BAB III

Kromatografi Lapis(an) Tipis (KLT)

Thin Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar.
Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada
gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase)
berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadang-
kadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan
membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas
plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.


Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena
strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa
diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk
kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase
diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau
j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom).
Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran:

Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil
diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian
mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari
300-1000 m
2
/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat
mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran:
Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum,
(CaSO
4
5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan
pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai
pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan
bercak.
Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini
sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa
dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah-
kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau
Silika gel GF
254
(berflouresensi pada , 254nm).
Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel
N.
Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi.
Silika gel untuk keperluan pemisahan preparative


Alumina
Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam yang
beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9), ada
juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga
digunakan CaSO
4
sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan pada
tinggkat tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa
pengikat dan bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel
dengan code G.H.P.F.


Selulosa
Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya
sama seperti mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya
hanya serat selulosenya pada TLC/KLT lebih pendek dari pada serat selulosa
kromatografi kertas. Panjang serat bervariasi 2-20 . Serat lebih pendek
menyebabkan difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit
(lebih kecil). Selulosa untuk TLC terdapat dim bentuk selulosa serat asli
(contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam
selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.




Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik
(tabel 1). Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun
campuran.
Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka
mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat
penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan
polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar
akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase
gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh
fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.

Tabel 1 : Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase gerak
(deret eluotropik)



non polar













polar

Parafin cair
Petroleum eter
Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Toluena
Kloroform
Dietileter
Etilasetat
Aseton
n-propanol
etanol
asetonitril
methanol
air

Pembuatan plat (lempeng) silica gel
30 Gram phase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual
dengan merk dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan
air atau pelarut lain sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng
kaca ukuran 20X20 cm, dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat
menggunakan alat perata Stahl-Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm,
20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih
kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam bubur adsorbent. Setelah
lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven
pada 100-120C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap.
Proses pengeringan atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat
kromatografi (fase diam), selanjutnya didalam rak penyimpan plat-plat ini
dimasukkan kedalam dexicator. Sehingga pada waktu penyimpanan plat-plat
tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian mekanisme
pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah
mekanisme absorption.

Tabel 2: Perbandingan berat fase diam dan cairan untuk pembuatan plat.

Fase diam Cairan Perbandingan
Fase diam : cairan = (g : ml)
1. Silika gel G atau GF Air 30:60-65
2. Silika gel H Air 30:80-90
3. Alumina G Air 30:40
4. Alumina H Air 30:80-90
5. Kiselgur Air 30:60-65
6. Serbuk selulosa MN 300 Air 1:5
7. Serbuk poliamida Kloroform: metanol = 2:3 1:9


Plat TLC yang siap pakai tersedia dipasaran, diantaranya dengan ukuran
20X20 diatas lembaran gelas, aluminium, plastik. Plat-plat ini dapat dipotong
sesuai dengan luas plat yang diperlukan. Untuk lembaran plastik tidak dapat
dipanaskan pada waktu pengamatan bercak/spot.


Penyiapan dan penotolan sampel
Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir
pelarut organik dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air
digunakan hanya bila tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk
keperluan analisis kuantitatif sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang
digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat
untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 l larutan yang
mengandung 50-100 g sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5-
2Qg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan
gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan
kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional
(20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak bulat atau
garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah. Untuk memudahkan penotolan dibuat garis
lemah dengan pensil, disebut garis awal. Pada garis awal ini biasanya ditotolkan
bercak-bercak dengan garis tengah 3-6 mm, bercak-bercak tadi diusahakan
diameternya seragam. Penotolan bercak pada plat TLC dapat dilakukan
berulang-ulang dan haras berhati-hati dijaga plat tidak rusak. Penotolan sample
yang terlalu banyak (over loaded) menyebabkan bercak hasil pengembangan
berbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan harga Rf. Bila totolan sample
sample telah kering maka plat siap untuk dielusi / dikembangkan.


Pengembangan (Elusi)
Hampir semua TLC dikembangkan dengan cara menaik dalam bejana
(chamber) pengembang dari gelas. Di dalam bejana ini dimasukkan fase gerak
hingga kedalaman 0,5 cm, pada dinding sebelah dalam bejana ditempelkan
kertas saring setinggi 20 cm yang ujung bawahnya tercelup fase diam. Fase
diam akan merambat keatas membasahi kertas saring, dengan demikian
ruangan dalam bejana tertutup ini akan lebih cepat dijenuhi dengan uap pelarut.
Setelah ruangan dalam bejana jenuh dengan uap fase gerak (terjadi
kesetimbangan), plat TLC dimasukkan dimulai pengembangan atau elusi. Bercak
sample pada garis awal jangan sampai tercelup dalam fase gerak. Fase gerak
akan merambat naik membawa komponen sample. Kecepatan merambat tiap-
tiap komponen berbeda tergantung kekuatan persaingan ikatan hydrogen yang
terjadi antara fase diam-senyawa (komponen)-fase gerak. Komponen yang
membentuk ikatan hydrogen lebih kuat dengan fase gerak akan terelusi lebih
cepat atau merambat lebih cepat. Sebaliknya kalau ikatan hidrogennya lebih kuat
dengan fase diam, komponen akan lebih lama tertahan fase diam atau
merambat lambat. Pengembangan dihentikan pada saat fase gerak mencapai
jarak tertentu, biasanya 1 cm sebelum ujung akhir plat. Batas dicapainya fase
gerak segera ditandai dengan pensil sebagai garis akhir. Lebih baik batas akhir
ini dibuat dahulu sebelum pengembangan, bila pelarut mencapai garis akhir, plat
segera diangkat dan dikeluarkan dari bejana.
Cara-cara pengembangan yang lain adalah :
1. Pengembangan berulang
Yaitu plat yang baru saja dielusi dikeringkan kemudian dielusi kembali
dengan fase gerak yang sama.
2. Pengembangan dua dimensi
Yaitu plat dikembangkan seperti biasa, setelah itu dikeringkan dan pelat
diputar 90 kemudian dikembangkan dengan fase gerak berbeda
(pemisahan flavone "Harbone")
Pengembangan sirkular
3. Contoh cara pengembangan ini adalah pada kromatotorn, sebenarnya
termasuk kromatografi planar juga. Perbedaan dengan KLT adalah cara
pengembangannya yaitu kromatotorn dikembangkan dengan cara
dipusingkan pada kecepatan tertentu. Sampel ditotolkan pada daerah
dekat sumbu putar, kemudian sambil dipusingkan fase gerak diteteskan
dan diatur kecepatannya, fase gerak ini akan keluar menetes dibagian
tepi pelat yang dipusing tersebut.


Pengamatan (mendeteksi) bercak / visualisasi
Cara mengamati bercak pada TLC dapat digolongkan menjadi dua : Pertama
dengan cara merusakkan / mereaksikan komponen/senyawa yang ada bercak itu
dan Kedua tanpa merusakkan komponen / senyawa. Cara pertama dengan
menyemprotkan pereaksi penanda.
Banyak pereaksi-pereaksi yang digunakan dapat dilihat dalam literature dan
dijual dipasaran (niaga). Contoh pereaksi semprot yang umum untuk senyawa
organik adalah asam sulfat dalam metanol, selanjutnya bercak dipanaskan di
dalam oven, sebaiknya digunakan oven yang ada jendela kacanya sehingga
dapat diikuti perubahan bercak selama pemanasan menjadi bercak warna hitam.
Pada dasarnya adalah reaksi oksidasi pada senyawa organic oleh asam sulfat.
Pereaksi lain adalah dengan disemprot dengan larutan lodium dan paling mudah
adalah dengan memasukkan plat kedalam bejana yang berisi uap lodium (kristal
lodium diletakkan dalam bejana, tidak merusak 75% senyawa). Contoh pereaksi
semprot dan penggunaannya dapat dilihat pada tabel 3.
Cara ke dua, yang tidak merusak komponen/ senyawa di bercak. Untuk
senyawa berwarna atau berpendar dibawah lampu UV (berfluoresensi) tidak
ada masalah menggunakan silika tanpa tambahan zat berpendar. Sedang
untuk senyawa yang tidak berpendar dibawah lampu UV digunakan fase diam
dengan tambahan zat berpendar.


Tabel 3 : Macam pereaksi warna / penanda dan penggunaannya

No. Pereaksi warna Jenis senyawa Warna

1. Anilina ftalat Gula mereduksi Berbagai warna
2.

Anisaldehida dalam H2SO4
dan asam asetat

Karbohidrat

Berbagai warna

3.

Stibium triklorida dalam
kloroform

Steroid, glikosida steroid.
Lipid alifatik, vit. A dll.

Berbagai warna

4.

Hijau brom kresol

Asam karboksilat

Bercak kuning pada
dasar hijau
5.

2,4-Dinitrofenilhidrazin

Aldehida dan keton

Bercak kuning
sampai merah
6.

Deagendorf

Alkaloid dan basa organic

Jingga

7. Besi III klorida Fenol Berbagai warna
8.

Flourescein;Br
2


Senyawa tak jenuh

Bercak kuning pada
dasar merah jambu

9.

Ninhidrin

Asam amino, gulaamino,
asamfosfatida

Biru

Analisis Kualitatif
KLT mempunyai kontribusi yang signifikan pada analisis kualitatif, walaupun
masih perlu data pendukung lainnya. Untuk analisis kualitatif diperlukan senyawa
murni pembanding. Sampel dan senyawa pembanding dilarutkan pada pelarut
yang sama, Kemudian laratan sampel ditotolkan pada ujung pelat KLT, 2 cm
sejajar dengannya ditotokan larutan senyawa murni dan disebelahnya lagi
ditotolkan campuran sampel dan senyawa pembanding. Kromatogram diangkat
diberi tanda batas akhir yang ditempuh fase gerak.
Diinventarisasi nilai Rf dan R
r
. Senyawa yang mempunyai nilai Rf yang sama
dengan nilai Rf senyawa pembanding dan pada pengulangan elusi dengan sistim
berbeda tetap memberikan nilai Rf yang sama, maka dapat disimpulkan
sementara senyawa tersebut identik dengan senyawa pembanding.
R
f
adalah jarak yang ditempuh senyawa (bercak) dibagi dengan jarak yang
ditempuh fase gerak.
hR
f
adalah R
f
x 100.
R
r
adalah jarak yang ditempuh senyawa sample dibagi dengan jarak yang
ditempuh senyawa pembanding menggunakan sistim yang sama.

Untuk keperluan mencari sistim KLT yang dapat digunakan untuk
senyawa obat dapat dicari pada beberapa literature. Satu diantaranya adalah
dari buku:

Isolation and Identification of drugs
Oleh:
E.G.C.Clarke, Judith Berle, M.Sc.
The Pharmaceutical Press, London, (1974)
Pada buku tersebut terdapat 22 sistim, Tl hingga T22. Tiap-tiap sistim
menggunakan campuran fase gerak dan digunakan untuk mengelusi golongan
obat tertentu. Sedangkan fase diam yang digunakan adalah silika gel dengan
ukuran plate 20x20cm. Diterakan juga nilai Rf dari beberapa senyawa pada
sistim tertentu. Untuk kromatografi kertas digunakan sistim dengan kode P.
Sekedar untuk contoh dikutip sebagian dari sistim-sistim itu (Tabel 4) dan kita
tinjau Rf dari obat sederivat hubungannya dengan polaritas dan struktur
molekulnya.
Tabel 4: Contoh Sistim Elusi Untuk Senyawa Obat

No

Sistem

Golongan senyawa obat
1 T1 Basa nitrogen (alkaloid)
2 T2 Antihistamin &
klordiazepoksid

3
4
5
6
T3
T4
T5
T6
Antihistamin &
tranquilliser
Antihistamin &
tranquilliser
Antihistamin &
tranquilliser
Antihistamin &
tranquilliser


7
8
T7
T8
Analgetika narkotik
Analgetika narkotik

9 T9 Alkaloid ergot
10 T10 Barbiturat Fase gerak :
Aseton 1
CHC1
3
9
Pengembangan : 10 cm +17
menit
Visualisasi :
- KMnO
4
warna yang
timbul kuning, coklat,
purple. Pereaksi
- Zwikkers warna yang
timbul Pink atau hijau

11 T11 Barbiturat
12 T12 Barbiturat Fase gerak :
Larutan amoniak pekat 5
Benzen 75
Dioksan 20
13 T13 Barbiturat
17 T17 Aspirin
22 T22 Golongan sulfa Sample dilarutkan dalam aseton
Fase gerak:
CHC1
3
1
Etanol 1
Heptana 1
Air 1,5%
Kesetimbangan 3 jam
Visualisasi : diazotasi dengan N-
l-naftiletilendiamin (spray)




















Tabel: 5, Obat-obat Sulfa dan Nilai R
f
pada T22















mempunyai Rf terkecil dari ketiga sulfa itu.
kuat dengan fase diam dari pada sulfa yang lain itu, dan ini ditunjukkan
senang melarut dengan fase diam atau dikatakan mempunyai affinitas yang lebih
sulfadimidin lebih cepat terelusi (R
f
terbesar), sedangkan sulfadiazin lebih
pirimidinnya tersubstitusi dua metil. R
f
ketiga senyawa ini membuktikan bahwa
tersubstitusi satu metil. Sedangkan sulfadimidin lebih kurang polar karena gugus
sulfadizin lebih polar dari pada sulfamerazin yang gugus pirimidinnya
pada sulfadiazin adalah gugus pirimidin tak tersubstitusi, oleh karena itu
adalah partisi. Struktur molekul ketiga sulfa pada Tabel 5, berbeda pada R, R
Fase gerak sistim T22 mengandung air, oleh karena itu mekanisme pemisahan

Tabel: 6, Senyawa Barbiturat dengan Nilai R
f
pada TI


























berikatan rangkap.
lebih polar dari pada sulfa yang mempunyai R2, alkil rantai lebih panjang.
gugus R2 ini, maka sulfa yang mempunyai R2, alkil rantai pendek adalah yang
dipilihkan barbiturat yang mempunyai perbedaan pada R2. Bila dibandingkan
Fase gerak sistim TIO adalah campuran aseton dan chloroform. Pada Tabel 6
Analisis Kuantitatif
Ketepatan dan ketelitian KLT untuk analisis kuantitatif lebih rendah bila
dibandingkan dengan kromatografi gas dan kromatografi kinerja tinggi. Namun
untuk keperluan tertentu sudah memadahi. Dibedakan dua cara:
1. Bercak langsung diukur
2. Bercak diambil (dikerok)

Ad 1.
Dengan dasar adanya hubungan antara luas bercak dengan banyaknya
senyawa terlarut maka senyawa dapat diukur kadarnya dengan mengukur luas
bercak. Cara dibedakan lagi:
a. Tanpa menggunakan kurva baku
Menurut Purdy & Truter: akar luas bercak berbanding lurus dengan
logaritma(lO) berat senyawa yang ada. Untuk menghitung dengan cara ini
maka perlu dibuat tetapan untuk senyawa pada sistem yang tertentu.
b. Menggunakan kurva baku
Dibuat kurva hubungan kadar dan luas bercak dari senyawa murni
pembanding.
Akan diperoleh persamaan garis lurus Y = bX + a. Selanjutnya luas bercak
sampel dapat dihitung. Adapun urutan kerja dapat disusun sbb :
1* Dibuat larutan mengandung senyawa murni yang akan dianalisis dengan 3
macam konsentrasi yang diketahui.
2* Dibuat larutan sample pada kadar tertentu sehingga setelah dielusi
memberikan
bercak yang bulat (ideal).
3* Ke 4 larutan ( 1 sampel, 3 lart baku) ditotolkan secara duplo pada lempeng
yang sama (20X20 cm).
Perlu diperhatikan:
- penotolan tegak lurus dengan alat suntik mikro, gelas kapiler.
- banyak larutan 5-10 pi.
- sekali penotolan saja dengan volume yang sama.
4* Lempeng dielusi / dikembangkan sampai jarak yang telah ditentukan (10-
20cm) didalam bejana yang dijenuhi fase gerak. Kemudian ditampakkan/
divisualisasikan degan cara yang sesuai.
5* Luas bercak diukur pada alat densitometer. Dibuat kurva hubungan kadar dan
luas kemudian dibuat persamaan garis lurus. Kadar senyawa dalam dapat
ditetapkan.

Ad 2. Mengukur kadar dengan cara elusi.
Cara ini akan memberikan ralat yang timbul karena memindahkan / mengerok
dan
elusi. Ditentukan letak bercak dengan cara yang tidak merusak, mengerok
bercak
beserta fase diam, kemudian diekstraksi dengan alat yang diperoleh diukur
kadarnya dengan spektrometri atau cara lain yang sesuai.
Urutan kerja dapat disusun sebagai berikut:
1*Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, demikian juga senyawa murni
(pembanding) dilarutkan dalam pelarut yang sama dengan pelarut untuk sample.
2*Banyak sample yang ditotolkan harus diketahui dengan tepat.
3*Dikembangkan secara biasa dan divisualisasikan dengan cara yang tidak
merusak.
4*Bercak yang dikehendaki diberi tanda dengan alat tajam, dibandingkan dengan
bercak baku.
5*Bercak beserta fase diam dikerok kemudian dilarutkan dalam pelarut yang
sesuai secara kuantitatif.
6*Larutan yang diperoleh bila perlu diuapkan dibawah rotary evaporator
dimasukkan ke dalam labutakar, ditetapkan kadarnya dengan cara yang sesuai.


KLT preparatif
Cara ini ideal untuk memisahkan sample dalam jumlah kecil (50mg-1gram).
Larutan sample ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat. Dielusi seperti
cara-cara biasa yang telah dijelaskan didepan. Akan terjadi bercak berupa garis
atau pita. Visualisasi dipilih cara yang tidak merusak. Jika terpaksa digunakan
cara-cara merusak mis, disemprot dengan pereaaksi, maka pelat ditutup
sebagian dan bagian kecil lain yang disemprot. Sehingga dapat diperkirakan
letak bercak berbentuk pita/garis lurus. Pita yang diinginkan dikerok dan
dilarutkan dengan pelarut yang sesuai. Fase diam. Yang sering digunakan
adalah silikagel dengan atau tanpa indicator flouresensi 254 nm. Tersedia TLC
preparative dijual dengan kualitas lebih baik daripada lapisan fase diam yang
dibuat sendiri. Tebal optimum lapisan preparative berkisar antara 1-1,5 mm.
Lapisan yang terlalu tebal kurang memberikan pemisahan yang baik. Lapisan
preparative dapat dibuat dengan ketebalan yang diinginkan dengan alat dari
Desaga.


Kromatografi Lapisan Tipis Kinerja Tinggi (KLTKT=HPTLC)
Ukuran fase diam sangat mempengaruhi hasil pemisahan , namun secara pasti
belum dapat ditentukan berapa ukurannya. Diketahui penyebarat ukuran partikel
berskala sempit akan memberikan hasil pemisahan yang lebih baik. KLTKT
adalah suatu contoh penggunaan fese diam berukuran halus dengan skala
sempit (5-10m). TLC ini memberikan hasil pemisahan yang lebih baik untuk
analisis kuantitatif.