus resultados para observar
diferenas entre os grupos, em virtude do tamanho da amostra inflado. Para todas as
anlises de medidas repetidas, se um efeito significativo foi observado post
hoc contrastes foram realizados para identificar as diferenas entre pares. As anlises
foram realizadas com o software SPSS verso 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA), com
exceo das medidas repetidas ANOVAs, que foram realizadas com SAS (verso 9.2;
Cary, NC, EUA). Todos os valores so expressos em mdia SEM.


Resultados
Os dados de base e concentraes hormonais sricos
As caractersticas fsicas e os nveis das hormonas sexuais so mostrados naTabela 1 .
Os animais que receberam o t foi superior ( P <0,05) do que os animais operados de
forma simulada. Os grupos OVX + T e OVX + T + AI tiveram maior peso corporal em
comparao com os animais sham-operados, mas valores semelhantes como ratos
OVX. Isto provavelmente devido hiperfagia associada com deficincia de estrognio
( Richard, 1986 ) nos grupos OVX. Deficincia de E2 em grupos OVX foi verificada
por meio de sua atrofia uterina significativa ( P<0,01). Apesar do aumento do peso
corporal em OVX, OVX + T e grupos OVX + T + AI, no houve diferenas no msculo
esqueltico (soma de sleo e extensor longo dos dedos msculos: farsa, 0,28 0,01 g;
OVX, 0,29 0,01 g ; T, 0,31 0,01 g, e OVX + T + AI, 0,31 0,01 g), fgado (sham,
12,6 0,3 g; OVX, 12,8 0,7 g; T, 15,0 0,7 g, e OVX + T + AI , 13,6 0,8 g) ou
massa ventricular (sham, 0,97 0,02 g; OVX, 0,92 0,07 g; T, 1,03 0,04 g, e OVX +
T + AI, 1,09 0,13 g). Note-se que a massa ventricular no foi diferente, quando
expressos em relao massa corporal, peso dos rgos ou comprimento do corpo para
ajustar qualquer variao nas taxas de crescimento entre os grupos. Consistente com a
atrofia uterina detalhado acima, no foram marcadas redues ( P <0,005) em E 2em
concentraes grupos OVX. Ambos os regimes de substituio T aumentou os nveis de
T circulantes ( P <0,05) superiores aos dos grupos sham e OVX.Oariectomy reduziu os
nveis de androstenediona ( P <0,005). Digno de nota, as concentraes de esterides
sexuais circulantes no pode registar mudanas na bioconverso perifrica de
andrognios em estrognios, devido ao efeito de diluio que ocorre a partir do
microambiente do tecido para o espao vascular.Por exemplo, o tecido e 2 nveis pode
ser de 10-20 vezes maior ( Geisler, 2003 ).Alm disso, os nveis de tecido mostram
pouca correspondncia com o seu nvel de circulao ( Geisler, 2003 ). Por ltimo,
existem numerosas outras enzimas que metabolizam esterides (por exemplo, 17-
hidroxiesteride-desidrogenase 2, que catalisa a converso de L 2 para a estrona menos
biologicamente activa;Labrie et al 2000. ) presente no tecido, o que pode converter
derivada localmente estrognios em molculas no detectado pelo nosso imunoensaio.
Ver esta tabela:




Tabela 1 as concentraes circulantes de hormnios sexuais e caractersticas fsicas


Distribuio das isoformas de MHC
Dado que as alteraes na expresso de MHC isoforma protena poderia impactar a
dinmica de encurtamento do sarcmero, avaliamos se as alteraes nas concentraes
de hormnios sexuais afetadas contedo isoforma circulante.Como mostrado na fig. 1 ,
a proporo relativa de -MHC (sham, 84,9 0,02%, OVX, 85,0 0,01%, OVX + T,
de 86,7 0,02%, e OVX + T + AI, 90,8 0,01%) e -MHC contedo (sham, 15,1
0,02%; OVX, 15,0 0,01%; OVX + T, 13,3 0,02% e OVX + T + AI, 9,2 0,01%)
no foi significativamente afetada por OVX ou regimes de substituio hormonal.


A Figura 1 da cadeia pesada de miosina (MHC) de distribuio de isoformas com
vrias permutaes de deficincia hormonal de substituio e uma , amostra de
electroforese em gel de separao de - e -MHC na operao simulada (controlo),
ovariectomizados (OVX), OVX + testosterona (OVX + T) e OVX + T mais inibidor da
aromatase (OVX + T + AI) grupos, com o msculo sleo (Sol) e tecido atrial direito
(AD), utilizado para verificar as posies das isoformas. B, os valores mdios para a
proporo relativa de teor e -MHC em cada grupo (- n = 6 animais por grupo). Os
valores esto expressos em mdia + SEM.

Dinmica sarcmero encurtamento
Parmetros de contrao e relaxamento foram analisadas para determinar o efeito de T
em funo dos cardiomicitos ( Fig. 2 ). A mdia da linha de base ( L diascomprimento
do sarcmero) no diferiu entre os grupos (sham, 1,77 0,02 m; OVX, 1,75 0,02 m;
OVX + T, 1,77 0,02 m; e OVX + T + AI, 1,76 0,02 mm) .No houve qualquer efeito
estatisticamente significativo do grupo em qualquer dos parmetros do sarcmero
encurtando a 2 Hz, 6 Hz ou 6 ISO, como se segue: Pico de encurtamento ( P = 0,63,
0,82 e 0,48, respectivamente); tempo para atingir o encurtamento ( P = 0,64, 0,34 e
0,34, respectivamente); velocidade de relaxamento ( P = 0,60, 0,60 e 0,51,
respectivamente); e o tempo para 50% de relaxamento ( P = 0,34, 0,36 e 0,34,
respectivamente). Como esperado, observou-se efeitos relacionados com a mudana de
frequncia e a adio de isoprenalina;no entanto, no houve grupo significativo
frequncia ou grupo efeitos de interao isoprenalina para qualquer do sarcmero
encurtando parmetros.

Figura 2 sarcmero encurtando dinmica em cardiomicitos isolados (4-6 clulas
por animal) em operao simulada (controle; n = 31 clulas), ovariectomizadas
(OVX; n= 30 clulas), OVX mais testosterona (OVX + T; n = 28 clulas) e OVX +
T mais grupos inibidor da aromatase (OVX + T + AI; n= 30 clulas) na freqncia
de estimulao 2 e 6 Hz e com a administrao de 300 n M isoprenalina em 6 Hz (6
ISO) foram encontrados efeitos de grupo em qualquer freqncia de estimulao ou
aps a administrao de isoprenalina, nem havia grupo frequncia ou grupo efeitos
isoprenalina.

Dinmica de clcio intracelular
O efeito de T em cardiomicitos intracelular de Ca 2 + de ciclos foi testado no engodo,
OVX, OVX + T e grupos OVX + T + (AI . Fig 3 ). Os sinais mdios de clcio basal no
diferiu entre os grupos ( R dias : falso, 0,92 0,06; OVX, 0,87 0,06; OVX + T, 0,89
0,06 e OVX + T + AI, 0,86 0,06). No houve efeito significativo de grupo em
qualquer uma das Ca 2 + parmetros de ciclagem de 2 Hz, 6 Hz ou 6 ISO, como segue:
O sinal de pico ( P = 0,45, 0,46 e 0,55, respectivamente); tempo at ao pico do sinal
( P = 0,64, 0,59 e 0,93, respectivamente); tempo para 50% do sinal diastlica ( P = 0,51,
0,69 e 0,98, respectivamente); e decadncia sinal ( P = 0,21, 0,24 e 0,59,
respectivamente).Embora tenhamos observado os efeitos de freqncia e isoprenalina
esperados, no houve grupo significativo frequncia ou grupo efeitos de interao
isoprenalina para qualquer um dos Ca intracelular 2 + parmetros de ciclismo.

Figura 3. dinmica do clcio intracelular em cardiomicitos isolados (5-7 clulas
por animal, com exceo de um animal, onde os dados eram de uma nica clula,
devido a problemas tcnicos) em operao simulada (controle; n = 31 clulas),
ovariectomizadas (OVX; n= 37 clulas), OVX mais testosterona (OVX + T; n = 32
clulas) e OVX + T mais grupos inibidor da aromatase (OVX + T + AI, n = 33
clulas) na freqncia de estimulao 2 e 6 Hz e com a administrao de 300
n M isoprenalina em 6 Hz (6 ISO) Sem efeitos de grupo foram encontrados em cada
freqncia de estimulao ou aps a administrao de isoprenalina, nem havia grupo
frequncia ou grupo efeitos isoprenalina.

Os efeitos agudos de testosterona
Os resultados, tanto para a operao simulada eo grupo OVX + T + AI foram
semelhantes ( Tabela 2 ). A exposio aguda de clulas a 1 M T no teve efeito
estatisticamente significativo em qualquer das variveis dinmicas de encurtamento ou
sinal de clcio medidos em cada 2 ou 6 frequncias de estimulao Hz, quando
comparado com as clulas da mesma animal exposto a soluo de controlo sem T
adicionado. Os P valores para o tratamento simulado (veculo contra T imediato) e
grupos T + AI (veculo contra T imediata) no foram significativas, como se segue:
Pico de encurtamento ( P = 0,72 e 0,75, respectivamente); tempo para atingir o
encurtamento ( P = 0,88 e 0,96, respectivamente); tempo para 50% de relaxamento
( P = 0,27 e 0,25, respectivamente); sinal de pico de clcio ( P = 0,12 e 0,11,
respectivamente);tempo at ao pico do sinal de clcio ( P = 0,49 e 0,21,
respectivamente); e decadncia sinal ( P = 0,81 e 0,64, respectivamente). Alm disso,
quando se comparam para efeito imediato T com base na mudana da frequncia (isto ,
entre 2 e 6 Hz), todas as presses sistlica e diastlica medidas tanto para o
encurtamento do sarcmero dinmica e de sinalizao de clcio foram semelhantes aos
de veculo.
Ver esta tabela:

Tabela 2 Avaliao de efeitos no-genmicos da testosterona sobre a dinmica do
encurtamento e Ca 2 + dinmica


Discusso
O presente estudo examinou o efeito do T sobre a biologia dos cardiomicitos em ratas
medindo dinmica encurtamento do sarcmero e ciclismo de clcio intracelular em
cardiomicitos isolados de adulto, ratos intactos e ratas ovariectomizadas com
diferentes permutaes de reposio hormonal. No foi encontrado nenhum efeito
agudo (ou seja, no-genmica) ou deficincia andrognica crnica ou substituio T
sobre a dinmica de encurtamento de cardiomicitos ou de bicicleta de
clcio. Adicionalmente, no foi encontrada a modulao dos efeitos da T sobre a
biologia de cardiomicitos pelo inibidor da aromatase anastrozole, sugerindo que no h
papel de modulao por meio de bioconverso para estradiol. Embora um elevado risco
para a doena cardaca foi observado em condies clnicas caracterizadas por
deficincia de andrognio em excesso e, os nossos dados sugerem que este efeito no ,
provavelmente, devido a um efeito de T em funo de cardiomicitos.

Poucos estudos examinaram o efeito do T sobre a estrutura e funo cardaca em
mulheres. Os primeiros trabalhos sugerem que os impactos suprafisiologicos T estrutura
cardaca em ratas intactas ( Koenig et al . 1.982 ). Estudos posteriores mostraram que a
frao de ejeo, frao de encurtamento e relaxamento foram reduzidos em animais
OVX, e estrognio e substituio T impedido independentemente dessas mudanas
( Scheuer et al ., 1987 ). A preocupao com ambos os estudos, no entanto, que a dose
de T era susceptvel de ser suprafisiolgica, embora isso seja difcil de avaliar, dado que
a ausncia de medies hormonais. Usando o peso uterino, como um ndice do estado
hormonal, no estudo de Scheuer et al . (1987) , a substituio T induzida crescimento
uterino em excesso de animais sham. Fisiologicamente, os andrgenos servir hormnios
como precursor para a biossntese do tecido local de E 2 , o que pode explicar inmeros
efeitos de rgos-alvo de T nas fmeas.Deste modo, este efeito trfico de T no tero em
estudos iniciais provvel que seja devida, em parte, a bioconverso perifrica de T-
E 2 ( Lea & Flanagan, 1998 ).Um efeito semelhante de T para modular a estrutura e
funo cardaca atravs de bioconverso para E 2 pode ocorrer, dado que as enzimas
responsveis pelo metabolismo da hormona esteride perifrica esto presentes em
cardiomicitos (Grohe et ai . 1,998 ). Assim, alguns dos efeitos observados em estudos
anteriores pode estar parcialmente relacionado com os efeitos do metabolismo de
rgos-alvo de T para E 2 . Este no era um problema em nosso estudo porque ns
inclumos um grupo T-complementado que foi tratado com o inibidor de aromatase
anastrozol para eliminar a possibilidade de que substituiu T poderia ser convertido em
E 2 . claro que esta no a razo pela qual nossos resultados no nvel de
cardiomicitos no corroboram os efeitos de rgos toda observado em estudos
anteriores ( Scheuer et al ., 1987 ), pois nenhum efeito foi observado com OVX + T sem
a inibio de aromatase. Houve diferenas na durao do tratamento com
T contra estudos anteriores ( Koenig et al 1982. ; Schaible et al1984. ; Scheuer et
al 1987. ), com o nosso estudo ser mais curto, mas alguns estudos tm mostrado efeitos
dos andrognios sobre cardiomicitos em cultura depois de apenas 1-2 dias ( Er et al .
2.007 ), evitando a durao do tratamento como uma explicao para a variao entre os
estudos. As diferenas entre os estudos podem estar relacionadas com a dose de
reposio T, embora isso seja difcil de resolver, na ausncia de informaes mais
detalhadas a respeito do grau de androgenaemia nos relatrios iniciais.

Independentemente do motivo para a variao entre os estudos, a maioria dos estudos
que avaliam a influncia de hormnios sexuais em funo dos cardiomicitos se
concentraram em estrognio no sexo feminino ( Onda et al2003. ; Dourado et al .,
2003 ; Ren et al 2003. ). Para o nosso conhecimento, ns somos o primeiro a examinar
o in vivo efeito do T sobre a dinmica dos cardiomicitos em ratos fmeas atravs de
uma gama de frequncias de contrao e estimulao -adrenrgico. Nos ratos machos,
t privao provocada pela gonadectomia suficiente para causar uma reduo acentuada
no encurtamento dos cardiomicitos mxima e atraso no relaxamento ( Scheuer et al.
1,987 ). Em contraste, no encontramos efeito significativo T em todos os parmetros
encurtamento / relaxamento em cardiomicitos de ratas adultas, sugerindo uma resposta
especfica do sexo para T. Os resultados de Vizgirda et al. (2002) que demonstram
diretamente uma resposta especfica do sexo para -adrenrgico apoio estimulao esta
noo. Ns no interrogar ainda mais este fenmeno, porque no era o objetivo deste
estudo para elucidar as diferenas de sexo. No mnimo, no entanto, os nossos resultados
argumentam contra qualquer papel para a deficincia de T e doses suprafisiolgicas de
T na modulao dinmica de cardiomicitos sarcmero em ambas as frequncias de
contrao fisiolgicas e subfisiolgica e em resposta a estimulao -adrenrgico em
ratas.

Sexo privao hormonal provocada por OVX foi mostrado para ter um impacto
negativo sobre a troca de clcio atravs do retculo sarcoplasmtico, alterando, assim, o
ciclismo de clcio ( Bupha-Intr & Wattanapermpool de 2006 ).Substituio de estradiol
tenha sido mostrado para prevenir eficazmente estas alteraes em ratos do sexo
feminino, mas tambm neste caso o efeito de T nas fmeas, no foi estudada. Nossos
resultados sugerem que T no modula clcio do retculo sarcoplasmtico liberao /
captao em cardiomicitos intactas isoladas de ratas sexualmente maduras. Nossos
resultados conflitantes com os da Er et al . (2007) , que encontrou um aumento da
frao de encurtamento e transitria pico de clcio aps 24-48 h de tratamento T
cultivadas em micitos de ratos fmeas. As diferenas podem estar relacionadas com a
variao observada entre os efeitos da deficincia / substituio de T para
cardiomicitosin vivo , tal como no presente estudo, contra ex vivo , em cultura de
clulas que so destitudas de seu meio estrutural, funcional e hormonal
normal. Embora reconheamos que existem vrios mecanismos intracelulares (bombas,
por exemplo, os canais e os seus reguladores) que trabalham em conjunto para manter a
homeostase do clcio, no sondar a expresso ou funo desses canais adicionais,
porque o efeito lquido de quaisquer alteraes nos mesmos, se Atualmente, parece ser
insignificante em cardiomicitos intactas de ratas adultas.

No houve efeito da exposio T crnica sobre a distribuio de MHC cardaca.Alm
disso, a variabilidade em menor -MHC e distribuio -MHC observado com
substituio T (2-5%), no deve ter um significado funcional ( Harris et
al1994. ; Suzuki et al 2009. ), o que poderia explicar a falta de diferenas na dinmica
de encurtamento do sarcmero com as nossas intervenes. de notar, ao contrrio de
alguns estudos ( Wattanapermpool & Reiser, 1999 ), no foram observadas alteraes
na distribuio isoforma MHC com OVX. As diferenas entre os estudos que podem
estar relacionados com a durao do perodo de hormona-deficiente (ou seja, 4 semanas,
no presente estudo vs 10-14 semanas em estudos anteriores). No entanto, considerando
a taxa de rotatividade de protena do msculo cardaco (~ 5% por dia; Goldstein et al .,
2004 ), que iria antecipar o tempo suficiente para modificar a distribuio isoforma
MHC dentro do prazo de nosso estudo. Talvez mais importante, em estudos anteriores,
encontrando um efeito sobre a distribuio isoforma MHC, OVX foi realizada em
animais pberes (8-10 semanas de idade), que um perodo de rpido crescimento,
enquanto estudamos animais adultos (16 semanas de idade). Os esterides sexuais,
incluindo t, parecem participar no desenvolvimento do sistema cardiovascular em ratos
fmea ( Zhu et al 2002. ; MacLean et al 2010. ), sugerindo que os efeitos sobre a
distribuio de OVX isoforma MHC pode ser devido modulao da cardaco
desenvolvimento. Considerando que quase todos os estudos at o momento que
avaliaram o papel dos esterides sexuais (E 2 ou T) sobre o tamanho cardaco /
cardiomicitos e funo impuseram deficincia de hormnio / substituio durante os
perodos de desenvolvimento (ou seja, em animais pberes), os efeitos previamente
definidos podem estar relacionados mais de um papel para esterides sexuais na
regulao do desenvolvimento do corao tamanho / funo. Embora isso no nega os
efeitos hormonais observados em estudos anteriores, eles podem no ser relevantes para
animais adultos. Independentemente do motivo para as diferenas entre os estudos,
pouco provvel que alteraes na distribuio isoforma MHC influenciado nossas
medies encurtamento do sarcmero.

Andrgenos podem ter efeitos imediatos, no-genmicos sobre a funo celular (Liu et
al ., 2003 ). Dado que as clulas a partir de experincias que analisaram os efeitos
crnicos do T foram removidos a partir da exposio hormona para> 1 h antes do teste
(isto , durante o isolamento dos cardiomicitos), possvel que um efeito de T pode ter
diminudo. Para combater este potencial mecanismo de ao do T em cardiomicitos,
foram reproduzidas as mesmas condies experimentais para um segundo grupo de
animais a fim de examinar os possveis efeitos T no genmicos. Comparao dos
cardiomicitos do mesmo animal com e sem T adicionados durante as medies
mostraram nenhuma evidncia de efeitos no-genmicos de T. Estes resultados so
consistentes com os de Er et al. (2007) , que descobriu que a exposio aguda T no
afetou significativamente retculo sarcoplasmtico Ca 2 + sinalizao em cardiomicitos
recentemente isoladas de ratas. Tomados em conjunto, estes resultados argumentam
contra efeitos no-genmicos de T sobre SR Ca 2 + ciclismo na cardiomicitos de ratos.
Devem ser discutidas vrias advertncias adicionais para nossos resultados. Em
primeiro lugar, nosso estudo utilizou nveis suprafisiolgicos de T, considerando-se que
os nveis de T normais variam de 5 a 15 ng dl -1 em ratas e de 40 a 60 ng dl -1 em ratos
machos ( Lea & Flanagan, 1998 ; Lan et al . 2009 ;Morales-Ledesma et
al 2011. ). Nossa justificativa para usar esta dose era maximizar a possibilidade de que
poderamos observar um efeito de T sobre a biologia dos cardiomicitos. Algum
poderia argumentar que doses mais fisiolgicas so obrigados a observar os efeitos do T
( Er et al . 2.007 ). No entanto, estudos iniciais mostraram um efeito de doses
suprafisiolgicas de T sobre a estrutura e funo cardaca em ratas ( Koenig et
al 1982. ; Scheuer et al1987. ). Assim, a nossa escolha da dose T no necessariamente
negar nossos resultados, embora mais estudos que interrogam doses que reproduzem
nveis fisiolgicos seria importante. Em segundo lugar, apesar de inmeros relatos
demonstraram receptores de andrgenos em mulheres a partir de uma variedade de
espcies ( Marsh et al ., 1998 ), ns no confirmar a presena desses receptores. Embora
seja improvvel que isso explicaria a falta de efeito do T observada em nosso estudo,
dado o considervel corpo de evidncias de sua presena em ratas ( Michel & Baulieu,
1980 ; Hirai et al 1994. ; Marsh et al 1998. ) , pode explicar a variabilidade em efeitos
entre ratinhos fmea de diferentes estdios de desenvolvimento ou, de forma mais
ampla, a variao na resposta entre os sexos ( Vizgirda et al . 2,002 ).

Em resumo, nossos resultados no mostraram efeito do T sobre a dinmica dos
cardiomicitos de encurtamento, Ca 2 + dinmica de bicicleta ou distribuio isoforma
MHC em ratas adultas. Dado que ns controlamos para os efeitos potenciais de T
bioconverso para E 2 , estamos confiantes de que a nossa abordagem experimental
produziu uma srie de androgenaemia entre os grupos sem modificar
E dois nveis. Embora reconheamos que as doenas cardiovasculares em humanos leva
meses ou anos para se manifestar, coletivamente nossos resultados argumentam que as
sndromes de deficincia de T ou excesso no so susceptveis de conferir efeitos
negativos sobre a funo cardaca diretamente, mas so mais provveis de afetar o risco
de doena cardiovascular atravs da modulao da outra sistemas (resistncia insulina,
adiposidade, funo vascular, etc).

Agradecimentos
Agradecemos Zengyi Chen e Richard LaChapelle para a sua assistncia tcnica
qualificada. Este estudo foi financiado por doaes da Universidade de Vermont
Departamento de Obstetrcia, Ginecologia e Cincias Reprodutivas, com apoio
adicional por parte dos Institutos Nacionais de Sade HL086902 (BMP).

Notas de Rodap
(Recebido 28 de abril de 2012, aceito aps reviso 13 de julho de 2012, primeiro
publicado on-line 13 de julho de 2012)