Tuz 0003 FBL 1 PDF

UNIVERSIDADDEZARAGOZA
FACULTADDEMEDICINA
DEPARTAMENTODEFARMACOLOGAYFISIOLOGA
MELATONINACOMOPROTECTORFRENTE
ALOSRADICALESLIBRESENLA
HEPATOTOXICIDADPORCIDOSBILIARES
TESISDOCTORALPRESENTADAPOR
Da.LorenaFuentesBroto
PARAOPTARALGRADODEDOCTOREUROPEO
Zaragoza,2008
III
ENRIQUE MARTINEZ BALLARN, Profesor Titular del rea de Fisiologa de la

UniversidaddeZaragoza,
JOS JOAQUN GARCA GARCA, Profesor Titular del rea de Fisiologa de la

UniversidaddeZaragoza,y
FRANCISCOJAVIERMIANAMENA,ProfesorAyudanteDoctordelreadeFisiologade
laUniversidaddeZaragoza,
CERTIFICAN:
QueD
a
LorenaFuentesBroto,harealizadobajonuestradireccinenelDepartamento
deFarmacologayFisiologadelaFacultaddeMedicinadelaUniversidaddeZaragoza,
elsiguientetrabajodeinvestigacintitulado:Melatoninacomoprotectorfrentealos
radicales libres en la hepatotoxicidad por cidos biliares. Consideramos que dicho
trabajorenelosrequisitosnecesariosparasupresentacinydefensacomoTesispara
optaralgradodeDoctorEuropeo.
Zaragoza,30deabrilde2008
JosJoaqunGarcaGarca EnriqueMartnezBallarn FranciscoJavierMianaMena
V
Estetrabajohasidofinanciadograciasalossiguientesproyectosdeinvestigacin:
Fisiologadelenvejecimientoydelestrsoxidativo(B40).
GrupodeInvestigacinConsolidadodelGobiernodeAragn.
RedTemticadeInvestigacinCooperativaen
EnvejecimientoyFragilidad(RETICEF)(RD06/0013).Fondo
deInvestigacinSanitaria.MinisteriodeSanidadyConsumo.
Enero2.003Diciembre2.008.
ProgramadeApoyoalaInvestigacin.Solicitudde
Infraestructuras.UniversidaddeZaragoza.Convocatorias
2.004(INF2004BIO03)y2007(INF2007BIO05).
AyudaparalapublicacindeTesisDoctorales.Colegio
OficialdeFarmacuticosdeZaragoza.
VII
AGRADECIMIENTOS
HacealgomenosdecincoaosasistauncursodeDoctoradoimpartidoporlos
profesores Joaqun Garca y Enrique Martnez Ballarn dnde mostraban los
interesantes estudios que se estaban llevando a cabo en su laboratorio. El tema me
fascinytraslaentrevistaoportuna,medieronlaoportunidaddecomenzaratrabajar
en el grupo de investigacin de Fisiologa del Envejecimiento de la Universidad de
Zaragoza. Los comienzos fueron difciles en busca de becas predoctorales u otras
ayudas, pero, algunas veces, no conseguir lo que una desea significa que una
oportunidad mejor est esperando para llamar a la puerta. As sucedi en mi caso, y
actualmente presento esta Tesis Doctoral como un deseo de mejorar y continuar mi
carreracientficodocente.
Una Tesis Doctoral es un reto profesional y personal, en el que intervienen
muchas Instituciones y personas sin las cuales sera imposible su realizacin, por eso
quieroagradecerelapoyoyelintersqueherecibidodetodosellos:
Al Ministerio de Sanidad, Gobierno de Aragn, Universidad de Zaragoza y
ColegioOficialdeFarmacuticosdeZaragoza,sincuyoapoyoestructuralyeconmico
hubierasidoimposiblellevaracaboestaTesis.
Al los profesores Joaqun Garca y Enrique Martnez Ballarn por haberme
brindadolaoportunidadderealizarestatesisdoctoralbajosudireccinydepositarsu
confianza en m, contribuyendo enormemente a terminar de despertar en m el
entusiasmo por la ciencia. Al Prof. Javier Miana por su predisposicin permanente
para brindarme ayuda en todo momento. Gracias a los tres por ensearme el
verdadero significado de la investigacin cientfica; vuestra labor como tutores,
directores y, sobre todo, como profesores y grandes transmisores de conocimientos,
hapermitidolarealizacindeestetrabajo.
Al Prof. Daro AcuaCastroviejo por aceptarme en su laboratorio, dnde, a
pesarderealizarunacortaestancia,meinculcelentusiasmoeintersporlacienciay
la necesidad de la voluntad, la disciplina y la constancia en el trabajo diario como
VIII
pilares bsicos para hacer ciencia. A la Prof. Germaine Escames que me dio sabios
consejosquemehanservidoyseguromeservirnenmicarreracientfica.
Herrn Prof. Rdiger Hardeland danke ich herzlich fr seine kompetente, nette
undzeitintensiveBetreuungsowohlwhrendmeinerTtigkeitinseinLabor.Bedanken
mchte ich mich ebenfalls fr das gute Arbeitsklima durch Herrn PD Dr. Burkhard
Poeggeler und Frau Jutta Bker. Bei Herrn PD. Dr. Burkhard Poeggeler bedanke ich
michfrdiezustzlicheUntersttzungimLaborsowiedieanregendenGesprche.Frau
Jutta BkermchteichfrihreHilfeundUntersttzungwhrendderArbeitimLabor
danken.
A mis compaeros de Fisiologa: Sergio, Maribel, Carlos, Csar, Eva, Gerard,
JosLuis,Luismi,EduardoyMarcos,conquieneshepasadoenellaboratoriomuchas
horasdetrabajoyalegras.
BeimeinenKommilitoneninGttingenSarah,Andrea,Anna,Monique,Mirko,
Katinka, Katrin mchte ich mich frdie gute und entspannte Zusammenarbeit in und
auerhalbdesLaborbedanken.
A mis compaeros de docencia en Huesca, en especial a Fernando Lostal y a
Marta Castro, quienes junto con mis directores de Tesis me habis dado grandes
consejos, nimo y complicidad en los momentos ms difciles. Gracias por supuesto a
todos los alumnos pasados y futuros, porque por vosotros realizo esta Tesis, para
poder seguir investigando y facilitando vuestro aprendizaje. Tambin a todas las
personasdelDepartamentoquehanhechoposiblequeestetrabajosalieraadelante.
AMapi,Marta,Goretti,Laura,Mara,Conchiytodosnuestroscompaerosde
tuperwareporlosagradablesmomentosenlabiblioteca.
Atodosmisamigos:losmaicos,losquenosconocimosentierrascharras(Bea,
Luci,Nai,Ana,Rebe,Elena,Pili,Alfredo,)losmandosdelHogarAragn(Elena,Mari,
Anabel, Rosa, Capi, LaHoz, Daro,), los compis de ptica (Gema, Sofa, Sara,),
graciasporhabermedemostradosiemprevuestrocarioyhabermeayudadosiempre
que os necesito, as como por aguantarme tanto en los buenos como en los malos
momentos.
IX
A toda mi familia, en especial a Jimena, la ms pequea. Pero todo esto no
hubiera sido posible sin el apoyo incondicional de mi madre, Nlida, una luchadora
nata, por haberme inculcado unos valores basados en el amor, trabajo y constancia,
tan necesarios para cualquier aspecto de la vida. Gracias por darme tanto nimo.
Gracias tambin a mi padre, Paco, que siempre ha confiado en m y me ha animado,
ensendome la importancia del respeto. A los dos gracias por ensearme que la
virtud est en el trmino medio, quizs nunca os podr agradecer suficientemente
todasvuestrasenseanzas,carioydedicacin.
A todas aquellas personas y amigos que no he citado y que de alguna forma
hancontribuidoaqueestaTesishayallegadoabuentrmino.
Atodos,muchasgracias.
XI

Amimadre,amipadre,
atodosmisprofesoresy
atodaslaspersonasque
heconocidoenmivida
porquedeellashe
aprendidocuantos.
XIII
"Todo hombre puede ser, si se lo propone,

escultordesupropiocerebro."
SantiagoRamnyCajal(18521934)
"Lasuertevieneaquienmenoslaaguarda."
FedericoGarcaLorca(18981936)
Conelconocimientoseacrecientanlasdudas.
JohannWolfgangGoethe(17491832)
ABREVIATURAS
XVII
Asc
Radicalascorbilo
NO xidontrico
O
2
Radicalsuperxido
OH Radicalhidroxilo
1
O
2
Oxgenosinglete
4HDA 4hidroxialquenales
ADN cidodesoxirribonucleico
ADNm cidodesoxirribonucleicomitocondrial
ADP Adenosindifosfato
AMPc Adenosinmonofosfatocclico
aMT MelatoninaN(2(5metoxiindol3
il)etil)acetamida
AP1 Protenaactivadora1
ATP Adenosintrifosfato
AscH
Ascorbato
BH4 Tetrahidrobiopterina
BSA Albminasricabovina
Bsep Bombaexportadoradecidosbiliares
CD4 LlinfocitosTcooperadores
cfos Factordetranscripcinpro
crecimiento
COX Ciclooxigenasa
CREB Protenasqueseunenafragmentos
delADNsensiblesalAMPc
DCA cidodesoxiclico
DNPH 2,4dinitrofenilhidrazina
EDTA cidoetilendiaminotetractico
eNOS xidontricosintasaendotelial
ERNs Especiesreactivasdependientesde
nitrgeno
EROs Especiesreactivasdependientesde
oxgeno
FAD Flavnadenndinucletido
FDA FoodandDrugAdministration
FMN Flavnmononucletido
FeCl
3
Clorurofrrico
GPx Glutatinperoxidasa
GTP Trifosfatodeguanosina
H
+
Hidrogenin
H
2
O
2
Perxidodehidrgeno
HEPES cido4(2hidroxietil)piperazina1
etanosulfnico
HIOMT HidroxiindolOmetiltransferasa
HO
2
Radicalperhidroxilo
HOCl cidohipocloroso
HONOOcidoperoxinitroso
IDO Indolamina2,3dioxigenasa
IL Interleucina
iNOS xidontricosintasainducible
IP3 Inositoltrifosfato
JNK QuinasascJunNterminal
LCA cidolitoclico
LOX Lipooxigenasa
LPO Lipoperoxidacin
MAO Monoaminooxidasa
MAPk Quinasasactivadaspormitgenos
MDA Malonildialdehdo
MPT Permeabilidadtransitoriamitocondrial
Mrp2 Protenasderesistenciaamltiples
frmacos
NaCl Clorurosdico
NAD Nicotinamidaadenndinucletido
NADP Nicotinamidaadenndinucletido
fosfato
NAT Nacetiltransferasa
NFB FactornuclearKappaB
nNOS xidontricosintasaneuronal
NO
2
Dixidodenitrgeno
NOS xidontricosintasa
O
2
Oxgenomolecular
ONOO
Aninperoxinitrito
p/v Peso/volumen
PI3K Fosfatidilinositol3quinasa
PKC ProteinquinasaC
PLA
2
FosfolipasaA
2
PLC FosfolipasaC
QCA cidoquenodesoxiclico
R Radicalalquilo
RO Radicalalcoxilo
ROO Radicalperoxilo
ROOH Perxidolipdico
RS Radicaldetomosdeazufre
SOD Superxidodismutasa
TCA cidotricloroactico
TDA cidotaurodesoxiclico
TLC cidotaurolitoclico
TNF Factordenecrosistumoral
TQA cidotauroquenodesoxiclico
TRIS Tris[hidroximetil]aminometano
UDA cidoursodesoxiclico
UV Ultravioleta
v/v Volumen/volumen
VitC cidoascrbico
NDICE
XXI
INTRODUCCIN..............................................................................................1
ESTRSOXIDATIVOENLOSSERESVIVOS.....................................................................3
Radicaleslibres......................................................................................................................3
Conceptoderadicallibre................................................................................................................3
Tiposderadicaleslibres.................................................................................................................4
Formacindelosradicaleslibresenlosseresvivos.....................................................................12
Mecanismosdeproteccin..................................................................................................23
Antioxidantes...............................................................................................................................24
Sistemasreparadores...................................................................................................................24
Fisiopatologadelosradicaleslibres...................................................................................26
Funcionesdelosradicaleslibres..................................................................................................26
Conceptodeestrsydaooxidativo...........................................................................................27
FISIOPATOLOGADELOSCIDOSBILIARES................................................................32
Sntesisytransporte.............................................................................................................33
Estructuraycaractersticasgenricas.................................................................................38
Funciones.............................................................................................................................39
Implicacionesetiopatognicas.............................................................................................40
FISIOLOGADELAMELATONINA................................................................................44
Estructurafuncionaldelaglndulapineal..........................................................................44
Biosntesisdemelatonina....................................................................................................46
Distribucin..........................................................................................................................50
Metabolismoyfarmacocintica..........................................................................................51
Mecanismosdeaccin.........................................................................................................53
Mecanismosmediadosporreceptor............................................................................................54
Interaccinconprotenasintracelulares......................................................................................57
Mecanismosyfuncinantioxidantedelamelatonina.................................................................59
Otrasfuncionesdelamelatonina........................................................................................66
Regulacindelosritmosbiolgicos.............................................................................................66
Regulacindelareproduccin.....................................................................................................67
Inmunomodulacin......................................................................................................................69
JUSTIFICACINYOBJETIVOS.........................................................................71
JUSTIFICACINYPLANTEAMIENTO............................................................................73
OBJETIVOSESPECFICOS.............................................................................................75
MATERIALYMTODOS.................................................................................77
MATERIAL...................................................................................................................79
XXII
Melatoninaprotegelahepatotoxicidadoxidativamediadaporcidosbiliares
Reactivosqumicosutilizados...............................................................................................79
Materialdelaboratorio........................................................................................................80
Materialbiolgico................................................................................................................81
DISEOEXPERIMENTAL..............................................................................................82
Estudiodeldaooxidativoporcidosbiliares.....................................................................83
Cinticasdetiempodedaooxidativo................................................................................84
Cinticasdeconcentracindedaooxidativo.....................................................................85
Cinticasdeconcentracindemelatonina..........................................................................86
MTODOSPARALAPREPARACINDELASMUESTRAS..............................................87
Perfusindelosanimalesyobtencintisular......................................................................87
Homogeneizacindeltejidoheptico..................................................................................87
Aislamientodemembranasdetejidoheptico....................................................................88
MTODOSANALTICOS...............................................................................................90
Determinacindelaconcentracindeprotenas................................................................90
Cuantificacindelaperoxidacinlipdica............................................................................92
Cuantificacinderestoscarbonilo.......................................................................................94
MTODOSESTADSTICOS............................................................................................96
Estudiodescriptivodelosdatos...........................................................................................96
Inferenciaestadstica...........................................................................................................96
Clculodedaooxidativoinducidoopotenciado................................................................96
ClculodelaIC
50
..................................................................................................................97
RESULTADOS.................................................................................................99
ESTUDIODELDAOPORCIDOSBILIARES..............................................................101
CINTICASDETIEMPODEDAOOXIDATIVO...........................................................108
CINTICASDECONCENTRACIN...............................................................................112
VALORACINDELAACTIVIDADANTIOXIDANTEDELAMELATONINA.....................119
DISCUSIN...................................................................................................127
CONCLUSIONES............................................................................................149
BIBLIOGRAFA..............................................................................................153

XXIII
NDICEDETABLAS:
Tabla 1. Vida media de algunas especies reactivas dependientes del oxgeno (EROs) y del
nitrgeno..............................................................................................................................................4
Tabla2.Resumendelosprincipalesantioxidantesbiolgicos...................................................................25
Tabla3.Estructurasdeloscidosbiliaresestudiadosenestetrabajo.......................................................36
Tabla 4. Efecto de distintos cidos biliares en la formacin de MDA+4HDA y carbonilacin
proteica en homogeneizados y membranas de hgado. La incubacin se realiz a 37C
durante2hcon1mMdecadacidobiliar,enpresenciayausenciadeFeCl
3
0,1mMycido
ascrbico0,1mM.............................................................................................................................101
Tabla 5. Incremento porcentual de dao oxidativo a lpidos y protenas hepticas causado por
cidosbiliares(1mM).......................................................................................................................102
Tabla 6. Efecto del tiempo de incubacin en la formacin de MDA+4HDA y restos carbonilo en
homogeneizadosymembranasdehgado.......................................................................................109
Tabla7.Efectodelcidotaurolitoclico(TLC)enlaformacindeMDA+4HDAyrestoscarbonilo
enhomogeneizadosymembranasdehgado..................................................................................113
Tabla8.Efectoprotectordelamelatonina(aMT)enlaoxidacindelpidosyprotenasinducida
por cido taurolitoclico (TLC) 1 mM, en ausencia y presencia de FeCl
3
0,1 mM y cido
ascrbico0,1mMenhomogeneizadosymembranasaisladasdehgado......................................119
Tabla 9. Concentraciones de melatonina necesarias para inhibir el 50% del dao oxidativo (IC
50
)
debido a la presencia de cido taurolitoclico 1mM, en ausencia y presencia de FeCl
3
0,1
mMycidoascrbico0,1mMenhomogeneizadosymembranasdehgado................................126
NDICEDEFIGURAS:
Figura 1. Configuracin electrnica de los orbitales moleculares de varias especies reactivas
dependientesdeoxgeno.....................................................................................................................5
Figura2.Sntesisdexidontricocatalizadaporlaxidontricosintasa...................................................10
Figura3.Reduccindeloxgenoparaformaragua....................................................................................13
Figura4.Formacinderadicaleslibresenlacadenadetransportedeelectronesmitocondrial..............15
Figura5.LocalizacindelsistemacitocromoP
450
enlamembranadelretculoendoplsmico.................17
Figura6.ActivacindelaNADPHoxidasa.PKC:proteinquinasaC.............................................................20
Figura7.Reaccionesprincipalesdelaperoxidacinlipdica......................................................................29
Figura8.Reaccionesdelosradicaleslibresconlasprotenas....................................................................30
Figura9.Principalescidosbiliaresysussitiosdesntesisymetabolismo................................................34
Figura10.Resumendelosmecanismosdetoxicidaddeloscidosbiliares..............................................43
Figura11.Biosntesisdemelatoninaapartirdetriptfano.......................................................................48
Figura12.Vanerviosaderegulacindelasntesisdemelatonina...........................................................49
Figura13.Resumendelosprincipalesmecanismosdeaccinyfuncionesdemelatonina.......................54
Figura14.InteraccindelamelatoninaconlosOH..................................................................................61
XXIV
Figura15.ReaccindeunamolculadeH
2
O
2
conotrademelatonina....................................................62
Figura16.Formacinde6hidroximelatoninaporlainteraccindemelatoninaconperoxinitrito..........63
Figura17.Reaccindelamelatoninaconelcidohipocloroso................................................................63
Figura18.Diseoynomenclaturautilizadaenlosexperimentosdeldaooxidativoinducidopor
cidosbiliaresenausenciaopresenciadeFeCl
3
ycidoascrbico..................................................83
Figura 19. Diseo experimental y nomenclatura en las cinticas de tiempo de cido
taurolitoclico(TLC)enausenciaopresenciadedaooxidativoinducidoporFe
2+
.........................84
Figura 20. Procedimiento experimental y nomenclatura utilizada en las cinticas de
concentracin de cido taurolitoclico (TLC) en ausencia o presencia de FeCl
3
y cido
ascrbico............................................................................................................................................85
Figura 21. Planificacin de los experimentos destinados a evaluar la accin antioxidante de la
melatonina (aMT) frente a la toxicidad del cido taurolitoclico (TLC) en ausencia o
presenciadeFeCl
3
ycidoascrbico.................................................................................................86
Figura22.Protocolodeaislamientodemembranasdehepatocitos........................................................89
Figura23.Protocolodecuantificacindeprotenas.................................................................................91
Figura24.Protocolodecuantificacindemalonildialdehdo(MDA)y4hidroxialquenales(4HDA).......93
Figura25.Fundamentodelacuantificacinderestoscarboniloenlasprotenas...................................95
Figura 26. Efecto de los cidos biliares en la formacin de MDA+4HDA en homogeneizados de
hgado..............................................................................................................................................103
Figura27. Efecto de los cidos biliares en la formacinderestos carbonilo enhomogeneizados
dehgado.........................................................................................................................................103
Figura 28. Efecto de distintos cidos biliares en la formacin de MDA+4HDA en membranas
hepticasaisladas............................................................................................................................104
Figura29.Efectodedistintoscidosbiliaresenlaformacinderestoscarboniloenmembranas
dehgado.........................................................................................................................................104
Figura 30. Efecto de los cidos biliares en la formacin de MDA+4HDA en homogeneizados de
hgadoenelsistemageneradorderadicaleslibresdelFeCl
3
ycidoascrbico............................106
Figura31.Loscidosbiliaresaumentaronlaformacinderestoscarbonilocausadaporhierroy
cidoascrbicoenhomogeneizadosdehgado..............................................................................106
Figura32.LoscidosUDA,TQA,TDAyTLCpotencianlaperoxidacinlipdicainducidaporFe
2+
en
lasmembranasaisladasdeltejidoheptico...................................................................................107
Figura 33. Efecto de los cidos biliares en la carbonilacin proteica en membranas aisladas de
hgado..............................................................................................................................................107
Figura34.EfectodeltiempodeincubacinenlaformacindeMDA+4HDAenhomogeneizados
dehgados.......................................................................................................................................110
Figura 35. Papel del tiempo de incubacin en la oxidacin proteica en homogeneizados de
hgado..............................................................................................................................................110
XXV
Figura36.InfluenciadeltiempodeincubacinenlaformacindeMDA+4HDAenmembranasde
hepatocitos.......................................................................................................................................111
Figura37.Efectodeltiempodeincubacinenlaformacinderestoscarboniloenmembranasde
hgado...............................................................................................................................................111
Figura38.Elcidotaurolitoclico(TLC)aumentlaperoxidacinlipdicaenhomogeneizadosde
hgado...............................................................................................................................................114
Figura 39. El cido taurolitoclico (TLC) modific la formacin restos carbonilo en
homogeneizadosdehgado.............................................................................................................114
Figura 40. Efecto concentracin dependiente del cido taurolitoclico (TLC) de la formacin de
MDA+4HDAenmembranasdehgado...........................................................................................115
Figura 41. Respuesta concentracin dependiente del cido taurolitoclico (TLC) en la
carbonilacinproteicaenmembranasaisladasdehgado..............................................................115
Figura 42. Efectos del cido taurolitoclico (TLC) en la formacin de MDA+4HDA en
homogeneizadosdehgado.............................................................................................................117
Figura 43. Cintica de concentracin de cido taurolitoclico (TLC) para la formacin de restos
carboniloenhomogeneizadosdehgado........................................................................................117
Figura44.ElTLCpotencilaperoxidacinlipdicaenmembranasdehgado.........................................118
Figura 45. Efecto del cido taurolitoclico (TLC) en la oxidacin de las protenas de las
membranasdehgado......................................................................................................................118
Figura46.Efectoprotectordelamelatonina(aMT)enlaoxidacindelpidosinducidaporcido
taurolitoclicoenhomogeneizadosdehgado................................................................................121
Figura 47. Efecto de la melatonina (aMT) en la oxidacin de protenas inducida por cido
taurolitoclicoenhomogeneizadosdehgado................................................................................121
Figura 48. Cintica de la melatonina (aMT) en la oxidacin de lpidos inducida por cido
taurolitoclico1mMenmembranasdehgado...............................................................................122
Figura 49. La melatonina (aMT) reduce la oxidacin de protenas inducida por cido
taurolitoclicoenmembranasdehgado........................................................................................122
Figura 50. Efecto de melatonina (aMT) en la oxidacin de lpidos potenciada por cido
taurolitoclico(TLC)enhomogeneizadosdehgado.......................................................................124
Figura 51. Melatonina (aMT) redujo la oxidacin de lpidos potenciada por cido taurolitoclico
(TLC)enmembranasdehgado........................................................................................................124
Figura 52. Cintica de concentraciones de melatonina (aMT) en la oxidacin de protenas
potenciadaporcidotaurolitoclicoenmembranasdehgado.....................................................126
INTRODUCCIN
3
Introduccin
ESTRSOXIDATIVOENLOSSERESVIVOS
RADICALESLIBRES
CONCEPTODERADICALLIBRE
El tomo est compuesto por un ncleo formado por protones y neutrones y
una corteza de electrones que se mueven en torno al ncleo y estn dispuestos en
orbitales,quesonregionesdelespaciodondelaprobabilidaddeencontrarunelectrn
esmayor.Loselectronessedistribuyenendiferentestiposdeorbitalessegnsunivel
energtico.Encadaorbitalpuedehaberhastadoselectrones,girandosobresupropio
eje,loquegeneraunaenergamagnticadeterminadaporelnmerocunticodespin,
que puede ser representado por, + , segn el sentido de giro horario o
antihorario respectivamente. Si un electrn dado se aparea con otro, entonces estos
dos electrones que desapareados tenan un sentido de rotacin opuesto, anulan
mutuamente sus spines o campos magnticos, denominndose a ese tomo o
molcula, diamagntica. Los electrones suelen buscar la asociacin con otro electrn,
de manera que se puedan aparear sus sentidos de rotacin en un sistema de baja
energa.
Unradicallibreesaquellaespeciequmica,yaseatomo,molculaopartede
sta,conexistenciaindependientequeposeeunoovarioselectronesdesapareadosen
su orbital ms externo [Fridovich, 1978]. El electrn desapareado o solitario tiene un
momentomagnticoospinnocompensadollamadomagnetnBohr,determinando
que el tomo o molcula sea paramagntica. La carga elctrica de la especie qumica
puede ser positiva, negativa o neutra. Los electrones tienden a estar pareados en su
orbital,porquestaeslaconfiguracinenergticamsestable,porello,elradicallibre
tieneunagrantendenciaarecuperarlasituacindeestabilidadperdida,loquepodr
logrardedosformas,biencediendoelelectrndesapareado,agentereductor,obien
captando un electrn, agente oxidante. En este proceso, el radical libre compensa su
orbital incompleto, pero a expensas de desestabilizar la configuracin electrnica del
elemento con el que reacciona, ya que el tomo o molcula atacado pierde o gana
4
electrones,convirtindose a su vez en radical libre [Halliwell, 1993]. La vida mediade
losradicaleslibresdependedeltiempoquetardanenreaccionarparaconseguircaptar
ocedersuelectrndesapareado(tabla1).
Tabla1.Vidamediadealgunasespeciesreactivasdependientesdeloxgeno(EROs)ydelnitrgeno
[Reiter,1995a].
Especie Frmula
Vidamedia
a37C(s)
Hidroxilo OH 10
9
Alquilo R 10
8
Oxgenosinglete
1
O
2
10
6
Superxido O
2
10
6
Alcoxilo RO 10
6
Peroxilo ROO 10
2
xidontrico NO <1
Oxgenomolecular O
2
>10
2
Perxidodehidrgeno H
2
O
2
Estable
TIPOSDERADICALESLIBRES
Existeunagrancantidadderadicaleslibres,tantoderivadosdeloxgenocomo
delnitrgeno,oradicaleslibrescentradosenotrasmolculas,comoelazufre.
1. ESPECIESREACTIVASDEPENDIENTESDEOXGENO
Sedenominanespeciesreactivasdependientesdeloxgeno(EROs),tantoasus
radicales libres como a las molculas precursoras y derivadas. Algunas son autnticos
radicales libres, como el hidroxilo. Otras, como el perxido de hidrgeno, no son en
realidadradicales,perosonfuentesdeellos.
1.1. Oxgenomolecular
En la naturaleza, el oxgeno como tal aparece mayoritariamente en forma
molecular o diatmica (O
2
). El oxgeno molecular contiene 16 electrones, distribuidos
en los orbitales moleculares. En total tiene 10 electrones enlazantes y 6 electrones
antienlazantesdeacuerdoconlateoradelorbitalmolecular,quesostienequecuando
dos tomos se enlazan combinan sus orbitales electrnicos, dando lugar a dos
orbitales moleculares. Uno de ellos es el enlazante, que se caracteriza por tener una
energa inferior a aqullos de los que proviene, y el otro es el antienlazante, cuya
5
Introduccin
energa es superior a la de los orbitales atmicos originales. El propio oxgeno
molecular es un radical libre, ya que posee dos electrones desapareados en los
orbitalesmsexternos,losantienlazantes(*)(figura1).
Amboselectronestienenelmismosentidoderotacin,loqueledaelcarcter
paramagntico a la molcula. El estado basal del oxgeno molecular recibe el nombre
de triplete, puesto que contiene electrones desapareados con spines paralelos. Al
tener el mismo nmero cuntico de spin para los dos electrones desapareados, la
molcula de O
2
slo interactuar con radicales cuyos electrones tengan spines
complementariosalosdeloxgeno,fenmenoquesedenominarestriccindespin.
Porello,elO
2
esunbirradicalconmuybajareactividad.
Figura1.Configuracinelectrnicadelosorbitalesmolecularesdevariasespeciesreactivasdependientesde
oxgeno.
1.2. Oxgenosinglete
La molcula de oxgeno puede presentarse con otras configuraciones
electrnicas en sus ltimos orbitales antienlazantes. Una de ellas es la del oxgeno
singlete (
1
O
2
), que es una forma excitada del oxgeno en la que los dos electrones de
losltimosorbitalesantienlazantesseconfiguranconspinesopuestos(figura1).El
1
O
2
O
2
Oxgenomolecular
1s
2s
*1s
*2s
2p
2p
*2p
*2p
1
O
2
Oxgenosinglete
O
2
Radicalsuperxido
H
2
O
2
Perxidodehidrgeno
6
no es un radical libre, pero al ser una forma excitada reacciona fcilmente con otras
molculas.
El
1
O
2
se genera a partir del oxgeno molecular, por absorcin de energa
electromagntica,lacualinviertetransitoriamenteelspindeunodelosdoselectrones
desapareados del oxgeno, de modo que los giros de los electrones en los orbitales
ms externos muestran una orientacin antiparalela. La absorcin de grandes
cantidadesdeenergaelectromagnticaporeloxgenomolecularparagenerar
1
O
2
se
encuentra restringida a acontecimientos fotoqumicos [Zigler y Goosey, 1981; Sik y
cols., 1983] (1). Tambin puede formarse en reacciones de oxidacin de diversas
especies o en el transcurso de algunas reacciones enzimticas. Su vida media es
alrededor de 10
6
segundos. Puede interaccionar con otras molculas transfirindoles
su energa de excitacin o combinndose qumicamente con ellas. El
1
O
2
tiene
capacidadparasustraerunhidrogenin(H
+
)deuncidograsoinsaturado,iniciandola
reaccindelaperoxidacinlipdica[HalliwellyGutteridge,1990].
(1)
1.3. Radicalsuperxido
El radical anin superxido (O
2
) procede de la reduccin univalente del

oxgenomolecular(2).Seproduceentodaslasclulaseucariotasanimales,sobretodo
enlamitocondriayelretculoendoplasmtico[Fridovich,1978;NohlyHegner,1978].
(2)
Enlacadenarespiratoriaenestado4,aniveldeloscomplejosIyIII,entreel1y
el2%deloselectronestransportados,nollegaalcomplejoIV,sinoquedalugaraO
2
[Boveris y cols., 1972]. Tambin se forma O

2
durante el estallido respiratorio de las

clulasfagocticas:monocitosmacrfagosygranulocitos,ycomoproductodemuchas
reacciones enzimticas, como las que implican a las deshidrogenasas flavoprotenicas
(xantina oxidasa, aldehdo oxidasa, purina oxidasa, etc.), oxidasas e hidroxilasas
(diamino oxidasa, galactosa oxidasa, citocromo P
450
a nivel del retculo endoplsmico
O
2
1
O
2
h
O
2
O
2
7
Introduccin
heptico, etc.) [Halliwell y Grootveld, 1987]. Finalmente, puede generarse por la
autooxidacin de molculas, como el gliceraldehdo, ascorbato, hidroquinonas, los
compuestos tilicos como la cistena, las catecolaminas, flavinas y hemoprotenas, en
presenciadecantidadestrazademetales[McCord,1989].Enconjuntosehaestimado
queenunacluladelcuerpohumanoseproducendelordende10
10
molculasdeO
2
porda[Amesycols.,1993].
El radical superxido puede lesionar los transportadores de electrones de la
cadenarespiratoriamitocondrial[SohalyBrunk,1992]ydelcidodesoxirribonucleico
(ADN) [Farr y cols., 1986], as como inducir la oxidacin de otras muchas molculas
comolaadrenalina,eldihidroxifumaratoolahidroxidopamina[HalliwellyGutteridge,
1999].
La eliminacin de O
2
generado en la clula se realiza por las enzimas

superxidodismutasas(SOD)quecatalizanlasiguientereaccin(3):
(3)
Aunque el O
2
no es muy txico, es la principal fuente de formacin de

perxidodehidrgeno(H
2
O
2
),queasuvezesunprecursordelradicalhidroxilo(OH),
laespeciereactivademayortoxicidad[Sawyer,1988;Fridovich,1997].TambinelO
2
puede reaccionar con el radical xido ntrico (NO), y formar anin peroxinitrito
(ONOO
)[Radiycols.,1991;HalliwellyGutteridge,1999].
1.4. Perxidodehidrgeno
ElH
2
O
2
noesunradicallibrecomotal,puesnoposeeelectronesdesapareados
en su orbital ms externo (figura 1), pero est dentro de las especies reactivas
derivadas del oxgeno porque produce otros radicales libres. Es la forma menos
reactivadelasespeciesreactivasdeoxgeno.Suimportanciarecaeenqueatraviesalas
membranasbiolgicas,conloquepuededarlugarareaccionesdeoxidacinenpuntos
de la clula ms alejados de su lugar de produccin participando en numerosas
reaccionesquedanlugaralageneracinderadicaleslibres.
2O
2
+2H
+
H
2
O
2
SOD
8
ElH
2
O
2
sepuedeformarapartirdediversasfuentes:Reduccindirectadeuna
molcula de oxgeno por dos electrones [Sawyer, 1988; Fridovich, 1997] (4);
dismutacin del O
2
, reaccin catalizada por la enzima SOD [Cheeseman y Slater,

1993; Frei, 1994] (5); producto de algunas enzimas (glucosa oxidasa, uricasa, etc.)
[FridovichyFreeman,1986]yporreaccionesqumicasdeautooxidacin.
(4)
(5)
Se ha comprobado que el H
2
O
2
est implicado en la regulacin de la
transduccin de la seal de expresin de genes a travs del factor nuclear Kappa B
(NFB)ylaprotenaactivadora1(AP1).Ambossonfactoresdetranscripcincapaces
de inducir la transcripcin de genes tales como el de la manganesosuperxido
dismutasa[Yiycols.,2002],interleucina2(IL2),factordenecrosistumoral(TNF),
antgenos del complejo mayor de histocompatibilidad y factor de transcripcin pro
crecimiento(cfos)[SchreckyBaeuerle,1994].
El H
2
O
2
no es txico a concentraciones fisiolgicas, pero mediante la reaccin
de FentonHaberWeiss (6) se puede convertir en OH [Fenton, 1894; Haber y Weiss,
1934].Elhierro(Fe)ascomoelcobre(Cu)sonlosmetalesdetransicinmscomunes,
por lo que la naturaleza del dao producido por estas reacciones depender de la
disponibilidadylocalizacindeestosmetales.
(6)
La detoxificacin del H
2
O
2
se lleva a cabo por accin de sistemas enzimticos
comolaglutatinperoxidasa(GPx),queconllevanlaformacindeagua(7).
(7)
1.5. Radicalhidroxilo
ElOHeselradicallibremsreactivoyporellodainoqueexiste,conunavida
mediadeaproximadamente1nanosegundo(tabla1).Notienegranpoderdedifusin
O
2
O
2
H
2
O
2
e
2O
2
+2H
+
H
2
O
2
SOD
O
2
+H
2
O
2
OH+OH
+O
2
FeoCu
H
2
O
2
+2GSH 2H
2
O+GSSG
GPx
9
Introduccin
y se desconoce una enzima que lo detoxifique directamente, posiblemente porque el
propioOHladestruira.
Enelservivosepuedeproducirporvariosmecanismos:1)Fisinhomolticadel
agua, aunque es poco frecuente puede formarse a consecuencia de radiacin de alta
energa (rayos X, rayos ) (8). 2) Ruptura fotoltica del H
2
O
2
(9), la luz UV no tiene
suficienteenergacomoparaescindirunamolculadeagua,peropuededividirelH
2
O
2
en dos molculas de radical hidroxilo. 3) Reacciones de FentonHaberWeiss [Fenton,

1894; Haber y Weiss, 1934], en la que una molcula de H
2
O
2
reacciona con una
molcula de O
2
, u otro agente reductor, para producir un OH, un OH
y O
2
(6),
aunque la velocidad de esta reaccin es demasiado baja para ser de importancia
fisiolgica, los metales de transicin como el hierro o el cobre pueden actuar como
cofactoresdelamisma,acelerandolavelocidaddelareaccin[HalliwellyGutterigge,
1989].Elpropiocidoascrbico,unbuenantioxidante,escapazdereducirelFe(III)a
Fe (II) tanto in vitro [Rowley y Halliwell, 1983b], como in vivo [Winterbourn y Vissers,
1983].
(8)
(9)
ElOHtienecapacidadparareaccionarconlasbasespricasypirimidnicasdel
ADN, es, por tanto, un agente genotxico [Bohr y Anson, 1999; Sastre y cols., 2000].
As mismo el OH puede arrancar un H
+
de la cadena carbonada de los cidos grasos
poliinsaturados, iniciando la peroxidacin lipdica [Halliwell y Gutteridge, 1990] y es
capazdedaarlasprotenas[Yu,1994].
1.6. Radicalperhidroxilo
El radical perhidroxilo (HO
2
) se genera a partir de O
2
. Es un radical libre muy

liposoluble,resultandounpotenteinductordelaperoxidacinlipdicaenmembranas
biolgicas[Kannerycols.,1987].
H
2
O OH+H
h
H
2
O
2
2OH
UV
10
1.7. Radicalesalcoxiloyperoxilo
Losradicalesalcoxilo(RO)yperoxilo(ROO)sonespeciesgeneradasdurantela
peroxidacin lipdica, por el ataque de algunos radicales libres sobre las cadenas
carbonadas de los cidos grasos [Kanner y cols., 1987; Halliwell y Gutteridge, 1999].
Son menos reactivos y ms selectivos que los radicales OH, pero son parte
fundamental en el desarrollo de la peroxidacin lipdica, dado que estas especies
puedeniniciarypropagarlareaccin[Kannerycols.,1987].
2. ESPECIESREACTIVASDEPENDIENTESDENITRGENO
Las especies reactivas dependientes de nitrgeno (ERNs) engloban tanto a los
radicales libres dependientes de nitrgeno como a las especies que generan dichos
radicales.
2.1. xidontrico
El NO es un gas lipoflico e hidrosoluble, cuya vida media es relativamente
larga (35 s). Se produce en numerosos tipos celulares durante la conversin de L
arginina a Lcitrulina, una reaccin catalizada por la xido ntrico sintasa (NOS)
[Moncadaycols.,1991;Bushycols.,1992](figura2).
Figura2.Sntesisdexidontricocatalizadaporlaxidontricosintasa.
Larginina N
hidroxiLarginina Lcitrulina xidontrico

H2N
HN
NH
H2N
O
HO
H
2
N
HN
O
H
2
N
O
HO
H2N
HN
NH
NH
O
HO
HO
N O +
NADP
+
NADPH
O
2
NADP
+
NADPH
O
2
11
Introduccin
ElNOesunradicallibrequetienecomofuncionesactuarcomoreguladordel
flujo sanguneo local, antiagregante plaquetario, se produce por los macrfagos
activados contribuyendo a la defensa inmunitaria primaria y tambin acta como
neuromodulador, segundo mensajero y mediador del neurotransmisor excitador
glutamato [Moncada y cols., 1991; Czapski y Goldstein, 1995]. Posee una accin
antiinflamatoriaimportante,peroalavezquepromueveladisfuncincelularytisular
a travs de un efecto proinflamatorio [Grisham y cols., 1999]. Otro efecto del NO
reside en su capacidad de reaccin con el hierro de protenas intracelulares,
principalmentelasmitocondriales,siendoinactivadasporllamayoradelasenzimas
que poseen un grupo prosttico hemo. Puede reaccionar con cidos nucleicos dando
lugaramutacionesyroturasdelADN,yocasionarnecrosis.
Elxidontricoesamenudoconsideradocomounaespadadedoblefilo.Un
exceso de NO es citotxico. Este NO es poco reactivo y no puede nitrar protenas
irreversiblemente,peropuedereaccionarconotrosreactivosintermediosquepueden
alterarsufuncin;comolareaccinentreNOyelO
2
dondeseformaONOO
,quees
un potente oxidante responsable de gran parte de la toxicidad causada por el NO
[BeckmanyAmes,1998;HalliwellyGutteridge,1999].
2.2. Radicalperoxinitrito
El ONOO
se forma in vivo por la reaccin entre el NO y el O

2
[Gryglewski y
cols.,1986;Radiycols.,1991;Milesycols.,1996;PietraforteyMinetti,1997](10):
(10)
Aunque se haya presentado a la reaccin de formacin del peroxinitrito como
una forma de eliminacin de O
2
sin la consiguiente formacin de H

2
O
2
[Granger y
Kubes, 1996; Wink y Mitchell, 1998], el ONOO
puede protonarse formando cido

peroxinitroso (HONOO) y ste se descompone con facilidad en OH y dixido de
nitrgeno(NO
2
),quesonmuytxicos[Janssenycols.,1993;Liptonycols.,1993].
ElONOO
tambinescapazdeinducirlaperoxidacinlipdicaenlipoprotenas,
interferirconlasealizacincelularpornitracinderesiduosaromticosenprotenas,
O
2
+NO ONOO
12
degradar carbohidratos, nitrar y oxidar la guanosina, y fragmentar ADN [Beckmann y
cols.,1994; BeckmanyKoppenol,1996]. Todas estasactividadesconviertenalONOO
enunamolculaconefectosdevastadoresenlafuncincelular.
2.3. Dixidodenitrgeno
El dixido de nitrgeno (NO
2
) es un radical libre contaminante producido
primariamenteapartirdelaoxidacindelNOatmosfrico[Postlethwaitycols.,1995].
Esuniniciadormuyefectivodelacadenadeperoxidacinlipdica[Halliwell,1994].
3. RADICALESDETOMOSDERIVADOSDECARBONO
Los radicales centrados en un tomo de carbono (R) surgen del ataque de un
radicaloxidantesobreunamolculabiolgica.Enelprimerpasosearrancauntomo
de hidrgeno de un grupo metileno situado entre dos enlaces dobles. Este tipo de
radicales es muy inestable y reacciona rpidamente con el oxgeno, dando lugar a un
ROO.Asuvez,estosradicalespuedenparticiparenotrasreaccionesquegenerarotras
especiesradicales[Frei,1994].
4. RADICALESDETOMOSDERIVADOSDEAZUFRE
Los tomos de azufre tambin pueden ser el centro de un radical libre (RS)
formado, por ejemplo, a partir de la cistena. sta se autooxida con facilidad dando
lugar a la formacin de radicales tiilo e hidroxilo [Estrela y cols., 1983; Sparrow y
Olszewski,1993].
FORMACINDELOSRADICALESLIBRESENLOSSERESVIVOS
Los radicales libres pueden ser de origen endgeno o exgeno [Freeman y
Crapo,1982;Frei,1994].
13
Introduccin
1. FUENTESENDGENASDERADICALESLIBRES
1.1. Cadenadetransportedeelectronesmitocondrial
Los organismos aerobios utilizan el oxgeno como aceptor de electrones
durante el proceso de la respiracin mitocondrial para acumular energa en forma de
adenosn trifosfato (ATP). En la mitocondria se produce la oxidacin de los cidos
grasos y el ciclo del cido ctrico, que producen la forma reducida de nicotinamida
adenndinucletido (NADH) y de flavn adenndinucletido (FADH
2
). Estas molculas,
a su vez, transfieren electrones a la cadena respiratoria, un sistema formado por
complejos enzimticos que catalizan una cadena de reacciones redox acopladas
utilizando al oxgeno como aceptor final de electrones, con la finalidad ltima de
obtener la energa necesaria para convertir el adenosn difosfato (ADP) en ATP. En la
respiracin mitocondrial es inevitable la formacin de subproductos a partir del
oxgeno, radicales libres [Yu, 1994]. Este hecho es conocido como la paradoja del
oxgeno, ya que el mismo oxgeno imprescindible para la vida en los organismos
aerobioslaquita.Lamitocondriaeslaprincipalfuentedeespeciesreactivascomo:O
2
,OH,H
2
O
2
,NOyONOO
.
Debido a las propiedades del oxgeno, su reduccin tetravalente requiere la
transferencia sucesiva de 4 electrones al orbital antienlazante, generando tres
intermedios parcialmente reducidosentre ste y el agua: el primero es el O
2
,
resultante de la reduccin molecular del oxgeno con un electrn; el segundo es el
H
2
O
2
,resultantedelaadicindeunsegundoelectrnydosprotones;elterceroesel
OH, resultante de la incorporacin de un tercer electrn y un protn. El cuarto
electrnyotroprotngeneranlamolculadeagua(figura3).
Figura3.Reduccindeloxgenoparaformaragua.SOD:Superxidodismutasa.
+2H
+
e
+H
+
e
+H
+
O
2
O
2
H
2
O
2
OH H
2
O
H
2
O
SOD Catalasaoperoxidasa
Complejocitocromooxidasa
14
La cadena de transporte electrnico mitocondrial est formada por complejos
situadosenlamembranainternamitocondrialquesedenominandelIalIV,aunquea
laenzimaATPsintasaavecesseledenominecomplejoV.
Elcitocromoa
3
delcomplejoIVdelacadenarespiratoriaescapazdemantener
estrechamenteunidasasucentroactivotodaslasespeciesparcialmentereducidasdel
oxgeno hasta que se completa la transferencia de 4 electrones y 4 protones al O
2
y
conellolaformacindeH
2
O[BenziyMoretti,1995].Portanto,lacitocromoCoxidasa
perteneciente al complejo IV de la cadena respiratoria no produce este radical.
Adems,exhibeciertaactividadsuperxidodismutasa.
Sin embargo hay elementos de la cadena de transporte electrnico
mitocondrial, como los complejos I (NADHcoenzima Q reductasa) y III (citocromo C
oxidasa),quetienenlacapacidaddetransferirunelectrndirectamentealO
2
,aunque
nosiempreseancapacesderetenerelO
2
formadoespecialmentecuandoelflujode
electrones es lento [Cross y Jones, 1991; Benzi y Moretti, 1995]. En el estado
controladoyaltamentereducido,estado4(cuandotodoelADPestenformadeATP),
el 2 % de los electrones transportados por la cadena de transporte electrnico
mitocondrial no llegan al complejo IV y producen la reduccin parcial del oxgeno,
liberando O
2
; y en el estado activo y ms oxidado, estado 3, la produccin de

radicales libres es mnima (0,1%) [Boveris y cols., 1972; Cadenas y cols., 1977; Frei,
1994]. En el caso del complejo I, el candidato ms probable como generador de
radicaleslibrespareceserelcentrohierrosulfuradoN2quegeneransuperxidocomo
resultado de la autooxidacin de la flavinsemiquinona asociada a este complejo
[TurrensyBoveris,1980;HerreroyBarja,1997;Genovaycols.,2004],mientrasqueen
elcasodelcomplejoIIIsehadebatidointensamentesobresipodrancorresponderala
autooxidacin de la ubisemiquinona [Boveris y cols., 1976] o al citocromo b [Nohl y
Jordan,1986](figura4).
15
Introduccin
Figura 4. Formacin de radicales libres en la cadena de transporte de electrones mitocondrial.SOD: Superxido

dismutasa, SDH: Succinato deshidrogenasa, cit c: Citocromo c, CoQ: Coenzima Q, GSH: Glutatin reducido, G6P:
Glucosa6fosfato.
As pues, se produce O
2
, que a travs de la reaccin catalizada por la

superxidodismutasageneraH
2
O
2
,queatraviesalasmembranasysalealcitoplasma,
dondepuedereaccionarconotrasespeciesformandodiversostiposderadicaleslibres
[Boveris y cols., 1972]. La produccin mitocondrial de H
2
O
2
fue inicialmente descrita
porJensen[1966].Estudiosposterioresdemostraronquelamayorpartedelperxido
de hidrgeno mitocondrial, proceda de la dismutacin del O
2
[Boveris y Cadenas,
1975].Sehaestimadoqueseproducendelordende10
10
molculasdeO
2
porclula
y da [Ames y cols., 1993]. Los procesos de formacin de O
2
son una serie de

reacciones no enzimticas cuya velocidad aumenta linealmente con la concentracin
deO
2
presenteenelmedio.
1.2. CitocromoP
450
El citocromo P
450
es una familia de hemoprotenas presentes en numerosas
especies,desdebacteriasamamferos,ydelasqueyasehanidentificadomsde2000
FMN
b
CoQ
NADH
O
2
O
2
H
2
O
2
Mn SOD
OH
Fe
2+
Cu/ZnSOD
H
2
O
2
O
2
O
2
Matrix
Complejo I
Complejo II
Complejo III
Complejo IV
H
2
O
Dao oxidativoa
lpidos,protenas
yADN
Disfuncin y
muerte celular
G6P 6Fosfogluconato
G6PDehidrogenasa
GSHReductasa
GSHPeroxidasa
O
2
NADP
+
NADPH
NADH
+
Succinato Fumarato
O
2
H
2
O
2
a
a
3
citc
Membrana
interna
FeS
N2
ADP ATP
H
+
ATPasa
citc
SDH
FeS
N2
Q
0
Q
i
b
FeS C
1
b
FeS
N1, N3,
N4
FeS
N2
GSH GSSG
CuB
16
isoformas diferentes. En el hombre, estn ampliamente distribuidos por todo el
organismo, especialmente hgado e intestino, que poseen uno o ms de estos
citocromos y se localizan en varias organelas, aunque principalmente en el retculo
endoplsmico y en las mitocondrias. El hepatocito posee una importante cantidad de
citocromo P
450
puesto que una de sus principales funciones es la detoxificacin de
sustancias endgenas, por lo tanto, sta supone tambin una importante fuente de
radicaleslibresenlaclula.
Salvo excepciones, el P
450
cataliza reacciones de monooxigenacin (11) que
requieren oxgeno molecular y NADPH para oxidar el sustrato, pero slo uno de los
tomosdeoxgenoesincorporadoenlamolculadelsustrato,mientrasqueelotroes
reducido hasta agua, por eso se denominan tambin monooxigenasas u oxidasas
mixtas.
(11)
Los citocromos P
450
pueden clasificarse en cuatro clases en funcin de cmo
acceden los electrones desde el NADPH hasta el centro cataltico del enzima [Werck
Reichhart y Feyereisen, 2000]: Las protenas de clase I se encuentran asociadas a la
membranainternadelamitocondriayutilizanunareductasaquecontieneFADyuna
ferrosulfoprotena (ferridoxina). Las de clase II usan una cadena de transferencia de
electrones ms corta y slo necesitan una reductasa del citocromo P
450
que contiene
FAD/FMN para la transferencia de electrones. El citocromo P
450
y las NADPH
citocromoP
450
reductasas no estn asociados y ambos estn anclados de forma
independienteenlacaraexternadelamembranadelretculoendoplsmico(figura5).
LaactividaddelcitocromoP
450
sevefavorecidaporlapresenciadecitocromob5 que
facilitalatransferenciadeelectronesdesdeelNADH[VergeresyWaskell,1995].Lasde
clase III son autosuficientes y no requieren un donante de electrones. Finalmente las
de clase IV, que slo se han identificado en hongos y reciben los electrones
directamentedelNADPH.
monooxigenasa
RH+NADPH+O
2
+H
+
ROH+NADP
+
+H
2
O
17
Introduccin
Figura5.LocalizacindelsistemacitocromoP
450
enlamembranadelretculoendoplsmico
FMN:Flavinmononucletido,FAD:Flavnadenndinucletido.
La NADPHcitocromoP
450
reductasa canaliza un flujo de electrones desde el
NADPHhastaelcitocromoP
450
.Enocasiones,loselectronessoncedidosporelNADH
mediante la actividad de la NADHcitocromo b
5
reductasa. El centro cataltico de los
P
450
eseltomodehierrohexacoordinado(conlos4anillosdelaprotoporfirinaIX,con
el grupo tiol de un residuo de cistena de la cadena polipeptdica y con el solvente,
normalmente agua). El primer paso del proceso cataltico consiste en la unin del
sustratoalcitocromoP
450
oxidado(Fe
3+
).Enelsegundopasoseproducelareduccin,
por la reductasa, del complejo hemoprotenasustrato al estado ferroso, el Fe
3+
del
grupohemopasaaFe
2+
.Eltercerpasoeslaunindeloxgenomolecularparaformar
uncomplejooxicitocromoP
450
,O
2
P
450
Fe
2+
sustrato;dichocomplejopuededisociarse,
dando lugar a un O
2
, regenerndose la hemoprotena frrica, P

450
Fe
3+
sustrato.
Adems el complejo recibe un segundo electrn para formar sucesivamente otros
complejos, de modo que en definitiva un tomo de oxgeno es transferido al sustrato
para oxidarlo y el otro reacciona con dos protones para formar agua; el sustrato
oxidado queda liberado y el citocromo P
450
se regenera en forma frrica. El resultado
final sera la hidroxilacin de diversos sustratos endgenos y exgenos. Mediante
dichas reacciones se consigue que muchas sustancias txicas sean ms hidrosolubles
facilitandosueliminacinpororinaybilis.
Sinembargo,sehapropuestolaformacindeO
2
porelcitocromoP
450
[Koop,
1992;Goeptarycols.,1995].EldesacoplamientodelciclocatalticodelP
450
seproduce
cuando los electrones del cofactor NADPH son consumidos sin formacin de
metabolitos oxidados. Esto ocurre cuando a) el intermediario Fe
2+
O
2
se autooxida
liberando anin superxido y regenerando el enzima en estado frrico; b) el
Citocromob5
Fe
2+
/Fe
3+
P
450
FMN
FAD
CitocromoP
450
reductasa
Retculoendoplsmico
NADPH
e
O
2
H
2
O
2
Sustrato
Metabolito
e
18
intermediarioFe
3+
hidroperxidosedisociaenunamolculadeH
2
O
2
yenzimafrrico;
oc)laespecieFe=Oenlugardeoxidarelsustratoesreducidaaunamolculadeagua
portransferenciaadicionaldeelectrones[OrtizdeMontellanoyDeVoss,2002].
1.3. ReaccionesdeFentonyHaberWeiss
ElH
2
O
2
esunamolcularelativamenteestableenausenciadecatalizadoresque
promuevan su descomposicin. Sin embargo, en presencia de iones de metales de
transicin, sobre todo hierro, y en menor medida cobre y otros iones, puede
interaccionarconellospormediodeunareaccindeoxirreduccin:lasreaccionesde
Fenton y HaberWeiss (12). En stas el O
2
reduce al metal, y ste al perxido de

hidrgeno, dando lugar a la formacin del OH y el anin hidroxilo. El metal no se
consumeenelprocesoactuandoslocomocatalizadordelmismo.
(12)
LanecesidaddelapresenciademetalesdetransicinenlareaccindeFenton
convierte al hierro y al cobre (los ms abundantes en los sistemas biolgicos) en
agentes esenciales como catalizadores del dao oxidativo. El Fe (II) se oxida a Fe (III)
con mucha facilidad, y ste es muy insoluble. Adems los procesos de captacin y
distribucin del hierro, y de los iones metlicos en general, estn muy finamente
regulados en los mamferos que contienen un gran nmero de protenas de unin a
metales: ferritina, transferrina, ceruloplasmina, etc., actuando como reserva de iones
metlicos y, adems, impidiendo que estos iones participen en reacciones redox
[Halliwell, 1991; Rouault y Klausner, 1996]. Por ello, el hierro libre en los sistemas
biolgicosestenmuypequeascantidadesyenformafrrica[HalliwellyGutteridge,
1986].ElverdaderopapeldelO
2
enlasreaccionesdeFentonyHaberWeisseselde
actuar como reductor del hierro. Sin embargo, el ion frrico puede a su vez, ser
reducidoporelascorbato(AscH
),oxidndosestearadicalascorbilo(Asc
)(13)conlo
que se genera un ciclo de produccin continua de OH [Rowley y Halliwell, 1983a;
Sawyer,1988].
H
2
O
2
+Fe
2+
OH+OH
+Fe
3+
O
2
+Fe
3+
O
2
+Fe
2+
O
2
+H
2
O
2
OH+OH
+O
2
FeoCu
19
Introduccin
(13)
1.4. NAD(P)Hoxidasas
Se asocian con la membrana plasmtica un gran nmero de oxidorreductasas
que utilizan NADH o NADPH como donantes de electrones y como aceptor final de
electroneselO
2
,cuyareduccinconllevalaformacindeO
2
[MoldovanyMoldovan,
2004]. El sistema mejor conocido es la NADPH oxidasa presente en los fagocitos
activados (neutrfilos, monocitos, macrfagos, eosinfilos) junto con la
mieloperoxidasa.
Al encontrarse con un agente infeccioso, los fagocitos experimentan un
aumento muy acusado de su consumo de oxgeno llamado estallido respiratorio.
Dichoconsumoocurreprincipalmenteenlamembranaplasmticadondeseencuentra
uncomplejoenzimtico,laNADPHoxidasa,queconstadediversassubunidades:gp91
y p22 (subunidades del citocromo b558 en la membrana), y p40, p47 y p67
(subunidades citoplasmticas) y la pequea protena rac1 que se une al trifosfato de
guanosina (GTP). La translocacin de las subunidades citoslicas reguladoras a la
membranacelularesunprerrequisitoparalaactivacindelaenzimaylasubsiguiente
produccin de O
2
. Si bien la interaccin del p67 con el citocromo b558 es esencial

paraelflujodeelectronesdesdelaNADPHalO
2
paraformarO
2
,tantoelrac1comoel
p47sirvencomotransportadoresparaelp67hacialamembrana.
El contacto entre el receptor CD35 y su ligando C3b, inicia en el fagocito una
serie de seales en las que participan protenas G (GTPasas), tirosinquinasas y
fosofolipasa C, entre otros componentes. El consecuente aumento del calcio
intracelular, las seales mediadas por inositoltrifosfato (IP3), y la PKC activan
finalmente a la NADPH oxidasa, fosforilando a sus subunidades citoslicas [Hoyal y
cols.,1998;IlesyForman,2002].Estassubunidadesfosforiladas,setranslocanalacara
interna de la membrana, proceso promovido por rac1, donde interaccionan con el
citocromob558(gp91yp22)yloactivan(figura6).Elcitocromob558activadoutiliza
el O
2
extracelular para producir O
2
. ste puede reducirse por la SOD, hasta H

2
O
2
, el
cualsirvecomoprecursordelageneracindeOH[Moslen,1994].
AscH
+Fe
3+
Asc
+H
+
+Fe
2+
20
LamieloperoxidasaincrementanotablementelaactividadmicrobicidadelH
2
O
2
dadoqueenpresenciadehaluros,generalmentecloruro,seoxidaparaformarelcido
hipocloroso(HOCl).
Figura6.ActivacindelaNADPHoxidasa.PKC:proteinquinasaC.
El OH y HClO son formados por la NADPH oxidasa y la mieloperoxidasa en los

fagocitosactivadoscomounmecanismoparacombatiralosmicroorganismos[Babior,
1978]. Sin embargo, esta funcin defensiva tambin tiene su contrapartida ya que
estosradicalespuedenatacarydaarlostejidossanoscircundantes,hechoqueseha
implicadoenlaetiopatogeniadealgunasenfermedadesconbaseinmunolgicacomo
laartritisreumatoide[Babior,1978;Moslen,1994].
El papel del O
2
producido en las clulas no fagocticas es menos conocido,

pero se asocia con procesos celulares esenciales como la proliferacin y la apoptosis
[Lambeth,2002].
1.5. Xantinaoxidasa
Laxantinadeshidrogenasaesunametaloflavoenzimacomplejaqueparticipaen
elmetabolismodelaspurinas,oxidandolahipoxantinaaxantinaystaacidorico.
Ensuformadeshidrogenasanoproduceradicaleslibres,yaqueempleaelNAD
+
como
aceptor de electrones [Saugstad, 1990; Kinnula y cols., 1995], pero en condiciones de
hipoxia, isquemia, y otras situaciones de dficit energtico, algunas proteasas
gp91
p22
p67
p47
p40
PKC
Rap1A
NADPHOxidasa
(gp91+p22=cit b558)
O
2
O
2
p67
p40
p47
Rac1
NADP
+
+H
+
NADPH
P
P
P
P
P
P
Citosol
Membrana
GTP
21
Introduccin
citoslicasseactivanporelaumentodelcalciointracelularycatalizanlaconversinde
xantinadeshidrogenasaaxantinaoxidasa[Grangerycols.,1981].Ensuformaoxidasa,
esta enzima emplea oxgeno molecular como aceptor de electrones produciendo
radicales libres [Radi y cols., 1992]. En hipoxia, la xantina deshidrogenasa, encargada
demetabolizarlahipoxantinaparadarxantina,pasaaxantinaoxidasay,comonohay
oxgeno disponible, la hipoxantina se va acumulando sin poder ser oxidada. Al
producirselareoxigenacinlaxantinaoxidasa,utilizandolahipoxantinaporunladoy
por otro el oxgeno molecular, aportado en la reperfusin, cataliza la formacin de
grandescantidadesdeO
2
yH
2
O
2
[Grangerycols.,1981;Saugstad,1990].
1.6. xidontricosintasa
UnafamiliadeenzimasdenominadasNOScatalizanlaconversindeLarginina
aLcitrulinayxidontrico[AndrewyMayer,1999;CosentinoyLuscher,1999].LaNOS
posee dos dominios catalticos. 1) El de actividad reductasa que est ubicado en la
mitad Cterminal de la enzima y presenta los sitios de unin para los cofactores
NADPH, FAD y FMN. Las flavinas FAD y FMN estn encargadas del traslado de
electronesdesdeelcofactorNADPHalgrupohemo.2)Eldominiodeactividadoxidasa
que contiene un grupo hemo ubicado en la mitad Nterminal de la protena, y
determina la oxidacin de la Larginina. Ambos dominios se hallan separados por un
sitiodeuninparalacalmodulina.Deestamaneraunterminalguanidinonitrogenado
de la arginina incorpora 5 electrones oxidndose, en una reaccin que es sustentada
porlaNADPHreducidaylasflavinasFMNyFAD.Latetrahidrobiopterina(BH4)yeltiol
constituyen cofactores adicionales de la NOS [White y Marletta, 1992; Vanhoutte,
1997;CosentinoyLuscher,1998;1999;Heymesycols.,1999].Elflujodeelectronesse
establece desde la NADPH hasta el hierro del grupo hemo. La transferencia de
electronesrequierelafijacindecalmodulinaalaNOS.ExistentresisoformasdeNOS:
Laneuronal(nNOS)ylaendotelial(eNOS)seexpresanconstitutivamenteysuactividad
est regulada por la concentracin intracelular de calcio [Bredt y cols., 1991; Lamas y
cols., 1992]. La inducible (iNOS) la expresan los macrfagos cuando son estimulados
porcitoquinas,lipopolisacridosuotrosantgenos,siendosuexpresinreguladatanto
a nivel transcripcional como posttranscripcional, en lo cual participan factores de
22
transcripcin sensibles al estado redox como el NFB o las quinasas activadas por
mitgenos (MAPk) [Moncada y Higgs, 1991; Yui y cols., 1991; Lowenstein y Snyder,
1992;MacMickingycols.,1997].
1.7. oxidacindecidosgrasos
Losmicrosomas,tambindenominadosperoxisomasrealizanlametabolizacin
de cidos grasos o oxidacin de cidos grasos con una longitud de cadena de 24 o
ms carbonos, as como la de fenoles, formaldehidos y alcoholes, requiriendo la
presencia de O
2
y generando grandes cantidades de H
2
O
2
[Boveris y cols., 1972;
Beckman y Ames, 1998]. Esta fuente tiene gran importancia en el hepatocito, ya que
dispone de grandes peroxisomas responsables del metabolismo de los cidos grasos
ascomodeotrassustanciastxicas,entrelasquedestacaelacetaldehdoprocedente
delaoxidacindeletanol[HalliwellyGutteridge,1999].
1.8. Ciclooxigenasa
LasntesisdeprostaglandinasnormalmenteimplicalaproduccindeOHcomo
consecuencia de la actividad ciclooxigenasa; stos participan en la cascada del cido
araquidnico,inhibiendolapropiaciclooxigenasaporunaretroalimentacinnegativa,
yfavoreciendoportantolarutametablicaproagregantedeltromboxanoA
2
frentea
larutaantiagreganteyvasodilatadoradelaprostaciclina.
1.9. Autooxidacindemonoaminas
Las aminooxidasas oxidan las monoaminas formando radicales libres. Los
mecanismos de formacin de stos en estas vas metablicas se han implicado en la
etiopatogenia de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de
Parkinson[FahnyCohen,1992;Chiuehycols.,1993].
1.10. Otrasenzimas
La lipooxigenasa y la ciclooxigenasa son enzimas asociadas a la membrana
plasmtica que participan en el metabolismo del cido araquidnico, generando
radicales libres durante su ciclo de catlisis [Freeman y Crapo, 1982; Frei, 1994]. Otra
23
Introduccin
fuente en la mitocondria son las enzimas dependientes de NADH. La interaccin de
algunosmetales,loshidroperxidosoel
1
O
2
conellas,producesualteracinyprovoca
elenvejecimientomitocondrial[Bindoli,1988].
2. FUENTESEXGENASDERADICALESLIBRES
Muchos agentes antineoplsicos [Deno y cols., 1982], tales como la
adriamicina, bleomicina, daunorrubicina y algunos antibiticos que dependen de
gruposquinoidesodeuninametalesparasuactividadsonfuentederadicaleslibres.
Algunosdelosefectosdeestasdrogassehanatribuidoasucapacidadparareducirel
oxgeno a O
2
, H
2
O
2
y OH. Tambin la irradiacin de los organismos debido a las
radiaciones (rayos X y ) o debido a radiaciones de partculas (electrones, protones,
neutrones, deuterones y partculas y ) y los factores ambientales, como los
contaminantes areos fotoqumicos, la hiperoxia, los pesticidas, humo del tabaco,
solventes, anestsicos e hidrocarburos aromticos. Estos agentes, o bien poseen
radicales libres, como el humo del tabaco, o bien se convierten en radicales libres
mediantelabiotrasformacinenlaqueactanenzimasconactividadmonooxigenasa,
como el citocromo P
450
o la flavn monooxigenasa, diversas oxidasas (alcohol
deshidrogenasa, aldehdo deshidrogenasa, amino oxidasas, aromatasas), la epxido
hidrolasaoesterasasyamidasashepticasyplasmticas[HalliwellyGutterigge,1989;
Philpot,1991].
MECANISMOSDEPROTECCIN
La atmsfera de nuestro planeta fue anaerobia hasta la aparicin del oxgeno
haceunos2.500millonesdeaos,comoresultadodelaroturadelaguaenelproceso
fotosinttico de unas algas microscpicas cianofceas. El oxgeno molecular, vital para
laexistenciadelosorganismosaerobios,esinherentementetxicodadasucapacidad
de formacin de radicales libres. Para sobrevivir en este ambiente aerobio poco
favorable, los organismos vivos desarrollaron una serie de mecanismos de defensa
antioxidante. La clula posee tambin la capacidad de sintetizar sistemas
reparadores/eliminadoresdelasprotenas,lpidosyADNdaados.
24
ANTIOXIDANTES
En 1995 Halliwell los defini como cualquier sustancia que, en bajas
concentraciones comparado con el sustrato oxidable, disminuye significativamente o
inhibelaoxidacindeestesustrato[Halliwellycols.,1995].Desdeunpuntodevista
bioqumico, los radicales libres se clasifican en enzimticos y no enzimticos. Los
primeros son protenas de peso molecular elevado, que minimizan el dao oxidativo
catalizando reacciones qumicas. Los antioxidantes no enzimticos son molculas
pequeas que reaccionan directamente con los radicales libres, evitando que ejerzan
su accin txica sobre lpidos, protenas y cidos nucleicos. En este contexto de
molculas antioxidantes no enzimticas se debe incluir a la melatonina, objeto de
estudio de este trabajo de investigacin, que se tratar en detalle ms adelante. Las
principalescaractersticasdevariasmolculasantioxidantespresentesenelservivoen
condicionesfisiolgicasseresumenenlatabla2.
SISTEMASREPARADORES
Aunque en sentido estricto no deben ser consideradas como antioxidantes, ya
que no eliminan radicales libres, hay una serie de enzimas que participan en los
procesos de reparacin de biomolculas daadas por ellos. Se ha demostrado que la
peroxidacin lipdicaestimula la fosfolipasa A
2
, y tambin que las formas peroxidadas
delosfosfolpidossonelsustratopreferidodelafosfolipasaA
2
[HalliwellyGutteridge,
1990],porlotantolafosfolipasaA
2
degradalosfosfolpidosoxidadosdelamembrana
[DempleyHalbrook,1983;SevanianyKim,1985;Dizdaroglu,1993].Tambinpodemos
destacar las enzimas reparadoras de ADN, la metionina sulfxido reductasa, y las
enzimas proteolticas intracelulares, que actan degradando protenas daadas
oxidativamenteevitandosuacumulacin[Daviesycols.,1986;GiuliviyDavies,1990].
25
Introduccin
Tabla2.Resumendelosprincipalesantioxidantesbiolgicos.
Antioxidantesenzimticos
Antioxidante Localizacin Accin
Superxido
dismutasas
SOD
(EC1.15.1.1)
Cu/ZnSOD Citosol,ncleoylisosomas
CatalizandismutacindeO
2
aH
2
O
2
[McCordyFridovich,
1969;Fridovich,1974]
MnSOD Mitocondria
ExtracelularSOD Plasma
Catalasaohemoperoxidasa
(EC1.11.1.6)
Peroxisomasycitosol
Cataliza depuracin de H
2
O
2
, reduce hidroperxidos
de metilo y etilo [Chance y cols., 1979; Bai y Cederbaum,
2001]
Glutatinperoxidasa
GPx(EC1.11.1.9)
Intracelular
Cataliza reduccin de H
2
O
2
y otros hidroperxidos
[Mills,1957]
Glutatinreductasa
GREC1.6.4.2)
Intracelular
Regenera el GSH a partir del GSSG [Hopkins y Elliott,
1931]
Glucosa6fosfato
deshidrogenasa(EC1.1.1.49)
Intracelular FuentedeNADPH
Antioxidantesnoenzimticos
Antioxidante Localizacin Accin
Glutatin
GSH
Intracelular,alveolos
Sustrato de la GPx, reacciona con OH, O
2
y radicales libres orgnicos,

regeneralavitaminaC[MartenssonyMeister,1991;Meister,1992;1994]
CoenzimaQ
Cadenadetransporte
electrnico
mitocondrial
Protege frente a la peroxidacin lipdica, regenera vitamina E [Do y cols.,
1996]
VitaminaE
Membranaslipdicas
ylipoprotenas
plasmticas
Depura
1
O
2
,O
2
,OH,NOyRO[Ohkiycols.,1984;Escamesycols.,1997;Siuycols.,
1998;HalliwellyGutteridge,1999;Siuycols.,1999],detienelaperoxidacinlipdicay
quelahierro[Zimmerycols.,1993]
VitaminaC
Fluidosintrayextra
celulares
DepuraO
2
,H
2
O
2
,OH,
1
O
2
yNOformandoradicalsemidehidroascorbato,
[Niki, 1991; Meister, 1992; Ghosh y cols., 1997; Mendiratta y cols., 1998; Chen y cols., 2000;
ZhangyOmaye,2000]contribuye a la regeneracin de la vitamina E [Mayycols.,
1998].
Acta como prooxidante cuando reduce Fe
3+
a Fe
2+
y ste cataliza la
reaccindeFentonHaberWeissgenerandoOH[Fukuzawaycols.,1981;Samuni
ycols.,1983;SahuyWashington,1991;1992;BuettneryJurkiewicz,1996;Gerster,1999].
cidorico Ampliadistribucin
DepuraOH,
1
O
2
,HClOyROO[Amesycols.,1981],quelametalesdetransicin
[Daviesycols.,1986]
Quelantes:transferrina,ceruloplasmina,ferritina,lactoferrina,
hemopexina,hemosiderina,EDTAydesferroxamina
Quelanmetalesdetransicin[BatesySchlabach,1973;Kanner
ycols.,1987;EhrenwaldyFox,1994;Yu,1994].
Bilirrubina Sangre,tejidos
Antioxidante que rompe reacciones en cadena, reacciona con ROO y
1
O
2
[NeuzilyStocker,1993]
caroteno Membranaslipdicas
Depura O
2
, ROO y
1
O
2
[Rousseau y cols., 1992; Regnault y cols., 1993; Telfer y cols.,
1994;Biesalskiycols.,1996]
Flavonoides Exgenos
Reaccionan con ROO, OH y el O
2
, formando el radical fenoxi [RiceEvansy

cols.,1995;RiceEvansyMiller,1996]
Glucosa Ampliadistribucin DepuraOH[Yu,1994]
Cistena Ampliadistribucin Reducecompuestosorgnicosdonandoelectronesdelsulfidrilo[Yu,1994]
Melatonina
Citosol,ncleo,
mitocondria,
membranas,plasma
Potente antioxidante. Depura OH, O
2
, H
2
O
2
, NO, HClO, ONOO
. Activa
enzimas antioxidantes e inhibe enzimas productoras de radicales libres
[Reiterycols.,2003a]
26
FISIOPATOLOGADELOSRADICALESLIBRES
El estrs oxidativo producido por los radicales libres ha sido implicado en la
patognesisdeunagranvariedaddeenfermedadesenelserhumano[Davies,1995].
FUNCIONESDELOSRADICALESLIBRES
Aunque los radicales libres son subproductos txicos del metabolismo celular,
existen evidencias de su necesidad para el desarrollo adecuado de la funcin celular
[Aslan y Ozben, 2003; Chiarugi y cols., 2003; Nathan, 2003]. Los radicales libres
participan,comomolculassealizadoras,enlaregulacindelcrecimientocelularyen
las respuestas adaptativas. Estmulos extracelulares, por citoquinas y factores de
crecimiento, producen un estallido transitorio de radicales libres en clulas de
mamferos.Lasealdetransduccininducidaporelfactordecrecimientoderivadode
plaquetasylatranscripcingnicainducidaporcitoquinas,seinhibencuandoseevita
el incremento de la concentracin de radicales libres, mediante su eliminacin por
agentesqumicosoenzimticos[DalleDonneycols.,2001].
Losradicalesdeoxgenopuedenactuarcomosegundosmensajeros,yaquesu
concentracin se eleva por accin de un ligando extracelular. Todos ellos activan una
forma citoplasmtica del factor de transcripcin NFB que resulta al eliminar una
subunidad proteica inhibidora, IB. El factor de transcripcin NFB es un complejo
multiproteicoqueregulaunagranvariedaddegenesrelacionadosconlainmunidad,la
inflamacinyelcncer.Estaactivacinseinhibeporagentesqueeliminanradicalesde
oxgenoypuederecuperarseporexposicinaundbilestrsoxidativo.
Desde los aos 90 varios estudios apuntan que una pequea cantidad de
oxidantestalescomoelperxidodehidrgenojueganunpapelcrucialcomosegundo
mensajeroenlatransduccindesealparalaactivacin,diferenciacinyproliferacin
celular[Schreckycols.,1992].Lainduccinoinhibicindelaproliferacincelularpor
lotantopareceserdependientedelosnivelesdeoxidantes/antioxidantesenlaclula.
Unambientereducidoestimulalaproliferacin,sinembargounligerocambiohaciaun
ambienteoxidadoinducelaapoptosisonecrosisenlasclulas.Enlneasgenerales,la
27
Introduccin
apoptosis es inducida por un estmulo moderado de oxidantes y la necrosis por un
efectooxidanteintenso.
CONCEPTODEESTRSYDAOOXIDATIVO
La generacin de radicales libres, en organismos sanos, est relativamente
equilibrada con sus sistemas de defensa antioxidante, pero cuando el equilibrio se
desplaza hacia la formacin de radicales libres, se genera estrs oxidativo. ste se
define como una alteracin del equilibrio entre las especies prooxidantes y las
antioxidantes, a favor de las primeras [Sies y Mehlhorn, 1986]. As pues, puede
originarseporunexcesodesustanciasprooxidantes(exposicinaradiacinionizante,
radiacin ultravioleta (UV) intensa, toxinas, estrs psicolgico o fsico, y ciertas
patologas), por una deficiencia de agentes antioxidantes (sistemas enzimticos
deficientes en recin nacidos, envejecimiento,), o por ambos factores a la vez. La
accinderadicaleslibressobrelosconstituyentesestructuralescelularesproduceuna
agresin interna continuada, que amenaza a la integridad de todas las biomolculas.
Las consecuencias patolgicas dependern entonces del tipo de constituyente celular
queseveamsdaado.
1. PEROXIDACINLIPDICA
Loslpidos,elcomponentemsabundantemolecularmentedelasmembranas
biolgicas, son las biomolculas ms susceptibles de ser atacadas por radicales libres,
especialmenteaqullosqueposeenmayornmerodedoblesenlacesensumolcula,
es decir, los cidos grasos poliinsaturados [Cheeseman y Slater, 1993; Gutteridge,
1995].LosradicaleslibresquepuedeniniciarestareaccinsonOH,
1
O
2
,elozono,RO
y ROO [Kanner y cols., 1987; Halliwell, 1990]. El proceso de ataque oxidativo a los
lpidossedenominaperoxidacinlipdica.
Lareaccindelaperoxidacinlipdicacomienzacuandounradicallibreatacaa
un carbono de la cadena aliftica de un cido graso, y se extrae un tomo de
hidrgeno. Esta reaccin se produce significativamente en los carbonos contiguos a
dobles enlaces de cidos grasos poliinsaturados, ya que los radicales formados se
28
estabilizan por resonancia con el doble enlace del resto acilo, formando conjugados
dienos.EsteradicalcentradoenuntomodecarbonoreaccionaconelO
2
yformaun
ROOyotrasmolculascomoendoperxidos,hidroperxidosycicloperxidos[Curtisy
cols., 1984]. El nuevo ROO formado es capaz, a su vez, de extraer un tomo de
hidrgeno de un fosfolpido adyacente, formando un radical alqulico (R) y un
perxidolipdico(ROOH),propagandoasunareaccinencadenaqueseextiendepor
todalamembrana[Kannerycols.,1987;Huntycols.,1988].Lareaccinslotermina
cuandolosradicaleslibresinteraccionanconmolculasantioxidantesobienmediante
lafragmentacindeloscidosgrasosengrannmerodeproductoshastaqueseagota
el sustrato, lo que implica la muerte celular. De forma esquemtica, la reaccin de la
peroxidacinlipdicasedivideencuatropasos:iniciacin,propagacin,ramificaciny
terminacin(figura7).
Laoxidacindeloscidosgrasospoliinsaturadosproducesuylaformacinde
uniones cruzadas entre fosfolpidos o entre fosfolpidos y protenas [Bruch y Thayer,
1983; Curtis y cols., 1984]. Estas alteraciones estructurales son las principales
responsables de la rigidez en las membranas biolgicas cuando stas son expuestas a
radicaleslibres,yporlotantodeterminasuprdidafuncional[Dobretsovycols.,1977;
BruchyThayer,1983;Schroeder,1984;Garzettiycols.,1993;ChenyYu,1994].
Entre los productos formados destacan el malonildialdehdo (MDA) y los 4
hidroxialquenales (4HDA), cuantificados en este trabajo como indicadores del grado
deoxidacinlipdica.Losproductosgeneradosdurantelaperoxidacinlipdicapueden
ser tambin molculas muy txicas capaces de provocar graves alteraciones en la
membrana como modificaciones en las protenas que la integran [Esterbauer y cols.,
1991;Subramaniamycols., 1997;Refsgaardycols., 2000;Zarkovic,2003]eincluso la
rupturadelamembrana[HalliwellyGutteridge,1990].
29
Introduccin
Figura7.Reaccionesprincipalesdelaperoxidacinlipdica.
RL:Radicallibre,LH:lpidointacto,MDA:malonildialdehdo,4HDA:4hidroxialquenales.
2. DAOOXIDATIVOALASPROTENAS
Todoslosaminocidospresentesenlasprotenastienenresiduossusceptibles,
sobretodoaniveldelgrupocarbonilo,deseratacadosporlosradicaleslibres.Dentro
delosaminocidos,latirosina,lafenilalanina,eltriptfano,lahistidina,lametioninay
la cistena son los que presentan mayor predisposicin a ser oxidados [Davies y cols.,
1987]. Esta oxidacin puede dar lugar a una alteracin de la estructura primaria y un
cambioconformacionaldelaprotenay,portanto,aunamodificacinoprdidadesu
funcin.
Las alteraciones bioqumicas que producen los radicales libres enlas protenas
incluyen oxidaciones de las cadenas laterales, fragmentacin de la cadena peptdica,
formacindeenlacescruzadosentreprotenas,modificacindelospuentesdisulfuroy
losenlacesnocovalentescomolosdehidrgeno,cambiosdeconformacin,alteracin
delahidrofobicidad,yadquisicindeotrosgruposreactivoscomoporejemplola3,4
Radicaleslibres
H
R
O
MDA4HDA
MDA: R=OH
4HDA:R=hidroxialquilo
Propagacin
Ramificacin
Inicio
R
R
R
cidograso
RL
O
2
LH
Conjugado dieno
Fe(II)
Radicalalcoxilo
H
+
+
O
O
R
HOO
R
Radicallipoperoxilo
Hidroperxido
Radicalalqulico
O
R
Terminacin
Destruccin
dela
membrana
Depuracin
por
antioxidantes
Reaccinde
dosradicales
libres
30
dihidroxifenilalanina, los hidroperxidos y los carbonilos [Davies y Goldberg, 1987;
Dean y cols., 1997; Stadtman, 2001; Davies, 2003]. Un caso a destacar es cuando el
H
2
O
2
ylasformasreducidasdelhierroycobre,interaccionanenlossitiosdeuninde
estosmetalesalasprotenas,produciendoradicaleslibresqueoxidaninmediatamente
a los residuos de aminocidos vecinos. En muchas enzimas este sitio de unin de
metalespuedeserelcentroactivo,porloqueelataquederadicaleslibresanularasu
funcionalidad[Stadtman,1993].
Aunque la reaccin de las protenas con los radicales libres no se puede
considerarcomounareaccinencadenaensentidoclsico,tambinseproducenuna
seriedereaccionessucesivas(figura8)[HeadlamyDavies,2003]:
Figura8.Reaccionesdelosradicaleslibresconlasprotenas.
En los procesos de dao oxidativo a protenas, algunos aminocidos como la

lisina,prolinayarginina,seoxidandandogruposcarbonilo,demodoqueelcontenido
encarbonilosdelasprotenassepuedeemplearcomounindicadordedaooxidativo
alasmismas[Stadtman,1992].Enestetrabajosehacuantificadolaaparicindeestos
restoscomoindicadorbioqumicodelaoxidacindelasprotenas.
3. DAOALADN
El ADN tambin es susceptible de dao oxidativo. El oxgeno es capaz de
adicionarse a las bases o al azcar del ADN. Cuando un radical libre ataca a una
desoxirribosadelADN,generalmenteseproduceunarupturadelacadenaaniveldel
ProtenaOOH+e
ProtenaO+OH
ProtenaOProtenaC
ProtenaOProtenacarbonilo+R
ProtenaO+ProtenaHProtenaOH+ProtenaC
ProtenaC+O
2
ProtenaOO
ProtenaOO+ProtenaHProtenaOOH+ProtenaC
ProtenaOOH+2e
+2H
+
ProtenaOH+H
2
O
31
Introduccin
lugar de reaccin. Sin embargo, la cadena complementaria que permanece intacta,
puede mantener juntos los dos extremos de la cadena daada hasta que acten las
enzimasreparadoras.Deestemodo,estetipodedaonoesusualmentecrticoparala
clula a no ser que haya una rotura cercana en las dos cadenas [Breen y Murphy,
1995]. La adicin de los radicales libres a las bases del ADN es ms habitual que la
ruptura de las cadenas, y da lugar a una gran variedad de productos derivados, entre
ellos se encuentran la 8oxoadenina, 8oxoguanina, 4,6diamino5
formamidopirimidina, 5hidroxicitosina, 2,6diamino4hidroxi5formamidopirimidina,
5hidroxiuracil, timina glicol y la 8hidroxi2' deoxiguanosina. Tambin se pueden
formarpuentescruzadosADNprotena.
Cuando la replicacin del ADN daado tiene lugar antes de la reparacin o
cuando un ADN daado se repara de manera incorrecta, tiene lugar una mutacin
[Halliwell y Aruoma, 1991; Breen y Murphy, 1995]. As pues, las lesiones oxidativas al
ADNylamutagnesissoncausasimportantesdelcncer[Amesycols.,1993].
UnadelasbasesmodificadascuyocontenidoaumentaenelADNtrasunestrs
oxidativoesla8hidroxiguanina[KasaiyNishimura,1984].Estalesinpuederepararse
por una glicosilasa, que elimina la base nitrogenada (8hidroxiguanina), o por una
endonucleasa, que elimina el nuclesido (8hidroxi2deoxiguanosina) [Tchou y
Grollman, 1993]. Tras ser escindidas del resto de la cadena, ambas se eliminan por la
orina.Lacantidaddelnuclesido8hidroxi2deoxiguanosinaenrganosoenorinase
utilizacomondicedeldaooxidativoalADNinvivo[Fragaycols.,1990].
Al menos en el caso del ADN nuclear se cree que el hierro juega de nuevo un
papel importante en el dao oxidativo. Si el H
2
O
2
llega al ncleo, reacciona con el
hierro ferroso, generando OH que ataca en ese mismo lugar al azcar o a la base,
produciendoroturasdehebraymodificacionesenlasbases[ImlayyLinn,1988].
EldaooxidativoalADNmitocondrial(ADNmt)esunas15vecessuperioraldel
ADN nuclear [Richter y cols., 1988]. La mitocondria es la principal fuente de radicales
libres,queactuaransobreloslpidosdemembranamitocondrial,lasprotenasdesus
sistemas enzimticos y, fundamentalmente, sobre ADNmt. Este ADNmt es muy
susceptible al dao oxidativo dado que, al contrario del ADN nuclear, carece de los
32
mecanismos de reparacin adecuados y no tiene la proteccin que suponen las
histonasypoliaminas[SchapirayCooper,1992].Estohallevadoapensarqueeldao
oxidativo sobre estructuras mitocondriales juega un papel determinante en los
procesos de envejecimiento, es la llamada teora mitocondrial del envejecimiento,
inicialmente propuesta por Harman en 1972, y desarrollada por Miquel en 1980
[Harman,1972;Miquel,1992].
4. DAOOXIDATIVOALOSGLCIDOS
Los mono y disacridos resisten la accin de los radicales libres de oxgeno. La
glucosa,lamanosayelmanitolsondepuradoresdelradicalsuperxido,alretenerloe
impedirsuaccinsobreotrasmolculas,actuandocomoagentesprotectorescelulares
[Albertiniycols.,1996].Eldaooxidativoalosglcidosrevisteimportanciacuandose
trata de polisacridos de funcin estructural, ya que los polisacridos son
despolimerizados por los radicales libres [Monboisse y Borel, 1992] dando lugar a
procesos degenerativos. Un caso especial es el del cido hialurnico cuya funcin
estructuralresideenmantenerlaviscosidaddelfluidosinovial.Laexposicinaagentes
oxidantes,sobretodoradicalsuperxidoprovocasufragmentacin,loqueconducea
ladesestabilizacindeltejidoconectivoyalaprdidadeviscosidaddelfluidosinovial,
como es el caso de la artritis reumatoide [Greenwald y Moy, 1980; Grootveld y cols.,
1991].
FISIOPATOLOGADELOSCIDOSBILIARES
Los cidos biliares son los aniones orgnicos predominantes en la bilis, y en
condiciones fisiolgicas estn confinados en la circulacin enteroheptica. Sin
embargo, en la colestasis, condicin patolgica del hgado definida como una
alteracinhepticaenlaquehayacumulacindebilis[Javittycols.,1982],cuandola
circulacin enteroheptica est interrumpida, los cidos biliares se acumulan en el
hgado.
33
Introduccin
SNTESISYTRANSPORTE
Enelhombre,lasntesisdecidosbiliaresC
24
serealizaenelhgadoapartirdel
colesterolaligualqueenlamayoradelosvertebrados.Loscidosbiliaressintetizados
de novo o primarios en el hombre son el cido clico, un cido biliar con tres grupos
hidroxiloenlasposicionesC3,C7yC12yelcidoquenodesoxiclico(QCA),unocon
dosgruposhidroxilosenlasposicionesC3yC7.Elprocesoglobaldelabiosntesisde
cidos biliares es complejo y abarca 20 pasos enzimticos diferentes (figura 10). En
esta ruta, la adicin de grupos hidroxilo y la oxidacin de la cadena lateral, forma
productos finales ms hidrosolubles del colesterol. A pesar de que la ruta de
hidroxilacinvaraentreespecies,stasiempreesenunapartedelamolcula,siendo
invariablemente el producto final una molcula anfiptica, dado que tiene una parte
hidrofbicayotrahidroflica.Sinembargo,loscidosbiliarestienendiferentesgrados
dehidrofobicidadehidrofilicidad[Sarbuycols.,2001].Antesdelasecrecinhacialos
canalculos biliares, tanto el cido clico como el QCA son conjugados en su grupo
carboxilo al grupo amino de la taurina o la glicina. La conjugacin mejora las
caractersticas hidroflicas del cido biliar y el poder cido de la cadena lateral,
convirtiendo un cido dbil (pKa5,0) en un cido fuerte (pKa3,9 para el conjugado
conglicinay2,0paraeldetaurina)ydisminuyendoladifusinpasivadecidosbiliares
a travs de las membranas celulares durante el trnsito a lo largo del rbol biliar y el
intestinodelgado.Elefectonetodelaconjugacinesmanteneraltasconcentraciones
intraluminales de cidos biliares en el intestino delgado para facilitar la digestin y la
posterior absorcin de grasas [Hofmann, 1999]. Sin embargo, los cidos biliares
tambin son desconjugados por la flora bacteriana endgena durante el paso
intestinal, lo que facilitar su reabsorcin y paso a sangre, para ser reconjugados de
nuevo en el hgado. Los cidos biliares conjugados a pH fisiolgico se encuentran
predominantemente en su forma aninica, por lo que se les llama tambin sales
biliares [Hofmann, 1994]. Por simplificar y por la similitud de ambas formas, en este
trabajo denominaremos ambas formas como cidos biliares. La mayora de los cidos
biliaressecretadosalintestinodelgadoporelesfnterdeOddi,sonabsorbidosintactos
en forma eficiente entrando en la circulacin enteroheptica, dejando pasar a colon
34
menosdeun5%delconjuntodecidosbiliares[Redinger,2003;KullakUblickycols.,
2004]. Los cidos biliares que son reabsorbidos en el leon, son transportados va
portalalhgado,dondesonextradosporloshepatocitos[KullakUblickycols.,2004].
Losnivelesdecidosbiliaresenlasangrevenosaportalduranteelayunoyelperiodo
postprandial son aproximadamente 0,014 y 0,043 mM respectivamente [Angelin y
cols.,1982].
Figura9.Principalescidosbiliaresysussitiosdesntesisymetabolismo
HO
H
H
H
Colesterol
cidoquenodesoxiclico cidoclico
cidodesoxiclico
cidolitoclico
cidosulfolitoclico
cido7oxolitoclico
cidoursodesoxiclico
Hgado
Bacterias
Intestinales
Bacterias
Intestinales
Hgado
HO
H
OH
OH
O
OH
H
H
H
HO OH
O
OH
H
H
H
HO
H
OH
O
OH
H
H
H
HO
O
OH
H
H
H
HO
O
OH
O
H
H
H
O
O
OH
S
O
O
HO H
H
H
HO OH
O
OH
H
H
H
35
Introduccin
Loscidosbiliaresquelleganalcolonsonmetabolizadosporlaflorabacteriana
anaerbica. Primeramente sufren una desconjugacin y despus la accin de la 7
deshidroxilasa bacteriana produce cidos biliares secundarios desoxiclico (DCA) y
litoclico (LCA) en el colon. El DCA, producido a partir del cido clico, es un cido
biliardihidroxilocongruposhidroxilosenlasposicionesC3yC12.ElLCA,producidoa
partir del cido QCA, es un cido biliar monohidroxilo con un grupo hidroxilo en la
posicin C3 (tabla 3). Tras ser absorbido en colon y retornar al hgado, el DCA es
reconjugadoconglicinaotaurinaycirculaensangreconloscidosbiliaresprimarios.
El LCA es poco soluble y se reabsorbe en muy pequea cantidad [Hill, 1990]. La
conjugacin heptica de los cidos biliares circulantes es extremadamente eficiente,
de manera que todos los cidos biliares de la bilis (en especial, cido clico, QCA y
DCA) estn en su forma conjugada [Falany y cols., 1994]. La desconjugacin y la
deshidroxilacin bacteriana en el colon tambin son muy eficientes, por lo cual los
cidos biliares de la materia fecal estn todos desconjugados y comprenden
primordialmente a los cidos biliares secundarios DCA y LCA. Como una modificacin
terciaria, el cido LCA tambin es sulfatado en la posicin C3 y reconjugado con
taurina o glicina. Los cidos biliares terciarios se forman en el hgado y por las
bacterias intestinales a partir de los cidos biliares secundarios. Estas reacciones
comprenden la sulfatacin y la hidroxilacin hepticas del cido LCA, formando cido
sulfolitoclico, y la reduccin del cido 7oxolitoclico a cido QCA o su epmero 7
ursodesoxiclico. El cido ursodesoxiclico (UDA) es conjugado en el hgado, circula
con el pool de cidos biliares primarios, y constituye menos del 5% de los cidos
biliaresprimarios.
Enlavesculabiliarlacomposicinbiliardecidosbiliareses:QCA(35%),clico
(35%),DCA(25%),UDA(2%),LCA(1%),otros(oxoy3hidroxiderivadosdeloscidos
biliares secundarios) (2%) [Ridlon y cols., 2006]. Y en el agua fecal de individuos con
unadietabajaenfibraes:DCA(58%),LCA(12%)yclico(4%)[Albertsycols.,2003].
36
Tabla3.Estructurasdeloscidosbiliaresestudiadosenestetrabajo.
[coeficientesdeparticinoctanolagua,logP,segnSarbuycols.,2001]
cidobiliarlibre cidobiliarconjugado
HO
O
OH
H
H
H
cidolitoclico(LCA)
Solubilidadenagua(20C,pH=7):0,023g/L
HO
H
H
H
H
S
O
O
OH
N
H
O
cidotaurolitoclico(TLC)
HO
H
OH
O
OH
cidodesoxiclico(DCA)
LogP=2,65
S
O
O
OH
N
H
HO
O
OH
cidotaurodesoxiclico(TDA)
Solubilidadenagua(20C,pH=7):95g/L
HO OH
O
OH
H
H
H
cidoquenodesoxiclico(QCA)
LogP=2,25
S
O
O
OH
N
H
HO OH
O
cidotauroquenodesoxiclico(TQA)
Solubilidadenagua(20C,pH=7):95g/L
HO OH
O
OH
H
H
H
cidoUrsodesoxiclico(UDA)
LogP=2,20
37
Introduccin
Recientementesehapuestodemanifiestolaimportanciadeloscidosbiliares
como reguladores transcripcionales de la homeostasis del colesterol. La cantidad de
cidos biliares sintetizada por el hgado, est estrechamente regulada para evitar la
sobreacumulacin de cidos biliares y de colesterol. Cuando los cidos biliares se
concentranporencimadelosnivelesfisiolgicos,seponeenmarchaunmecanismode
retroalimentacin negativa que disminuye su sntesis [Russell y Setchell, 1992]. Por el
contrario, la formacin de cidos biliares se incrementa cuando el sustrato, el
colesterol, se acumula. Ambas respuestas reguladoras ocurren en la transcripcin y
estn mediadas por miembros de la familia de receptores nucleares hormonales,
actuandoendosgenesquecodificanlashidrolasasdelasrutasbiosintticas[Chawlay
cols.,2001].
Los cidos biliares sufren un largo proceso de circulacin enteroheptica
[MulleryJansen,1997;MeieryStieger,2002].Diversossistemasdetransporteenlas
membranas basolateral y canalicular de los hepatocitos permiten su secrecin de la
sangrealabilis.DirigiendolatotalidaddelprocesoseencuentralaNa
+
K
+
ATPasaen
la membrana basolateral que mantiene un gradiente electroqumico entre el
hepatocitoyelmedioextracelular.Estetransportadorintercambiatresionesdesodio
intracelulares por dos iones de potasio extracelulares, manteniendo as un alto
gradiente sodiopotasio. Adems, dado el balance global del intercambio elctrico, el
interior de la clula est cargado negativamente (35mV) en comparacin con el
exterior,favoreciendolacaptacindeionescargadospositivamenteylaexcrecinde
los iones con carga negativa. La ATPasa Na
+
K
+
est presente en la membrana
basolateral, no se encuentran en la membrana canalicular [Sellinger y Boyer, 1990].
Estetransportadorentreotros,estinfluidoporcambiosenlafluidezdelamembrana.
La captacin de cidos biliares por el hepatocito se realiza a travs de un
cotransportador sodiotaurocolato localizado en la membrana basolateral. Este
mecanismosodiodependienteesespecficoparaloscidosbiliares.Existetambinun
transportador inespecfico que se ocupa de la captacin de aniones orgnicos, quees
sodioindependiente y transporta tanto cidos biliares como una gran variedad de
aniones y cationes orgnicos. Este transportador es de la familia de protenas
transportadoras de aniones orgnicos, denominada abreviadamente OATP. Otros
38
transportadores de iones en la membrana basolateral son los intercambiadores de
sodio y potasio implicados en el control de pH intracelular. Un cotransportador Na
+
HCO
3
tambin realiza esta funcin. La membrana basolateral tambin contiene

mecanismos de captacin de sulfatos, cationes orgnicos y cidos grasos no
esterificados, y diversas isoformas de la protena de resistencia a multidrogas o MRP.
Eltransportedecidosbiliaresatravsdelaclulaimplicaalasprotenascitoslicas.
El retculo endoplsmico y el aparato de Golgi tambin estn implicados en el
transportedecidosbiliares.Eltransportevesicularpareceserimportantenicamente
cuandoexistentasasdeflujosuprafisiolgicasdecidosbiliares.
Encondicionesnormales,elpasolimitanteeneltransportedecidosbiliaresa
travsdeloshepatocitosessuexcrecinalabilisatravsdelamembranacanalicular
de la que se encargan diversos sistemas de transporte primario activo, dependientes
de ATP, bombas exportadoras de sales biliares. Estas protenas son unos
transportadorespertenecientesalasuperfamiliadetransportadoresABC.
Los cidos biliares, como componentes de la bilis, recorren los conductos
biliares hasta la vescula biliar donde se almacenan para su futuro uso. La regulacin
transcripcional y posttranscripcional de los transportadores involucrados en la
circulacin enteroheptica est estrechamente relacionada con la regulacin de la
homeostasis lipdica. La disminucin o ausencia de la expresin de los sistemas de
transporte hepatocelulares es una causa importante de diversos tipos de
enfermedadescolestticas[Traunerycols.,1998].
ESTRUCTURAYCARACTERSTICASGENRICAS
Los cidos biliares son esteroides hidroxilados, sintetizados a partir de
colesterolenelhgado.Lamolculadeuncidobiliarcontieneunanilloesteroideoy
una cadena hidrocarbonada lateral corta. La cadena termina en un grupo carboxilo,
quepuedeserconjugadoconglicinaotaurinaatravsdeungrupoamino.Losanillos
esteroideos contienen grupos hidroxilo y los cidos biliares se diferencian por el
nmero, la posicin y la orientacin de estos grupos. La distribucin de los grupos
hidroflicos, grupos hidroxilo y cadena lateral y los hidrofbicos en distintas caras del
39
Introduccin
anillo esteroideo genera una molcula anfiptica. En la tabla 3 se han detallado las
estructurasqumicasdeloscidosbiliaresestudiadosenestetrabajo.
Lahidrofobicidad/lipofilicidaddeuncompuestoesunapropiedadcomplejaque
generalmente se mide disolvindolo en una mezcla bifsica de agua y un lquido
inmiscibleydeterminandoluegolaconcentracindeequilibrioencadafase.Secalcula
as el coeficiente de particin entre ambos solventes. El ms usado como medida de
hidrofobicidad es el coeficiente de particin octanolagua (Po/w) y para utilizarlo en
relacioneslinealesdeenergalibreseexpresacomologaritmo(logP).
En la tabla 3 se compendian los coeficientes de particin de los cidos biliares
obtenidos de los datos experimentales de la bibliografa [Sarbu y cols., 2001]. En
resumen, podemos decir que el LCA es el ms hidrofbico de los estudiados en este
trabajo, y en orden de hidrofilicidad creciente estn el DCA, QCA y el ms hidroflico
deloscidosbiliareslibreseselUCA.Losrespectivoscidosbiliaresconjugadosconla
taurina son ms hidroflicos que sus cidos libres [Attili y cols., 1986; Natalini y cols.,
2007].
FUNCIONES
Los cidos biliares y sus sales, son productos naturales constituyentes
fundamentales de la bilis. La principal funcin de los cidos biliares es la emulsin de
loslpidosbiliares,enparticularelcolesterol.Porlotanto,lasntesisdecidosbiliares
y su excrecin en heces representa el nico mecanismo significativo para eliminar el
excesodecolesterol.Suaccinemulsionantetambinfacilitalaabsorcinintestinalde
las vitaminas liposolubles y la digestin de los triglicridos de la dieta, ya que
proporciona una mayor accesibilidad de las lipasas pancreticas a estas grasas.
Adems, la bilis es una importante va de eliminacin de toxinas, carcingenos,
frmacos y sus metabolitos. Tambin se excretan en la bilis adems del colesterol,
otros compuestos endgenos y productos metablicos como bilirrubina y hormonas
[NathansonyBoyer,1991].
40
IMPLICACIONESETIOPATOGNICAS
Desde hace tiempo se conoce que los cidos biliares estn implicados en la
etiopatogenia de enfermedades como el cncer [Cook y cols., 1940; para revisin ver
Bernstein y cols., 2005]. El mecanismo de accin de la carcinognesis es todava
desconocido, pero hay varios efectos que pueden estar implicados (figura 10). Los
cidos biliares a altas dosis son extremadamente txicos, probablemente a travs del
dao a las membranas celulares [Billington y cols., 1980], membranas mitocondriales
[Goresycols.,1998;PalmeirayRolo,2004]ointerfiriendoconlafuncincelular[Vaezi
y Richter, 2000]. Esta citotoxicidad y alteracin de la membrana puede estimular la
proliferacin y, por lo tanto, contribuir al cncer [Nagengast y cols., 1995]. A bajas
dosis, se sabe que los cidos biliares estimulan efectos de sealizacin celular que
involucran, PKC [LaRue y cols., 2000], cmyc [Tselepis y cols., 2003], COX2 [Zhang y
cols., 1998] y NFB [Jenkins y cols., 2004]. Los cidos biliares pueden ser tanto
promotores tumorales como carcinognicos a travs de dos vas de sealizacin
celular distintas: ERK (Ras/Raf/MEK/ERK) y PKC que median cooperativamente la
activacin inducida por los cidos biliares de un heterodmero formado por los
factoresoncognicosFosyJundenominadoprotenaactivadora1(AP1)[Qiaoycols.,
2000].
Los cidos biliares pueden ser genotxicos a travs de la induccin de dao
oxidativoalADN[Venturiycols.,1997;Debruyneycols.,2001;Bernsteinycols.,2005].
As, pueden activar la formacin ONOO
[WashoStultz y cols., 1999]. El dao al ADN

puedeestarcausadodirectamenteporNO,porONOO
oporOH[Boothycols.,1997;
Jaiswal y cols., 2000]. Esta hiptesis encajara con las investigaciones en las que los
cidos biliares no pueden daar directamente al ADN, sino que requieren
intermediarios celulares [Scates y cols., 1994; Glinghammar y cols., 2002]. Los cidos
DCA y QCA, a concentraciones fisiolgicas, estimulan la hidroxilacin de las bases de
ADN mediada por radical hidroxilo, generando 8hidroxideoxiadenina y 8
hidroxideoxiguanina [Allgayer y cols., 1999; 2002]. El LCA inhibe la polimerasa , una
enzima necesaria para la reparacin del ADN [Ogawa y cols., 1998]. El DCA causa la
degradacin de p53 [Qiao y cols., 2001]. Las funciones de esta p53 en la respuesta al
41
Introduccin
daodelADNincluyen,primero,paradadelciclocelulardandotiempoparapermitirla
reparacin del ADN; segundo, actuar directamente sobre la reparacin del ADN; y
tercero, estimulacin de la apoptosis cuando el dao al ADN es excesivo [Bernstein y
cols., 2002]. Por lo tanto, la reduccin de p53 inducida por DCA incrementara la
inestabilidad genmica ya que disminuye la reparacin del ADN y reduce la retirada
porapoptosisdelasclulascondaoenelADN.Laprdidadelacapacidadapopttica
est asociada con un aumento en la tasa de mutacin [CherbonnelLasserre y cols.,
1996; CherbonnelLasserre y Dosanjh, 1997; Saintigny y cols., 2001]. Mediante el test
de Ames Salmonella se ha medido la capacidad mutagnica de los cidos biliares
[Silverman y Andrews, 1977], sin embargo los cidos biliares no han mostrado
genotoxicidad, posiblemente porque la principal fuente de produccin de EROs, la
mitocondria,estausenteenlasbacterias.
Losefectoscelularesinducidosporcidosbiliaresincluyenproliferacincelular,
apoptosisyregulacingentica,ydependendelaproduccindeEROs[Cravenycols.,
1986; 1987; Araki y cols., 2005]. Estos desempean un papel relevante en la
carcinognesis[Cerutti,1985;Olinskiycols.,1992;GuytonyKensler,1993;Feigycols.,
1994; Jaruga y cols., 1994]. En la etiopatogenia del cncer influyen varios factores en
sus tres fases evolutivas, mutacin del ADN (iniciacin), estimulacin o crecimiento
celular (promocin) y malignizacin celular (progresin) [Elledge, 1996]. Los radicales
libres pueden actuar en cualquiera de ellas [Nakamura y cols., 1988; Salim, 1993;
Hussainycols.,1994;Zalewski,2004].
La generacin de EROs celulares puede tener tanto efectos pro como
antiapoptticos segn el estmulo y la cantidad y duracin de la produccin de EROs
[Tirosh y cols., 2003; Park y cols., 2004]. Las EROs pueden estimular la activacin de
vasdesealizacincelularantiapotticascomoERKyfosfatidilinositol3quinasa[Qiao
y cols., 2001]. En hepatocitos de rata, los cidos biliares DCA y TDA aumentan la
produccin de EROs mitocondrial, lo que activa receptores con actividad tirosina
quinasa y estimulan las vas de sealizacin ERK y fosfatidilinositol3quinasa (PI3K).
Por lo tanto la toxicidad de DCA puede ser potencialmente reducida por las EROs al
activarlavasERKyPI3K,alavezqueestimuladaporlasEROsatravsdelaprdida
42
irreversible del potencial de membrana y liberacin del citocromo C hacia el citosol
[Qiao y cols., 2001]. Recientemente se ha observado que DCA es un clastgeno,
mutgenoytxicoparalasclulasesofgicas,induciendosugenotoxicidadatravsde
unmecanismomediadoporEROs[Jenkinsycols.,2007].
El factor de transcripcin NFB est involucrado en la activacin de rutas de
supervivencia[Rustycols.,2000;Mistryycols.,2004;Mattson,2005]yprotegefrente
a la apoptosis [Colell y cols., 2001; CrowleyWeber y cols., 2002; Richmond, 2002;
Monks y cols., 2004]. NFB estimula la progresin tumoral, en parte, a travs de la
activacindelaNOS[Payneycols.,1998]ylaciclooxigenasa2[SchotteliusyBaldwin,
1999; Schmid y Adler, 2000] y la liberacin de citoquinas proliferativas y
antiapoptticas [Jobin y Sartor, 2000; Lu y cols., 2004]. DCA activa NFB en
hepatocitos a travs de diversos mecanismos que tienen en comn la generacin de
estrs oxidativo [Payne y cols., 2007]: la activacin de protenas de membrana
plasmtica como la NADPH oxidasa y la Na
+
/K
+
ATPasa; la accin de enzimas
metabolizantesdexenobiticoscomolasmonooxigenasascitocromoP
450
;laalteracin
delcomplejomitocondrialIV;ylamodulacindeflujosdeCa
2+
.
43
Introduccin
Figura 10. Resumen de los mecanismos de toxicidad de los cidos biliares [modificado de Bernstein y cols., 2005].
EROs: Especies reactivas dependientes de oxgeno, PLA
2
: Fosfolipasa A
2
, COX: Ciclooxigenasa, LOX: Lipooxigenasa,
tBid: Bid truncado, RE: Retculo endoplsmico, PARP: Poli (ADPribosa) polimerasa, iNOS: xido ntrico sintasa
inducible, eNOS: xido ntrico sintasa endotelial, NFB: Factor nuclear Kappa B, PLC: Fosfolipasa C, IP3:
Inositoltrifosfato.
Dao
mitocondrial
Transportede
electrones
NAD
+
tbid
bid
Caspasa8
cidoaraquidnico
COX
LOX
EROs
Activacin
NFB
ActivacinPARP
DaoalADN
Enzimas
reparadoras
delADN
ncleo
iNOS
ARNm iNOS
ProtenaiNOS
NO
eNOS
Bak
PLC
cidosbiliares
EROs
Bak
H
2
O
2
O
2
ONOO
OH
Ca
2+
p65
p50
Receptor
Fas
NAD
+
PAR
Fe
2+
/Fe
3+
Snitrosilacin
O
2
O
2
PLA
2
IP
3
+
Membrana
celular
Citosol
estrsalRE
44
FISIOLOGADELAMELATONINA
ESTRUCTURAFUNCIONALDELAGLNDULAPINEAL
La glndula pineal o epfisis cerebral se conoce desde hace ms de 2000 aos,
ya que se describi por primera vez por Herfilo de Alejandra (335280 a.C.), quien
afirm que este rgano actuaba como un esfnter que controla el flujo de
pensamientos. En el siglo II d.C., Galeno de Prgamo (129199), introdujo el trmino
conariumparalaglndulapineal,porquelapinealtieneformadelconodeunapia,y
concibilaglndulapinealcomounaestructuranecesariaparadarsoportealosvasos
sanguneos. El trmino actual pineal deriva del latn pinealis, y pinea significa pia.
Citas literarias clsicas orientales sitan el sptimo chacra en la zona
correspondiente a la glndula pineal, refirindose a ste como el tercer ojo, un
rganodeclarividenciaymediacinquetambinpermitealhombrerecordarsusvidas
pasadas.
Se considera una de las mejores descripciones de la pineal y de su situacin
anatmica la realizada por Andrs Vesalio (15141564) en su obra De Humanis
Corporis Fabrica, sin embargo fue el polifactico Ren Descartes (15961650), quien
ensulibroDeHomine,recogiendoengranpartelaideadelafilosofagriega,asign
alaglndulapinealellugardonderesideelalma,siendounaencrucijadaanatmicade
conexinentrelocorporalyloespiritual.Descartespensquelosestmulospercibidos
porlosojoseranllevadosalcerebroydesdeallalcanzabanlaglndulapineal.
A partir de la segunda mitad del siglo XIX se replante la fisiologa de la
glndula pineal, aumentando el inters por su anatoma comparada, histologa y
embriologa, principalmente debido al desarrollo de mtodos tcnicos ms refinados
decorteytincintisular.En1850,RudolphAlbertvonKolliker(18171905)observla
presencia de fibras nerviosas en la glndula pineal de mamfero, y en 1904, Santiago
RamnyCajal(18521934)encontrfibrasnerviosasramificadasenlaglndulapineal
deratn,ysugiriqueerandeorigensimptico[RamnyCajal,1904].
45
Introduccin
A finales del siglo XIX, con el auge de la fisiologa del sistema endocrino se
sospechquelaglndulapinealdelosmamferospudieradesempearunpapelcomo
glndulaendocrina.Estahiptesisseconfirmconlaobservacindecasosclnicosde
pubertad precoz en nios con tumores no parenquimatosos de la glndula pineal
[Heubner,1898].En1905,Studnickaestablecielorigendelaglndulapinealcomoun
rganofotorreceptorenespeciesinferioresypostullafuncinsecretoradelapineal
[Studnicka,1905].
Sinembargo,entodalahistoriadelainvestigacindelaglndulapinealnohay
ningndescubrimientomsimportantequeeldesuprincipalhormona,lamelatonina,
unaestructuraaisladaporLernerycols.[1958].Estosautoresdescubrieronquedicha
molculaaclarabalapieldelarana,yledieronelnombredemelatoninaalrelacionar
sufuncinconelpigmentomelaninaysuestructuraconlaserotonina.
Durante el siglo pasado se fueron conociendo en mayor profundidad las
funciones de la glndula pineal,como la importancia de laluzoscuridad en el control
de su funcin [Fiske y Huppert, 1968] y los efectos de la glndula pineal en la
reproduccindelosmamferoscomorganoneuroendocrino[Wurtmanycols.,1963;
HoffmanyReiter,1965].Estosdescubrimientossentaronlastodavaincipientesbases
delafisiologamodernadelaglndulapinealylamelatonina.
La glndula pineal, en el hombre, est localizada inmediatamente por encima
de los tubrculos cuadrigminos del mesencfalo, en la regin de la comisura
posterior. Es un rgano impar con forma cnica y unido al diencfalo por el tallo
pineal.Labasedeestetallopresentaunfondodesacoquesecontinaconlacavidad
del tercer ventrculo. Tambin se le denomina epfisis puesto que es la evaginacin
superior del diencfalo en contraposicin a la glndula pituitaria o hipfisis que se
encuentraenlaparteinferior.
Embriolgicamente la pineal se origina a partir del ectodermo hacia la octava
semana de vida fetal como una evaginacin del epndimo que forma el techo del
tercer ventrculo. Aunque comienza como una estructura sacular, rpidamente la
proliferacindelasclulasdesusparedeslaconviertenenunaglndulaslida.
46
Es uno de los tejidos corporales con mayor flujo sanguneo en relacin a su
peso que en el hombre adulto es de unos 150 mg [Reiter, 1981]. La irrigacin de la
pineal proviene fundamentalmente de vasos de la piamadre, ramas de las arterias
coroidalesposterioresquederivandelacerebralposterior.
La glndula pineal est inervada por fibras postganglionares simpticas
procedentes del ganglio cervical superior [Ramn y Cajal, 1904]. Tambin tiene
inervacin serotoninrgica de origen central, fibras pinealopetales, y fibras
pinealofugales que se proyectan hacia diversas reas del sistema nervioso central
inmaduro[Vollrath,1985].
Histolgicamente, la glndula pineal en los mamferos est compuesta
fundamentalmente por dos tipos celulares integrados en folculos: la clula
parenquimatosa o pinealocito, y la clula intersticial o astrocito inmaduro [Vollrath,
1985]. La evolucin filogentica funcional de la pineal se corresponde con una
evolucin citolgica, de tal forma que si en especies inferiores predomina el
pinealocito como fotorreceptor, conforme nos acercamos a los mamferos, las
estructuras celulares evolucionan para capacitar al pinealocito en la sntesis de
melatoninayotrassustancias,ysuposteriorsecrecin.
BIOSNTESISDEMELATONINA
La melatonina es una molcula de al menos dos mil millones de aos
[Poeggeler y Hardeland, 1994; Macas y cols., 1999], que est presente en todos los
animalesyplantasdondesehabuscado,conlamismaestructuramolecular,situacin
que muy rara vez sucede en la Naturaleza. Se cree que la melatonina apareci con la
misin fundamental de neutralizar el efecto daino del oxgeno como productor de
radicales libres, poseyendo un potente efecto antioxidante. Con el transcurso del
tiempohasidocapazdeiradquiriendootrasfuncionespropiasdeunahormona.
La melatonina o Nacetil5metoxitriptamina es una indolamina descrita por
primera vez por McCord y Allen (1917) y aislada por Lerner y cols. [1958] a partir de
extractos de glndula pineal. Se trata de un cristal orgnico, de color blanco, con un
47
Introduccin
pesomolecularesde232,38Dayunpuntodefusinentre116y118C,pocosoluble
enaguaymuchoenetanol[Szmuszkoviczycols.,1960].
La biosntesis de melatonina (figura 11) a partir de triptfano, un aminocido
aromticoesencial,tienelugarenlaglndulapinealyenotrostejidosproductoresde
melatonina como retina [Grace y cols., 1991], cuerpo ciliado del iris [Aimoto y cols.,
1985], glndula lacrimal [Mhatre y cols., 1988], mdula sea [Tan y cols., 1999b],
aparato digestivo [Bubenik, 1980; Vakkuri y cols., 1985a; Huether y cols., 1992; Tan y
cols.,1999a],ovario[Itohycols.,1997],sistemainmune[GuerreroyReiter,2002]yel
sistemaportalheptico[Huetherycols.,1992].As,losnivelestisularesdemelatonina
soncientosderdenesdemagnitudmayoresquelosdelplasma[ReiteryTan,2003].
Eltriptfanoentraenelpinealocitodesdeloscapilaressanguneosatravsde
un transporte activo bajo control adrenrgico y sufre una hidroxilacin en posicin 5
por accin de la triptfano5hidroxilasa, convirtindose en 5hidroxitriptfano. Este
paso limitante en la sntesis ocurre en la mitocondria y requiere una pteridina como
cofactor,posiblementelatetrahidrobiopterina,molculaquealcanzaconcentraciones
elevadas en la glndula pineal [Sitaram y Lees, 1978]. La actividad de la triptfano5
hidroxilasatambindependedelosgrupostiol.As,losagentesreductoresaumentan
lavelocidaddereaccinde50a100veces[Hori,1975;EbadiyGovitrapong,1986].Se
ha descrito una pequea variacin circadiana de la actividad de la triptfano5
hidroxilasa,ligeramentemayordurantelanoche[Wurtmanycols.,1971].Finalmente,
la cantidad de sustrato tambin puede ser un factor clave en la sntesis del 5
hidroxitriptfano.
Posteriormente,el5hidroxitriptfanosedescarboxilamediantelaLtriptfano
descarboxilasa para formar 5hidroxitriptamina o serotonina, siendo sta un
importante neurotransmisor del sistema nervioso central. La Ltriptfano
descarboxilasaestlocalizadaenelcitosoldelpinealocitoydeotrasestirpescelulares.
Suactividadestreguladaporlailuminacinambientalatravsdefibrassimpticasy
requiereelpiridoxalfosfatocomocofactor[Snyderycols.,1964].
48
N
H
COOH
NH
2
Triptfano
N
H
COOH
NH
2
triptfano5hidroxilasa
5hidroxitriptfano
Ltriptfanodescarboxilasa
HO
N
H
NH
2
HO
5hidroxitriptamina
(serotonina)
NAT
NH
NH
HO
O
CH
3
Nacetilserotonina
HIOMT
NH
NH
O
O
CH
3
CH
3
Melatonina
(Nacetil5metoxitriptamina)
Figura11.Biosntesisdemelatoninaapartirdetriptfano.
NAT:Nacetiltransferasa,HIOMT:hidroxiindolOmetiltransferasa.
Laserotoninatienedosvasprincipalesdemetabolizacinenlaglndulapineal.
Puede desaminarse por accin de la MAO, o convertirse en melatonina por la accin
de dos enzimas que actan sucesivamente: en primer lugar la Nacetiltransferasa
(NAT), que presenta un marcado ritmo circadiano, y transfiriere a la serotonina un
grupo acetilo del cofactor acetil coenzima A principalmente, dando as lugar a la N
acetil5hidroxitriptamina o Nacetilserotonina. A continuacin la enzima
hidroxiindolOmetil transferasa (HIOMT) va a transferir a la Nacetilserotonina un
grupo metilo de un cofactor de Sadenosilmetionina y convertirla en Nacetil5
metoxitriptamina,melatonina.
49
Introduccin
LaactividaddelaNacetiltransferasa,determinaelritmopinealdeproduccin
hormonal y puede regularse mediante su expresin gnica o mediante la activacin y
estabilidaddelaenzima[pararevisinverHardeland,2008].Laexpresindelaenzima
se puede regular por una va nerviosa controlada por el ncleo supraquiasmtico del
hipotlamo, el llamado reloj biolgico. Esta va (figura 12) comienza en la retina y
continaatravsdelosaxonesdelasclulasganglionares[Lewyycols.,1980;Smithy
cols., 1981]. En el quiasma ptico estas fibras se separan del tracto ptico principal
para dirigirse al ncleo supraquiasmtico. Este ncleo proyecta al ncleo
paraventricular del hipotlamo, desde donde se dirige a la columna intermediolateral
de la mdula espinal torcica, origen de las terminaciones preganglinicas que
alcanzan al ganglio cervical superior [Cardinali y cols., 1981]. Finalmente, las fibras
posganglionares se introducen en el parnquima pineal y llegan a los pinealocitos en
unarelacinanatmicaquerecuerdaaunaestructurasinptica.
Figura 12. Va nerviosa de regulacin de la sntesis de melatonina.NSQ: Ncleo supraquiasmtico, GCS: Ganglio
cervicalsuperior,NA:Noradrenalina,NAT:Nacetiltransferasa,HIOMT:hidroxiindolOmetiltransferasa.
El estmulo lumnico durante el da mantiene hiperpolarizados a los

fotorreceptoresloqueimpidelaliberacinalfinaldelavanerviosadenoradrenalina.
En ausencia de luz, los fotorreceptores generan potenciales de accin que son
conducidos por esta va neuronal hasta los terminales simpticos que liberaran
Triptfano
Serotonina
Nacetil
serotonina
Melatonina
NAT
HIOMT
AMPc
ATP
Pinealocito
Retina
NSQ
(Relojbiolgico)
GCS
Mdulaespinal
Capilares
Capilares
NA
Sntesis
proteica
Adenilato
ciclasa
50
noradrenalina que se une a receptores adrenrgicos
1
y
1
del pinealocito [Reiter,
1991a].Dichaunindesencadenaunareaccinbioqumicaintracelular,quesetraduce
enunincrementodelaexpresinyactividaddelaNAT,conlaconsecuenteelevacin
delasconcentracionesdeNacetilserotoninaymelatonina[Hardelandycols.,1993].
AlgunosfactorespuedenmodificarlaactividaddelaNAT:elestrsyfrmacos
como la pargilina (inhibidor de la monoaminooxidasa), la isoprenalina (anlogo a la
noradenalina),y la desmetilimipramina (bloquea la captacin de noradrenalina),
aumentan la actividad de la NAT, mientras que por el contrario, los bloqueantes, la
ciclohexamida (inhibe la sntesis proteica) y la ouabana (despolariza la membrana),
inhibenlaNAT[RomeroyAxelrod,1974;Quay,1980].
Recientemente, se ha demostrado la presencia, en prcticamente todos los
tejidosdelorganismo,delaexpresindelosgenesquecodificanlosenzimasclavede
la sntesis de melatonina (NAT y HIOMT) [Stefulj y cols., 2001]; por lo que cada tejido
puede producir la melatonina que necesita en cada momento, sin depender de la
melatoninacirculante.
DISTRIBUCIN
La estructura indlica de la melatonina la hace una molcula bastante
liposoluble,queatraviesafcilmentepordifusinsimplelabicapadelamembranadel
pinealocito.Estodeterminaqueelestmulodelasntesisdemelatoninaenlaglndula
pineal eleve rpidamente sus niveles en plasma y en todos los compartimientos del
organismo[Reiter,1991b].
Lamelatoninaestransportadaenelplasmaenparteunidaalaalbmina(70%)
y en parte en forma libre (30%). La vida media de la melatonina en el plasma oscila
entre20y40minutos[Illnerovaycols.,1979;Vakkuriycols.,1985b].
Decualquierformalosnivelesplasmticosdemelatoninaestncondicionados
por la duracin del ciclo luz/oscuridad siguiendo un ritmo circadiano, con
concentraciones altas durante la noche y basales durante el da [Pang y cols., 1980;
Aimotoycols.,1985;MenndezPelezycols.,1987;Reiter,1991a].
51
Introduccin
Incluso la seal de melatonina es capaz de reflejar informacin fotoperidica
acerca de los cambios estacionales. De modo genrico, podramos decir que en el
verano se producen bajos niveles de melatonina, y en invierno concentraciones
mayores,perodemenoramplitud[Arendtycols.,1981].
El ritmo circadiano de melatonina est fuertemente influido por la edad. Los
recin nacidos y hasta los 3 meses de vida producen cantidades elevadas de
melatoninaenrelacinaladulto,perocarecenderitmocircadiano.Alfinaldelprimer
ao de vida es cuando comienzan a diferenciarse los niveles plasmticos diurnos y
nocturnos,alcanzandolasmayoresconcentracionesenelpiconocturno[Waldhausery
cols.,1993;Reiter,1998].Durantelapubertadhayunacadasobretodoaexpensasde
los valores nocturnos. Este ritmo circadiano da/noche se mantiene hasta que en
pocaadultaentrelos45y65aos,decaeprogresivamentehastaigualarselosniveles
sricos diurnos y nocturnos [Reiter, 1995b]. Otros factores que afectan al ritmo
circadianodemelatoninasonelciclomenstrual,eltiempodiariodeexposicinalsol,
elconsumodealgunosfrmacoscomobloqueantesobenzodiacepinas,elestrsyel
ejercicio[Ariznavarretaycols.,2002].
Sinembargo,lamelatoninasintetizadafueradelaglndulapinealescasamente
pasa a la circulacin, manteniendo niveles elevados de melatonina en los tejidos
[Hardeland,2008].Estorefuerzaquelamelatoninarealiceotrasfuncionesademsde
la hormonal. A nivel gastrointestinal, la melatonina se produce en las clulas
enterocromafines, pero tambin se puede obtener melatonina del plasma o del tubo
digestivo. Aunque las concentraciones se mantienen moderadas, el tracto
gastrointestinal, debido a su tamao, puede contener hasta 400500 veces ms
melatoninaque la glndula pineal [Bubenik, 2002; Hardeland y PandiPerumal, 2005].
Tambin se encuentran altas concentraciones de melatonina en la bilis y en la
circulacinenteroheptica[Bubenikycols.,1999;Tanycols.,1999a].
METABOLISMOYFARMACOCINTICA
Tras su paso por la sangre la mayor parte de la melatonina se cataboliza en el
hgado,dondesetransformaen6hidroximelatonina,graciasalaaccindelasenzimas
52
del citocromo P
450
, cmo CYP1A2, CYP1A1 o CYP1B1 [Ma y cols., 2005], o por
depuracin de la melatonina de dos OH. La 6hidroximelatonina es eliminada
fcilmente por la orina al hacerse ms hidrosoluble tras la conjugacin heptica con
anin sulfato o con cido glucurnico [Kopin y cols., 1961; Kveder y Mc, 1961;
Hardeland y cols., 1993]. La enzima CYP2C19 tambin en el hgado produce la
desmetilacindemelatoninaformandoNacetilserotonina[Maycols.,2005].
La melatonina puede seguir otras rutas catablicas, como la desacetilacin
paraconvertirseen5metoxitriptaminaylaposteriordesaminacinporlaMAOAque
produce 5metoxindol3acetaldehido, que a su vez ser convertido, por la aldehdo
deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa, en cido 5metoxiindolactico y 5
metoxitriptofol respectivamente. Esto sucede principalmente en la retina, aunque
tambinenelhgado[Galzinycols.,1988;Graceycols.,1991].
Tambin es posible su transformacin en kinureninas mediante una ruptura
oxidativa de su anillo pirrlico. Esto ocurre en la glndula pineal y el cerebro en
presencia de la mieloperoxidasa, de la enzima indolamina2,3dioxigenasa (IDO)
[Hirataycols.,1974;Kennawayycols., 1988], odenumerosasformasnoenzimticas
como la reaccin con OH, O
2
o H
2
O
2
[Hardeland y cols., 1993; Tan y cols., 1998;
2000a]. En este caso, la melatonina se transforma primero en N
1
acetilN
2
formil5
metoxikinurenamina (AFMK) y despus por la accin de la arilamina formamidasa
[Hardeland y PandiPerumal, 2005; Hardeland, 2005; PandiPerumal y cols., 2006], la
hemoperoxidasa (catalasa) [Tan y cols., 2000a; Hardeland, 2005] o la liberacin
inducida por luz UV de monxido de carbono, se transforma en N
1
acetil5
metoxikinurenamina (AMK), molcula estable que se puede eliminar por la orina
[SeeveryHardeland,2008].Conestemecanismonoenzimtico,lamelatoninadepura
dosradicaleslibresalavez:OHyO
2
.
AMK y AFMK son productos del metabolismo de la melatonina en el cerebro,
perotambinsonproductossecundarioscuandolamelatoninaactacomodepurador
deradicaleslibres[Hirataycols.,1974].Esinteresanteelhechodequelosprincipales
metabolitos de melatonina en cerebro, AFMK y AMK, tambin manifiestan
importantes propiedades antioxidantes [Tan y cols., 2001; Tan y cols., 2003; Mayo y
53
Introduccin
cols., 2005], por lo tanto no slo la melatonina sino tambin sus metabolitos son
altamente eficientes en reducir el dao producido por los radicales libres. Nos
referimos a sta como la cascada antioxidante de la melatonina, un proceso que
incrementa mucho la eficiencia de su ubicua actividad como depurador de radicales
libresyantioxidante.
Otravadedegradacineslaformacindecompuestostricclicosdelafamilia
delascarbolinas.Estasmolculassehanaisladoentodoslostejidosdondehaygran
produccin de melatonina [Airaksinen y cols., 1978; Kari, 1981; Leino y cols., 1983;
Leino,1984;Leinoycols.,1984].Sehapropuestounavanoenzimticaconsistenteen
la condensacin de una indolamina y un aldehdo, denominada ruta de Pictet
Spengler, que conduce a la formacin de carbolinas [McIsaac y cols., 1972; Bosin y
cols.,1983;Callawayycols.,1994].
MECANISMOSDEACCIN
Trasconsideraralamelatoninacomounahormona,seintentaronexplicarsus
funciones, principalmente las relacionadas con el control de los biorritmos y la
reproduccin, a travs de su interaccin con receptores de membrana. Sin embargo,
estudiosposterioreshandescritofuncionesdelamelatoninaqueeranindependientes
de receptores de membrana. As, en primer lugar, se demostr que la melatonina es
un potente depurador de radicales libres [Tan y cols., 1993b; Reiter y cols., 1994]; en
segundo lugar, se caracterizaron receptores nucleares para la melatonina en rganos
perifricos[AcuaCastroviejoycols.,1993;BeckerAndreycols.,1994;Hiroseycols.,
1994] y en SNC [AcuaCastroviejo y cols., 1993; Giguere y cols., 1994; Carlberg y
Wiesenberg,1995];porltimo,sedemostrlacapacidaddelamelatoninaparaunirse
aalgunasprotenasintracelulares,comolaprotenaquinasaC(PKC)[AntonTayycols.,
1998], la calmodulina [HuertoDelgadillo y cols., 1994; Pozo y cols., 1997] y la
calreticulina[Macasycols.,2003].
Esquemticamente, los mecanismos de accin de la melatonina pueden
dividirse en dos, aqullos que estn mediados por su unin a un receptor, ya sea de
54
membranaonuclear,yaqullosqueserealizandeformaindependientedereceptor,
comolainteraccinconprotenasintracelularesylaactividadantioxidante(figura13).
Figura13.Resumendelosprincipalesmecanismosdeaccinyfuncionesdemelatonina.MT:Receptordemembrana
demelatonina,AC:Adenilatociclasa,RZR/ROR:Receptoresnuclearesdemelatonina,RL:Radicaleslibres,MTP:Poro
depermeabilidadtransitoriamitocondrial,RE:Retculoendoplsmico.
MECANISMOSMEDIADOSPORRECEPTOR
1. RECEPTORESDEMEMBRANA
Mediante agonistas marcados (2[
125
I]yodomelatonina) se han identificado
receptores de membrana de melatonina [Dubocovich y Takahashi, 1987; Vanecek y
cols.,1987;Weaverycols.,1988;WilliamsyMorgan,1988].Sonreceptoresproteicos
RZR/ROR
Ncleo
[Ca
2+
]
i
Calmodulina
AMPc
AC
ATP
Regulacin debiorritmos
yreproduccin,
Inmunomodulacin
Antioxidante
Protena
ARNm
Calreticulina
Melatonina
RE
Sangre
COOH
NH
3
MT
Protena G
Citoplasma
MTP
Depleccin
ATP
Mitocondria
RL
RL
55
Introduccin
con420aminocidos,depesomolecular47.424Daycon7dominiostransmembrana
hidrofbicos[Ebisawaycols.,1994].Funcionalmentepodemoshablardedostiposde
receptores:dealtaafinidad,delordende10100pMpor2[
125
I]aMTyqueincluyena
los subtipos MT
1
y MT
2
; y receptores de baja afinidad, con afinidad de 110 nM,
MT
3
[Dubocovichycols.,2003].
LosreceptoresMT
1
yMT
2
,sonreceptoresdemembranaacopladosaprotenas
G inhibidoras y ejercen su accin principalmente mediante la inhibicin de la
adenilatociclasa, lo que conlleva una disminucin del adenosinmonofosfato cclico
(AMPc) intracelular, la disminucin de la actividad de la proteinquinasa A y la
fosforilacindeCREB,protenasqueseunenafragmentosdelADNsensiblesalAMPc.
Los receptores MT
1
se expresan en cerebro, abundantemente en el ncleo
supraquiasmtico,elhipotlamomediobasal,ylaporcintuberaldelaadenohipfisis
[Vanecek, 1988; Williams y Morgan, 1988; Weaver y cols., 1989]. Adems est
presenteenotrasregionesdelsistemanerviosocentral,vasculaturadeciertosrganos
yclulasdelsistemainmunitario[Martnycols.,1982;Laudonycols.,1988;Vanecek,
1988;WilliamsyMorgan,1988;Duncanycols.,1989;Weaverycols.,1989;Bittmany
Weaver,1990;WeaveryReppert,1990;BlazynskiyDubocovich,1991;Stankovycols.,
1991;Lindroosycols.,1993;Pangycols.,1995;Songycols.,1997;GarcaPerganeday
cols.,1999].LosMT
2
sehallanenlaretinayotrasestructurascerebralesdemamferos
[Reppertycols.,1995b;Reppertycols.,1996;Morycols.,1999].ElreceptorMT
3
noes
claro que cumpla todos los criterios de receptor acoplado a protena G, su activacin
estimulalahidrlisisdefosfoinositol[Dubocovichycols.,2003].
Sehandesarrolladodiversosagonistasyantagonistasmelatoninrgicosquese
utilizan en investigacin, o como en el caso de ramelteon (Rozerem) como un
frmacoaprobadoporlaFoodandDrugAdministration(FDA)estadounidenseparael
tratamientodelinsomnio[PandiPerumalycols.,2007].
2. RECEPTORESNUCLEARES
La melatonina tiene funciones en tejidos en los que no se ha descrito
receptores de membrana, como el corazn y el tiroides [Buzzell y cols., 1989; Reiter,
56
1991b; Chen y cols., 1993]. La existencia de receptores nucleares de melatonina se
sugiriantesdesudescubrimiento,cuandoWithyachumnarnkulaislmelatoninaenel
ncleo celular, planteando que la melatonina podra actuar modificando la expresin
gnica en las clulas diana [Withyachumnarnkul y cols., 1986]. Mennenga y cols.
[1991] describieron la presencia de melatonina en el ncleo de clulas de retina y
glndulapinealdepalomasyratas,yredundaronenlaposibilidaddequeacteenla
transcripcingnica.
MenndezPelez y cols. [1991] demostraron que la melatonina inhibi la
expresin de la enzima 5aminolevulinato sintasa en la glndula harderiana del
hmster sirio, y ms adelante descubrieron una protena nuclear que podra actuar
como receptor nuclear para la melatonina, llevando a cabo estudios de
fraccionamientosubcelularentejidosdeglndulaharderiana,hipotlamoehgadode
rata [MenndezPelez y cols., 1993]; tambin detectaron melatonina en el ncleo
celular de numerosos tejidos, incluyendo cerebro, glndulas pineal y harderiana,
intestino, hgado, rin y bazo de roedores y primates, comprobando que la
melatoninaaparecadispuestaprincipalmenteasociadaalacromatinanuclearynoen
elnucleolo.
AcuaCastroviejo y cols. [1993; 1994] utilizando estudios de unin de ligando
con
125
IaMT describieron la unin especfica de alta afinidad de melatonina en un
purificadodencleosdehepatocitosderata, conK
d
=148190pM, sugiriendoquela
uninespecficaseproducaconlafraccinproteicadelncleo,ynoconelADN.Estos
resultados, junto con los anteriores de MenndezPelez y cols. podran explicar
efectos de la melatonina tales como la estimulacin de enzimas antioxidantes, que
podranestarmediadosporlaaccinsobreunreceptornuclear.
Los receptores nucleares son protenas localizadas en el interior del ncleo,
capacesdeunirsealareginreguladoradealgunosgenes.Estasprotenas,cuandose
unen a su ligando especfico se activan, de forma que junto con factores de
transcripcin generales regulan la actividad de la ARN polimerasa II, necesaria para la
expresin gnica. Se conocen varias familias de receptores nucleares para hormonas
esteroideas, tiroideas, vitamina D
3
y retinoides. En muchos de estos receptores no se
57
Introduccin
pudo describir ninguna funcin cuando se descubrieron, por lo que se les denomin
receptoresnucleareshurfanos[Laudetycols.,1992].
Se han clonado seis receptores nucleares de melatonina, miembros de la
familia de protenas hurfanas RZR/ROR. Se denominan ROR
1
, ROR
2
, ROR
3
, RZR,
RZR, RZR [BeckerAndre y cols., 1993; Carlberg y cols., 1994; Giguere y cols., 1994;
Hirose y cols., 1994]. RZR y ROR son nombres diferentes para el mismo receptor
nuclear, que presenta al menos cuatro isoformas distintas generadas por el
procesamientodiferencialdeuncidoARNmprecursorcomn[Giguereycols.,1994].
RZR/ROR y RZR se expresan en el SNC [Carlberg y Wiesenberg, 1995]. RZR
se encuentra en el ncleo supraquiasmtico, retina y glndula pineal y sus niveles de
expresinsiguenritmoscircadianos,connivelesmsaltosdurantelanoche,ysigueun
mecanismoreguladoporAMPc[Balerycols.,1996;Andreycols.,1998].RZR/RORse
expresa en la periferia, con niveles ms altos en la piel y en los leucocitos de sangre
perifrica [BeckerAndre y cols., 1993]. El receptor RZR se encuentra
fundamentalmente en el msculo esqueltico, aunque tambin se ha localizado en el
timo y en cantidades ms bajas en pncreas, prstata, testculo, corazn e hgado
[Hiroseycols.,1994].
El patrn caracterstico en la expresin de los miembros de la familia de
receptores hurfanos RZR/ROR, sugiere que cada subtipo de receptor debe tener
funciones diferentes, relacionadas con mecanismos de control gnico especficos de
distintas clulas en diferentes procesos biolgicos, tal y como ocurre con otros
receptores nucleares que tambin poseen varios subtipos e isoformas, como RAR o
receptor de cido retinoico, RXR o receptor X retinoico, TR o receptor de hormonas
tiroideas,ylosPPARsoperoxisomeproliferatoractivatedreceptors.
INTERACCINCONPROTENASINTRACELULARES
Se ha descrito la unin de la melatonina con protenas intracelulares, como
calmodulina, calreticulina y PKC. La calmodulina es una protena ubicua y
multifuncional, cuya funcin principal es quelar calcio, lo que le permite modular la
actividad de muchas enzimas. Posee cuatro sitios de unin [Teo y Wang, 1973]. La
58
calmodulina interacta con una gran cantidad de protenas y pptidos citoslicos
[Manalan y Klee, 1984]. Entre las enzimas que regula se encuentra la fosfodiesterasa
de los nucleticos cclicos y la adenilato ciclasa necesaria para la formacin del AMPc
intracelular [Cheung, 1970; Cheung y cols., 1975]. Adems puede interactuar con la
Ca
2+
ATPasadeeritrocitosysinaptosomas,laquinasadelacadenaligerademiosina,la
NAD quinasa, la fosforilasa quinasa, la Ca
2+
/Mg
2+
ATPasa y la NOS [Schmidt y cols.,
1992]. Tambin se une a otras protenas del citoesqueleto, como la protena 2
asociada al microtbulo, tubulina, miosina y troponina. Cuando la melatonina
interacta con la calmodulina, inhibe la actividad fosfodiesterasa de forma
concentracindependiente, lo que permite modular directamente las seales
intracelularesdecalcio[BenitezKingycols.,1993;BenitezKingycols.,1996;Ouyangy
Vogel,1998].
La calreticulina es una protena del retculo endoplasmtico que tambin une
calcio. Se trata de una protena con varias funciones, entre las que se incluyen la
actividad de los chaperones, la homeostasis intracelular del Ca
2+
y la regulacin de la
adhesin intercelular por interaccin con las integrinas de la membrana [Macas y
cols.,2003].Hayvariasevidenciasquesugierensulocalizacincitoslica[Jethmalaniy
cols.,1997;Yoonycols.,2000;Holaskaycols.,2001]ynuclear[Roderickycols.,1997].
As, se describen interacciones de la calreticulina con la transduccin de la seal
hormonaldelosglucocorticoidesylosestrgenos[Platetycols.,2000;Holaskaycols.,
2001].Launindelamelatoninaalacalreticulinaesaltamenteespecficayseproduce
conunaafinidadenelrangonanomolar[Macasycols.,2003].
La PKC es una quinasa de serina y treonina activada por Ca
2+
. Esta enzima
fosforiladiversossustratosymodificalaestructuradelcitoesqueleto[Aderem,1992].
BentezKing y AntnTay [1996] comprobaron que la melatonina activa la PKC, con
una IC
50
de 1 nM, de forma dependiente de Ca
2+
. Sin embargo, otros derivados y
anlogos de la melatonina, como la serotonina, 6hidroximelatonina, y N
acetilserotonina,notuvieronefectosobrelaactividaddelaenzima[AntonTayycols.,
1998].
59
Introduccin
Los resultados obtenidos de la interaccin de melatonina con calmodulina,
calreticulinayPKC,respaldanlaideadequelamelatoninapuedecontribuiramodular
laestructuradelcitoesqueleto.Adems,comolastresprotenassondependientesde
Ca
2+
, es posible que otras protenas con dominios de unin al calcio tambin puedan
estar influidas por la melatonina. Los efectos de la melatonina en estos procesos de
fosforilacin/desfosforilacin pueden ser el mecanismo por el que esta indolamina
modulenumerosasrespuestasbiolgicas.
Adems, otro lugar de unin de la melatonina parece encontrarse en la
mitocondria [Hardeland y Poeggeler, 2007]. Se postula que la protena de unin se
localiza en la rampa anfiptica del complejo I de la cadena de transporte electrnico
mitocondrial[Hardeland,2008].Aconcentracioneselevadas,sehademostradoquela
melatonina es capaz de inhibir la apertura del poro de permeabilidad transitoria
mitocondrial (PTP) [Andrabi y cols., 2004], un hecho que podra implicar un sitio de
uninadicional,debajaafinidad.
La unin de la melatonina a los sitios de unin no mediados por receptor,
propuestos previamente, permitira explicar por qu la melatonina a pesar de ser
capazdeatravesartodaslasmembranasbiolgicasnoseliberaengrandescantidades
altorrentecirculatorio,sinoquepermaneceenlostejidosamayorconcentracinque
en el plasma [Hardeland, 2008]. Adems el hecho de que se acumule en algunos
tejidos provoca la ausencia de ritmo circadiano de melatonina en stos, y esto
tambinpuederesolverotraparadoja:porquelpiconocturnodemelatoninadebera
tener efectos protectores tanto de da como de noche, siendo que la mayor
produccin de radicales libres es en las fases de actividad neural y motora, ya que al
carecerderitmosdemelatonina,slolageneracinderadicaleslibresseconvierteen
decisiva para la fase de detoxificacin en estos tejidos [Hardeland y cols., 2003;
Hardeland,2005].
MECANISMOSYFUNCINANTIOXIDANTEDELAMELATONINA
La presencia de melatonina en organismos unicelulares, como Gonyaulax
polyedra[PoeggeleryHardeland,1994],obacterias[Manchesterycols.,1995;Tildeny
60
cols., 1997], refuerzan la hiptesis de que la melatonina es un protector celular
conservadoevolutivamente[Hardelandycols.,1995;Reiterycols.,1997].
Unmecanismodeaccindelamelatonina,independientedesuinteraccincon
receptores o con protenas intracelulares, es su interaccin con radicales libres. Esta
accinocurreentodosloscompartimientosdelorganismo.Laprimeraobservacinde
quelamelatoninatienepropiedadesantioxidanteslarealizaronIanasycols.[1991],y
laconfirmaronTanycols.[1993b],quedemostraronquelamelatoninaneutralizaOH.
A partir de ese momento, son miles los trabajos que demuestran la capacidad de la
melatonina para interactuar con EROs, y por ello actuar como una molcula
antioxidante.
1. ACCIONESANTIOXIDANTESDIRECTASDELAMELATONINA
1.1. ReaccinconOH
Su accin directa se debe a que la melatonina y algunos de sus metabolitos
poseenlacapacidaddedepurarporsmismosalgunasespeciesreactivasdeoxgenoy
denitrgeno[AcuaCastroviejoycols.,2001;Reiterycols.,2003b].
Lamelatoninaesunamolcularicaenelectrones,quecedeunelectrnalOH,
formndose un radical indolil, que es menos reactivo que el OH [Tan y cols., 1993b;
2000a]. Este radical puede reaccionar a su vez con un O
2
para formar el producto

final,AFMK,queseeliminapororina[Hardelandycols.,1993;Poeggelerycols.,1994].
OtraposibilidadesqueelindolilradicalformadoreaccioneconotroOHparaproducir
la 3hidroximelatonina cclica (figura 14), que se elimina por orina. Mediante esta
reaccin, una molcula de melatonina tiene la capacidad de depurar dos OH. Se ha
propuestoquela3hidroximelatoninacclicasepuedeutilizarcomounndicefiablede
estrsoxidativoenelorganismoinvivo[Robertsycols.,1998;Tanycols.,1998;Stasica
y cols., 2000]. Tanto la 3hidroximelatonina cclica como la AFMK, tienen funciones
depuradorasdeagentestxicos[AcuaCastroviejoycols.,2001;Reiterycols.,2003a].
61
Introduccin
N
H
O
H
3
C
HN
O
CH
3
N
O
H
3
C
HN
O
CH
3
OH
OH O
2
N
O
H
3
C
N O
CH
3
O
O H
H
H
N
H
O
H
3
C
N
O
CH
3
HO
H
AFMK
3OHMELATONINACCLICA
MELATONINA
RadicalINDOLIL
Figura14.InteraccindelamelatoninaconlosOH.
AFMK:N
1
acetilN
2
formil5metoxikinurenamina
1.2. ReaccinconH
2
O
2
La melatonina reacciona directamente con H

2
O
2
produciendo AFMK, a travs
deunaseriedeintermediosdereaccin(figura15)[Tanycols.,2000a;2000b].Sienel
medio se encuentra presente tambin un
1
O
2
, el mecanismo de reaccin es diferente
perotambinconducealmismoresultado,unamolculadeAMFK.Acontinuacin,la
enzima catalasa (hemoperoxidasa) puede metabolizar el AMFK a AMK, y est se
excretaporlaorina.
62
Figura15.ReaccindeunamolculadeH
2
O
2
conotrademelatonina.AFMK:N
1
acetilN
2
formil5
metoxikinurenamina,AMK:N
1
acetil5metoxikinurenamina.
1.3. ReaccinconONOO
La melatonina reacciona directamente con el ONOO
[Zhang y cols., 1999], y el

resultado de esta reaccin es la formacin de 6hidroximelatonina, derivado que
tambin tiene propiedades antioxidantes [Qi y cols., 2000; Maharaj y cols., 2003a;
2003b]. El ONOO
se descompone en presencia de CO
2
o protenas que contengan el
grupohemo,comolahemoglobina.Sienelmediodereaccinhayionesbicarbonato,
los productos de la reaccin son 2hidroximelatonina cclica y 3hidroximelatonina
cclica. La 3hidroximelatonina cclica es el producto de reaccin de melatonina con
OH,ysecreequerealmenteloqueocurreesqueelONOO
sedescomponeparadar
OH, y ste es el que reacciona con melatonina [Zhang y cols., 1998; Zhang y cols.,
1999](figura16).
N
H
O
H
3
C
HN
O
CH
3
MELATONINA
N
H
O
H
3
C
HN
O
CH
3
O
O
H
2
O
2
1
O2
N
O
H
3
C
N
H
O
CH
3
O
O H
H
DIOXIETANO
Catalasa (mieloperoxidasa)
H
2
O
2
N
H
O
H
3
C
HN
O
CH
3
O
EPOXIDO
H
2
O
N
H
O
H
3
C
NH
O
H
3
C
OH
HO
DIOL
N
H
O
H
3
C
N
H
O
CH
3
O
H
AFMK
AFK
63
Introduccin
N
H
O
H
3
C
N
CH
3
O
H
N
H
O
H
3
C
N
CH
3
O
H
+ONOO
HO
N
H
O
H
3
C
N
O
CH
3
HO
H
N
H
O
H
3
C
N
O
CH
3
OH
+
ONOO
HCO
3
3OHmelatoninacclica 2OHmelatoninacclica
MELATONINA
6OHmelatonina
Figura16.Formacinde6hidroximelatoninaporlainteraccindemelatoninaconperoxinitrito.
1.4. ReaccinconHClO
LamelatoninapuedereaccionarconelHClOparaproducir2hidroximelatonina,
por medio de una reaccin de adicin nuclefila [Marshall y cols., 1996; Dellegar y
cols.,1999].Participanactivamentelasmolculasdeagua,poresoocurremuchoms
fcilmente en el citosol que en la membrana. Tras una serie de pasos intermedios,
ilustrados en la figura 17, se produce la 2hidroximelatonina que se excreta por orina
[Dellegarycols.,1999].
N
H
O
H
3
C
HN
O
CH
3
N
H
O
H
3
C
HN
O
CH
3
O
Cl
H
MELATONINA
OH
+Cl
+H
3
O
+
2OHMELATONINA
HClO
H
2
O
N
H
O
H
3
C
HN
O
CH
3
Cl
+OH
O
H
H
N
H
O
H
3
C
H
N
O
CH
3
Cl
O
H
H
O
H
H
H
N
H
O
H
3
C
H
N
O
CH
3
Cl
O
H
H
OH
H
Figura17.Reaccindelamelatoninaconelcidohipocloroso.
64
1.5. Reaccinconotrosradicaleslibres
Lamelatoninatambinpuedeneutralizarel
1
O
2
oxidndose aAFMK[Cagnoliy
cols.,1995;DeAlmeidaycols.,2003]ydepurarROO[Pieriycols.,1994],interfiriendo
as en la propagacin de la peroxidacin lipdica [Reiter y cols., 2003a], aunque este
ltimo podra deberse ms a la accin de otras especies reactivas que pueden
provocar peroxidacin lipdica que a la depuracin en s de radicales ROO. No
obstante, la melatonina es altamente eficaz para reducir los niveles de oxidacin
lipdica,tantobasalescomoestimuladospordiversosmecanismosoxidativos[Reitery
cols.,2003a].
2. OTRASACCIONESANTIOXIDANTESDELAMELATONINA
Ademsdelacapacidadintrnsecaparadepurarradicaleslibres,lamelatonina
es capaz de estimular la actividad y expresin de otros sistemas antioxidantes,
estableciendoasunaformadeaccinindirectaparalareduccindelestrsoxidativo
[Kotlerycols.,1998;Antolnycols.,2002;Mayoycols.,2002].
En primer lugar, estimula el ciclo del glutatin, aumentando la actividad de la
GPx y de la GR, regulando as el balance GSSG/GSH [BarlowWalden y cols., 1995;
Pablos y cols., 1995; Pablos y cols., 1998; Martn y cols., 2000a]. Adems, aumenta la
produccin de glutatin por la estimulacin de la glutamilcisteina sintasa, enzima
limitanteenlarutadesntesisdeglutatin[Urataycols.,1999];yestimulalaglucosa
6fosfatodeshidrogenasa,queeslaencargadadegenerarelNADPH,requeridoporla
GR [Pierrefiche y Laborit, 1995]. As, la melatonina estimula otras enzimas
antioxidantes como la SOD [Antoln y cols., 1996] y la catalasa [CotoMontes y
Hardeland, 1999; AcuaCastroviejo y cols., 2001; Reiter y cols., 2003a; Len y cols.,
2004]. Tambin inhibe otras enzimas que generan radicales libres, como la 5
aminolevulinato sintasa [Antoln y cols., 1996] y la NOS [Pozo y cols., 1994; 1997]. La
melatonina tambin ejerce una accin sinrgica con otros antioxidantes como las
vitaminasEyC[Reiterycols.,2003a].
Dado que la melatonina es tanto lipoflica [Reiter, 1991b] como hidroflica
[Shidaycols.,1994],puederealizarsusfuncionesantioxidantesconigualeficienciaen
65
Introduccin
mltiples compartimentos subcelulares, es decir, en el ncleo [Tan y cols., 1993a;
Blickenstaff y cols., 1994; Vijayalaxmi y cols., 1995], en el citosol [Abe y cols., 1994] y
en las membranas [Pierrefiche y cols., 1993; Giusti y cols., 1995; Melchiorri y cols.,
1995].
Recientemente se ha descrito que la melatonina puede realizar sus funciones
antioxidantes a nivel mitocondrial. Estos estudios tienen especial inters porque la
mitocondria es la primera fuente de radicales libres en las clulas eucariotas [Yu y
cols., 1992] y adems porque la melatonina es capaz de atravesar fcilmente la
membrana mitocondrial y se acumula a elevadas concentraciones en dicha organela
[Martnycols.,2000a;AcuaCastroviejoycols.,2002;AcuaCastroviejoycols.,2003;
Len y cols., 2004]. Entre las principales acciones de la melatonina sobre la fisiologa
mitocondrial cabe incluir las siguientes: 1) la administracin crnica de melatonina
incrementa el nmero de mitocondrias de las clulas [Decker y Quay, 1982]; 2)
estabiliza la membrana interna mitocondrial [Garca y cols., 1999]; 3) incrementa la
actividad de los complejos I y IV de la cadena de transporte de electrones en las
mitocondrias hepticas y cerebrales [Martn y cols., 2000b; AcuaCastroviejo y cols.,
2001;AcuaCastroviejoycols.,2005];4)previenelaformacinderadicaleslibrespor
la mitocondria, se postula que esta accin est mediada por un sitio de unin de la
melatonina en el centro hierrosulfurado N2 del complejo I [Hardeland y Poeggeler,
2007]; 5) aumenta la produccin de ATP mitocondrial [Martn y cols., 2002]; 6)
estabiliza la membrana mitocondrial frente a las EROs [Karbownik y cols., 2000] y 7)
antagoniza o previene la apoptosis modulando la funciones mitocondriales [Baydas y
cols.,2005;Sourdevalycols.,2006]incluyendolosefectosenlahomeostasisdelcalcio
y el potencial de membrana mitocondrial [Xu y Ashraf, 2002; Hardeland, 2005;
Sourdeval y cols., 2006], y tambin inhibiendo el poro de transicin mitocondrial
[Andrabi y cols., 2004]. Buenos ejemplos de los efectos protectores de la melatonina
en la mitocondria son la inhibicin de la peroxidacin lipdica inducida por cianuro y
cidokanico[YamamotoyMohanan,2002;2003],lareduccindelalipoperoxidacin
dependientedeNADPHenmitocondriasdeplacentahumana[Milczarekycols.,2000],
la reduccin del dao en mitocondrias de cerebros de ratas inducido por lesin
oxidativa [Wakatsuki y cols., 2001] y la prevencin de la toxicidad del 1metil4
66
fenilpiridinio[Absiycols.,2000],elhidroperxidodetbutilo[Martnycols.,2000a]y
el cianuro [Yamamoto y Tang, 1996]. Finalmente, la administracin crnica de
melatonina estimula la respiracin mitocondrial en hgado y cerebro de ratones con
envejecimientoacelerado[Okataniycols.,2002a;2002b;2003b;2003a].
Algunas de las propiedad antioxidantes de la melatonina son debidas a su
efecto genmico en la regulacin de la expresin de protenas y la actividad de
enzimasantioxidantes[Antolnycols.,1996],ascomolainhibicindelaexpresinde
enzimas prooxidantes/proinflamatorias como la iNOS, la mtNOS y la COX2 [Gilad y
cols., 1997; Crespo y cols., 1999; Escames y cols., 2003; Mayo y cols., 2005]. La
melatonina, adems es un agente neuroinmunomodulador e inhibe la translocacin
delfactornuclearNFBenelinteriordelncleo[Chuangycols.,1996].
OTRASFUNCIONESDELAMELATONINA
Adems de su funcin antioxidante, la melatonina tambin participa en el
control de los ritmos circadianos, la regulacin de la reproduccin y la
inmunomodulacin.
REGULACINDELOSRITMOSBIOLGICOS
La glndula pineal es el principal mediador de la respuesta fisiolgica ante los
ritmosanuales,ascomodelosritmoscircadianos.Mediantesuprincipalproductode
secrecin,lamelatonina,actacomonexodeuninentreelmedioambienteluminoso
ylossistemasnervioso yendocrino.Todoslos efectoscronobiticosdelamelatonina
estn mediados por los receptoresde membrana MT
1
y MT
2
[Reppert y cols., 1995a;
Jin y cols., 2003; Dubocovich y Markowska, 2005]. En el ncleo supraquiasmtico, la
melatoninaafectaalafaseyamplituddelaoscilacincircadiana.Dadoquelaglndula
pinealestbajoelcontroldelncleosupraquiasmtico,suaccinenestemarcapasos
circadianorepresentaunmecanismoderetroalimentacinenvueltoenelreajustedel
oscilador[Hardeland,2008].
67
Introduccin
Laadministracinexgenademelatoninasincronizalosritmoscircadianosque
se encuentran en curso libre. Entre ellos el ritmo circadiano de la actividad de las
neuronas del ncleo supraquiasmtico. sta sincronizacin se produce a travs de los
receptores de alta afinidad para la melatonina. En humanos, la administracin de
melatonina sincroniza los ritmos de temperatura, sueo/vigilia y el de la melatonina
endgena.Lacurvaderespuestadefaseesunaimagenespeculardelaqueproducen
lospulsosdeluz[Cassoneycols.,1986;Reiter,1993;Vanecek,1998].
Elefectodelamelatoninasobrelosritmoscircadianostambinsehaestudiado
enpersonasquerealizanviajestransatlnticos[Petrieycols.,1989;Tresguerresycols.,
2001; Takahashi y cols., 2002], en personas que trabajan en turnos de noche [Sack y
Lewy, 1997; Yoon y Song, 2002] y en pacientes con ceguera causada por destruccin
de la retina [Lewy y Newsome, 1983]. En todos ellos se describieron importantes
alteracionesenelritmodesecrecindemelatoninayenlosciclossueovigilia.
La administracin exgena de melatonina a dosis farmacolgicas produce
hipotermia[DeaconyArendt,1995].Porellosecreequelamelatoninatambinregula
la variacin circadiana de la temperatura corporal [Kostervan Hoffen y cols., 1993].
Todasestasfuncionesestnrelacionadasconelejehipotlamoepifisiario,enconcreto
con el ncleo supraquiasmtico hipotalmico, que modulara la secrecin de
melatonina[Reiter,1991c].
REGULACINDELAREPRODUCCIN
Bajo fotoperiodos naturales, la duracin del pico nocturno de melatonina es
inversamente proporcional a las horas de exposicin a la luz. El fotoperiodo cambia
con las estaciones del ao, siendo las noches ms cortas en verano y ms largas en
invierno, y en consecuencia, los picos de melatonina duran menos en verano que en
invierno. En animales de reproduccin estacional, la melatonina regula el tamao de
losrganossexuales,lasecrecindehormonasasociadasconlafisiologareproductiva
yelcicloestral[Reiter,1993;Moore,1999].Hoydaseaceptaquelaglndulapineal,a
travs de su hormona melatonina, controla los eventos neuroendocrinos de manera
fotoperidica [Badura y Goldman, 1992; Edmonds y Stetson, 1994]. En particular, los
68
cambios estacionales en los patrones de secrecin de melatonina constituyen una
sealesencialparalasfluctuacionesanualesdelacapacidadreproductoraenanimales
mantenidosbajocondicionesfotoperidicasnaturales[Reiter,1973b;Arendt,1986].
Hace ms de un siglo se estableci la relacin de la glndula pineal con el
desarrollo sexual y los cambios gonadotrficos. Heubner (1898) describi el caso
clnicodeunnioconpubertadprecoztrasdesarrollaruntumorenlaglndulapineal.
Enlosltimosaos,numerosostrabajosrelacionanlaglndulapinealylasecrecinde
indolaminas con la reproduccin en mamferos [Reiter y Fraschini, 1969; Reiter,
1973a].
Se ha propuesto una relacin entre la disminucin de la secrecin de
melatonina al final de la infancia y la pubertad y el desarrollo de los caracteres
sexuales [Waldhauser y cols., 1993]. Algunos autores sostienen la relacin inversa
entre la melatonina circulante y la edad. Durante la infancia y adolescencia no est
necesariamenterelacionadaconeldesarrollosexual,sinomsbienconlamaduracin
corporal, lo que coincidira con las observaciones que relacionan la secrecin de
hormona de crecimiento con melatonina en respuesta a la inyeccin de factor
liberador de hormona del crecimiento [Valcavi y cols., 1993]. Los cambios en la
actividadsexualdealgunosmamferosestnligadosalosestacionales[Reiter,1991a].
Endiversasespecieslaadministracindemelatoninaescapazdemodularlaactividad
del eje gonadal a diferentes niveles, incluyendo la secrecin hipotalmica de factor
liberadordegonadotropinas,larespuestadelosgonadotroposhipofisiariosyporello,
la liberacin de gonadotropinas y prolactina, la sntesis de esteroides gonadales o la
respuesta de los rganos diana perifricos. Aunque los efectos ms comnmente
observadosfuerondecarcterinhibidor,dependenengranmedidadelaespecieyde
la pauta temporal de administracin [Diaz y cols., 1999; Ianas y cols., 1999]. Muchos
mamferos tienen ciclos anuales de fertilidad e infertilidad, y es en estas especies
donde la melatonina tiene una clara funcin reguladora de los ciclos reproductores.
Estaspautasgarantizanqueelnacimientodelascrasseproduzcaenlapocadelao
enlaquelascondicionesambientalesyladisponibilidaddealimentoseanlasptimas
para la supervivencia de los neonatos. En estas especies la pinealectoma bloquea los
69
Introduccin
efectos del fotoperiodo, y la administracin de melatonina en la pauta apropiada es
capazderecuperardichoefecto[Dardesycols.,2000].Porejemploenelhmstersirio,
elaumentoenlaactividadpinealprovocadoporlareduccinenladuracindelosdas
duranteelotooyelinvierno,produceregresingonadalenelmachoeinterrupcin
de los ciclos estrales en la hembra, asegurndose as la inactividad sexual en dichas
estacionesdelao,sinembargo,lapinealectomaeliminadichainactividadestacional
[Hoffman y Reiter, 1965; Stetson y WatsonWhitmyre, 1986; CotoMontes y
Hardeland,1999].
Desdeelao2000estlegalizadaenEspaalacomercializacindemelatonina,
como medio para mejorar la eficiencia reproductiva del ganado ovino. Se utilizan
miniimplantes subcutneos (2x4 mm) colocados en la base de la oreja que contienen
18 mg de melatonina, que se van liberando lentamente al objeto de inducir niveles
plasmticosdeentre100y300pg/mlduranteunperiododetiempodeunos100das.
Deestaformalaovejainterpretaunciclodedascortos[Malpauxycols.,1997],loque
estimulasuactividadsexual[Forcadaycols.,2007],consiguiendoassincronizartodos
lospartosenlapocadeseada.
INMUNOMODULACIN
Los efectos inmunorreguladores de la melatonina representan otra lnea de
defensa [para revisin ver CarrilloVico y cols., 2005; Hardeland, 2008] [Maestroni y
Conti, 1996; Gilad y cols., 1998; Guerrero y Reiter, 2002]. En la actualidad su papel
antiinflamatorio est bien demostrado [Mayo y cols., 2005; Escames y cols., 2006],
donde los efectos antioxidantes, mediante la disminucin del NO, y los efectos
mitocondriales,atenanlasealproinflamatoria[Hardeland,2008].
La melatonina tambin ejerce una accin estimulante de la respuesta inmune
mediantelaactivacindevariostiposcelularescomolinfocitosTyB,NK,monocitosy
clulas retculo endoteliales [Hardeland, 2008] y el aumento de produccin de
interleucina4(IL4)enlinfocitosTcooperadores(CD
4
)delamdulaseaylasclulas
madredelalneagranulocticamacrofgica[Maestroniycols.,1994b].
70
Lamelatoninatambinprotegealasclulasdelamdulaseadelaapoptosis
inducida por sustancias citotxicas [Maestroni y cols., 1994a] y a los timocitos de la
apoptosis inducida por glucocorticoides [Sinz y cols., 1999]; esta proteccin se ha
confirmado con el descubrimiento de receptores de alta afinidad para melatonina en
linfocitos T
CD4
[GonzlezHaba y cols., 1995]. Otros autores han descrito que la
melatonina estimula la secrecin de IL1, IL6, INF [Barjavel y cols., 1998], la sntesis
de ARNm de IL1, la actividad citotxica de los monocitos [Morrey y cols., 1994] y el
incremento en la produccin de IL2 e IFN por los linfocitos [GarcaMaurino y cols.,
1998].
JUSTIFICACINYOBJETIVOS
73
Justificacinyobjetivos
JUSTIFICACINYPLANTEAMIENTO
La bilis contiene cidos biliares, bilirrubina, colesterol, metales de transicin
(comohierroycobre),esteroideslipoflicosyvariosmetabolitosdexenobiticos.Entre
sus funciones fisiolgicas destaca la de regular el metabolismo del colesterol,
promoverlaabsorcindegrasasyvitaminasliposolubles,ylaexcrecindesustancias
txicas. Sin embargo, los cidos biliares, que son sus mayores componentes, son
citotxicoscuandoseacumulanintraoextracelularmente.Loscidosbiliaresinducen
apoptosisynecrosiscelular,probablementedebidoaldaooxidativoalamitocondria
[Robertsycols.,1997;PalmeirayRolo,2004;Roloycols.,2004;Ferreiraycols.,2005;
Sokolycols.,2005].
En la colestasis, situacin de acumulacin de los cidos biliares, se ha
demostrado que los cidos biliares inducen dao heptico [Parola y cols., 1996;
Portincasa y cols., 2007], intestinal [Assimakopoulos y cols., 2006], renal [Kucuk y
cols.,2003]ycerebral[Chroniycols.,2006].Laacumulacinsuprafisiolgicadecidos
biliares tambin induce pancreatitis aguda [Reinheckel y cols., 1998], fallo renal
[Bomzon y cols., 1997], lesiones gastrointestinales [Craven y cols., 1986], y dao al
ADN [Booth y cols., 1997; Debruyne y cols., 2001; Bernstein y cols., 2005; Jansen,
2007]yestnimplicadoseneldesarrollodelesfagodeBarret[Jenkinsycols.,2007;
Songycols.,2007].
Losradicaleslibreshansidoinvolucradosenlaetiologadelacolestasis[Sokol
y cols., 1993]. Esta hiptesis es apoyada por los datos experimentales que muestran
como diversos antioxidantes previenen estos cambios patolgicos [Canturk y cols.,
1998;Sokolycols.,1998a;Montillaycols.,2001;Roloycols.,2001;Gumprichtycols.,
2004; Paumgartner y Beuers, 2004; Ara y cols., 2005; Crocenzi y cols., 2005; Soden y
cols.,2007].
La melatonina previno el dao al hepatocito inducido por cidos biliares
[Montillaycols.,1998;Padilloycols.,2004],recuperelestadoantioxidanteenlarata
con ligadura del conducto biliar, [Esrefoglu y cols., 2005; Ohta y cols., 2005]. La
melatonina tambin protegi de la colestasis materna [Prez y cols., 2007], el estrs
74
oxidativo cerebral [Cruz y cols., 2007] y gstrico [Polat y Emre, 2006] en ratas con
ictericia obstructiva, y frente al dao a la mucosa gastrointestinal inducido por una
variedad de procesos generadores de radicales libres como la isquemia/reperfusin,
alcoholyaspirina[Brzozowskiycols.,1997;DeLaLastraycols.,1997].Tambinseha
demostradoconcentracionesdemelatoninadelordendecientosdevecesmayoresen
labilisqueenelplasmadependiendodelaespecieanimaldondesehanmedido[Tan
y cols., 1999a; Messner y cols., 2001]. Se ha propuesto que esta presencia de
melatoninatanelevadaenlabilispudieraestarrelacionadaconsufuncinprotectora
contraeldaooxidativodeloscidosbiliares.
Estetrabajodeinvestigacinsediseparaprofundizarsistemticamenteenel
conocimientodelpapeldelestrsoxidativoenlahepatotoxicidadporcidosbiliaresy
laspropiedadesantioxidantesdelamelatoninafrenteastahepatotoxicidad.
En primer lugar se estudi el estrs oxidativo inducido por cidos biliares para
comprobar si los cidos biliares per se generan dao oxidativo. En segundo lugar,
evaluamos la potenciacin del dao oxidativo inducido por hierro y ascrbico en
presenciadeloscidosbiliares.Seutilizunmodeloproductorderadicaleslibresque
sebasenlageneracindeOH,utilizandounsistemaconstituidoporclorurofrricoy
cido ascrbico, que como agente reductor, convierte el Fe (III) en Fe (II), por lo que
exacerba la reaccin de Fenton. En tercer lugar, se investigaron las condiciones
ptimasdelalesinoxidativaaloslpidosyprotenasinducidaporcidosbiliares.Por
ltimo, en cuarto lugar, se evalu la actividad antioxidante y protectora de la
melatonina,consideradacomoelprincipalproductodesecrecindelaglndulapineal,
frentealdaoinducidoporcidosbiliares.
Entodoslosexperimentosseutilizarondostiposdemuestras,homogeneizado
heptico y membranas aisladas. El uso de membranas celulares aisladas bien lavadas
se justifica para reducir las interferencias en el modelo oxidativo causadas por la
presencia de antioxidantes endgenos. En los homogeneizados de hgado se
mantienen los niveles fisiolgicos de antioxidantes. Puesto que la membrana celular
est constituida en esencia por lpidos y protenas, se utilizaron dos indicadores
diferentes de lesin causada por radicales libres. Por un lado se determinaron los
75
Justificacinyobjetivos
niveles de MDA+4HDA, como marcadores del dao oxidativo a los lpidos, y por otro
se midieron los niveles de restos carbonilo como indicadores del dao oxidativo a las
protenas.Ambosparmetrosbioqumicosdefinenbieneldaooxidativoproducidoa
la membrana, y la cuantificacin de stos en ausencia o presencia de los diferentes
cidos biliares y de melatonina en variadas concentraciones ofrece una visin global
del dao producido por los cidos biliares y la proteccin que melatonina puede
ejercersobreeltejidohepticofrentealdaoporradicaleslibresinducidoporcidos
biliares.
OBJETIVOSESPECFICOS
Primero: Comparar entre s las posibles efectos prooxidantes, de los cidos biliares,
valorandosuactividadoxidativadelpidosyprotenasdehomogeneizadosy
membranas aisladas de tejido heptico, en presencia y ausencia de cloruro
frrico y cido ascrbico. El cido biliar que mayor potenciacin del dao
oxidativoproduzcaseseleccionarparasuposteriorevaluacin.
Segundo: Definir las condiciones de mximo dao oxidativo por cidos biliares, en
homogeneizados y membranas aisladas de tejido heptico, fijando el
tiempo de incubacin ptimo para inducir de forma significativa la
oxidacindelpidosyprotenas.Elmodelooxidativoelegidoseutilizaren
todaslasvaloracionesdelapotenciaantioxidantedelamelatonina.
Tercero: Analizar los efectos protectores de melatonina, sobre la oxidacin de
lpidos y protenas de homogeneizados y membranas aisladas hepticas
inducida por cidos biliares, en presencia y ausencia de cloruro frrico y
cidoascrbico.
MATERIALYMTODOS
79
MaterialyMtodos
MATERIAL
REACTIVOSQUMICOSUTILIZADOS
Todoslosreactivosqumicosutilizadosenestetrabajoseobtuvieronapartirde
diversas casas comerciales, siempre de la mayor pureza disponible, y fueron
conservados segn las condiciones ptimas indicadas en el envase. A continuacin se
relacionan clasificados por el mtodo donde se han utilizado y se indican los
fabricantesdondeseadquirieron:
Perfusinanimalypreparacintisular
Clorurosdico(NaCl)(Panreac).
Tiopentalsdico(BraunMedical).
cido 4(2hidroxietil)piperazina1etanosulfnico (HEPES) (Sigma
Aldrich).
Tris[hidroximetil]aminometano(TRIS)(SigmaAldrich).
Modelodeinduccindedaooxidativo
Quenodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato, desoxicolato,
taurodesoxicolato, ursodesoxicolato, litocolato y taurolitocolato
sdicos, melatonina (aMT), cloruro frrico (FeCl
3
), cido ascrbico,
etilendiaminotetracticodisdico(SigmaAldrich).
Cuantificacindelaperoxidacinlipdica
Acetonitrilo, cido metanosulfnico, 1metil2fenilindol, 1,1,3,3
metrametoxipropano, Tris [hidroximetil] aminometano y metanol
(SigmaAldrich).
cidoclorhdrico(HCl)(Panreac).
80
CuantificacindeLosrestoscarboniloproteicos
2,4dinitrofenilhidrazina(DNPH),cidotricloractico(TCA),guanidina,
etanolyacetatodeetilo(SigmaAldrich).
Determinacindelaconcentracindeprotenas
Albmina srica bovina (BSA), Tris[hidroximetil]aminometano (TRIS)
(SigmaAldrich).
ReactivodeBradford(Biorad).
NaCl,LCA,TLC,DCA,TDA,QCA,TQA,UDA,BSA,EDTA,guanidina,DNPH,TCAy
TRIS se disolvieron en agua destilada ultrapura obtenida con un sistema MilliQ de
Millipore. Estas disoluciones se prepararon semanalmente, siendo almacenadas en
botellasdevidriocolormbaryconservadasenneveraa4C.LaDNPHtrasdisolverse
en agua ultrapura, se almacen en una botella de vidrio color mbar en oscuridad a
temperaturaambiente.El1metil2fenilindolsediluyenacetonitriloyseconserva
4C.
El cido ascrbico, el FeCl
3
, y el 1,1,3,3tetrametoxipropano se disolvieron en
tampn TRIS 20 mM (pH=7,40). Melatonina se disolvi en etanol (2%) y TRIS 20 mM.
Todosestosreactivosseprepararonelmismodadelexperimento,justoantesdeser
utilizadas.
MATERIALDELABORATORIO
El trabajo experimental se realiz en los laboratorios de Fisiologa del
Envejecimiento y del Estrs Oxidativo sitos en el Departamento de Farmacologa y
Fisiologa de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza. Estn equipados
conelsiguienteutillajeutilizadoenestainvestigacin:
- Agitadores:VrtexVelpScientificazx3yvrtexHeildolphREAX2000.
- BalanzadeprecisinCobosCBH300J.
- BalanzadeprecisinCobosA220CB.
81
MaterialyMtodos
- BaotermostatizadoconagitacinBunsenBTG1.
- Centrfuga Beckman Avanti 30, refrigerada y equipada con dos rotores:
F1010para10tubosde10mLyH6002paratubosEppendorfde1,5y2mL.
- Espectrofotmetro BeckmanCoulter DU800 con cubetas de plstico
desechablesparamedirenelrangovisibleycubetasdecuarzoparamediren
elrangoultravioleta(UV).
- HomogeneizadordeteflnacopladoaunrotorHeidolphRZR2020.
- HomogeneizadorUltraTurraxJanke&KunkelT25.
- DosjuegosdepipetasdeprecisinGilson:P20,P200,P1000yP5000.
- UnjuegodepipetasEppendorf:0,12,5;220;10100;50250y2001000.
- pHmetroCrisonmicropH2001equipadoconsondadetemperatura.
- Materialquirrgicodiverso:pinzas,tijeras,separadores,bistur,etc.
- SistemadeaguadestiladadeMilliporeMilliRX.
- SistemadeaguaultrapuradeMilliporeMilliQ.
- Mquinapreparadoradeescamasdehielo.
- Nevera(20C).LIEBHERRPremium.
- Ultracongelador(80C).Ing.CLIMAS.CVF350/80.
MATERIALBIOLGICO
Seutilizaronloshgadosdeuntotalde65ratasmachoderazaSpragueDawley
conpesoscomprendidosentre200225g,adquiridasenHarlanIbrica.Losanimales
permanecieronestabuladosenunambientecontrolado(temperatura221C,ciclo
de luz:oscuridad de 12:12 horas), con agua y comida ad libitum (dieta de
mantenimientopararoedores,HarlanIberica,tipoRMM).Todoslosexperimentosse
realizaron cumpliendo estrictamente la normativa vigente europea (Directiva
82
86/609/CEE), espaola (Real Decreto 1201/2005) y autonmica (Ley 11/2003) para el
uso de animales de experimentacin. Para evitar la influencia del ritmo circadiano,
todaslasextraccionesdetejidoserealizaronentrelas8:00ylas10:00a.m.
DISEOEXPERIMENTAL
Enlaprimerafaseseestudielefectodediferentescidosbiliaresinduciendo
dao oxidativo. Esto nos permiti seleccionar el cido biliar con mayor efecto
prooxidante y realizar una segunda fase de estudios cinticos de tiempo y de
concentracin para obtener las condiciones ptimas que se utilizaron en la tercera y
ltima fase, donde se evalu el efecto protector de la melatonina frente al dao
oxidativoproducidoporestecidobiliar.Todoslosexperimentosserealizaronendos
tiposdemuestras:homogeneizadodehgadoymembranasdehepatocitosaisladas.
Por ltimo, adems de estudiar el efecto prooxidante de los cidos biliares, se
analiz su accin potenciadora del dao oxidativo producido por un sistema in vitro
generador de radicales hidroxilo (OH) y peroxilo (ROO) basado en la reaccin de
Fenton.El metaldetransicinfue elhierroenestadoreducido(Fe
2+
). LosionesFe
2+
seobtuvierondeFeCl
3
(0,1mM)ycidoascrbico(0,1mM)comoagentereductor.La
oxidacin se detuvo al final de la incubacin mediante la adicin de EDTA 2 mM. El
EDTAquelaelhierrolibredelmedioydeesaformafrenalaprogresindelareaccin
deFenton.
Inmediatamentedespusdecadaincubacingeneradoradedaooxidativose
cuantificaron los niveles de dos marcadores del estrs oxidativo en el hgado, uno
especficoparalaoxidacindelpidosyotroparalasprotenas,MDA+4HDAyrestos
carbonilodelasprotenasrespectivamente.

E
de
0,
y
bi
Fig
au
qu
c
STUDIO
Homo
e hepatocit
,5mg/mL,f
cido asc
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gura 18. Diseo

usencia o pres
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C
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Fen
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Control
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3
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m
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M)
A
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3
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OPOR
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ntos del dao o
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litoclico.
adoo
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0,1mM)+ci
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CIDOS
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TQA+
DCA+
TDA+
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(0,1mM)
ar
83
Mtodos
ES
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3
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84
Mela
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Sin
Cont
Cont
Cont
Cont
Contr
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3
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ndo, con ag
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TLC
TLC
TLC
TLC
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.
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mM,y1mM
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MaterialyM
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3
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TLC+0,1
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Mtodos
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86
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5;1;2;3;5mM
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M)
87
MaterialyMtodos
MTODOSPARALAPREPARACINDELAS
MUESTRAS
PERFUSINDELOSANIMALESYOBTENCINTISULAR
El objetivo de realizar una perfusin in vivo con suero fisiolgico del lecho
vascular,fueevitarquelahemoglobinainterfirieraenlosresultadosdeMDA+4HDA
yqueelhierrohemticoelevaralosnivelesbsalesdeestrsoxidativo.
Las ratas fueron anestesiadas mediante administracin intraperitoneal de
tiopental(50mg/kg).Acontinuacin,seaccedialacavidadabdominalmedianteuna
incisinenlalneaalbahastaeldiafragma,teniendocuidadodenodaarelhgado.Se
desplazelpaqueteintestinalparafacilitarelaccesoalhgado.Mediantetoracotoma
en U se accedi a trax y rpidamente, se practic una puncin en el pex cardaco,
con una cnula de 18G. La perfusin intraventricular se realiz con suero fisiolgico
(0,9%NaCl)a4C.Parafacilitareldrenajedelsistemavenososerealizunaincisinen
laaurculaderechadelcorazn,loquepermitiunarpidavadesalidadelasangre,
que iba siendo sustituida con el suero fisiolgico. Finalizada la perfusin en
aproximadamente dos minutos, se extrajo el hgado lo ms rpidamente posible, se
lavconsuerofisiolgicoa4CmediantepasessucesivosporplacasPetricolocadasen
hielo. Los rganos se colocaron sobre papel de filtro para eliminar el suero y a
continuacin los hgados se almacenaron a 80C hasta ser utilizados el da del
experimento.
HOMOGENEIZACINDELTEJIDOHEPTICO
UnavezpesadoelhgadosetroceconbistursobreunaplacaPetrisituadaen
hielo y los pedazos se introdujeron en un homogeneizador de vidrio con tefln
acopladoaunrotorHeidolphRZR2020.SeaaditampnTrisHCl20mMaraznde
5 mL/g de tejido. La velocidad del homogeneizador fue de 300 revoluciones por
minuto, velocidad que corresponda a la menor eficaz para homogeneizar el tejido.
88
Todo este proceso se realiz en fro para reducir al mximo posible la degradacin
enzimtica tisular manteniendo el vidrio de homogeneizacin en hielo picado.
Posteriormente, las muestras se distribuyeron en alicuotas y se almacenaron a 80C
hastaelmomentodeserutilizadasenlosensayos.
AISLAMIENTODEMEMBRANASDETEJIDOHEPTICO
Las membranas celulares se aislaron siguiendo la metodologa descrita por
Escamesycols.conligerasmodificaciones[Escamesycols.,2001;MillnPlanoycols.,
2003]. Este mtodo consiste en la centrifugacin diferencial (figura 22). En primer
lugarsecentrifugelhomogeneizadoa1000xgdurante10mina4Cparaeliminarlos
restos de tejido no homogeneizado, los ncleos grandes y otros detritos celulares. A
continuacin el sobrenadante se centrifug a 50.000 g durante 20 min a 4C. El
precipitado, que contena las membranas y las mitocondrias, se resuspendi en
tampn HEPES 20 mM KCl 140 mM (pH=7,4) y se volvi a centrifugar a 10.000 g
durante 15 min a 4C. Una vez recogido el sobrenadante y la capa flogstica, que
contenan las membranas celulares, se centrifug a 50.000 g durante 20 min a 4C.
Esta velocidad de centrifugacin conllev la precipitacin de las membranas,
obteniendo por tanto un precipitado que se volvi a resuspender en tampn TrisHCl
20mMpH7,4.
Protocolo
- Homogeneizarlasmuestrasdeloshgados(1/10,p/v)enlasolucintampn
deHEPES20mM/KCl140mMpH7,4.
- Centrifugarelhomogeneizadoresultantea1.000gdurante10mina4C.
- Centrifugarelsobrenadantea50.000gdurante20mina4C.
- ResuspenderelprecipitadoeneltampnHEPES20mM/KCl140mMpH7,4
(1/10,p/v).
- Centrifugara10.000gdurante15mina4C.
89
MaterialyMtodos
- Homogeneizar el sobrenadante y la capa flogstica y centrifugar a 50.000 g
durante20mina4C.
- ResuspenderelprecipitadofinalentampnTrisHCl20mMpH7,4(1/1,p/v)
yconservarenalcuotasa80Chastalarealizacindelosensayos.
Figura22.Protocolodeaislamientodemembranasdehepatocitos.
Mtodobasadoenlacentrifugacinadiferentesvelocidades,loquepermitesepararunasorganelasdeotras.
HIGADO homogeneizadoen
HEPES20mM/KCl 140mMpH=7,41/10 (p/v)
Centrifugacin1.000xg, 10min
Resuspender enHEPES1/10(v/v)
Centrifugacin50.000xg,20min
Resuspender enTRIS20mM1/1(p/v)
Congelar a80C
90
MTODOSANALTICOS
DETERMINACINDELACONCENTRACINDEPROTENAS
Todos los resultados de los indicadores de dao oxidativo obtenidos en este
trabajo estn referidos a la concentracin de protenas de las muestras analizadas.
Para calcularla se utiliz el mtodo de Bradford [1976]. Se basa en la reaccin, por
fuerza inica, entre grupos sulfonados cidos presentes en el azul de Coomassie y
grupos amino libres presentes en aminocidos bsicos, principalmente arginina, lisina
e histidina. Esta reaccin produce cambios de absorbancia a 595nm que son
directamenteproporcionalesalaconcentracindeprotena(figura23).
Laconcentracindeprotenasdelamuestraproblemaseobtuvointerpolando
su valor de absorbancia en la curva patrn obtenida (coeficiente correlacin 0,99
0,01) y multiplicando posteriormente por el factor de dilucin aplicado en cada caso.
Losvaloresdeconcentracindeprotenasseexpresanenmg/mL.
Protocolo
- Dispensar 2 alcuotas de 4 L de cada una de las muestras problema
previamente diluida para que la lectura est comprendida entre los
estndaresinferiorysuperior.
- AadiratodoslostubostampnTris20mMhastacompletar800L.
- Dispensar 200 L de reactivo de Bradford de Biorad (Azul brillante de
CoomassieG250al 0,01%,etanol 4.7%,cido ortofosfrico8,5%,diluidoen
aguadestilada).
- Agitar e incubar durante 10 min a temperatura ambiente y leer la
absorbanciaa595nmenelespectrofotmetro.Utilizarcomoblanco 800L
Tris20mMy200LreactivodeBradford.
91
MaterialyMtodos
- Para construir la recta de calibrado se realizan disoluciones de
concentraciones conocidas (016 g/mL) de seroalbmina bovina (BSA) en
tampnTris20mM.
Figura23.Protocolodecuantificacindeprotenas.

Clculoporinterpolacinconlacurvaestndar
(mgprotena/mL)
AzuldeCoomassie
Absorbancia =595nm
Muestra
Protenas
Cadenaslateralesbsicas
yaromticas
Complejoprotenacolorante
Na+
S O O
O
N N+
S O O
O
HN
O
92
CUANTIFICACINDELAPEROXIDACINLIPDICA
Laaccindelosradicaleslibressobreloslpidostienelugarfundamentalmente
sobre los cidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares, provocando su
peroxidacin.Losproductosfinalesdeesteprocesodeperoxidacinlipdica(LPO)son
aldehdos, gases hidrocarbonados y varios residuos qumicos, siendo mayoritarios el
MDA y los 4HDA. Por lo tanto la concentracin de MDA+4HDA es un indicador del
grado de peroxidacin de los lpidos de las membranas biolgicas [Valenzuela, 1991].
La concentracin de MDA+4HDA se determin por un mtodo colorimtrico
[Esterbauer y Cheeseman, 1990] basado en la reaccin de un reactivo cromgeno, el
Nmetil2fenilindol, con el MDA o con los 4HDA, a una temperatura de 45C. La
condensacin de una molcula de MDA 4HDA con dos molculas de Nmetil2
fenilindolproduceuncromforoestableque,enpresenciadelcidometanosulfnico
presentaunaabsorbanciamximaa586nm(figura24).
Todaslasdeterminacionesserealizaronporduplicado.Lasconcentracionesde
MDA+4HDA se corrigieron por las concentraciones de protenas, expresando las
concentracionesfinalesennmolMDA+4HDA/mgprotena.
Protocolo
- Centrifugarlasmuestrasa3.000xgdurante10minutosa4C.
- Dispensar 2 alcuotas de 200 L del sobrenadante y aadir 650 L de N
metil2fenilindol10,3mMdisueltoenacetonitrilo,ymetanol,enrelacin
1:3(v/v).
- Agitarydispensar150Ldecidometanosulfnico15,4M.
- Incubarlostubosdurante40minutosa45C.
- Centrifugara3.000xgdurante10mina4C.
- Incubar10minatemperaturaambiente.
- Medirlaabsorbanciaa586nmenelespectrofotmetro.
93
MaterialyMtodos
- Para obtener la recta de calibrado se utilizaron diluciones de
concentracin conocida (0 10 mol/L), a partir de una disolucin de
1,1,3,3tetrametoxipropano 10 mM en TRIS 20 mM. El 1,1,3,3
tetrametoxipropanoalhidrolizarse,liberaMDAdeformaestequiomtrica
[Nielsenycols.,1997].
Figura24.Protocolodecuantificacindemalonildialdehdo(MDA)y4hidroxialquenales(4HDA).
Ph
N
CH
3
Ph
N
CH
3
Ph
N
CH
3
Clculoporinterpolacinconlacurvaestndar
(nmol MDA/mgprotena)
Nmetil2fenilindol
Absorbancia =586nm
Complejo
MDA2(Nmetil2fenilindol)
H
R
O
Muestra
MDA4HDA
MDA: R=OH
4HDA:R=hidroxialquilo
94
CUANTIFICACINDERESTOSCARBONILO
Para valorar el dao oxidativo a las protenas de los homogenizados y de las
membranas,seutilizladeterminacindelosrestoscarbonilodelasprotenas[Davies
y Goldberg, 1987; Dean y cols., 1997]. Para ello se sigui el protocolo descrito por
Levine y cols. [1990] con modificaciones mnimas. Este mtodo est basado en la
reaccindelosrestoscarbonilodelasprotenasconlaDNPH,formndoseunderivado
que se cuantifica midiendo su absorbancia en el rango 360390 nm. Durante el
procedimientoseutilizaelTCAparalaprecipitacindelasprotenas,loslavadospara
la eliminacin del exceso de DNPH que no ha reaccionado con restos carbonilo, y la
guanidina para redisolver las protenas y poder realizar la lectura en el
espectrofotmetro(figura25).
A partir de la absorbancia obtenida se calcul la concentracin de restos
carboniloempleandolaleydeBeerLambertyelcoeficientedeabsorcinmolardela
DNPH(=22.000M
1
cm
1
).Finalmente,trasladeterminacindelasprotenastotales,
losresultadosseexpresaronennmolderestoscarbonilo/mgdeprotenastotales.
Protocolo
- Aadir a 1 mL de las muestras: 100 L de TRIS 20 mM pH 7,4 y 200L de
DNPH10mMenHCl2N.
- Agitareincubardurante1ha37C.
- Dispensar325LTCA50%froeincubarenhielodurante10min.
- Centrifugara3.000xg10mina4C.
- Lavar el precipitado 3 veces, resuspendiendo con 1 mL de etanol:acetato
deetilo1:1,v:vycentrifugandoa11.000xgdurante3mina4C.
- Disolverelprecipitadofinalen700LdeguanidinaHCl6MpH=2,00.
- Agitareincubar,a37Cdurante15min.
- Centrifugara12.000xgdurante10mina4C.
95
MaterialyMtodos
- Leer la absorbancia del sobrenadante a 375 nm (lmpara ultravioleta) en
cubeta de cuarzo a temperatura ambiente. Utilizar como blanco una
disolucindeguanidina6M.
Figura25.Fundamentodelacuantificacinderestoscarboniloenlasprotenas.
ClculomediantelaleydeBeerLambert
(nmol restoscarbonilo/mgprotena)
2,4dinitrofenilhidrazina
Absorbancia =375nm
Muestra
Restoscarbonilo
C
H
Prot
O
NH
H
2
N
NO
2
NO
2
NH
N
NO
2
NO
2
C
H
P rot
96
MTODOSESTADSTICOS
ESTUDIODESCRIPTIVODELOSDATOS
Las variables cuantitativas se definieron mediante dos parmetros, la media
aritmtica, como medida de la tendencia central, y el error estndar, como una
medidadeladispersin.Porello,losresultadossonexpresadossiemprecomomedia
aritmticaerrorestndar.
En cada grupo de estudio se comprob la hiptesis de normalidad de las
distribucionesmedianteeltestdeShapiroWilk.Elvalordesignificacinestadsticase
establecienp0,05.
INFERENCIAESTADSTICA
Dependiendo del resultado de las pruebas de normalidad, para estudiar las
diferenciasentrelosdistintosgrupos,portratarsededatosrelacionados,serealizun
anlisisdelavarianzaparamuestrasrepetidas,paramtrico,oeltestdeFriedman,no
paramtrico.Lahiptesisnulafueaceptadaparatodosaquellosdatosdelosgruposen
losqueFnofuesignificativaparaunvalordep0,05.
Paralacomparacinestadsticaentrelasmediasdelosgruposdedatosenlos
que F fue significativa se aplic el test de la t de Student para datos pareados,
paramtrico, o el test de Wilcoxon, no paramtrico, con un nivel de significacin
aceptadoenp0,05.
CLCULODEDAOOXIDATIVOINDUCIDOOPOTENCIADO
Para poder comparar las potencias prooxidantes de cada uno de los cidos
biliares incluidos en este estudio, se calcul el porcentaje de dao oxidativo inducido
porcadacido.Paraelloseutilizlaecuacin(14):
(14) % daoinducido=
X
a
X
c
X
c
100
97
MaterialyMtodos
Donde X
c
es la concentracin de MDA+4HDA o restos carbonilo en las
muestras en ausencia de cido biliar, o controles y X
a
es la concentracin de MDA+4
HDAoderestoscarboniloenlasmuestrasincubadasconunaconcentracin1mMde
cadacidobiliar.
Posteriormenteseutilizcomosistemaconocidogeneradorderadicaleslibres
laadicinalamuestradehierroferroso.Enestecaso,seestudienlosdiversoscidos
biliaressuefectopotenciadordeldaooxidativoproducido.Paracalcularelporcentaje
dedaooxidativopotenciadoporcadacidoseemplelasiguienteecuacin(15):
(15) % daopotenciado=
X
a+
X
c+
X
c+
100
Donde X
c+
muestras en ausencia de cido biliar y en presencia de 0,1 mM de FeCl
3
y 0,1 mM de
cido ascrbico, o controles positivos y X
a+
es la concentracin de MDA+4HDA o de
restoscarboniloenlasmuestrasincubadasconunaconcentracin1mMdecadacido
biliar,0,1mMdeFeCl
3
y0,1mMdecidoascrbico.
CLCULODELAIC
50
En este estudio se define IC

50
como la concentracin de melatonina necesaria
para inhibir al 50% la formacin, debida al TLC, inducida o no por hierro ferroso, de
MDA+4HDA y de restos carbonilo en los homogeneizados y membranas aisladas. Se
calcul grficamente tras la representacin de los porcentajes de inhibicin en la
formacin de estos dos marcadores de lesin oxidativa para cada concentracin de
melatonina.Paraelloseutilizlaecuacin(16):
(16) % inhibicin=
X
1
X
2
X
1
X
0
100
Donde X
0
muestrasenausenciadeTLC,ocontroles;X
1
eslaconcentracindeMDA+4HDAode
restos carbonilo en las muestras incubadas con TLC 1 mM; X
2
es la concentracin de
MDA+4HDA o de restos carbonilo en las muestras incubadas con TLC 1 mM y
melatoninaadistintasconcentraciones.
RESULTADOS
101
Resultados
ESTUDIODELDAOPORCIDOSBILIARES
En primer lugar, para el desarrollo de este estudio se llev a cabo una
clasificacindetodosloscidosbiliaresanalizadossegnsuefectocomoinductoreso
potenciadores de dao oxidativo. Posteriormente, se seleccion el cido biliar que
mayorpotenciacindedaooxidativoprodujo.Latabla4resumeelefectodedistintos
cidos biliares en la formacin de MDA+4HDA y restos carbonilo proteicos en
homogeneizadosymembranasdehgado.
Tabla 4. Efecto de distintos cidos biliares en la formacin de MDA+4HDA y carbonilacin proteica en
homogeneizadosymembranasdehgado. Laincubacinserealiza37Cdurante2hcon1mMdecadacidobiliar,
enpresenciayausenciadeFeCl
3
0,1mMycidoascrbico0,1mM.Losvaloressonlamediaerrorestndardeal
menosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*)ovscontrolenpresenciadeFeCl
3
0,1mMycido
ascrbico0,1mM(#).
Fe
2+
cido
biliar
Homogeneizados Membranas
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
A
u
s
e
n
c
i
a
Control 0,250,05 2,160,35 1,470,30 3,831,30

QCA 0,330,02 3,330,24
(*)
1,720,15 8,162,99
(*)
TQA 0,800,15
(*)
4,560,27
(*)
1,980,22 9,461,84
(*)
DCA 0,450,05 5,500,74

(*)
2,530,30
(*)
9,591,77
(*)
TDA 0,830,13
(*)
5,900,72
(*)
2,470,38 11,511,97
(*)
UDA 0,390,05 5,920,86

(*)
2,520,21
(*)
10,551,99
(*)
LCA 0,360,06 4,780,43

(*)
2,460,17
(*)
8,922,01
(*)
TLC 1,930,40
(*)
5,930,58
(*)
6,590,40
(*)
15,732,77
(*)
P
r
e
s
e
n
c
i
a
Control+ 3,941,13
(*)
6,050,78
(*)
69,262,89
(*)
38,2313,63
(*)
QCA+ 4,240,84
(*)
6,950,67
(*)
67,372,36
(*)
45,3711,94
(*)
TQA+ 4,600,94
(*)
7,930,83
(*)
83,553,92
(*,#)
53,7214,65
(*,#)
DCA+ 4,170,72
(*)
7,600,78
(*)
68,612,33
(*)
49,6012,19
(*,#)
TDA+ 4,490,90
(*)
8,250,86
(*,#)
86,133,25
(*,#)
51,0314,53
(*,#)
UDA+ 3,600,81
(*)
6,990,52
(*)
76,403,49
(*,#)
48,3812,02
(*,#)
LCA+ 3,420,94
(*)
7,570,78
(*)
73,503,59
(*)
47,3712,47
(*,#)
TLC+ 4,751,10
(*,#)
9,901,74
(*)
89,573,32
(*,#)
66,439,25
(*,#)
Trasincubarloshomogeneizadosdehgadodurante2henpresenciade1mM
de distintos cidos biliares, se estudi la formacin de MDA+4HDA (figura 26). Como
puedeobservarse,tantoelTQAcomoelTDAyelTLCaumentaronsignificativamentela
LPO con respecto al control. Expresando estos resultados como porcentaje de dao
102
oxidativo inducido, tenemos que TQA, TDA y TLC aumentaron significativamente los
valores de LPO respecto al control un 214%, 227% y 657% respectivamente (tabla 5).
La figura 27 ilustra los cambios en la oxidacin de protenas en homogeneizados de
hgadoenpresenciadeloscidosbiliaresevaluados.QCA,TQA,LCA,DCA,TDA,UDAy
TLC aumentaron significativamentelos valores de restos carbonilo respecto al control
un55%,111%,122%,155%,174%,174%y175%respectivamente.Delaobservacin
de las figuras 26 y 27 y la tabla 4, se deduce que los cidos biliares conjugados con
taurina(TQA,TDAyTLC)aumentaronsignificativamentetantolosnivelesdeLPOcomo
laoxidacindeprotenasenhomogeneizados.
En membranas, el efecto prooxidante de los cidos biliares fue superior al de
homogeneizados, especialmente en el TLC. As, LCA, UDA, DCA y TLC aumentaron
significativamente los valores de LPO respecto al control un 68%, 72%, 73% y 350%
respectivamente (figura 28). Tambin QCA, LCA, TQA, DCA, UDA, TDA y TLC
aumentaron significativamente los valores de restos carbonilo respecto el control un
113%,133%,147%,150%,175%,201%y311%respectivamente(figura29).
Tabla5.Incrementoporcentualdedaooxidativoalpidosyprotenashepticascausadoporcidosbiliares(1mM).
Fe
2+
cido
biliar
MDA+4HDA RestosCarbonilo MDA+4HDA RestosCarbonilo
A
u
s
e
n
c
i
a
QCA 30 55 18 113
TQA 214 111 35 147
DCA 77 155 73 150
TDA 227 174 69 201
UDA 53 174 72 175
LCA 42 122 68 133
TLC 657 175 350 311
P
r
e
s
e
n
c
i
a
Control+ 1.447 180 4.626 899

QCA+ 8 15 3 19
TQA+ 17 31 21 41
DCA+ 6 26 1 30
TDA+ 14 36 24 33
UDA+ 9 16 10 27
LCA+ 13 25 6 24
TLC+ 21 64 29 74
103
Resultados
Figura 26.Efectodeloscidos biliaresenlaformacindeMDA+4HDAenhomogeneizadosdehgado.Losvalores

sonlamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*).
Figura27.Efectodeloscidosbiliaresenlaformacinderestoscarboniloenhomogeneizadosdehgado. Los
valoressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*).
104
Figura28.EfectodedistintoscidosbiliaresenlaformacindeMDA+4HDAenmembranashepticasaisladas. Los
valoressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*).
Figura 29. Efecto de distintos cidos biliares en la formacin de restos carbonilo en membranas de hgado. La
incubacin se realiz a 37C durante 2h en presencia de una concentracin 1 mM de cada cido biliar. Los valores
sonlamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*).

105
Resultados
Al aadir al medio de incubacin cloruro frrico y cido ascrbico aument
significativamente la oxidacin de lpidos y de protenas comparado con el control en
ausencia de hierro, tanto en homogeneizados como en membranas (figuras 30 a 33).
As, los valores de la LPO son 15 y 46 veces superiores que los valores control en
homogenizadosyenlasmembranasrespectivamente(figuras30y32).Enlosestudios
de oxidacin de las protenas, tras la adicin de cloruro frrico y cido ascrbico, los
carbonilosproteicosfueron2y9vecessuperioresquelosobtenidossinhierroenlos
homogenizadosyenlasmembranasrespectivamente(figuras31y33).
La mayora de los cidos biliares aument la peroxidacin lipdica en los
homogeneizadoshepticosproducidaporlareaccindeFenton,sibienlasdiferencias
tan slo fueron estadsticamente significativas respecto al control oxidado en
presencia del TLC (figura 30), con un 21 % de incremento. Este cido ya fue el que
obtuvolamayorsignificanciaenausenciadehierro(figura26).
En trminos del estrs oxidativo proteico de los homogeneizados, se
obtuvieron resultados similares. La mayor carbonilacin la alcanzarn el TDA, 36% de
incremento respecto al control positivo, y el TLC, 64% (tabla 5), si bien tan slo se
obtuvo significacin estadstica en el contraste del control positivo con el TDA, por la
mayordispersinderesultadosobtenidosenlosexperimentosdelTLC(figura31).
Al igual que sucedi en los homogeneizados, los resultados fueron ms
evidentes cuando la muestra utilizada fue la membrana. En stas, UDA, TQA, TDA, y
TLC potenciaron significativamente la LPO presente en el control positivo en un 10%,
21%, 24% y 29%, respectivamente (figura 32). Respecto a la oxidacin proteica
causada por el hierro, los cidos que potenciaron significativamente la aparicin de
restos carbonilo fueron LCA, UDA, DCA, TDA, TQA y TLC con incrementos de 24%,
27%,30%,33%,41%y74%respectivamente(figura33).
106
Figura30.EfectodeloscidosbiliaresenlaformacindeMDA+4HDAenhomogeneizadosdehgadoenelsistema
generadorderadicaleslibresdelFeCl
3
ycidoascrbico.Losvaloressonlamediaerrorestndardealmenosseis
observaciones,p0,05vscontrol(*)ovscontrol+(#).
Figura31.Loscidosbiliaresaumentaronlaformacinderestoscarbonilocausadaporhierroycidoascrbicoen
homogeneizados de hgado. Los valores son la media error estndar de al menos seis observaciones, p 0,05 vs
control(*)ovscontrol+(#).
107
Resultados
Figura 32. LoscidosUDA,TQA,TDAyTLCpotencianlaperoxidacinlipdicainducidaporFe

2+
enlasmembranas
aisladas del tejido heptico. Los valores son la media error estndar de al menos seis observaciones, p 0,05 vs
control(*)ovscontrol+(#).
Figura 33. Efecto de los cidos biliares en la carbonilacin proteica en membranas aisladas de hgado. Los valores
sonlamediaerrorestndardealmenosseisobservaciones,p0,05vscontrol(*)ovscontrol+(#).

108
Del estudio de los resultados expuestos en la tabla 5 y las figuras 26 a 33, se
seleccion para su posterior evaluacin el TLC por ser el cido biliar que mayor
induccindedaooxidativoenlpidosyprotenasprodujo,tantoenhomogeneizados
comoenmembranas.Enpresenciadehierro,elTLCtambinpotencilaLPOtantoen
homogeneizados como en las membranas, en las que TLC tambin potenci la
formacinderestoscarbonilodebidaahierro.nicamentenoseobservunaaccin
significativa en la oxidacin de protenas debida a hierro en homogeneizados aunque
seevidenciunaclaratendencia(figura31).
CINTICASDETIEMPODEDAOOXIDATIVO
Conelfindeestablecerunascondicionesexperimentalescomunesdelmodelo
generador y potenciador de dao oxidativo, se realiz un estudio cintico de tiempo
encuatrogruposdiferentes.SedeterminaronlasconcentracionesdeMDA+4HDAyde
restos carbonilo en los homogeneizados y las membranas aisladas hepticas,
manteniendo una agitacin y temperatura constante de 37C y modificando la
duracin de la incubacin (0, 10, 30, 60 y 120 min). Un primer grupo del estudio,
denominado control, valor la oxidacin lipdica y proteica, en homogeneizados y
membranas en ausencia de TLC, cloruro frrico y cido ascrbico. El segundo grupo,
denominadoTLC,determinlosefectosdeltiempodeincubacincuandoseaadi
al medio TLC 1 mM. Un tercer grupo, denominado control+, valor los efectos del
tiempo de incubacin cuando se aadi cloruro frrico y cido ascrbico. El cuarto
grupo,denominadoTLC+,analizlapresenciaconjuntadeincubacindeTLC1mM
conclorurofrrico0,1mMycidoascrbico0,1mM.Losresultadosobtenidosenlas
cinticasdetiemposeresumenenlatabla6ylasfiguras34a37.
109
Resultados
Tabla 6. Efecto del tiempo de incubacin en la formacin de MDA+4HDA y restos carbonilo en homogeneizadosy
membranasdehgado.Laincubacinserealiza37Cenpresenciayausenciadecidotaurolitoclico(TLC)1mM,
enpresencia(+)yausenciadeFeCl
3
0,1mMycidoascrbico0,1mM.Losvaloressonlamediaerrorestndarde
almenosseisobservacionesindependientes,*:p0,05vscontrolcorrespondiente(tiempodeincubacin:0min).
Fe
2+
TUBO
Tiempo
(min)
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
A
u
s
e
n
c
i
a
Control
0 0,320,05 3,460,53 0,090,05 2,150,98

10 0,300,04 5,600,66
(*)
0,100,06 4,301,59
30 0,280,04 6,050,76
(*)
0,110,07 6,890,93
(*)
60 0,320,04 6,340,78
(*)
0,450,30 7,400,91
(*)
120 0,340,03 6,090,69

(*)
0,760,56 5,500,45
(*)
TLC
0 0,570,06 7,530,59 7,540,74 6,580,38

10 0,580,05 6,770,86 4,950,56 8,771,08
(*)
30 0,600,05 7,560,49 5,250,68 11,392,22

(*)
60 0,710,04
(*)
7,390,58 5,340,34
(*)
12,532,79
(*)
120 0,760,02
(*)
7,390,37 6,390,30
(*)
12,741,50
(*)
P
r
e
s
e
n
c
i
a
Control+
0 0,340,05 4,470,10 2,100,77 5,861,98

10 0,330,04 5,370,67 11,622,60
(*)
9,622,37
(*)
30 0,360,07 5,620,66 30,102,88

(*)
12,292,48
(*)
60 0,370,05 5,840,66 38,161,88

(*)
12,172,20
(*)
120 0,490,06
(*)
5,770,68 47,721,40
(*)
21,618,44
(*)
TLC+
0 0,470,10 5,980,95 14,925,59 15,042,25

10 0,500,10 5,680,64 28,689,30 20,832,42
(*)
30 0,550,09 6,320,78 41,213,04

(*)
27,464,16
(*)
60 0,650,10
(*)
6,670,82 49,512,06
(*)
38,863,56
(*)
120 1,310,24
(*)
6,230,92 65,517,77
(*)
46,455,61
(*)
En primer lugar se realiz un estudio de la evolucin temporal de la

peroxidacin lipdica en los homogeneizados hepticos. La figura 34 ilustra los
resultadosydesuobservacinpuedededucirsequeuntiempodeincubacindehasta
doshorasnoalterlasconcentracionesdeMDA+4HDAdelasmuestrascontroles.Por
el contrario, se requirieron dos horas de incubacin de los homogeneizados en
presencia de FeCl
3
y cido ascrbico, controles positivo, para que aumentara la
peroxidacinlipdicadeformasignificativa,mientrasquebastconunahoraparaque
se obtuviera significacin estadstica cuando se utiliz el TLC, ya fuera en ausencia o
presencia de hierro y cido ascrbico. En el dao oxidativo a las protenas de los
homogeneizados no se obtuvieron diferencias en funcin de la duracin de la
110
incubacin para ninguno de los modelos oxidativos estudiados, ni el de TLC ni el de
FeCl
3
ycidoascrbico,yafueranutilizadosdeformaaisladaocombinada(figura35).
Figura34.EfectodeltiempodeincubacinenlaformacindeMDA+4HDAenhomogeneizadosdehgado.La
incubacinserealiza37Cenpresenciadecidotaurolitoclico1mM(),enpresenciadeFeCl
3
0,1mMycido
ascrbico0,1mM()yenpresencia()decidotaurolitoclico1mM,FeCl
3
0,1mMycidoascrbico0,1mMyen
ausenciadetodosellos().Losvaloressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservaciones
independientes,*p0,05vs0minutos.
Figura35.Papeldeltiempodeincubacinenlaoxidacinproteicaenhomogeneizadosdehgado.Laincubacinse
realizenpresenciadecidotaurolitoclico1mM(),enpresenciadeFeCl
3
0,1mMycidoascrbico0,1mM()
y en presencia () de cido taurolitoclico 1 mM, FeCl
3
0,1 mM y cido ascrbico 0,1 mM y en ausencia de todos
ellos().Losvaloressonlasmediaserroresestndares.n=6,*p0,05vs0minutos.
111
Resultados
Figura 36. Influencia del tiempo de incubacin en la formacin de MDA+4HDA en membranas de hepatocitos. La
3
0,1mMycido
3
ausenciadetodosellos().Losvaloressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservaciones*p0,05vs0
minutos.
Figura 37. Efecto del tiempo de incubacin en la formacin de restos carbonilo en membranas de hgado. La
3
0,1mMycido
3
ausencia de todos ellos (). Los valores son la media error estndar de al menos seis observaciones
independientes,*p0,05vs0minutos.
112
Losestudioscinticosterceroycuartoserealizaronenmembranasaisladasde
tejido heptico. El tercero valor la concentracin de MDA + 4HDA y el cuarto la
determinacin de restos carbonilo. En los dos se produjeron aumentos de la lesin
oxidativadirectamenterelacionadosconladuracindelaincubacin.Laperoxidacin
lipdica en membranas aisladas (figura 36) apenas se modific en las muestras
controles.AunqueelTLCprovocunligeroaumentosignificativoapartirdeunahora
de incubacin, los resultados ms espectaculares se produjeron en el modelo
fentoniano ya sea aplicado solo o con TLC, con significacin a partir de los 10 y 30
minutos respectivamente. Respecto a la oxidacin de protenas de las membranas
aisladas, los incrementos significativos en su carbonilacin fueron a partir de los 30
minutos para los controles y de 10 minutos para el TLC y los dos estudios con hierro
(figura37).
Tras el anlisis conjunto de los cuatro estudios cinticos, se decidi utilizar un
tiempo de incubacin de dos horas para las siguientes fases experimentales de esta
investigacin, dado que ste fue el tiempo en el que se detectaron los mayores
cambiossignificativos.
CINTICASDECONCENTRACIN
EnprimerlugarseestudiaronlosefectosdelTLCenconcentracionesde0,001
0,01 0,1 0,3 1 y 3 mM para valorar su capacidad de generar dao oxidativo. A
continuacin se estudiaron sus efectos, en presencia de cloruro frrico y cido
ascrbico.Latabla7recogelasconcentracionesdeMDA+4HDAyderestoscarbonilo
obtenidas.
Las figuras 38 y 39 ilustran los efectos del TLC sobre la oxidacin lipdica y
proteica respectivamente en los homogeneizados hepticos. Todas las
concentraciones de TLC aumentaron significativamente tanto los niveles de MDA+4
HDA como la carbonilacin proteica, lo que sugiere que incluso a pequeas
113
Resultados
concentraciones como 0,001 mM ya se produce lesin oxidativa en los
homogeneizados,indicandoqueestasmuestrassonmuysensiblesalTLC.
Por el contrario, en las membranas, el dao oxidativo a lpidos y protenas al
aadirTLCaumentdeformaconcentracindependiente,observndoseunaumento
significativo de MDA + 4HDA y de la carbonilacin proteica, desde concentraciones
igualesosuperioresa0,3mMdeTLC(figuras40y41).
Tabla 7. Efecto del cido taurolitoclico (TLC) en la formacin de MDA+4HDA y restos carbonilo en
homogeneizadosymembranasdehgado.Losvaloressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservaciones
independientes,p0,05vscontrol(*)ovscontrol+(#).
Fe
2+
TLC
(mM)
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
A
u
s
e
n
c
i
a
Control 0,440,04 3,590,52 0,920,49 5,422,69

0,001 0,760,03
(*)
9,171,23
(*)
1,480,81 9,061,15
0,01 0,650,06
(*)
10,010,63
(*)
1,850,66 10,011,00
0,1 0,690,05
(*)
10,111,07
(*)
2,740,65 10,161,32
0,3 0,600,03
(*)
9,980,47
(*)
3,670,44
(*)
11,581,87
(*)
1 0,780,03
(*)
9,660,29
(*)
4,240,39
(*)
14,913,41
(*)
3 0,820,04
(*)
10,320,84
(*)
4,940,86
(*)
17,104,40
(*)
P
r
e
s
e
n
c
i
a
Control+ 0,510,04
(*)
7,150,98
(*)
35,383,81
(*)
17,981,75
(*)
0,001+ 0,520,06
(*)
6,910,85
(*)
38,204,17
(*,#)
24,083,70
(*,#)
0,01+ 0,540,05
(*)
7,610,77
(*)
38,614,24
(*,#)
26,522,60
(*,#)
0,1+ 0,530,06
(*)
7,240,66
(*)
40,473,96
(*,#)
32,372,23
(*,#)
0,3+ 0,760,13
(*)
7,920,80
(*)
44,574,60
(*,#)
35,490,89
(*,#)
1+ 0,990,19
(*,#)
6,700,83
(*)
49,305,39
(*,#)
39,322,48
(*,#)
3+ 1,820,33
(*,#)
8,160,42
(*)
46,105,50
(*,#)
42,083,09
(*,#)
114

Figura 38. El cido taurolitoclico (TLC) aument la peroxidacin lipdica en homogeneizados de hgado. La
incubacin se realiz a 37C durante 2h. Los valores son la media error estndar de al menos seis observaciones
independientes,*:p0,05vscontrol.

Figura 39.Elcidotaurolitoclico(TLC)modificlaformacinrestoscarboniloenhomogeneizadosdehgado.Los
valoressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientes,*:p0,05vscontrol.
115
Resultados
Figura 40. Efecto concentracin dependiente del cido taurolitoclico (TLC) de la formacin de MDA+4HDA en
membranasdehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante2h.Losvaloressonlamediaerrorestndardeal
menosseisobservacionesindependientes,*:p0,05vscontrol.
Figura 41. Respuesta concentracin dependiente del cido taurolitoclico (TLC) en la carbonilacin proteica en
membranas aisladas de hgado. Los valores son la media error estndar de al menos seis observaciones
independientes,*:p0,05vscontrol.
116
La incubacin de homogeneizados y membranas hepticas con FeCl
3
y cido
ascrbico, provoc un aumento significativo de las concentraciones deMDA+4HDA y
derestoscarbonilo,loqueindiclapresenciadeperoxidacinlipdicayproteicaenel
hgado (tabla 7 y figuras 39 a 45). Los radicales OH y ROO generados in vitro por la
reaccindeFentonincrementaronun16%yun3.746%laperoxidacinlipdicadelos
homogeneizadosydelasmembranasrespectivamente(figuras42y44).Enelcasode
lasprotenas,laoxidacinseaumentenun99%yun232%respectivamente(figuras
43y45).
LaadicindeTLCaloshomogeneizadosaconcentracionesigualesomayoresa
1mM, potenci significativamente la peroxidacin lipdica respecto a la obtenida solo
en presencia del sistema Fenton (figura 42). Esta respuesta fue dependiente de la
concentracin de TLC. Por el contrario, ninguna de sus concentraciones modific
significativamente la oxidacin proteica que haba inducido el FeCl
3
y cido ascrbico
(figura43).
En las membranas celulares aisladas del tejido heptico, el TLC potenci de
forma significativa tanto la peroxidacin lipdica (figura 44) como la carbonilacin de
lasprotenas(figura45)desdesuconcentracinmspequea,0,001mMdeTLC.
Considerandotodosestosresultadosdeformaglobal,sedecidimanteneruna
concentracin1mMdeTLCpararealizarlaltimafaseexperimentalconmelatonina.
117
Resultados
Figura42.Efectosdelcidotaurolitoclico(TLC)enlaformacindeMDA+4HDAenhomogeneizadosdehgado.La
incubacin se realiz a 37C durante 2 con TLC (0,001 3 mM), en ausencia o presencia de FeCl
3
0,1 mM y cido
ascrbico0,1mM.Losvaloressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientes,p0,05
vscontrol(*)ovscontrol+(#).
Figura 43. Cintica de concentracin de cido taurolitoclico (TLC) para la formacin de restos carbonilo en
homogeneizados de hgado. La incubacin se realiz a 37C durante 2h con TLC (0,001 3 mM), en ausencia o
presencia de FeCl
3
0,1 mM y cido ascrbico 0,1 mM. Los valores son la media error estndar de al menos seis
observacionesindependientes,p0,05vscontrol(*)ovscontrol+(#).
118
Figura44.ElTLCpotencilaperoxidacinlipdicaenmembranasdehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante
2h con TLC (0,001 3 mM), ausencia o presencia de FeCl
3
0,1 mM y cido ascrbico 0,1 mM. Los valores son la
mediaerrorestndardealmenosseisobservaciones,p0,05vscontrol(*)ovscontrol+(#).
Figura 45. Efecto del cido taurolitoclico (TLC) en la oxidacin de las protenas de las membranas de hgado. La
incubacinserealiza37Cdurante2hconTLC(0,0013mM),enausenciao presenciadeFeCl
3
0,1mMycido
vscontrol(*)ovscontrol+(#).
119
Resultados
VALORACINDELAACTIVIDADANTIOXIDANTE
DELAMELATONINA
Enesteapartadosehanevaluadolosefectosantioxidantesdelamelatoninaen
unrangodeconcentracionesde0,1a5mM.Delosochomodelosutilizadosenlafase
experimental anterior, se han utilizado todos con la excepcin de la oxidacin de
protenas en homogeneizados hepticos en presencia de FeCl
3
y cido ascrbico, ya
que la adicin de TLC incluso hasta concentraciones de 3mM, no indujo cambios
significativos en relacin a los niveles de carbonilacin proteica respecto a los
obtenidossloporFeCl
3
ycidoascrbico(figura43).LasconcentracionesdeMDA+4
HDAyderestoscarboniloobtenidasenloshomogeneizadosymembranasseresumen
enlatabla8.
Tabla 8. Efecto protector de la melatonina (aMT) en la oxidacin de lpidos y protenas inducida por cido
taurolitoclico(TLC)1mM,enausenciaypresenciadeFeCl
3
0,1mMycidoascrbico0,1mMenhomogeneizadosy
membranas aisladas de hgado. Los valores son las medias errores estndares. n=6, p 0,05 vs control (*), vs
control+(#),vsTLC()ovsTLC+().
Fe
2+
TUBO
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
MDA+4HDA
(nmol/mgprotena)
RestosCarbonilo
(nmol/mgprotena)
A
u
s
e
n
c
i
a
Control 0,270,04 3,470,27 0,350,18 6,661,62

TLC 0,600,07
(*)
8,350,59
(*)
5,360,58
(*)
10,942,45
(*)
aMT0,1 0,540,04
(*)
8,050,41
(*)
5,650,51
(*)
9,141,12
(*)
aMT0,5 0,520,02
(*)
7,270,38
(*)
5,860,30
(*)
7,840,73
aMT1 0,510,04 7,700,32
(*)
5,440,68
(*)
6,270,96
aMT2 0,540,03
(*)
7,560,29
(*)
5,030,42
(*)
6,620,98
aMT3 0,460,03
(*,)
7,580,72
(*)
4,990,44
(*)
6,430,93
aMT5 0,440,02
()
6,700,74
(*)
4,460,52
(*,
)
5,881,55
()
P
r
e
s
e
n
c
i
a
Control+ 0,440,04
(*)
39,985,88
(*)
18,144,16
(*)
TLC+ 0,820,14
(*,#)
52,066,04
(*,#)
43,714,67
(*,#)
aMT+0,1 0,850,21
(*,#)
48,325,09
(*,#,)
47,535,11
(*,#)
aMT+0,5 0,490,06
(*,#,)
41,944,94
(*,)
30,473,15
(*,#,)
aMT+1 0,390,05
(*,)
27,278,65
(*,)
20,304,15
(*,)
aMT+2 0,380,06
(*,)
10,746,32
(*,#,)
9,952,29
(#,)
aMT+3 0,350,06
()
3,881,44
(*,#,)
6,150,83
(#,)
aMT+5 0,330,05
(#,)
2,020,52
(*,#,)
2,71,94
(#,)
120
La figura 46 ilustra los efectos de la adicin de melatonina en la oxidacin
lipdica causada por el TLC 1 mM en homogeneizados hepticos. En esta grfica se
muestra que la melatonina tuvo un comportamiento antioxidante a concentraciones
superiores a 2 mM, ya que 3 mM y 5 mM redujeron significativamente las
concentracionesdeMDA+4HDAenun42%yun51%conrespectoalasdeTLC1mM.
A partir de estos datos pudimos calcular grficamente que la concentracin de
melatonina necesaria para prevenir el 50% de la oxidacin lipdica en los
homogeneizados, IC
50
, fue 4,73 mM. Respecto al modelo de la carbonilacin proteica
causadoporelTLC1mM,aunquelamelatoninaredujolaoxidacin,losresultadosno
fueronestadsticamentesignificativos(figura47).
En membranas aisladas del tejido heptico se obtuvieron resultados muy
discretos en la preservacin de la toxicidad oxidativa del TLC. Tan solo melatonina 5
mMredujoun18%lasconcentracionesdeMDA+4HDAobtenidastraslaincubacin
con TLC 1 mM (figura 48). Una mayor actividad antioxidante de la melatonina se
observ frente a la oxidacin de protenas, ya que los niveles de carbonilacin del
control se incrementaron significativamente con la exposicin a TLC 1 mM, sin
embargo,fueronsimilaresalosdetectadosenaquellasmuestrasqueademsdelcido
biliar recibieron un cotratamiento con melatonina a concentraciones iguales o
superiores a 0,5 mM (figura 49). De esta ltima representacin grfica puede
deducirse que, bajo nuestras condiciones experimentales, la IC
50
de melatonina para
reducir la oxidacin de las protenas de las membranas inducida por el TLC 1 mM fue
detansolo0,15mM.
121
Resultados
Figura 46. Efecto protector de la melatonina (aMT) en la oxidacin de lpidos inducida por cido taurolitoclico en
homogeneizadosdehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante2h.Losvaloressonlamediaerrorestndarde
almenosseisobservaciones,p0,05vscontrol(*)ovsTLC1mM().
Figura 47. Efecto de la melatonina (aMT) en la oxidacin de protenas inducida por cido taurolitoclico en
homogeneizadosdehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante2h.Losvaloressonlamediaerrorestndarde
almenosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*).
122
Figura 48. Cintica de la melatonina (aMT) en la oxidacin de lpidos inducida por cido taurolitoclico 1mM en
membranasdehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante2h.Losvaloressonlamediaerrorestndardeal
menosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*)ovsTLC1mM().
Figura 49.Lamelatonina (aMT)reducelaoxidacindeprotenasinducidaporcidotaurolitoclicoenmembranas

dehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante2hcondiferentesconcentracionesdemelatonina.Losvaloresson
lamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientes,p0,05vscontrol(*)ovsTLC1mM().
123
Resultados
LaoxidacinlipdicainducidaporFeCl
3
ycidoascrbico,ypotenciadaporTLC
1 mM tambin fue reducida significativamente por la adicin de melatonina tanto en
homogeneizadoscomoenmembranas,deunaformadirectamentedependientedela
concentracin(tabla8).
En homogeneizados, la oxidacin lipdica inducida por FeCl
3
y cido ascrbico,
fue casi el doble que el control basal (figura 50). Dicha oxidacin se potenci en
presenciadeTLC,obteniendonivelesdeoxidacintresvecessuperioresalcontrol.En
presencia de bajasconcentracionesde melatonina (0,5 mM), los valores de MDA+4
HDAcayerondrsticamenteyseobservunareduccinsignificativaconrespectoalos
homogeneizadostratadosconTLCenpresenciadehierro.Enloshomogeneizadoscon
TLCyhierrotratadosconconcentracionesigualesosuperioresa1mMdemelatonina,
los niveles de LPO caen por debajo de la mitadde los valores de los homogeneizados
con TLC y hierro, recuperndose a concentraciones iguales o superiores a 3 mM de
melatonina, hasta los valores basales de LPO en ausencia tanto de TLC como de
hierro. La IC
50
de la melatonina para inhibir la formacin de MDA+4HDA en
homogeneizados hepticos en presencia de TLC 1mM, FeCl
3
y cido ascrbico fue de
0,40mM.Porltimo,enlasmembranas,laoxidacinlipdicainducidaporFeCl
3
ycido
ascrbico fue 40 veces superior al control (figura 51). Dicha oxidacin se potenci en
presencia de TLC, obteniendo niveles de oxidacin ms de 50 veces superiores al
control. Desde la concentracin de melatonina ms baja estudiada (0,1 mM) se
observ una reduccin significativa de la LPO con respecto a las membranas tratadas
con TLC en presencia de hierro y ascrbico. Los niveles de MDA + 4HDA en las
membranas con TLC y hierro tratadas con concentraciones de 0,5 a 1 mM de
melatonina son similares a los controles positivos de peroxidacin lipdica. El
tratamientoconmelatonina5mM enmembranascon TLCyhierroferroso,consigui
valores de LPO ms de 25 veces inferiores a los observados en la muestras tratadas
con TLC y hierro ferroso (tabla 8), observndose tendencia de recuperacin a los
niveles basales, aunque se mantienen diferencias significativas con respecto a los
niveles control en ausencia de TLC y hierro ferroso. La IC
50
de la melatonina en la
inhibicin de la formacin de MDA+4HDA en membranas hepticas en presencia de
TLC1mM,FeCl
3
ycidoascrbicofuede1,06mM.
124
Figura 50. Efecto de melatonina (aMT) en la oxidacin de lpidos potenciada por cido taurolitoclico (TLC) en
homogeneizados de hgado. La incubacin se realiz, en ausencia o presencia de TLC 1mM, FeCl
3
0,1 mM y cido
vscontrol(*),vscontrol+(#),ovsTLC1mM().
Figura51.Melatonina(aMT)redujolaoxidacindelpidospotenciadaporcidotaurolitoclico(TLC)enmembranas
dehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante2h,enausenciaopresenciadeTLC1mM,FeCl
3
0,1mMycido
ascrbico0,1mM.Losvaloressonlamediaerrorestndardealmenosseisobservacionesindependientesp0,05
vscontrol(*),vscontrol+(#),ovsTLC1mM().
125
Resultados
En la carbonilacin proteica de las membranas, se observ que el dao
oxidativo inducido por FeCl
3
y cido ascrbico fue 3 veces superior al control basal
(figura 52). Dicha oxidacin se potenci en presencia de TLC 1 mM, incrementado la
carbonilacinproteicahastamsde5vecesqueelcontrol.Laoxidacindeprotenas
inducidaporFeCl
3
ycidoascrbicoypotenciadaporTLCenmembranastambinfue
reducidasignificativamenteporlaadicindeconcentracionesdemelatoninaigualeso
superiores a 0,5 mM. Los niveles de restos carbonilo en las membranas con TLC y
hierro ferroso tratadas con 1 mM de melatonina son similares al control positivo.
Concentraciones de melatonina iguales o superiores a 2 mM presentaron niveles de
oxidacin de protenas significativamente inferiores al control positivo y recuperaron
losnivelesdecarbonilacinproteicabasalesyaquenoseobservandiferenciasconlos
controles.Eltratamientoconmelatonina5mMalasmembranascon1mMTLCy0,1
mM hierro ferroso, consigui valores de carbonilacin proteica ms de 15 veces
menores que los observados en las membranas con TLC 1 mM, hierro y cido
ascrbico.LaIC
50
delamelatoninaenlainhibicindelaformacinderestoscarbonilo
enmembranashepticasenpresenciadeTLC,FeCl
3
ycidoascrbicofue0,79mM.
126
Figura 52. Cintica de concentraciones de melatonina (aMT) en la oxidacin de protenas potenciada por cido
taurolitoclicoenmembranasdehgado.Laincubacinserealiza37Cdurante2h,enausenciaopresenciadeTLC
1mM, FeCl
3
0,1 mM y cido ascrbico 0,1 mM. Los valores son la media error estndar de al menos seis
observacionesindependientesp0,05vscontrol(*),vscontrol+(#),ovsTLC1mM().
Finalmente para facilitar la comparacin global de los resultados de este

estudio, incluimos una tabla con las concentraciones IC
50
obtenidas para melatonina
previniendoeldaooxidativoalpidosoprotenasyenhomogeneizadosomembranas
celularesaisladasdelhgado(tabla9).
Tabla 9. Concentraciones de melatonina necesarias para inhibir el 50% del dao oxidativo (IC
50
) debido a la
presencia de cido taurolitoclico 1mM, en ausencia y presencia de FeCl
3
0,1 mM y cido ascrbico 0,1 mM en
homogeneizadosymembranasdehgado.
Fe
2+
IC
50
(mM)
MDA+4HDA RestosCarbonilo MDA+4HDA RestosCarbonilo
Ausencia 4,73 >5 >5 0,15
Presencia 0,40 1,06 0,79
DISCUSIN
129
Discusin
Los desrdenes hepticos colestticos son un grupo heterogneo de
enfermedades que cursan con una alteracin del flujo biliar. Entre otras y a modo de
ejemplolaatresiabiliar,lacirrosisbiliarprimaria,lacolangitisesclerosanteprimariay
todaslastumoracionesqueensucrecimientoocluyanlasvasbiliarespuedengenerar
colestasis. El tratamiento debe ser fundamentalmente etiolgico y en numerosas
ocasiones,estapatologaesresponsabledequedebarecurrirsealtrasplanteheptico
enunelevadoporcentajedepacientes[Starzl,1989;WhitingtonyBalistreri,1991].
La alteracin del flujo biliar puede deberse a un defecto funcional en la
formacindelabilisaniveldelhepatocito,colestasisintraheptica,oaunaalteracin
de la secrecin o el transporte de la bilis a nivel del rbol biliar, colestasis
extraheptica. Anatomopatolgicamente es obvio que en las dos modalidades de
colestasis y de forma invariable se produce lesin hepatocelular y que sta, al menos
enparte,debeproducirseporlaacumulacindealgunodeloscomponentesdelabilis.
A pesar de que no se conoce completamente su fisiopatologa, se considera que el
principal hecho funcional responsable de la hepatotoxicidad celular durante la
colestasis,eslaacumulacindecidosbiliaresenelhgado[Greimycols.,1973;Attiliy
cols.,1986;Schmucklerycols.,1990;Heumanycols.,1991;Fischerycols.,1996;Bove,
2000]. Es evidente que para poder aplicar con xito teraputico un tratamiento en la
colestasis se requiere entender los mecanismos moleculares y celulares que se
desencadenanenesteprocesopatolgico.
Aunque las teoras fisiopatolgicas que implican a los cidos biliares en la
colestasis son muy numerosas, bsicamente podemos agruparlas en dos grandes
categorasquenosonexcluyentes:laprimeraenlaqueeldaohepticoestmediado
porlaaccindetergentedelassalesbiliaresylasegundaporsuaccinprooxidante.
Por su estructura qumica y en el rango de concentraciones fisiolgicas, los
cidos biliares desempean una importante funcin detergente que facilita la
absorcin intestinal de lpidos. Estas molculas aunque carecen de actividad
enzimtica, no son protenas sino derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno,
emulsionan las grasas ingeridas en la dieta en una suspensin de gotas de pequeo
tamaoenelmedioacuosointegradoporloslquidosingeridos,losjugosdigestivosy
130
la propia bilis. Generar esta emulsin lipdica favorecer la accin posterior de las
lipasas pancretica e intestinal. Sin embargo, si las concentraciones intracelulares de
sales biliares se elevan, hecho propio de la colestasis, su accin detergente puede
concentrarseenlasbicapaslipdicasdelasmembranascelulares,unasestructurasque
estnintegradasmayoritariamenteporfosfolpidosunidosentrescasiexclusivamente
por enlaces electrostticos dbiles. Aunque esta accin detergente directa que
provoca la disrupcin de la membrana sea posible [Billington y cols., 1980], su
contribucin fisiopatolgica relativa durante la colestasis es muy discutida, ya que se
requieren concentraciones intracelulares de sales biliares muy elevadas para que la
repercusin funcional sea realmente significativa [Fischer y cols., 1996]. Sin embargo,
estambinprobablequeactendeformamsfocalizadasobreelanillodelpidosque
rodea a las protenas de la membrana, pudiendo modificarlas, activarlas e inhibirlas,
como sucede con la fosfolipasa A
2
que libera cido araquidnico y ste a su vez, a
travs de las enzimas ciclooxigenasa y lipoxigenasa, reduce parcialmente el oxgeno
molecular liberando EROs y formando prostaglandinas y leucotrienos [DeRubertis y
cols., 1984; Craven y cols., 1986; 1987; Booth y cols., 1997]. Del mismo modo los
cidos biliares pueden activar a la fosfolipasa C que forma inositoltrifosfato [Chung y
cols.,1985;Nakanishiycols.,1990]ysteliberaCa
2+
desdeelretculoendoplsmicoal
espacio intracelular, lo que terminar activando la eNOS Ca
2+
/calmodulina
dependiente[Schmidtycols.,1992].
El segundo grupo de teoras sobre la fisiopatologa de los cidos biliares, los
involucraenlaproduccindedaooxidativoynitrosativomediadoporradicaleslibres
[Dahmycols., 1988;Sokolycols., 1991;2001].Laacumulacindeestoscidosaltera
procesos tan esenciales para la clula como la produccin de energa por la
mitocondria, aumentando la formacin de ms EROs que son capaces de oxidar
lpidos, protenas y cidos nucleicos deteriorando de esta forma la funcin celular
[Sokolycols.,1991;1993;Krahenbuhlycols.,1994;Sokolycols.,1995;1998b;2001].
Enlaactualidadsehadescritoqueloscidosbiliarespuedeninducirdaooxidativoin
vitro en hepatocitos aislados [Sokol y cols., 1993; 1995], cultivos primarios de
hepatocitos [Rodrigues y cols., 1998a], homogeneizados hepticos [Sokol y cols.,
1998b] y en mitocondrias hepticas [Sokol y cols., 1993; 1995; Rodrigues y cols.,
131
Discusin
1998b].Tambinlaadministracinintravenosadecidosbiliares[Sokolycols.,1998a]
y la ligadura del conducto biliar inducen dao oxidativo in vivo [Sokol y cols., 1991;
Singh y cols., 1992; Krahenbuhl y cols., 1995; Panozzo y cols., 1995; Parola y cols.,
1996; Alptekin y cols., 1997; GonzlezCorrea y cols., 1997; Tsai y cols., 1997; Sokol y
cols.,1998b;Tsaiycols.,1998;Orellanaycols.,2000].Esnecesariosealarquesibien
en la colestasis se observa una acumulacin de cidos biliares, tambin sucede a la
inversa ya que la perfusin intravenosa de cidos biliares es capaz de reducir el flujo
biliarygenerarunprocesocolesttico[Sokolycols.,1998a].
Lamitocondria,principallugardeformacinderadicaleslibresenlaclula,yel
retculo endoplsmico, son dos de las organelas ms afectadas por la acumulacin
intracelular de cidos biliares durante la colestasis [Krahenbuhl y cols., 1994; Sokol y
cols., 1995; 1998a; Yerushalmi y cols., 2001; WashoStultz y cols., 2002; Crowley
Weber y cols., 2003; Rolo y cols., 2003]. Durante la colestasis los cidos biliares se
acumulanintracelularmenteeinterfierenconeltransportemitocondrialdeelectrones,
reduciendolasntesisdeATP,inhibiendoelestado3delarespiracinyreduciendola
actividaddeloscomplejosIyIIdelacadenaderespiracinmitocondrial[Krahenbuhly
cols., 1994]. La alteracin del flujo de electrones conduce a los complejos I y III a
generarcantidadesconsiderablesdeaninsuperxido.[GarcaRuizycols.,1995].Los
cidos biliares por tanto, aceleran la generacin de O
2
a estos niveles, desbordando

lasdefensasantioxidantesmitocondriales.ElO
2
formadoenexcesoenlamitocondria
es reducido a H
2
O
2
por la SOD y ste puede salir de la mitocondria y acceder a otros
compartimientos celulares donde o bien ser txico o bien reducirse a H
2
O por el
glutatinoloqueesmuchopeor,puedereaccionarconhierroocobreygenerarOH,
elradicallibremstxicoqueseconoceporsereldevidamediamscorta.Poreso,
los niveles mitocondriales de glutatin descienden durante la colestasis lo que limita
esta va defensiva antioxidante [Sokol y cols., 1998a]. El glutatin reducido es el
sustrato de enzimas antioxidantes esenciales para el mantenimiento del equilibrio
oxidativo, la homeostasis oxidativa, y adems por su elevada concentracin
intracelularseleconsideraunantioxidanteclave.Estudiosrecientesdescribenqueen
ratas con obstruccin biliar quirrgica hay una disminucin tanto en el glutatin
reducidodeltejidohepticocomoenelplasmtico[Montillaycols.,2001].Inclusoen
132
estemismomodeloquirrgicosehanobservadodeficienciasenelsistemaenzimtico
antioxidante de otros territorios extrahepticos como el rin, donde se describieron
descensosenlasactividadesdelaglutatinreductasa,GPx,glutatintransferasa,SOD
y de la CAT [Cruz y cols., 2001], y el estmago y muy posiblemente esta minusvala
antioxidante puede contribuir a explicar por qu la mucosa gstrica de animales con
colestasisseulceraconmayorfacilidadenpresenciadediversosagentesfacilitadores
delalesin[Dehpourycols.,1999;Ekbladycols.,2000;Zeuzem,2000].
Otras causas por las que los cidos biliares inducen lesin oxidativa son: 1) la
generacin endgena de cido araquidnico [Cocco y cols., 1999]; 2) la activacin del
receptordemuerteFas,quecortaatravsdelacaspasa8laprotenaproapopttica
Bid,yelBidtruncadoseinsertaenlamitocondriacausandouncambioconformacional
en la protena proapopttica BAK que permite la permeabilizacin de la membrana
externaylaliberacindecitocromoC[Faubionycols.,1999;Higuchiycols.,2001];3)
el aumento de la liberacin de calcio a nivel del retculo endoplsmico mediante la
protenaBAK;4)ladisminucindelosnivelesdeNAD
+
.
Adems de la implicacin mitocondrial en la gnesis de la lesin oxidativa
mediada por cidos biliares, se ha descrito que stos pueden activar varias isoformas
de las NADPH oxidasas [Lambeth, 2002], un enzima complejo con varias subunidades
localizadas en el citosol y en la membrana que genera O
2
y que en el hgado se
encuentran en muchas extirpes celulares, como en las clulas de Kupffer [Ljubuncic y
cols.,1996],enloshepatocitos[Reinehrycols.,2005]einclusoenlosneutrfilosque
alcanzaneltejidohepticocomoconsecuenciadelalesininflamatoriamediadaporla
colestasis inducida por la ligadura del conducto biliar [Parola y cols., 1996; Casini y
cols.,1997;Zimmermanycols.,1997].
Los cidos biliares a concentraciones bajas (25100 M) inducen apoptosis en
cultivosdehepatocitosderata[Patelycols.,1994],hepatocitosaislados[Gumprichty
cols.,2000;Yerushalmiycols.,2001]yenlneascelulareshepticasexpuestasacidos
biliares hidrofbicos [Jones y cols., 1997; Rodrigues y cols., 1998a; Faubion y cols.,
1999; Rust y cols., 2000; Reinehry cols., 2005]. Tambin inducen apoptosis invivo en
el hgado de ratas alimentadas con dietas ricas en cidos biliares hidrofbicos
133
Discusin
[Rodriguesycols.,1998b],osistassonperfundidasconcidosbiliares[Chiecoycols.,
1997;Sokolycols.,1998a],osiselespracticalaligaduradelconductobiliar[Miyoshiy
cols.,1999;Grafycols.,2002].Concentracionesmayoresdecidosbiliares(5001000
M)producenmuertecelularpornecrosisenhepatocitosaisladosycultivosprimarios
de hepatocitos [Galle y cols., 1990; Patel y cols., 1994; Sokol y cols., 1995]. Se
considera que ambas formas de muerte celular inducida por cidos biliares, son
importantes en la patognesis de los desrdenes colestticos hepticos mediante la
generacin de dao oxidativo [Sokol y cols., 1995; 2001]. Se cree que el mecanismo
porelqueloscidosbiliareshidrofbicosinducenapoptosistantoinvivocomoinvitro
se debe principalmente a la activacin de los receptores de muerte Fas [Faubion y
cols.,1999;Miyoshiycols.,1999;Sodemanycols.,2000;Takikawaycols.,2001;Grafy
cols., 2002]. Los cidos biliares proapotticos activan la NADPH oxidasa produciendo
un estrs oxidativo que desencadena la fosforilacin de las quinasas cJunNterminal
(JNK) [Leppa y Bohmann, 1999] y el miembro Yes de la familia de las Src quinasas
[Reinehr y cols., 2004], activando a los receptores de muerte Fas y conduciendo a la
apoptosis.
En el mecanismo propuesto de apoptosis inducida por cidos biliares, la
produccindeEROsserainicialmenteatravsdelaactivacindelaNADPHoxidasay
posteriormentelamitocondriaactuaradeamplificadordelasealdeestrsoxidativo.
Algunos estudios sobre la apoptosis y/o necrosis inducida por cidos biliares se han
centrado en la permeabilidad transitoria mitocondrial (MPT) como un evento crtico
previo a la muerte celular [Botla y cols., 1995; Gores y cols., 1998; Rodrigues y cols.,
1998a;Yerushalmiycols.,2001].LaMPTesunrpidoaumentoenlapermeabilidadde
la membrana mitocondrial causado por la apertura de un megacanal, el poro de
permeabilidad transitoria mitocondrial, que atraviesa las membranas mitocondriales
internayexterna[Pastorinoycols.,1993;Crompton,1999].Cuandoseactivaelporo,
se produce el hinchamiento mitocondrial, la prdida del potencial electroqumico a
travs de su membrana, la reduccin de la fosforilacin oxidativa, la generacin de
EROs [Lemasters y cols., 1998] y la ruptura de la membrana mitocondrial externa,
permitiendo que diversas protenas del espacio intermembranoso sean liberadas al
citosol, incluyendo la seal proapopttica citocromo C y diversos inhibidores de la
134
apoptosis [Ott y cols., 2002]. Particularmente interesantes son los hallazgos que
correlacionanunaumentoenlageneracindeEROsconlainduccindelaMPTporlos
cidos biliares [Patel y Gores, 1997; 1998b; Rodrigues y cols., 1998a; Sokol y cols.,
2001; Yerushalmi y cols., 2001; Sokol y cols., 2005], probablemente a travs de la
modificacinoxidativadelasprotenasdelporodeMPT.
Rodriguesycols.observaronqueelefectocitoprotectordelUDA,uncidobiliar
hidroflico, probablemente se debe a su capacidad para inhibir la MPT [1998b;
Rodrigues y cols., 1998a]. Otros frmacos, los 21aminosteroides o lazaroides, que
estn diseados para localizarse en el interior de las membranas celulares y actuar
depurando EROs, tienen una potente capacidad de inhibir la peroxidacin lipdica y
han sido capaces de proteger frente a la apoptosis inducida por cido
glicoquenodesoxiclico en cultivos de hepatocito de rata, sugiriendo una estrecha
relacin entre estrs oxidativo y apoptosis en la toxicidad inducida por cidos biliares
[Patel y Gores, 1997]. Tambin Yersuhalmi y cols. [2001] demostraron que bajas
concentraciones de cido glicoquenodesoxiclico son capaces de estimular la
produccin de EROs en 1530 minutos en hepatocitos aislados y en 1 hora de
desencadenar la permeabilidad de transicin mitocondrial que es seguida en unas
horas por una significativa apoptosis hepatocelular. Tambin estudiaron cmo los
antioxidantessoncapacesdeinhibirtantolaapoptosiscomolainduccindelaMPTen
estemodelo,hechoquesugierequeelestrsoxidativodentrodelhepatocitodebede
serunasealnecesariaenlainduccindelaMPT,queprecedeyesrequeridaparala
cascada de eventos que conducen a la apoptosis inducida por cidos biliares
[RodriguesySteer,2000].
Se cree que la induccin de la MPT perseaumenta la produccin de EROs en la
cadenarespiratoriaatravsdelaliberacindelcitocromo Cmitocondrial[Zamzami y
cols.,1995],loquealteraralatransferenciadeelectronesdelcomplejoIIIalcomplejo
IV. La alteracin resultante podra tener el mismo efecto que la inhibicin directa del
complejoIIIporloscidosbiliares[Krahenbuhlycols.,1994]yconduciralcomplejoIII
a generar cantidades considerables de anin superxido. El aumento de las EROs
puede causar de nuevo la modificacin por oxidacin de las protenas del poro de
135
Discusin
MPT, causando mayor MPT con la consiguiente liberacin del citocromo C de la
mitocondria [Lemasters y cols., 1998]. As, se forma un bucle autoamplificado de
eventos en la mitocondria, inicialmente estimulada por estrs oxidativo de los cidos
biliares o por liberacin del citocromo C, que puede perpetuar, y magnificar el estrs
oxidativo intracelular [Yerushalmi y cols., 2001]. Estos mismos autores han propuesto
queelestrsoxidativoagudoestimulalaMPTenmayorproporcinenlamitocondria
limitandolasntesisdeATPylasfuncionesdelasbombascatinicasATPdependientes
de la membrana plasmtica produciendo alteraciones de la homeostasis del calcio,
activacin de las proteasas celulares, y alteraciones de la membrana que en
combinacinconelfalloenergticomitocondrialculminanenlanecrosishepatocelular
[Yerushalmi y cols., 2001]. Los agentes qumicos que bloquean la MPT disminuyen la
necrosishepatocelularinducidaporcidosbiliares[Sokolycols.,2001].
Finalmente,otrafuenteimportantedeEROsgeneradasporloscidosbiliareses
lamicrofloradelaluzintestinal.Lascepasbacterianasquetoleranlabilis,sintetizany
utilizan menaquinonas y vitamina K
1
como un cofactor en la deshidrogenacin de los
sustratosdeloscidosbiliaresparaformarvitaminasKreducidas[Valkoycols.,2001].
SecreequeestasvitaminasKreducidaspuedentransportarsealinteriordelasclulas
de la mucosa colnica en forma de micelas donde iniciaran reacciones de oxido
reduccinquegeneranO
2
[Valkoycols.,2001].
A la hora de plantear nuestro estudio fue necesario tomar una serie de
decisiones importantes para la consecucin de los objetivos. En primer lugar tuvimos
que decidir el tipo de muestra utilizada: el homogeneizado y la membrana celular
purificada,enamboscasosprocedentesdeltejidoheptico.Bajonuestrascondiciones
experimentales,loscidosbiliaresprodujeronelevacionesdelosindicadoresdelesin
oxidativa mucho mayores en membranas aisladas que en homogeneizados. Las
muestras de homogeneizados conservan todos los componentes celulares incluyendo
los niveles endgenos de antioxidantes del tejido heptico. Por el contrario las
membranaspurificadasensuprocesodeaislamientodelrestodeorganelassufrieron
varioslavadoscontampn,porloquesereducealamnimaexpresinlainterferencia
de los antioxidantes endgenos, lo que podra explicar su mayor susceptibilidad a la
136
lesin oxidativa. Otra ventaja adicional de las membranas es que con ellas
simplificamoslacomposicindelasmuestras,yaquelasmembranasentornoal90%
estn formadas por lpidos y protenas. En el caso de los homogeneizados estn
presentestodaslasbiomolculas.
Laeleccindelosindicadoresdelesinoxidativavinomarcadaporsuutilizacin
enlabibliografacientfica.Paravalorarlalesinoxidativaenloslpidoselmtodoms
utilizado, casi de forma unnime, es la cuantificacin del MDA, un fragmento final de
losrestosacilosdelosfosfolpidos[Halliwell,1991].Sehademostradoqueenratasa
las que se les practic la ligadura del conducto biliar se observ un incremento de la
peroxidacin lipdica y que sta est involucrada en el desarrollo del dao del tejido
heptico[Singhycols.,1992;Krahenbuhlycols.,1995;Panozzoycols.,1995;Parolay
cols., 1996; Alptekin y cols., 1997; Tsai y cols., 1997; 1998; Orellana y cols., 2000].
Ademslaobstruccinbiliareslaresponsablelaaparicindelesionesoxidativasenlos
lpidos de otras localizaciones extrahepticas como el rin, el intestino, el corazn e
incluso cruza barreras protectoras como la hematoenceflica alcanzando el tejido
cerebral[Ljubuncicycols.,2000;Montillaycols.,2001;Assimakopoulosycols., 2006;
Cruz y cols., 2007], lo que sugiere que la lesin oxidativa que inicialmente estaba
confinadaalhgadoderivaensistmica.
As, las concentracionesde MDA enel tejido renal aumentan en los modelos de
colestasis[Tajiriycols.,1995;Ljubuncicycols.,2000;Cruzycols.,2001]ysecreeque
elestrsoxidativopuededesempearunpapelesencialenladisfuncinrenalasociada
a la ictericia obstructiva, posiblemente por una accin indirecta a travs de la
formacindevariosmediadoresvasoactivosquepuedenmodificarlamicrocirculacin
glomerular[Bomzonycols.,1997].Anivelintestinal,laacumulacindecidosbiliares
altera la circulacin enteroheptica [Ljubuncic y cols., 2000], hecho que se ha
propuesto puede explicarse por su capacidad para unirse a lipoprotenas de baja
densidad[Ceryakycols.,1993].Enelcoraznsehadescritoquedurantelacolestasis
hay una acumulacin de cidos biliares en las mitocondrias cardiacas, sobre todo los
ms lipoflicos (LCA, DCA, y QDA) y que son responsables de una disminucin en el
control de la cadena respiratoria y en el potencial de membrana, causando la
137
Discusin
induccin de MPT [Ferreira y cols., 2005]. Por ltimo, estudios recientes demuestran
queenpacientesconictericiaobstructivaaumentaelestrsoxidativoenelcerebro,y
se cree que es al menos parcialmente responsable de la patognesis de la
encefalopata heptica [Norenberg y cols., 2004; Chroni y cols., 2006]. Nuestros
resultadoscoincidencontodasestasobservacionespreviassobrelasimplicacionesde
losradicaleslibresenlafisiopatologadelacolestasisydemuestranquevarioscidos
biliares pueden producir lesin oxidativa de los lpidos tanto a nivel de
homogeneizadoscomoenmembranasaisladas.
Elegimos la determinacin de los restos carbonilo proteicos como indicador del
dao oxidativo a protenas producido por radicales libres [Cao y Cutler, 1995a; b;
Adams y cols., 2001]. Nuestro estudio es el primero que demuestra que la exposicin
in vitro a los cidos biliares conlleva carbonilacin proteica tanto en los
homogeneizadoscomoenlasmembranas,loqueesunsignodesufrimientooxidativo
porpartedelasprotenas.
Otra cuestin clave fue las decisiones sobre el modelo experimental. En el caso
de una accin de los cidos biliares caba la posibilidad de que no tuvieran suficiente
actividad como para inducir la lesin directa y que sin embargo fueran capaces de
potenciar el estrs oxidativo desencadenado por cualquier situacin oxidativa. En
consecuenciadecidimosprobarsuefectoutilizandounsistemageneradorderadicales
OHyROOmediantelareaccindeFentonquecombinaelhierrofrricoconelcido
ascrbico[Cadenasycols.,1989;SahuyWashington,1992;WisemanyHalliwell,1994;
MillnPlanoycols.,2003;Guajardoycols.,2006].TantoelhierrocomolavitaminaC
estnpresentesaaltasconcentracionesenelhgadosano[BaskinySalem,1997].En
nuestroestudioelhierroferrosoaumentlasconcentracionesdeMDA+4HDAyrestos
carboniloconrespectoalcontrolenhomogeneizadoscomoenmembranas(tablas4,7
y 8). Esto fue especialmente evidente en las membranas aisladas utilizando el
indicador del MDA+4HDA. Estas diferencias observadas segn el tipo de muestra e
indicador biolgico parecen lgicas si consideramos que los cidos grasos
poliinsaturadosdelasmembranascelularessonmuysusceptiblesalalesinoxidativa
138
por radicales libres, iniciando una reaccin en cadena de oxidacin de los lpidos,
peroxidacinlipdica,dedevastadorasconsecuenciasparalasmembranasbiolgicas.
En ausencia del dao oxidativo inducido por el hierro, todos los cidos biliares
queestudiamosaumentaronlosnivelesderestoscarbonilotantoenhomogeneizados
como en membranas. Sin embargo en la oxidacin lipdica el incremento fue
estadsticamente significativo tan slo al aadir los cidos biliares conjugados con
taurina:TQA,TDAyTLC,enelcasodeloshomogeneizadosydeLCA,UDA,DCAysobre
todoTLCenlasmembranasaisladas.Unaprimeraconclusininteresantequesepuede
desprender de estos resultados es que todos los cidos biliares tuvieron cierta
capacidadprooxidante.Ademseldaoinducidoporsales biliaresalasprotenasfue
independiente de su grado de solubilidad en medios acuosos o hidrfobos. Sin
embargo,aniveldeloslpidosydadoqueloscidosbiliaresqueestnconjugadoscon
lataurinasonmshidroflicosenrelacinalasformasnoconjugadas[Nataliniycols.,
2007]yquedentrodelosnoconjugadoslahidrosolubilidaddelUDAesmayorquela
deLCA,DCAyQCA[Nataliniycols., 2007],puedeproponersequelasolubilidadenel
medioacuososeauncondicionanteimportanteenlainduccindeldaolipdicoenlos
homogeneizados,unrequisitoquenofuenecesarioenelcasodelasmembranas.Esto
posiblemente se deba a que utilizando membranas aisladas purificadas, hasta los
cidos biliares ms hidrofbicos pueden acumularse en el core hidrofbico de las
bicapasydeestamanerapotenciarsuaccinprooxidante.
Tras la induccin con hierro los resultados fueron algo ms discretos. En el caso
deloshomogeneizadosnuevamentefueeltratamientoconloscidosconjugadoscon
lataurinalosquemselevaronlosnivelesdeoxidacindelpidosyprotenas,aunque
la significacin estadstica solo se registr para TLC y TDA respectivamente. En las
membranas aisladas las significaciones fueron obtenidas en todos los conjugados con
taurina,yenUDAenelcasodelaoxidacinalpidos,ydetodosloscidosaexcepcin
delQCAenlaoxidacinaprotenas.Estosresultadosqueestnenlamismalneadelo
sucedidoenausenciadehierro,refuerzanlaimportanciadelanaturalezahidroflicao
no, expuesta anteriormente. Nuestros resultados estn en concordancia con los de
Sreejayan y cols., quienes demostraron que los cidos biliares son capaces de
139
Discusin
potenciarlaperoxidacinlipdicainducidaporhierroyquestaserelacionadeforma
directa con su hidrofilidad/hidrofobicidad, encontrando que los mayores efectos
prooxidantesenloslpidossealcanzaronconelTLC,[SreejayanyvonRitter,1998];sin
embargo no encontraron actividad prooxidante de los cidos biliares en ausencia de
hierro, posiblemente esta pequea discrepancia se deba a que utilizaron modelos de
membranas artificiales, liposomas [Sreejayan y von Ritter, 1998]. El TLC disminuye
selectivamente la fluidez de la membrana canicular, alterando la actividad
transportadora canalicular de cidos biliares y probablemente otros solutos [Mills y
cols., 1987]; tambin altera la localizacin canalicular de los transportadores de
protenas, incluyendo protenas de resistencia a mltiples frmacos (Mrp2),
transportador de aniones orgnicos en la membrana apical del hepatocito y del
enterocito [Beuers y cols., 2001], y la bomba exportadora de cidos biliares (Bsep),
transportadorcanaliculardecidosbiliares[Crocenziycols.,2003b],quenormalmente
estninteriorizadosenlamembranaenestructurasvesiculares.
Otro cido biliar contrastado en la literatura es el UDA. En condiciones
fisiolgicasestecidoestenlabilishumanayrepresentaaproximadamenteel2%del
total de cidos biliares. Este cido ha sido ampliamente utilizado en la teraputica
humana [Leuschner y cols., 1989; Poupon y cols., 1991; Beuers y cols., 1992; Rubin y
cols.,1994;PaumgartneryBeuers,2002].AunqueinicialmentelaFDAestadounidense
aprob su utilidad clnica en la disolucin de los clculos vesiculares, hoy no se utiliza
con este propsito ya que ha sido desplazado por el xito de la colecistectoma
laparoscpica.PosteriormentelaFDAloaprobparaeltratamientodelacirrosisbiliar
primaria, ya que el UDA demora la progresin de la fibrosis heptica y mejora la
supervivencia[Anguloycols.,1999].Tambintieneindicacionesteraputicasenotros
trastornos como las colestasis asociadas al embarazo y a la nutricin parenteral
[Beuers y cols., 1998] y se ha propuesto su uso en combinacin con antioxidantes
lipoflicos para proteger a los hepatocitos frente a la toxicidad por amiodarona
[OuazzaniChahdiycols.,2007].ElobjetivodeltratamientoconUDAseapoyaenque
trassuadministracinoral,elUDAseacumulaenelpoolcirculantedecidosbiliares
y desplaza a los cidos biliares endgenos [Marteau y cols., 1990] lo que permite
alterarlacomposicindelpooldecidosbiliaresdisminuyendolacitotoxicidaddelos
140
cidos biliares endgenos y reduciendo la secrecin biliar de colesterol. Su
administracin a dosis teraputicas eleva su concentracin hasta alcanzar el 40% de
todos los cidos biliares presentes en la bilis [Beuers y cols., 1998]. Adems y a
diferencia de los cidos biliares hidrofbicos, el UDA, mejora la funcin mitocondrial
en pacientes con alteraciones hepatobiliares [Lazaridis y cols., 2001] y junto con el
tauroursodesoxiclico son potentes inhibidores de la apoptosis inducida por cidos
biliares a las clulas hepticas [1998b; Rodrigues y cols., 1998a; Rodrigues y Steer,
1999;Benzycols.,2000;Grafycols.,2002].SecreequelaaccinprotectoradelUDA
depende no slo de su efecto colertico [Kurz y cols., 2000; Kurz y cols., 2001], sino
tambin de la modulacin de la permeabilidad mitocondrial y la inhibicin de la
produccindeEROs[1998b;Rodriguesycols.,1998a;RodriguesySteer,1999].ElUDA
reduce la permeabilidad de transicin mitocondrial y evita la translocacin de la
protena proapopttica BAX a la mitocondria, la liberacin del citocromo C
mitocondrialylaactivacindelacascadadecaspasas[1998b;Rodriguesycols.,1998a;
1999; 2003]. El UDA inhibe la apoptosis modulando la expresin gnica de la ruta
apopttica EF1/Mdm2/p53/BAX [Sola y cols., 2003; Amaral y cols., 2007]. El UDA
activa la rutas de supervivencia de la fosfatidilinositol 3quinasa y las MAPK
[Schoemakerycols.,2004].
El UDA mejor las defensas antioxidantes endgenas en hepatocitos de rata
[Mitsuyoshi y cols., 1999]. En este mismo sentido su administracin en modelos de
cirrosis biliar primaria in vivo, mejor los niveles de glutatin, aunque fue ineficaz
reduciendo la peroxidacin lipdica [Pemberton y cols., 2006]. Tambin en la cirrosis
biliar primaria, el tratamiento con UDA corrigi parcialmente el nivel sanguneo de
glutatin,perofracasenlaprevencindelaperoxidacinlipdica[Pembertonycols.,
2006].Sinembargosehademostradoqueinvitroreducelaoxidacinlipdicainducida
por DCA [Mitsuyoshi y cols., 1999] y por TDA, posiblemente por un desplazamiento
competitivo de este cido biliar hidrofbico de la superficie lipdica [Sreejayan y von
Ritter,1998].Enmodelosfentonianos,aunqueelUDAhamostradociertainteraccin
con hierro (III) [Lapenna y cols., 2002], ha resultado ineficaz frente a la oxidacin
lipdica producida por hierro (II) [Sreejayan y von Ritter, 1998]. Bajo nuestras
condiciones experimentales, el UDA sin ser muy potente, s ha generado dao
141
Discusin
oxidativo en lpidos y protenas de membranas aisladas y en protenas de
homogeneizados.Posiblementesuaccinestimulantedelosantioxidantesendgenos
haya sido suficiente para que en los homogeneizados no se haya detectado lesin
oxidativa en los lpidos. En los experimentos en los que se indujo estrs oxidativo
mediante hierro ferroso, el UDA potenci el dao oxidativo a lpidos y protenas en
membranas aisladas pero no en los homogeneizados, hecho que refuerza la hiptesis
anterior.
Tambin merece la pena destacar las observaciones realizadas con QCA, un
estereoismero del UDA con una hidrofobicidad y unas actividades biolgicas
completamentedistintas.Setratadeuncidobiliarhidrofbicoqueesmayoritarioen
la bilis humana llegando a representar el 35% de los cidos biliares totales y cuya
administracinpresentatoxicidadenunagranpartedeestudiosrealizadosaunquelos
mecanismos por los que acta son bastante desconocidos [Rolo y cols., 2000; 2001;
Yerushalmiycols.,2001;Grafycols.,2002;Gumprichtycols.,2004;Boucherieycols.,
2005;Sokolycols.,2005].Ennuestrosexperimentos,QCAprodujodaooxidativoslo
a protenas tanto en homogeneizados como en membranas y en ausencia de hierro.
SiendoqueelQCAesunodeloscidosbiliaresmstxicosconocidoyquealcanzauna
concentracin tan elevada en condiciones fisiolgicas, los resultados prooxidantes de
nuestroestudioaniveldelasprotenastienenunaespecialrelevanciaparaexplicarsu
toxicidad. Al conjugarlo con la taurina, TQA, aumenta la solubilidad en agua del QCA
[Natalini y cols., 2007]. En nuestro estudio en ausencia de hierro TQA produjo dao
oxidativo a protenas tanto en homogeneizados como en membranas, incluso con
mayoresnivelesdeoxidacinquelosdetectadosparaQCA,yunaumentosignificativo
de la peroxidacin lipdica en homogeneizados. Adems el TQA potenci el dao
oxidativo a lpidos y protenas generado por hierro en membranas, donde el QCA
apenas presentaba diferencias con respecto al control con hierro. Estos resultados
novedosos en el dao oxidativo a las protenas inducido por QCA y TQA estn en la
lneadelasobservacionesrealizadasporlaperfusinintravenosadelTQAenratasque
produjo una lesin heptica asociada a incrementos de la oxidacin lipdica [Sokol y
cols.,1998a].Ademsenhepatocitosaisladoseltratamientoconaltasconcentraciones
142
(>0,5 mM) del conjugado con glicina del QCA, el cido glicoquenodesoxiclico,
produjeronunamayoroxidacinlipdicaynecrosiscelular[Gumprichtycols.,2000].
Tambin el DCA se comport como prooxidante, circunstancia que tiene gran
inters porque representa el 25% de todos los cidos biliares en el ser humano. Bajo
nuestras condiciones de laboratorio, el DCA produjo dao oxidativo a protenas en
homogeneizadosymembranas,yoxidacindeloslpidosdelasmembranasaisladas.
Enpresenciadehierroyascrbico,DCApotencilacarbonilacinproteicacausadapor
la reaccin de Fenton en las membranas de los hepatocitos. Esta diferencia con QCA
podraexplicarseporsuhidrofilia,yaqueDCAesmshidrofbicoqueQCA[Nataliniy
cols., 2007]. Por otra parte el TDA es el DCA conjugado con taurina. Su actividad
prooxidante fue similar a la observada para TQA, con la diferencia de que el TDA
potencia el dao oxidativo a protenas generado por hierro ferroso en
homogeneizados,loquepodrarelacionarseconqueTDAesmshidrofbicoqueTQA
y por lo tanto puede producir mayor dao a las protenas. Nuestros resultados estn
en la misma lnea que la potenciacin que el TDA ejerce sobre la oxidacin lipdica
inducidaporhierroenliposomasdefosfatidilcolina[SreejayanyvonRitter,1998].
Finalmente sealar que el LCA es el cido biliar ms hidrofbico de todos los
evaluados en este trabajo. Representa el 1% del total de cidos biliares. El LCA,
disminuye tanto el flujo biliar dependiente como el independiente de los cidos
biliares [King y Schoenfield, 1971]. El mecanismo de reduccin del flujo biliar
independientedecidosbiliaressehaexplicadoporlainhibicindelaNa
+
K
+
ATPasa
[ReichenyPaumgartner,1979;Kakisycols.,1980],lainhibicindelapermeabilidadde
las uniones comunicantes [Boucherie y cols., 2005], y el desacoplamiento de los
transportadoreshepticoscomoBsep[Akitaycols.,2001;Yuycols.,2002;Crocenziy
cols., 2003b]. En pacientes con enfermedad colesttica crnica se encuentran niveles
elevadosdeLCA[Murphyycols.,1972;Fischerycols.,1996].AligualqueDCA,elLCA
gener dao oxidativo a protenas tanto en homogeneizados como en membranas, y
aumentos de MDA+4HDA en las membranas aisladas. Tambin potenci el dao
oxidativo a protenas generado por hierro ferroso en membranas. Su conjugado con
taurina es el TLC, que fue el cido biliar que mayor oxidacin lipdica y carbonilacin
143
Discusin
proteicaprodujoentodaslasposibilidadesestudiadas,homogeneizadosomembranas
y ausencia o presencia de hierro y ascrbico. Tan solo fall al intentar potenciar la
oxidacin a protenas producida por hierro ferroso en los homogeneizados. Esto
sugiere que la conjugacin con taurina del LCA, lo que aumenta su hidrofilia [Sarbu y
cols., 2001] aumenta de forma significativa su capacidad oxidativa lesiva de lpidos y
protenas.
Dado que el TLC fue el cido biliar de todos los estudiados que ms estrs
oxidativo gener, tanto para lpidos como para protenas y en homogeneizados y
membranas, lo elegimos para estudiar el efecto protector de la melatonina en la
toxicidad biliar, sin embargo antes de realizar esos estudios decidimos conocer mejor
su habilidad prooxidante utilizando dos modelos cinticos, uno de tiempo y otro de
concentracin. Las cinticas de tiempo se realizaron en cuatro modalidades
experimentales: slo con muestra biolgica o muestras control, otras aadiendo TLC,
otras en presencia de hierro y ascrbico que se consideran muestras control +, y un
ltimo grupo de muestras en exposicin de hierro y ascrbico, con TLC. Como era
previsible los controles en ausencia de hierro no obtuvieron diferencias significativas
delosindicadoresdeoxidacinlipdicaentrelosdistintostiemposdeincubacinnien
homogeneizadosnienmembranas,tansolounpequeoaumentoapartirdelos10y
30 minutos para homogeneizado y membranas respectivamente, circunstancia que
podra indicarnos una mayor susceptibilidad basal de las protenas a tiempos de
incubacin prolongados. En las cinticas realizadas en presencia de oxidantes, se
obtuvieron cambios significativos desde los 10 minutos en el caso de la oxidacin
proteicainducidaporTLC,soloocombinadoconhierrohastalasdoshoraseneldao
oxidativo a los lpidos causado por el hierro y el cido ascrbico. En general, la
aparicin de lesin oxidativa fue anterior en las protenas que en los lpidos, hecho
coincidente con la cintica de los controles y en las membranas que en los
homogeneizados. A la vista de estos resultados elegimos un tiempo de dos horas ya
que era ptimo para inducir la mayor cantidad posible de modelos estudiados. En el
estudio realizado en liposomas de fosfatidilcolina expuestos a varios cidos biliares
incluyendo el TLC, al igual que nosotros tambin utilizaron un tiempo de dos horas
[Sreejayan y von Ritter, 1998]. En lo que se refiere al estudio cintico de
144
concentracin, observamos que TLC produjo un aumento en todos los casos
estudiados,conexcepcindelapotenciacindelacarbonilacinproteicainducidapor
hierro y ascrbico en homogeneizados hepticos. La existencia de una relacin
toxicidad oxidativaconcentracin de TLC fue muy evidente en las experiencias con
membranas. La mayor susceptibilidad de stas podra asociarse a que los
homogeneizadosmantienensusnivelesbasalesdeantioxidantesendgenos.
Elmecanismodeaccinpropuestoparalatoxicidaddeloscidosbiliares,donde
la mitocondria heptica es a la vez un blanco importante [Krahenbuhl y cols., 1995] y
unafuentepotencialderadicaleslibres[Sokolycols.,1995],ascomolareduccinde
las defensas mitocondriales antioxidantes endgenas como el glutatin y la
ubiquinona, en ratas con ligadura crnica del conducto biliar [Krahenbuhl y cols.,
1995], y de la Cu,ZnSOD y CAT en el hgado de pacientes con diversas hepatopatas
[Togashi y cols., 1990], sugieren fuertemente que los antioxidantes puedan
desempear un papel hepatoprotector. De hecho, varios estudios presentan efectos
beneficiosos de los antioxidantes en el dao heptico [Pastor y cols., 1997; Sokol y
cols., 1998a; Montilla y cols., 2001; Yerushalmi y cols., 2001; Crocenzi y cols., 2003a;
Cruzycols.,2003;Gumprichtycols.,2004;Araycols.,2005;Gumprichtycols.,2005].
Recientemente se ha descrito que adems de la melatonina sintetizada en la
glndula pineal sometida al control circadiano, se puede sintetizar en muchos otros
tejidos,comolasclulasenterocromafinesdelamucosaintestinal[PolatyEmre,2006]
yseconocequeencondicionesdesaludlasconcentracionesdemelatoninaenlabilis
delasratasyotrosmamferossonmsde100vecesmayoresqueenelplasma[Tany
cols., 1999a], proponindose que estos niveles tan altos de melatonina en la bilis
puedan desempear una funcin hepatoprotectora [Calvo y cols., 2001; Messner y
cols., 2001]. Sin lugar a dudas, la Nacetil5metoxitriptamina o melatonina es la
indolamina pineal cuya funcin antioxidante est mejor contrastada en la literatura
cientfica, ya que ms de un millar de publicaciones realizadas por numerosos grupos
de investigacin con un amplio repertorio de modelos experimentales oxidativos la
avalan [para revisin vase Reiter y cols., 2003a; 2007; Koppisetti y cols., 2008]. La
melatonina ejerce un efecto protector de la lesin heptica causado por la colestasis
145
Discusin
inducida por la ligadura del conducto biliar en la rata, una accin que seguramente
estmediadaporsushabilidadesantioxidantesyantiinflamatorias[Ohtaycols.,2003;
Mayoycols.,2005].Sinembargo,elmecanismontimoporelcuallamelatoninaejerce
unefectoteraputicoenelhgadocolestticoestodavadesconocido.
Nuestros resultados indican que la melatonina redujo la oxidacin lipdica
producida por cido TLC tanto en homogeneizados como en membranas ya fuera en
ausenciaopresenciadelhierroydelcidoascrbico.Estasobservacionesconcuerdan
connumerososestudiosenlosquemelatoninafueprotectorafrentealaperoxidacin
lipdica en varios modelos experimentales. As, a modo de ejemplo, la melatonina
redujo la LPO en diferentes modelos experimentales con membranas aisladas. As,
estabiliz las membranas microsmicas hepticas expuestas a FeCl
3
/ADP/NADPH e
incluso potenci la funcin antioxidante de otras molculas como el tamoxifeno y la
pinolina [Garca y cols., 1997; 1998; 1999]. En modelos de hepatotoxicidad in vivo, la
melatonina ha demostrado su eficacia frente a la toxicidad del alfanaftilisotiocianato
[Ohta y cols., 2000; Calvo y cols., 2001; Ohta y cols., 2001], el shock endotxico y no
endotxico [Sewerynek y cols., 1995; ElSokkary y cols., 1999a], la isquemia
reperfusinheptica[Sewerynekycols.,1996],laadministracindeetanol[ElSokkary
ycols.,1999b]ylainyeccindetetraclorurodecarbono[Ohtaycols.,2000].
Encobayasalasqueselespracticlaligaduradelconductobiliar,lamelatonina
redujo la aparicin de clculos pigmentarios y revirti los cambios que la oclusin
quirrgica provoc en la concentracin de sales biliares, el pH biliar, las
concentraciones de MDA y el estatus antioxidante total [Shiesh y cols., 2000]. La
melatoninatambinredujoeldaooxidativohepticoylaapoptosisenlacolestasisy
lacirrosis[Ohtaycols.,1999;Lpezycols.,2000;Cruzycols.,2003;Ohtaycols.,2003;
Padilloycols.,2004;Cruzycols., 2005;Esrefogluycols.,2005].Cabe destacarquesu
accinfrentealanecrosis/apoptosisinducidaporisquemia/reperfusinenratas,est
mediada porque disminuye el estrs oxidativo e inhibe la va apopttica al limitar la
liberacin del citocromo C hacia el citosol y la activacin de la caspasa 3 [Kim y Lee,
2008]. El tratamiento con melatonina aument el nivel antioxidante total del suero y
redujo la concentracin srica de MDA, adems de mejorar los parmetros del dao
146
renalenratasconligaduradelconductobiliar[Chenycols.,2001],einclusominimiz
laoxidacinlipdicaentejidosextrahepticoscausadaporlacolestasis,comodiversas
regiones cerebrales [Cruz y cols., 2007], el rin [Cruz y cols., 2001; Bulbuller y cols.,
2002]yelestmago[PolatyEmre,2006].
En nuestro estudio se demuestra por primera vez que la melatonina protege de
la oxidacin proteica inducida por TLC en membranas celulares aisladas, una accin
queserealizaconunaeficaciasuperioraladesarrolladaanivellipdico,yaquerevirti
los niveles de restos carbonilo a los valores basales, no observndose diferencias
significativasconrespectoalcontroldesdeconcentracionesde0,5mMdemelatonina
(figura52).
A diferencia de los lpidos existen muy pocas evidencias de la actividad
protectoradelamelatoninaaniveldelasprotenas.Aunquepocotiempodespusdel
descubrimiento de la accin antioxidante de la melatonina se estudiaron sus efectos
protectores, manteniendo los niveles de glutatin tras la administracin de butionin
sulfoximina,untxicoqueprovocalaaparicindecataratas[Abeycols.,1994],nofue
hasta el ao 2000 cuando Kim y cols., demostraron que la melatonina redujo la
carbonilacin de la albmina srica bovina causada por la accin del hierro y el cido
ascrbico,conuna IC
50
aproximadade1,4mM [Kimycols.,2000].Enestesentido, la
melatonina tambin evit la fragmentacin y carbonilacin de la albmina bovina
debida a Cu
2+
y H
2
O
2
[Mayo y cols., 2003]. Resultados protectores se obtuvieron con
otras protenas como la lisozima, la albmina srica humana y la lactoglobulina A
[Salvi y cols., 2001]. En cultivos celulares, la melatonina redujo de una forma
concentracin dependiente la prdida de bandas de espectrina y la disminucin de
restos sulfhidrilo que causa el ONOO
en las membranas de eritrocitos [Di Mascio y

cols., 2000]. En modelos in vivo, la melatonina redujo la carbonilacin proteica en
rin e hgado de animales tratados con frmacos como la gentamicina y el
paracetamol [Sener y cols., 2002b; 2003b] y amortigu el dao oxidativo en modelos
de isquemiareperfusin heptica y renal y en quemaduras [2002a; Sener y cols.,
2002c;2003a;2003b].
147
Discusin
El mecanismo de accin de la melatonina protegiendo frente a la toxicidad
oxidativadeloscidosbiliares,posiblementeserealiceporquelamelatoninaescapaz
de reaccionar de forma directa con varios radicales libres y EROs, en la actualidad
sabemosquealmenosOH,ROO,H
2
O
2
,
1
O
2
,ONOO
yHClO[Tanycols.,1993b;Pieriy
cols., 1994; Reiter, 2000; Tan y cols., 2000a]. De todos ellos, los dos primeros son los
ms implicados en el modelo experimental de FeCl
3
y cido ascrbico que hemos
utilizado en este trabajo. Poeggeler y cols. [1993] en un amplio estudio en el que
compararonvariasmolculasantioxidantes,demostraronquelamelatoninatieneuna
tasa de reaccin con OH y ROO elevada: 0,6010
11
y 0,7510
11
moll
1
s
1
,
respectivamente. Otra posible va de accin de la melatonina es aumentando la
actividaddelasenzimasantioxidantes:GPx,glutatinreductasa,glutatintransferasa,
CAT y SOD en el tejido heptico [Montilla y cols., 2001; Ohta y cols., 2005], un
mecanismoqueennuestromodeloexperimentalsolopuedetenerespecialintersen
aquelloscasosenlosquehemosutilizadohomogeneizados,yaqueenlasmembranas
aisladasconloslavadossepierdecasicompletamenteestaactividad.
Podemos considerar a la melatonina como uno de los antioxidantes de mayor
espectro[Poeggelerycols.,1994]queademsposeeunaseriedeventajassobreotros
antioxidantes clsicos: 1) Tiene propiedades farmacolgicas excelentes tras
administracin oral o parenteral. Atraviesa bien las membranas biolgicas [Shida y
cols.,1994;Costaycols.,1995],loquelepermitealcanzartodosloscompartimientos
celulares, pudiendo de esta manera actuar como antioxidante en el ncleo y en la
mitocondria,doslugaresdondeademslamelatoninaseconcentra[MenndezPelez
y cols., 1993]. 2) No se ha detectado ningn efecto adverso importante en los
tratamientosconmelatonina,nisehapodidocalcularsudosisletal50enelanimalde
experimentacin[Reiter,1997].3)ProtegealasmolculasdeADN,protenasylpidos
utilizando mecanismos de accin frente a radicales libres muy variados, ya sean
directos por interaccin con ellos o indirectos a travs de la potenciacin de otros
antioxidantes como enzimas antioxidantes endgenas que son a su vez, capaces de
depurarradicaleslibres[Reiterycols.,1999;2003a].4)Algunosdelosproductosdela
interaccin de la melatonina con radicales libres a su vez tienen propiedades
antioxidantes, lo que prolonga la actividad antioxidante [Seegar y cols., 1997; Tan y
148
cols.,2000a;Burkhardtycols.,2001;Tanycols.,2001;2003a;Maharajycols.,2003b;
Ressmeyerycols.,2003;Tanycols.,2003].
A la vista de todas nuestras experiencias podemos resumir que la melatonina
previenetantolaoxidacinlipdicacomoproteica,inducidasporelcidobiliarTLCen
homogeneizados y membranas aisladas hepticas. Estos resultados amplan las
experienciaspreviassobrelaperoxidacinlipdicaqueseproducedurantelapatologa
colesttica y aportan las primeras evidencias sobre los efectos protectores de la
melatonina ante la oxidacin proteica inducida por sales biliares, contribuyendo a
explicar su mecanismo fisiopatolgico y planteando nuevas estrategias teraputicas
frenteaestapatologahepticadeampliaincidenciaennuestrasociedad.
CONCLUSIONES
151
Conclusiones
Traselanlisisdelosresultadosobtenidosysudiscusin,podemosconcluirque:
Primera: Laexposicininvitrodehomogeneizadosomembranasaisladasdetejidoheptico
a siete cidos biliares provoc ataque por radicales libres a sus lpidos y protenas.
En todos los casos se constat carbonilacin proteica, mientras que slo los
conjugadoscontaurinaindujeronlipoperoxidacinenhomogeneizadosyDCA,UDA,
LCA y TLC en las membranas hepticas. El TLC fue el cido biliar que implic
mayores niveles de MDA+4HDA y carbonilacin. Las potencias relativas de cada
cido biliar pueden deberse a su estructura qumica, que rige su grado de hidro
liposolubilidadysucapacidaddetransferenciaelectrnica.
Segunda: Todos los cidos biliares estudiados potenciaron el efecto prooxidante del hierro
salvo el QCA. Esta accin se observ mejor en las membranas que en los
homogeneizados.NuevamenteelmayorefectoloprodujoelTLCconexcepcinde
la oxidacin proteica de los homogeneizados, en las que slo el TDA modific las
concentracionesderestoscarboniloconsignificacinestadstica.
Tercera: La incubacin con TLC de las membranas hepticas en presencia y ausencia de
cloruro frrico y cido ascrbico aument las oxidaciones lipdica y proteica de
formatiempoyconcentracindependiente.Enloshomogeneizadosestaaccindel
TLCsloseobservpotenciandolaperoxidacinlipdicacausadaporelhierro.
Cuarta: Lamelatoninaprevinodeformaconcentracindependienteeldaooxidativoalos
lpidosyprotenascausadoporelTLC,especialmenteaniveldelasprotenasdelas
membranas hepticas. Tambin redujo con gran eficiencia el efecto potenciador
delTLCenlaoxidacincausadaporhierroyascrbico.
Quinta: La accin protectora de la melatonina in vitro frente a la lesin oxidativa causada
por cidos biliares refuerza la necesidad de realizar ms estudios farmacolgicos
queevalenelpapeldelamelatoninaenlaprevencindelahepatotoxicidaddelas
patologascolestticasmediadaporradicaleslibres.
BIBLIOGRAFA
155
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UNIVERSIDADDEZARAGOZA

ENRIQUE MARTINEZ BALLARN, Profesor Titular del rea de Fisiologa de la

JOS JOAQUN GARCA GARCA, Profesor Titular del rea de Fisiologa de la

JosJoaqunGarcaGarca EnriqueMartnezBallarn FranciscoJavierMianaMena

"Todo hombre puede ser, si se lo propone,

) procede de la reduccin univalente del

[Boveris y cols., 1972]. Tambin se forma O

durante el estallido respiratorio de las

generado en la clula se realiza por las enzimas

no es muy txico, es la principal fuente de formacin de

, reaccin catalizada por la enzima SOD [Cheeseman y Slater,

en dos molculas de radical hidroxilo. 3) Reacciones de FentonHaberWeiss [Fenton,

, u otro agente reductor, para producir un OH, un OH

. Es un radical libre muy

hidroxiLarginina Lcitrulina xidontrico

se forma in vivo por la reaccin entre el NO y el O

sin la consiguiente formacin de H

puede protonarse formando cido

; y en el estado activo y ms oxidado, estado 3, la produccin de

Figura 4. Formacin de radicales libres en la cadena de transporte de electrones mitocondrial.SOD: Superxido

, que a travs de la reaccin catalizada por la

son una serie de

, regenerndose la hemoprotena frrica, P

reduce al metal, y ste al perxido de

. Si bien la interaccin del p67 con el citocromo b558 es esencial

. ste puede reducirse por la SOD, hasta H

El OH y HClO son formados por la NADPH oxidasa y la mieloperoxidasa en los

producido en las clulas no fagocticas es menos conocido,

y radicales libres orgnicos,

, formando el radical fenoxi [RiceEvansy

En los procesos de dao oxidativo a protenas, algunos aminocidos como la

tambin realiza esta funcin. La membrana basolateral tambin contiene

[WashoStultz y cols., 1999]. El dao al ADN

El estmulo lumnico durante el da mantiene hiperpolarizados a los

para formar el producto

La melatonina reacciona directamente con H

La melatonina reacciona directamente con el ONOO

[Zhang y cols., 1999], y el

gura 18. Diseo

gura 20. Proce

En este estudio se define IC

Control 0,250,05 2,160,35 1,470,30 3,831,30

DCA 0,450,05 5,500,74

UDA 0,390,05 5,920,86

LCA 0,360,06 4,780,43

Control+ 1.447 180 4.626 899

Figura 26.Efectodeloscidos biliaresenlaformacindeMDA+4HDAenhomogeneizadosdehgado.Losvalores

Figura 32. LoscidosUDA,TQA,TDAyTLCpotencianlaperoxidacinlipdicainducidaporFe

0 0,320,05 3,460,53 0,090,05 2,150,98

120 0,340,03 6,090,69

0 0,570,06 7,530,59 7,540,74 6,580,38

30 0,600,05 7,560,49 5,250,68 11,392,22

0 0,340,05 4,470,10 2,100,77 5,861,98

30 0,360,07 5,620,66 30,102,88

60 0,370,05 5,840,66 38,161,88

0 0,470,10 5,980,95 14,925,59 15,042,25

30 0,550,09 6,320,78 41,213,04

En primer lugar se realiz un estudio de la evolucin temporal de la

Control 0,440,04 3,590,52 0,920,49 5,422,69

Control 0,270,04 3,470,27 0,350,18 6,661,62

Figura 49.Lamelatonina (aMT)reducelaoxidacindeprotenasinducidaporcidotaurolitoclicoenmembranas

Finalmente para facilitar la comparacin global de los resultados de este

a estos niveles, desbordando