Biosensores

Por el Dr. Eduardo Cortn

Grupo de Biosensores y Bioanlisis
Pertenecemos al CONICET y a la FCEN, UBA
Formamos parte del Departamento de Qumica Biolgica
Cooperamos con el INTI, la CONEA, y dos grupos en Canad
y Madrid

Grupo independiente
El grupo realiza tareas de desarrollo y transferencia de tecnologa,
investigacin bsica, divulgacin cientfica, y docencia.
Lo componen 9 personas, entre investigadores, tcnicos, estudiantes
doctorales y de grado.

Biosensores para Calidad de

Aguas
Durante la siguiente hora:
-Introduccin
-Los biosensores, que son, ejemplos
-Caractersticas y ventajas de los biosensores
-Materiales biolgicos utilizados
-Biosensores enzimticos y microbianos
-Biosensores enzimticos, aplicaciones
-Biosensores microbianos, aplicaciones, BOD y Toxicidad
-Sensores de alerta temprana en el contexto internacional
-El denominado Proyecto Pilcomayo
-Otros sistemas, otras aplicaciones

Introduccin a los Biosensores

Seal
Bioqumica

Material
Biolgico

Seal
Elctrica

Transductor

Seal
Elctrica

Amplificador

Procesado
y archivo

Los biosensores son instrumentos

analticos basados en la respuesta de un
material biolgico en estrecho contacto
con un transductor fsico/qumico, que
convierte la respuesta biolgica en una
seal elctrica.
La especificidad del reconocimiento
biolgico permite que muchos de los
biosensores puedan operar en matrices
complejas (sangre, leche, aguas).
3

Precursor Histrico de los

Biosensores (Canary on a cage)

Debido a ello, se suele hablar actualmente de canary on a

chip, debido a la tendencia actual a los ensayos en
microvolumenes
4

Precursor Histrico de los

Biosensores
The Kemberton Colliery Mines Rescue Brigade 'C' Team,
photographed in front of the Rescue Station in 1914. The man
on the left is carrying a canary in a cage to detect carbon
monoxide after a fire or explosion - canaries were used simply
because their yellow colour made them easier to see in semidarkness underground - otherwise sparrows or any other
small birds, which were equally sensitive to the effects of gas
would have been just as effective! During WWI the sappers
tunnelling at the Western Front used canaries for gas
detection but they would trim the claws as it was discovered
that a canary could die of gas and the effects of rigor meant
that they would grip their perch and not fall off. If this
happened the miners/sappers might not notice the onset of
gas. The men are wearing 'Proto' breathing sets, developed by
Siebe Gorman & Co from the earlier 'Fleuss' apparatus.

(Madeley, Shropshire, England)

5

Los Perros Espaciales

Antes de que el hombre llegara al espacio, los cientficos discutan si era posible sobrevivir en
ingravidez. Quizs la radiacin a esas alturas fuese mortfera. 1948 USA enva los primeros
monos en V2s. La Unin Sovitica emplea los denominados Space Dogs, enva unos 13 perros
en distintas misiones para ensayar los trajes presurizados. Abajo Laika en el Sputnik 2, en 1957.
Primer animal en orbita terrestre (pero su capsula no fue diseada para ser recuperada)

LAIKA
6

Ventajas de los Biosensores

Permiten medir un analito sin purificacin previa

Altamente especficos (enzimas), o mas o menos
inespecficos (microbianos)
La informacin obtenida es mucho mas real que con
los mtodos analticos clsicos (biodisponibilidad)
Mediciones rpidas y equipos porttiles han sido
diseados
La lista de posibles compuestos txicos en el
ambiente aumenta continuamente
Es necesario, entonces, sistemas analticos de amplio
espectro, inespecficos
7

Transductores y materiales de origen biolgico ms

utilizados
(Los materiales biomimticos no son mencionados en esta tabla)

El Mtodo de Inmovilizacin del Material

Biolgico es Crtico

Materiales biolgicos para

aplicaciones medioambientales
Enzimas, clulas enteras y anticuerpos son los materiales
biolgicos ms utilizados

10

Que pueden medir los

biosensores enzimticos?
Los ms importantes (+90%
mercado mundial) son los
que miden glucosa, usados
por diabticos
Si se inmovilizan enzimas
sensibles a determinado
contaminante, este podr ser
medido
Biosensores basados en la
inhibicin de la acetil
colinesterasa detectan
insecticidas fosforados y
otros inhibidores

O2
CH2 OH
H

CH2 OH
O

H
OH

H
OH

OH
H

Glucosa
Oxidasa

OH

OH

Glucosa + O2

O
H
OH

H
H2 O2

OH

-gluconolact ona + H2 O2

11

Ejemplo de Biosensor Enzimtico

u

PAAOs + PEG 400 + E - NH2

(entrecruzante)

GEL

Grupos amino de la enzima

El polietilendiglicidileter, una mezcla con un peso molecular promedio de 400

(PEG 400) entrecruza la enzima y el PAAOs obtenindose un gel redox estable.

]m [
NH

Os
Enzima

]n
NH2

N
N

N
Os

Cl

PAAOs

Electrodo de trabajo
12

Biosensor para pesticidas basado

en inhibicin enzimtica

Acetilcolina: La acetilcolina es el neurotransmisor especfico de las

sinapsis, tanto del sistema nervioso somtico como en las sinapsis
ganglionares del sistema nervioso autnomo y en los rganos diana de la
divisin parasimptica. La sntesis de acetilcolina tiene lugar en el botn
terminal y es metabolizada por la acetilcolinesterasa en el espacio
sinptico

Los organofosforados y
carbamatos son inhibidores
de la colinesterasa, enzima que
cataliza la hidrlisis de los
steres del neurotransmisor
acetilcolina. Los
organofosforados se unen a la
acetilcolinesterasa e inhiben su
actividad de manera
irreversible, tanto en los
glbulos rojos como en el
plasma, por lo cual su
restauracin depende de la
sntesis de nuevas molculas
de la enzima, a diferencia de
los carbamatos en los que esta
unin es reversible de manera
espontnea

13

Biosensor para pesticidas basado

en inhibicin enzimtica
La deteccin de cambios de pH muchas veces
no es til, por ello la combinacin con una
segunda enzima, como la colina oxidasa (que
toma la colina y la oxida, produciendo H2O2,
fcil de medir amperomtricamente).

La acetilcolina es
degradada a colina y
acetato, por lo tanto el pH
de la solucin circundante
se acidifica

S. Sotiropoulou et al., Analytica Chimica Acta, 530, 14, 2005, 199-204

rganofosforado usado como insecticida.

14

Biosensores microbianos
Se los puede clasificar en dos tipos:
Especficos, en los que un gen reporter, (por
ejemplo lux) se activa en presencia de un activador;
se han descrito para Hg++, y algunos hidrocarburos

Inespecficos, en los que el metabolismo

microbiano cambia por el conjunto de sustancias
que se encuentran en solucin. BOD y Toxicidad

15

Ejemplo de biosensor microbiano

Celda de flujo utilizada en ensayos con
Lactobacillus
80

Electrodo de pH

Concentracin de glucosa
0,0 mM
0,1 mM
0,5 mM
2,5 mM
10 mM
25 mM

60

mV

Desperdicio
Carrier
Bao
termostatico

40

20

Cuentas de alginato
0
1

T / min

Velocidad de acidificacin para distintas concentraciones de glucosa

16

Preguntas que puede responder

un biosensor inespecfico
Es la cantidad de materia orgnica la normal?
q Hay elementos txicos en el agua?
q Hay cambios en el anlisis actual respecto a una
muestra control?
q

En algunos de estos ensayos el criterio de deteccin es

muy amplio, requieren confirmacin, generalmente
mediante mtodos de qumica analtica
instrumental en laboratorio.
17

Demanda bioqumica de oxgeno,

BOD5
a. Principle: The method consists of filling with sample, to
overflowing, an airtight bottle of the specified size and
incubating it at the specified temperature for 5 d. Dissolved
oxygen is measured initially and after incubation, and the BOD
is computed from the difference between initial and final DO.
Because the initial DO is determined shortly after the dilution is
made, all oxygen uptake occurring after this measurement is
included in the BOD measurement.
b. Sampling and storage: Samples for BOD analysis may degrade
significantly during storage between collection and analysis, resulting in
low BOD values. Minimize reduction of BOD by analyzing sample
promptly or by cooling it to near-freezing temperature during storage.
However, even at low temperature, keep holding time to a minimum.
Warm chilled samples to 20 3oC before analysis.
18

Medicin de BOD por el mtodo estndar

Es problemtico medir
varias muestras
simultneamente
Sin sensor
electroqumico de
DO (oxgeno
disuelto) la titulacin
consume mucho
tiempo
Muestras grandes,
diluciones intensivas

19

Mas inconvenientes del mtodo

estndar para medir BOD
u Tiempo

de medicin muy largo

u No se puede medir on-line (por lo tanto
incapacidad de tomar acciones
correctivas en plantas de tratamiento)
u Dificultad de producir equipos
porttiles para gestin medioambiental

20

Biosensor para Toxicidad

Biosensores
Microbianos
para la determinacin de
toxicidad total estn
basados en la
inhibicin del
metabolismo, medido
como disminucin de
la produccin de luz en
bacterias luminiscentes,
disminucin de la
respiracin u otros
indicadores
metablicos.

Biosensores Enzimticos Basados

a)

b)

en dos principios bsicos:

Utilizando una enzima que
degrada el txico que se quiere
medir. Por ejemplo, la enzima
polifenol oxidasa para medir
fenol
Utilizando la inhibicin de la
actividad enzimtica provocada
por diversos txicos en enzimas
sensibles; rgano fosforados y
carbamatos inhiben fuertemente
la acetilcolinesterasa
21

El Riachuelo. Muchas veces el efecto de

la contaminacin no es tan evidente

22

Biosensores de Alerta Temprana, estado

de desarrollo a nivel mundial
u

Diferentes organismos son utilizados, desde bacterias a peces.

23

Sistemas (redes) de Alerta Temprana

funcionando en USA
ORSANCOOhio River Valley Water
Sanitation Commission.
Lower Mississippi River early warning system.
Delaware Valley early warning system.
Upper Mississippi River early warning system

Algunos usan biosensores basados en bacterias

(Microtox), otros basados en almejas, algas o
microinvertebrados.
Casi todos miden tambin parmetros fsicoqumicos del agua, por ejemplo usando una sonda
multiparamtrica (temperatura, pH, oxgeno
disuelto y conductividad).
(BEWS) biological early warning systems
24

Los sistemas usados en otros ros no

se adaptan a los grandes ros
sudamericanos
Alta cantidad de slidos en suspensin (Pilcomayo), lo que
impide el funcionamiento de cualquier sistema ptico, as
como dificulta la supervivencia de peces y almejas.

25

Pocos biosensores de toxicidad en el mercado

Bio-Sensor model 7008.

Algae Toximeter - Online

Biomonitoring Using
Green Algae

What These Fish Know

Can Hurt You!
Employing fish sensors,
the Bio- Sensor detects
the presence of a broad
range of toxic substances.
Changes in ventilatory
behavior and certain
locomotor activities are
detected immediately
through noninvasive
electronic sensors in each
tank

Biological Monitoring, Inc. (BMI)

Virginia, USA

bbe Moldaenke GmbH

Alemania

26

Desarrollo de Tecnologa, Grupo Biosensores

Proyecto Pilcomayo

Proyecto BOD
Biosensor para la determinacin de
la Demanda Bioqumica de Oxgeno
Se desarrolla un mtodo
electroqumico, para medir de
manera rpida el BOD. El mtodo
se basa en la utilizacin de
compuestos mediadores (como el
ferrocianuro) que son reducidos
por el metabolismo microbiano, el
aumento de su concentracin (en
su forma reducida) en el medio es
proporcional al BOD

Desarrollo y Construccin de un Sistema

Automtico de Alerta Temprana para el Ro
Pilcomayo.
Disear y construir un sistema que
permita monitorear en forma continua o
discontinua el estado general del agua de
ros de la cuenca del Pilcomayo, que
permita detectar eventos anmalos,
bsicamente el incremento de la
toxicidad por presencia de elevadas
concentraciones de metales pesados u
otras sustancias qumicas.
Equipo:
Pablo Nuez (estudiante Biologa e Ingeniera),
Leonardo Cantoni ( Tecnlogo), Celina Bonetto
(Biloga) y Eduardo Cortn (Director)
Patrocinado por la Subsecretaria de Recursos
Hdricos

Equipo:
Anah Weinstock (Qumica), Dra. Liliana
Fraigi (Ingeniera Electrnica), Norberto
Mancuso (Qumico) y Eduardo Cortn
FCEyN, UBA; INTA; DIRANSA (PYME)

25mV/s
50mV/s
100mV/s

40
30
20
10

0
-10

5mV
ferro/ferri
cupla_B

-20
-30
-40
-50
-60
-70
-600

-400

-200

mV

200

400

600

27

Proyecto BOD
Tres diferentes enfoques para medir BOD rpida
1) Basado en biosensor potenciomtrico de dixido de carbono, con
comunidad microbiana mixta inmovilizada en membrana. Se ha
publicado, y el material especifico se encuentra en estudio por la
oficina de patentes del CONICET, evaluando su patentabilidad.
2) Basado en respirometra de ferricianuro. Se ha enviado un poster, se
esta preparando una publicacin, y de acuerdo a los resultados se
considerar la posibilidad de proteccin
3) Basado en Celdas de Combustible Microbianas. Estudios a nivel
acadmico, acerca de las comunidades microbianas que colonizan los
electrodos y crecimiento de biofilms sobre electrodos.

28

Proyecto BOD
Basado en respirometria de ferricianuro
Se desarrolla un mtodo electroqumico, para medir de manera rpida
el BOD. El mtodo se basa en la utilizacin de compuestos
mediadores (como el ferrocianuro) que son reducidos por el
metabolismo microbiano, el aumento de su concentracin (en su forma
reducida) en el medio es proporcional al BOD
Equipo:
Celina Bonetto, Natalia Sacco, Anah Weinstock (Qumica), Dra. Liliana
Fraigi (Ingeniera Electrnica), Norberto Mancuso (Qumico) y Eduardo
Cortn FCEyN, UBA; INTA; DIRANSA (PYME)
25mV/s
50mV/s
100mV/s

40
30
20
10
0

-10

5mV
ferro/ferri
cupla_B

-20
-30
-40
-50
-60
-70
-600

-400

-200

mV

200

400

600

29

Proyecto BOD
Basado en sensor potenciomtrico de dixido de carbono

-62
-64
-66

-10
-64

-20

-68

-72

Y = -77.48 + 0.374 X
r2 = 0.991

-76

-68

Biosensor response (mV)

Biosensor response (mV)

-60

-60

Biosensor response (mV)

-58

10

20

30

40

50

-1

BOD 5 (mg L )

-70
-72
-74

-30
-40
-50
-60
-70

-76
-80

-78
0

50

100

Tim e (minutes)

150

200

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

-1

Glucose (m g L )

30

Orgenes y objetivos del

Proyecto Pilcomayo
u

u
u

Durante el ao 2007, se realizan reuniones con el Ing. Claudio Laboranti y la Lic. Mariana Jakomin para analizar las
posibilidades existentes para un sistema de alerta temprana; las caractersticas esperadas/necesarias del biosensor se definen
con el Dr. Andrs Rodrguez y sus colaboradores durante los aos 2009 y 2010, para el desarrollo y construccin de un sistema
de alerta temprana.
La cuenca trinacional del Ro Pilcomayo es puede ser afectada por contaminacin en la cuenca alta o media. Existe la necesidad
de conocer la calidad del agua en Misin La Paz.
Son requisitos que funcione de manera automtica, analice y transmita datos, y pueda sobrevivir a condiciones extremas de
temperatura, as como a fluctuaciones en la provisin de energa elctrica.

El proyecto empieza a
ser delineado.
Porque se necesita un sistema de alerta temprana?
Los ros son vulnerables a eventos de contaminacin
que (muchas veces) no son reportados.
La deteccin temprana permite una respuesta temprana
por las Agencias Regulatorias, minimizando los daos y
sus costos asociados.
No se puede gestionar un recurso sin conocerlo. Hasta
ahora la informacin disponible no es abundante.

31

El grupo Pilcomayo
Pablo Nuez (estudiante Biologa e Ingeniera)

Diseo del software y firmware de los

dispositivos involucrados en el biosensor.
Desarrollo y puesta a punto de tcnicas de
fabricacin in-house de circuitos impresos.
Trabajo conjunto con Leonardo Cantoni en
la instalacin y puesta a punto de las
instalaciones para comunicacin.

32

El grupo Pilcomayo
Leonardo Cantoni
Desarrollos Electrnicos e Informticos
Sistemas de campo en ambientes extremos
Adquisicin, control y transmisin de datos.
Experiencia en el rea de Oceanografa Antrtica (I.A.A.),
instrumental cientfico de laboratorio y de campo.
Participacin en proyectos multidisciplinarios nacionales e
internacionales .
Experiencia Docente en el rea de informtica nivel
terciario (Prof. CON.SU.DEC)

33

El grupo Pilcomayo
Celina Bonetto (Biloga)

Lic. Bonetto
Mara Celina

Microbiologa: Eleccin de
cepa bacteriana sensible ante
la presencia de metales
pesados. Estudio de
condiciones de crecimiento
ptimas.
Bioensayos: Estudios de
metabolismo bacteriano
(respiracin) empleando un
electrodo de CO2. Anlisis de
muestras artificiales con
metales pesados. Anlisis de
muestras de agua del Ro
Pilcomayo.

34

Avances del Proyecto: Esquema en

Bloques

35

Avances del Proyecto: sistema

electromecnico

Diagramacin del sistema electromecnico

Anlisis de las opciones disponibles
Diseo preliminar
Tanques de Reactivos
Dispensers automticos
Sistema de movimiento de Sensores
Cinta transportadora Muestras
Recipientes de muestras
Bacha de lavado y desage
Sist. Lavado automtico
Sistema de Control y
transmisin de datos

36

Desarrollo de electrnica compatible

con proyecto Pilcomayo
. Hasta el momento se han utilizado placas ADC comerciales, principalmente de
National Instruments; si bien estas placas son perfectas para las etapas de
desarrollo, el costo de las placas ADC sumado al software propietario de
National Instruments hace necesario que su reemplazo por tecnologa propia
Caractersticas tcnicas de la placa ADC-Minicomputador, 16 canales
Computador monoplaca basado en el microcontrolador LPC2478 de NXP
(ARM7, 512KB Flash, 32KB SRAM, controlador LCD) con 16 MB de RAM
dinmica externa, slot para tarjetas SD/MMC, USB host y device (1 y 1),
bus CAN, Ethernet 10/100, puerto RS-232, conectores para interfaz a
travs de I2C y SPI, conector JTAG, conector para display LCD (STN o
TFT). 16 canales de adquisicin de 16-bits de resolucin mxima, 125
kilomuestras por segundo (mximo). Pueden utilizarse sistemas
operativos GNU/Linux o FreeRTOS, adems de firmware especfico
desarrollado ad hoc para aplicaciones en particular. Aplicaciones posibles:
adquisicin de datos (local y remota), automatizacin, control industrial,
robtica.
37

Desarrollo de electrnica compatible con

proyecto Mastitis y Pilcomayo

38

Avances del Proyecto: sistema de

adquisicin y control
Diseo y armado de una microcomputadora basada
en placas industriales Intel para biosensor.
Primera versin de una distro Linux para sistemas
embebidos optimizada para biosensor.
Interfaz con modem GSM/GPRS para transmisin
de datos y emisin de alertas via SMS.
Instalacin y puesta en funcionamiento del foro y
del wiki de desarrollo con documentacin del
proyecto. (Slo uso interno de momento)

39

Avances del proyecto, seleccin de cepa

microbiana, transductor y ensayos
Eleccin de cepa bacteriana
Pseudomonas putida KT2440:
u Sensible a metales pesados como
Pb2+, Cr6+, Zn2+, Cd2+, Hg2+.
u Requerimientos nutricionales
medios, temperatura ptima 32 C,
resistente a la liofilizacin, aerobia
estricta.

P. putida es tan sensible como V. fischeri

a metales pesados.
Condiciones de incubacin y crecimiento
ms sencillas para P. putida.

Tabla: Patrones de inhibicin comparando el

crecimiento de V. fischeri y P. putida

40

Proyecto Pilcomayo

Incubacin por 60 min

Figura 1. Esquema que muestra el flujo de la seal que proviene desde
las soluciones prueba (control y muestra). Se obtiene una grafica de E
(mV) vs. tiempo. Se utiliz una frecuencia de toma de datos de 1 Hz).

Concentraciones de 1,48 mg/l de 3,5diclorofenol son efectivamente

detectadas por el sistema de medicin
como EC50. Estos valores presentan un
limite de deteccin menor a los
informados para ensayos que utilizan la
misma bacteria, pero diferente mtodo
de deteccin y principio de
funcionamiento (anlisis colorimtricos
y crecimiento, respectivamente, ISO
10712:1995 [1], que son de 21,4 mg/l.
Los resultados se presentan aqu luego
de 60 min de incubacin y son
favorablemente comparables a los
valores publicados en la norma
internacional ISO 10712 que estipula

tiempos de incubacin de 16 hs.

41

Futuro de la utilizacin de
biosensores en monitoreo ambiental

Mtodos inespecficos, BOD

y Toxicidad
Mtodos especficos,
basados en genes reporters
o interaccin antgeno anticuerpo

A portable biosensor called RAPTOR

Plus for detecting pathogens.
Antibody-coated, fiber-optic probes
are secured inside disposable
plastic cartridges in the center
hatch. Up to four target pathogens
can be detected simultaneously in
only 10 min.

Problemas:
Es necesario validar los
biosensores respecto a
mtodos aceptados
Falta aceptacin legal
acerca de su utilizacin
Limites de deteccin
relativamente altos
considerando
legislacin ambiental
actual (poco sensibles
en general)
42

El proyecto y nuestra visin

El proyecto Biosensores utiliza un sistema de
monitoreo de calidad de agua especficamente
desarrollado para su utilizacin en aguas turbias,
como la de los grandes ros sudamericanos. Incluye
la medicin de parmetros fsico-qumicos del agua
en forma continua.

El proyecto es mucho ms que

Biosensores; se desarrollan tambin
los sistemas de comunicacin,
procesado y circulacin de la
informacin va WEB. Este podra
ser el comienzo de una Red Nacional
de Monitoreo Automtico de
Calidad del Agua, siguiendo la
tendencia de los pases ms
industrializados.
43

Gracias por su tiempo!

44

Importancia de la medicin de BOD

Efecto de diferentes
volmenes de
descarga cloacal en
el curso de un ro.
La descarga mayor
(inaceptable) no
puede ser depurada
por el ecosistema,
ocasionando
perjuicios (muerte de
peces y otros
organismos, perdida
de calidad del agua,
etc.).
45

Biosensor para BOD y Calibracin

Biosensores. Las clulas se
inmovilizan utilizando
membranas de filtracin
(similar a papel de filtro) u
otros mtodos (geles) al
electrodo. La seal elctrica
entregada por el electrodo
es medida y registrada en
forma contina. Mediante el
agregado de patrones se
puede calcular la BOD de
una muestra incgnita. El
patrn es una mezcla
estandarizada de material
orgnico.
46

Mtodo especifico, RAPTOR

A portable biosensor called RAPTOR Plus for detecting pathogens. Antibodycoated, fiber-optic probes are secured inside disposable plastic cartridges. Up to
four target pathogens can be detected simultaneously in only 10 min.

47

Limits of detection for toxins and pathogens using a 1010minute assay performed with RAPTOR
Hazard

Type and Limit of Detection

Staphylococcal enterotoxin B (SEB)

Ricin
Cholera toxin
Yersinia pestis F1
Bacillus anthracis
Bacillus globigii
Brucella abortus
Francisella tularensis
Giardia lamblia

Toxin, 1 ng/ml
Toxin 10 ng/ml
Toxin 1 ng/ml
Bacterial surface protein 10 ng/ml
Gram positive bacterium (vegetative form) 50 cfu/ml
Gram positive bacterium (spore) 5 x 104 spores/ml
Gram negative bacterium 7 x 104 cfu/ml
Gram negative bacterium 5 x 104 cfu/ml
Protozoan cysts 3 x 104 cysts/ml

48