Informe de Prcticas Biocombustibles, profesor Don Cristbal Cara Corpas.

Produccin de bioetanol a partir de poda de olivo

Grado en Recursos Energticos, Universidad de Jan, E.P.S.Linares, 23700,
Espaa


RESUMEN

En este trabajo se estudia la obtencin de bioetanol a partir de poda de olivo mediante la
configuraciones de proceso: Hidrlisis y Fermentacin Secuenciales (HFS) y se
compara con la Sacarificacin y Fermentacin Simultneas (SFS) y prehidrlisis y
sacarificacin y Fermentacin Simultaneas (PSFS). Se realizan y evalan varios
pretratamientos, cido, alcalino (Pret. Agua 121C y 40 Min/Pret. cido 130C y 40
Min). La fermentacin se realiza con Saccharomyces cerevisiae.
El mejor resultado se consigue con un pretratamiento acuoso, con la que se producen
ms cantidad de glucosa, aunque menos de los dems azucares restantes, lo que supone
un mayor rendimiento y eficiencia. Los dos rendimientos en la obtencin de bioetanol
con las 2 configuraciones ensayadas no son muy significativas.

Palabras clave: pretratamiento, hidrlisis enzimtica, fermentacin, etanol, poda de
olivo



















Informe de Prcticas Biocombustibles, profesor Don Cristbal Cara Corpas.
Introduccin

El mundo se quedar sin petrleo, ni hoy ni maana, pero se quedar sin petrleo en
algn momento y debemos dejar al petrleo antes que el petrleo nos deje a nosotros. Y
cuanto antes empecemos, mucho mejor, porque todo nuestro sistema econmico y social
se basa en el petrleo por lo que el cambio tomar mucho tiempo y mucho dinero y
debemos tomar este asunto muy en serio [1].
El cambio climtico es una amenaza potencial para los sistemas vitales de nuestro
mundo. Para retener la amenazante dinmica del cambio climtico es necesario frenar el
aumento de la concentracin de gases de efecto invernadero en la atmsfera.[2].
La mayor parte del aporte de CO2, entre las diversas fuentes, proviene del sector
transportes. Con lo que utilizando combustibles menos contaminantes se reducirn
estas emisiones. [3].
Los biocombustibles lquidos (bioetanol y biodiesel), obtenidos a partir de biomasa, son
los nicos productos renovables que pueden integrarse fcilmente en los actuales
sistemas de distribucin y son una de las pocas alternativas de diversificacin del sector
transporte a corto plazo [4].
En este trabajo se ha utilizado el residuo de poda del olivar, uno de los cultivos ms
importantes en Espaa, cuya superficie actual de produccin es de, aproximadamente,
2,46 10 ha [5]. Puesto que la hectrea del olivar produce como trmino medio 3 10
kg de residuos por ao, se puede estimar que la produccin total anual de este residuo es
superior a 7,3 10 kg[6]. Actualmente se emplean dos formas de eliminacin para este
residuo agrcola. Una de estas prcticas consiste en su trituracin y esparcimiento en los
campos de cultivo con la posible generacin de plagas y enfermedades y un aumento de
riesgo de incendio. La otra va de eliminacin consiste en la quema del residuo de poda
en los propios campos de cultivo u hogares de los arrendatarios y sus conocidos, con los
consiguientes problemas medioambientales. Una alternativa para el residuo de poda de
olivo sera su aprovechamiento como biomasa renovable y abundante que adems, no
contribuye a incrementar el efecto invernadero, no emite xidos de azufre a la atmsfera
y, a la vez se est aprovechando un residuo agrcola para el que, en la actualidad, no
existe ninguna aplicacin econmicamente viable. [7]
La produccin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica ha sido investigada
utilizando desechos agrcolas, cultivos sin aplicaciones alimenticias, papel reciclado y
residuos slidos urbanos, entre otros. El transformar los carbohidratos de materia
lignocelulsica de una forma eficiente es hoy en da una de las lneas de investigacin.
[8].
La produccin de etanol se realiza en cuatro etapas: primero, un pretratamiento que
altere la estructura y composicin de la biomasa, seguido de la hidrlisis, que fracciona
los carbohidratos en monosacridos, y la posterior fermentacin de estos carbohidratos
en etanol y concentracin del mismo por destilacin [9].



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Caracterizacin de la biomasa


La biomasa proviene de la poda de olivo de la provincia de Jan, a la cual se le ha
realizado una molturacin con un dimetro inferior a 5 cm y tamizada a un dimetro de
6 mm. La biomasa ha sufrido un proceso de secado natural en pilas de no ms de 50 m.








La composicin de esta poda de olivo es:



Poda de olivo (original)
Extractivos 25,55 %
Lignina 20,16 %
Cenizas 2,80 %
Glucosa 26,01 %
Xilosa 11,65 %
Galactosa 1,66 %
Arabinosa 2,71 %
Manosa 1,35 %









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Fase 0: Intento fallido, a causa del reactor autoclave

Para este proceso utilizaremos biomasa lignocelulsica. En concreto esta es poda de
olivo al 6% de humedad.


Figura 1.- Poda de olivo



Figura 2.- Filtracin a vacio

Inicialmente realizaremos un pretratamiento de la biomasa, buscando eliminar parte no
estructural de la materia. Este proceso lo realizaremos al 20% en peso. Es decir, 100
gramos de poda de olivo por cada 500ml de volumen de reaccin. Debemos de tener en
cuenta que la biomasa posee un 6% de humedad por tanto no sera exactamente 100g
de biomasa, si no que deberemos utilizar 106,4g de biomasa al 6% de humedad.

100 100
(100% 6% )
= 106,4

Vertemos en el reactor los 106,4 gramos de poda y los 493,6ml de agua, para que as, al
completar con la humedad que contiene la biomasa, sigamos manteniendo la relacin de
20% en peso.
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Lo Introducimos en el reactor tipo autoclave, para iniciar as el pretratamiento.


Figura 3.- Autoclave

Las condiciones son de 125C y 40 min, estas condiciones las configuramos dndole a
Men (Botn de la izquierda) Seleccionar ciclo. Debemos tener en cuenta que el
tapn del reactor debe de estar entre-abierto. En el autoclave se introducen dos
proporciones equitativas de agua mineral y agua destilada, porque el agua destilada es
muy agresiva con los metales, incluso con el acero inoxidable ya que pierde el
equilibrio entre los aniones y cationes, y por lo general el agua se torna cida por la
prevalencia del dixido de carbono (CO2) y al eliminarle los iones como calcio y
magnesio, se reduce la dureza del agua y alcalinidad).

En el autoclave existe una cantidad de agua que se calienta mediante resistencias.
Inicialmente, tras haber elegido el ciclo a efectuar, se realiza un vaco. Y empieza el
proceso para alcanzar las condiciones deseadas, esto tarda unos 20 min
aproximadamente.


Figura 4.- Introduccin de la biomasa tratada en el autoclave
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El objetivo en este pretratamiento en el autoclave, como ya hemos explicado
anteriormente, es eliminar la mayor cantidad de parte no estructural. De esta manera
podemos eliminar alrededor de un 20% de parte no estructural. Para calcular lo anterior,
necesitamos saber cuanto slido queda y que cantidad se ha disuelto de los 100g de
biomasa seca inicial. Con este pretratamiento tan solo eliminamos parte no estructural,
por lo tanto no obtendremos azucares.

Ha habido un problema en el autoclave, por lo que el tiempo de pretratamiento solo ha
sido de 15 minutos aproximadamente. Aun as seguimos con el proceso.

Figura 5.- Error en el autoclave

La cmara de esterilizacin del autoclave informa de que no hay agua durante el ciclo,
recomienda que compruebe la vlvula de drenaje y las conexiones de la cmara de
esterilizacin. Vierta ms agua.

Enfriamos y procedemos a la separacin slido-lquido. Esto se lleva a cabo a travs de
de una filtracin a vaco. Obteniendo un slido al que le hemos eliminado cantidad de
parte no estructural y un hidrolizado con gran cantidad de polifenoles, que inhiben la
accin bacteriana y participan negativamente en los procesos de hidrlisis.

Figura 6.- Separacin slido-lquido
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La parte slida se deja secar a 40C durante un periodo de 3 das. Tras esto a la biomasa
le quedar aproximadamente un 2% de humedad, pero en nuestro caso tomaremos como
que esta es prcticamente nula. Una vez la muestra est seca, ser pesada y en relacin a
los 100g de biomasa inicial calcularemos la masa eliminada de parte no estructural, que
ha sido disuelta en el hidrolizado.



Figura 7.- Secado en bandeja

Del hidrolizado debemos medir: ph (En el primer da de prcticas no dio tiempo),
Volumen recuperado, azucares y txicos (Medidos por el profesor), y polifenoles totales
a travs de un espectro fotomtrico.


Figura 8.- PH-metro

Resultados obtenidos en la fase 0, la cual fue fallida y carece de validez, por no
completar el pretratamiento.

- Biomasa recuperada de los 100g iniciales: 85,64g (Suponemos al 0% de humedad)

- Volumen de hidrolizado obtenido: 270ml
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- RGT (Recuperacin Gravimtrica Total):

=
85,64
100
100 = 85,64

- Parte no estructural eliminada: 14,36%. Debemos tener en cuenta que el porcentaje de
cantidad no estructural para nuestra biomasa ronda el 30%, sabiendo que se pretenda
eliminar alrededor de un 20%, podemos decir que esto es a causa del fallo en el
autoclave y por lo tanto da lugar a un pretratamiento fallido. Debemos conseguir un
70%, ya que no es sencillo eliminar el 100% de la parte no estructural. Y hemos
conseguido un 50%.

Tras este proceso fallido, se proponen dos vas de accin, que comienzan con un
pretratamiento diferente cada una. A continuacin vamos a realizar el proceso de forma
cida y de forma neutra, es decir con las mismas condiciones del proceso fallido.

Fase 1: Pretratamiento con agua.

Tras el intento fallido por el fallo en el autoclave, vamos a realizar el mismo proceso por
dos vas diferentes, en este caso nos centramos con el pretratamiento con agua. En esta
va realizaremos idnticamente lo mismo que en el intento fallido. Tan solo que en este
caso si se cumplieron las condiciones establecidas de pretratamiento. A 121C y 40
minutos.

Esto fue hecho por el profesor.

A continuacin tuvimos que filtrar a vaco, obtener el hidrolizado y poner a secar la
biomasa pretratada a 40C.

Resultados obtenidos en la fase 1, con pretratamiento con agua.

- Biomasa recuperada de los 100g iniciales: 84,04g (Suponemos al 0% de humedad)
- Volumen de hidrolizado obtenido: .ml
- RGT (Recuperacin Gravimtrica Total):

=
84,04
100
100 = 84,04

- Parte no estructural eliminada: 16%. Debemos tener en cuenta que el porcentaje de
cantidad no estructural para nuestra biomasa es del 27%. Nosotros hemos eliminado un
16%, por lo tanto hemos conseguido un 60% aproximadamente.
- Anotaciones: El profesor pudo optimizar el proceso de eliminacin de parte no
estructural hasta un 80%, nosotros hemos obtenido un 20 menos que l. Tericamente
podramos haber perdido
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Fase 1: Pretratamiento cido

Tras el intento fallido por el fallo en el autoclave, vamos a realizar el mismo proceso por
dos vas diferentes, en este caso nos centramos con el pretratamiento cido.

En esta va de accin, utilizaremos en el pretratamiento una disolucin al 2% en peso de
H2SO4. Para ello se volver a utilizar una relacin slido-lquido del 20% en 500ml.


500 .
224
100.

100.
9624

124
1.84. 24
= 5,6 24

Realizamos los 500ml de disolucin al 2% de H2SO4 en un matraz Erlenmeyer. A
continuacin vertemos la disolucin con los 106,4 gramos de biomasa hmeda en el
reactor.

Tras esto introducimos en el reactor tipo autoclave con unas condiciones de 130C y 40
minutos.

Tras ser sacados, se filtr a vacio, se midi el volumen de hidrolizado y la biomasa
pretratada se puso a secar a 40C durante un da.

Resultados obtenidos en la fase 1, con pretratamiento cido.

- Biomasa recuperada de los 100g iniciales: 72,42g (Suponemos al 0% de humedad)
- Volumen de hidrolizado obtenido: 250ml
- RGT (Recuperacin Gravimtrica Total):

=
72,42
100
100 = 72,42

- Parte no estructural eliminada: 27,58%. Debemos tener en cuenta que el porcentaje de
cantidad no estructural para nuestra biomasa ronda el 30%, pero un factor importante es
que con el pretratamiento cido tambin eliminamos parte de los azucares.
- PH: 0,731
- Anotaciones:
Posee un olor y un aspecto totalmente diferente en relacin con el pretratamiento con
agua. Hubo seas de un posible quemado, en relacin a la parte del secado de esta
biomasa a 40C. Solo tuvo de tiempo de secado 26 aproximadamente, por lo tanto su
contenido en humedad no habra disminuido lo suficiente. Aunque ignoramos esto en
nuestro proceso.
Debemos tener en cuenta que los dems grupos han perdido aproximadamente 10
gramos ms que nosotros.

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Fase 2: Pretratamiento alcalino de biomasa pretratada con agua

La biomasa pretratada con agua se le realiza un cambio de ph. Para que en la fase
posterior, la hidrlisis sea ms efectiva. Para ello realizamos una mezcla slido-lquido
al 10% en relacin peso/volumen, utilizando 20g de esta biomasa pretratada con agua,
en 200 ml de disolucin de H2O2 al 0,5 peso/volumen.


Figura 9.- Pretratamiento acuosa y cida

La disolucin de agua oxigenada fue realizada por las alumnas de biotecnologa. Una
vez realizada la mezcla, intentamos cambiar su pH a 11,5. Utilizando 3 pastillas de
NaOH y 9 gotas de disolucin 10 molar, alcanzamos un PH de 11,452.

Tras esto calentamos a 80C durante 30 minutos. Esto no fue exactamente as, ya que la
temperatura variaba, y no poda superar los 80C, por lo tanto debamos de apartar de la
placa calefactora y despus volver a calentar cuando hubiera disminuido, variando la
potencia de la placa segn la necesidad.


Figura 10.- Calentamiento placa calefactora

Una vez hecho esto, filtramos a vaco guardamos el hidrolizado, e introducimos a secar
a 40C la biomasa tratada de forma alcalina.
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Fase 2: Pretratamiento alcaino pretratada de forma cida (2%H2SO4)

La biomasa pretratada con cido se le realiza un cambio de ph. Para que en la fase
posterior, la hidrlisis sea ms efectiva.

Para ello realizamos una mezcla slido-lquido al 10% en relacin peso/volumen,
utilizando 20g de esta biomasa pretratada con cido, en 200 ml de disolucin de H2O2
al 0,5 peso/volumen.

La disolucin de agua oxigenada fue realizada por las alumnas de biotecnologa.

Una vez realizada la mezcla, intentamos cambiar su PH a 11,5. Utilizando 5 pastillas de
NaOH y 20 gotas de disolucin 10 molar, alcanzamos un PH de 11,900.

Tras esto calentamos a 80C durante 30 minutos. Esto no fue exactamente as, ya que la
temperatura variaba, y no poda superar los 80C, por lo tanto debamos de apartar de la
placa calefactora y despus volver a calentar cuando hubiera disminuido, variando la
potencia de la placa segn la necesidad.

Una vez hecho esto, filtramos a vaco guardamos el hidrolizado, e introducimos a secar
a 40C la biomasa tratada de forma alcalina.

Fase 3: Tras el tratamiento alcalino

Una vez seca la biomasa tratada de forma alcalina, tanto con pretratamiento cido o
acuoso, pesamos las respectivas bandejas.

Resultados obtenidos en la fase 3, con tratamiento alcalino.

- Biomasa recuperada en el tratamiento alcalino de los 20g de biomasa con
pretratamiento cido de partida: 12,21g (Suponemos al 0% de humedad) Tonos
oscuros, marrones, verdes intensos y ocre.


Figura 11.- Biomasa recuperada cido
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- Biomasa recuperada en el tratamiento alcalino de los 20g de biomasa con
pretratamiento acuoso de partida: 15,96g (Suponemos al 0% de humedad)Tono claro
grisceo, verde claro y marrn.


Figura 12.- Biomasa recuperada acuoso

- RGT (Recuperacin Gravimtrica Total):

=
12,21
20
100 = 61.05(.)

=
15,96
20
100 = 79,80(.)


Una vez realizados los pretratamiento y tratamientos anteriores, continuamos con los
anlisis de los hidrolizados.


Figura 12.- Esquema hidrolizado
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Los anlisis obtenidos son los siguientes:


Liqu. H2O Liqu. H2SO4
Glucosa (g/l) 5,55 12,911
Xilosa (g/l) * 0,502
Galactosa (g/l) * 2,653
Arabinosa (g/l) * 3,837

* La cantidad de Xilosa, Galactosa y arabinosa
obtenida en el hidrolizado acuoso es muy baja.

En lo referente al hidrolizado con pretratamiento cido, debemos destacar que en las
cantidades de azcares, hay muy poca cantidad de xilosa, ya que estas suelen estar en
cantidades parecidas a las de la glucosa.

Tomamos un volumen de 500ml, aunque esto no es completamente real. Algo que
debemos tener en cuenta es que cuanta ms biomasa se utilice para la obtencin de
azucares fermentables, ms deviaciones existirn.

A continuacin para cada azcar realizamos el RGT, teniendo en cuenta la composicin
en azucares de la biomasa inicial. Y calculamos el porcentaje de azcar fermentable
existente. Tanto para a biomasa con pretratamiento cido como para la biomasa con
pretratamiento acuoso.

Glucosa (%) 26,01
Xilosa (%) 11,65
Galactosa (%) 1,66
Arabinosa (%) 2,71


Biomasa con pretratamiento cido:

Glucosa:
Segn el anlisis del hidrolizado existen 12 gramos de glucosa por litro. Como
utilizamos medio litro, poseemos 6 gramos de glucosa en el hidrolizado con
pretratamiento cido.

La biomasa posee un 26% de glucosa, esto quiere decir que por cada 100g de biomasa,
26 gramos son glucosa.

=
6
26
100 = 23,08


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Este 23,08% de glucosa, est referido a la glucosa que se ha perdido en el hidrolizado a
partir de la que tenamos inicialmente. Por lo tanto perderemos:

=
23,08
100 .
26 = 6

Para obtener la glucosa disponible, es tan simple como realizar la diferencia entre la
glucosa existente en la materia prima con la que se ha perdido en el hidrolizado.

= 26 6 = 20

El 20% es la glucosa fermentable en la hidrlisis enzimtica. Para los dems azucares
realizamos el mismo procedimiento.

Xilosa:
Segn el anlisis del hidrolizado existen 0,502 gramos de xilosa por litro. Como
utilizamos medio litro, poseemos 0,251 gramos de xilosa en el hidrolizado con
pretratamiento cido.

La biomasa posee un 11,65% de xilosa, esto quiere decir que por cada 100g de biomasa,
11,65 gramos son xilosa.

=
0,251
11,65
100 = 2,15

Este 2,15% de xilosa, est referido a la xilosa que se ha perdido en el hidrolizado.

Para obtener la xilosa disponible, es tan simple como realizar la diferencia entre la
xilosa existente en la materia prima con la que se ha perdido en el hidrolizado.

= 11,65 0,25 = 11,4

El 11,4% es xilosa fermentable en la hidrlisis enzimtica.

Galactosa:
Segn el anlisis del hidrolizado existen 2,653 gramos de galactosa por litro. Como
utilizamos medio litro, poseemos 1,327 gramos de galactosa en el hidrolizado con
pretratamiento cido.

La biomasa posee un 1,66% de galactosa, esto quiere decir que por cada 100g de
biomasa, 1,66 gramos son galactosa.

=
1,327
1,66
100 = 80
Este 80% de galactosa, est referido a la galactosa que se ha perdido en el hidrolizado.
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Para obtener la galactosa disponible, es tan simple como realizar la diferencia entre la
galactosa existente en la materia prima con la que se ha perdido en el hidrolizado.

Galactosadisponible = 1,66galactosaprima 1.33galactosahidrolizado = 0,33

El 0,33% es galactosa fermentable en la hidrlisis enzimtica.

Arabinosa:
Segn el anlisis del hidrolizado existen 3,837 gramos de arabinosa por litro. Como
utilizamos medio litro, poseemos 1,919 gramos de arabinosa en el hidrolizado con
pretratamiento cido.

La biomasa posee un 2,71% de arabinosa, esto quiere decir que por cada 100g de
biomasa, 2,71 gramos son arabinosa.

=
1,919
2,71
100 = 70,81

Este 70,81% de arabinosa, est referido a la arabinosa que se ha perdido en el
hidrolizado.

Para obtener la arabinosa disponible, es tan simple como realizar la diferencia entre la
arabinosa existente en la materia prima con la que se ha perdido en el hidrolizado.

Arabinosadispon. = 2,71arabinosaprima 1.92arabinosahidrolizado = 0,79

El 0,79% es arabinosa fermentable en la hidrlisis enzimtica.


Biomasa con pretratamiento acuoso:

Glucosa:
Segn el anlisis del hidrolizado existen 5,55 gramos de glucosa por litro. Como
utilizamos medio litro, poseemos 2,78 gramos de glucosa en el hidrolizado con
pretratamiento acuoso.

La biomasa posee un 26% de glucosa, esto quiere decir que por cada 100g de biomasa,
26 gramos son glucosa.

=
2,78
26
100 = 10,69

Este 6,85% de glucosa, est referido a la glucosa que se ha perdido en el hidrolizado a
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partir de la que tenamos inicialmente. Por lo tanto perderemos:

=
6,85
100.
26 = 2,78

Para obtener la glucosa disponible, es tan simple como realizar la diferencia entre la
glucosa existente en la materia prima con la que se ha perdido en el hidrolizado.

Glucosadisponible = 26glucosaprima 2,78glucosahidrolizado = 23,22

El 23,22% es la glucosa fermentable en la hidrlisis enzimtica.

Como conclusin, un resumen de los porcentajes de azcares fermentables disponibles
en la hidrlisis enzimtica.



Pretratamiento
cido
Pretratamiento
Acusoso
Glucosa (%) 20,00 23,22
Xilosa (%) 11,40 -
Galactosa (%) 0,33 -
Arabinosa (%) 0,79 -
Total (%) 32,52 23,22

Observamos que existe mayor cantidad de azcares fermentables en la biomasa con
pretratamiento cido. Aunque debemos tener en cuenta que los niveles de xilosa salieron
demasiado bajos, cuando estos deberan ser muy parecidos al de la glucosa en el
hidrolizado. Y de esta manera no haber tanta diferencia.

Por esto vamos a realizar el supuesto en el que los niveles de xilosa hubieran salido
normales, y corroborar que el total de azucares fermentables en ambas biomasas son
muy parecidos.

Tomando que como aproximacin que existen 13 gramos de xilosa por litro. Como
utilizamos medio litro, poseemos 6,5 gramos de xilosa en el hidrolizado con
pretratamiento cido.

La biomasa posee un 11,65% de xilosa, esto quiere decir que por cada 100g de biomasa,
11,65 gramos son xilosa.


=
6,5
11,65
100 = 55,79 % xilosa


Este 55,79% de xilosa, est referido a la xilosa que se ha perdido en el hidrolizado.
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Para obtener la xilosa disponible, es tan simple como realizar la diferencia entre la
xilosa existente en la materia prima con la que se ha perdido en el hidrolizado.

Xilosadisponible = 11,65xilosaprima 6,5xilosahidrolizado = 5,15xilosa

El 5,15% es xilosa fermentable en la hidrlisis enzimtica.

Tras esto la tabla anterior queda as:


Pretratamiento
cido
Pretratamiento
Acusoso
Glucosa (%) 20,00 24,22
Xilosa (%) 5,15 (11,4) -
Galactosa (%) 0,33 -
Arabinosa (%) 0,79 -
Total (%) 26,27 (32,52) 24,22

Donde los niveles de azcares fermentables son ms semejantes.

Fase 4: Preparacin hidrlisis enzimtica

Debemos preparar 500ml de disolucin tampn de pH=5. Para esto utilizamos cido
ctrico 0,1M y cido sdico 0,1M.

En un matraz Erlenmeyer de 200ml con agitacin, siendo las condiciones ptimas:

- Temperatura: 50C
- 150 RPM
- 15 UPS Celulasa/g sustrato
- 10% V/V Beta
- pH=5

Utilizamos una relacin al 5% en peso, es decir, 1,25 gramos en 25 ml, de esta manera
nos aseguramos que no se produzca la inhibicin de la encima.

A continuacin prepararemos los dos matraces, en cada uno introducimos la biomasa
pretratada correspondiente, con los 25 ml de disolucin tampn, que consta de 41 ml de
cido ctrico y 59 ml de cido sdico. Tras esto introducimos 3,125 gramos de
celulasa. Y completamos con agua.

15

12,5
1
60
= 3,125
Por ltimo esto lo complementamos con el 10% de Beta, es decir 0,312 ml de Beta.
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Figura 13.- Agitador-incubadora ES-20.

Fase 5: Resultados de hidrlisis enzimtica

El proceso explicado anteriormente est en funcionamiento desde el Jueves 28/11/2013
a las 21.30 hasta el Lunes 30/11/2013 a las 10 de la maana.

Mediremos la cantidad de azucares reductores, sin distincin, con un efecto
fotocolorimtrico con un reactivo DNS. Determinar el contenido en azcares reductores
utilizando el mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) con glucosa como estndar.

Este reactivo DNS lo ha preparado el profesor. Para preparar el reactivo RNS. En 100
ml de disolucin, utilizamos 1 g de 3,5 Dinitrosalicilico, 20 ml de NaOH (2N), 50 ml de
H
2
O(todo esto bien agitado) y por ltimo se aade 30 g de tartrato Na2K.

Adems necesitamos preparar 500ml de la disolucin madre, la cual es de un gramo de
glucosa por litro de disolucin.

Figura 14.- Disolucin madre 1 gramo glucosa/litro de disolucin
El proceso seguido es el siguiente:
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A 0,5 ml de muestra se le va adicionar 1 ml reactivo DNS, lo introducimos en bao
Mara a una temperatura aproximadamente de 90 C durante 5 minutos y se va a dejar
enfriar durante ms o menos 10 minutos en contacto con agua fra.

El proceso paso a paso:

Metemos 1 gramo de glucosa en un matraz de 0,5 para que la concetracin sea de 0,5. A
este 0,5 ml de glucosa luego se le aade 1 ml de reactivo DNS (realizado por el
profesor).


Figura 15.- Matraz de 0,5

Peso glucosa = 0,50075 gramos de glucosa.

El rango de medidas que vamos a utilizar va a ser desde 0,05 g/l hasta 1g/l (Pasando por
0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 g/l).


Esto lo introducimos en 10 tubos (0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; Blanco; Recta Patrn
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cida; Recta Patrn acuosa).


Figura 16.- Preparacin tubos

Los 10 tubos los introducimos en bao Mara a una temperatura aproximadamente de
90 C durante 5 minutos y lo dejamos enfriar durante 10 minutos en contacto con agua
fra del grifo.


Figura 17.- Enfriamiento agua fra

Las muestras las llevamos a un espectrmetro que nos permite comparar
la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la
estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la
luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no
puede producir ningn efecto sin ser absorbida.
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La espectrofotometra ultravioleta-visible utiliza haces de radiacin del espectro elec-
tromagntico, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el
de la luz visible de 400 a 700 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los
materiales en la regin ultravioleta y visible del espectro.
La espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo electromagntico de la
luz visible, de 400 a 700 nm.


Figura 18.- Espectrofometra



Figura 19.- ABS con = 540 mm y realizacin Blanco

Tras la realizacin del proceso anterior, realizamos la medicin de los azucares
mediante el efecto fotocolorimtrico, con longitudes de onda de 540 y 640. Y
realizamos
=540 =640
Blanco 0,311 0,135
0,05 0,194 0,144
0,1 0,374 0,167
0,2 0,81 0,241
0,4 1,613 0,423
0,6 1,913 0,523
0,8 2,014 0,606
1 2,043 0,863
Mu. Acida 2,057 0,738
Mu.
Alcalina 2,088 0,987

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Conclusiones

Comparando los resultados obtenidos con las distintas hidrlisis llevadas a cabo, observamos
que mediante un pretratamiento cido se pierden ms cantidad de glucosa, compensndose
esto por la obtencin de mayor parte de otros azucares.

En nuestro caso, la fermentacin de los azucares nos da como resultado bioetanol, y por lo
tanto, el pretratamiento acuoso y el posterior tratamiento alcalino, nos ser de mayor utilidad
en este proceso bioqumico, ya que en el habr rendimientos superirores.

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