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Reao de precipitao
Reao de aglutinao
ELISA
Radioimunoensaio (RIA)
Imunofluorescncia/Imunohistoqumica
Western Blotting
Citometria de Fluxo
OBS-Reaes Reversveis
Afinidade
Quanto maior a afinidade do anticorpo pelo antgeno,
mais estvel ser a interao.
Alta Afinidade
Baixa Afinidade
Ac
Ac
Ag
Ag
Especificidade
A capacidade de ligao da regio varivel de
Aglutinao/Hemoaglutinao
Aplicaes:
-Tipagem sangunea (ABO), Coombs (Rh),
VDRL (sfilis), ASLO (anti-estreptolisina O),
Fator Reumatide , bHCG, Protena C Reativa.
-Deteco de aumento do ttulos de Ac (4x)
(infeces virais e bacterianas - soroconverso)
Aglutinao/Hemoaglutinao
Principio formao de imunocomplexos pela de equivalncia de Ag e Ac
Zona de maior
Aglutinao
Aglutinao/Hemoaglutinao
- Vantagens: Mtodo simples, de fcil execuo,
baixo custo, rpido;
3) Controle negativo:
4) Mistura-se:
negativo
positivo
Imunoprecipitao
Anticorpo livre
Antgeno livre
+
-
=
=
Zona de
equivalncia
Zona de excesso
de antgeno
Percentual de
imunocomplexo
precipitado
Zona de excesso
de anticorpo
Imunoprecipitao
Os ensaios baseados no princpio da precipitao
possuem sensibilidade de deteco menor quando
comparados a outras tcnicas imunolgicas, j que h
necessidade de formao de grandes complexos Ag-Ac
para serem detectados.
Atualmente, sistemas automatizados que utilizam o
princpio da precipitao so utilizados:
Nefelometria
Turbidimetria
MTODOS
APLICAES
ELISA
- Pesquisa
- Diagnstico
- Soroepidemiologia
ELISA direto
COR
Substrato
(OPD)
COR
COR
Anticorpo
primrio
LAVA 3x
Aplicaes:
1)
2)
ELISA indireto
substrato
Anticorpo
secundrio
LAVA
LAVA3x
3x
cor
cor
Anticorpo
primrio
Radioimunoensaio (RIA) e
Ensaio Imunoradiomtrico (IRMA)
Mtodo quantitativo.
A reao Ag-Ac medida pela deteco de radioatividade.
Teste de alta sensibilidade, comparvel ao ELISA (pois utiliza
bascamente o mesmo princpio boa amplificao ).
Desvantagens:
- custo mais caro que o ELISA
- no utiliza reagentes estveis (radioistopos)
- decaimento do reagente (trtio H3 ou I125)
- eliminao de resduos da reao
total de radiao mdia anual de exposio = 0,012 mGy
beta counter
I 125
MTODOS
Imunofluorescncia
e
Imunohistoqumica
APLICAES
- Pesquisa
- Diagnstico
-Epidemiologia
-Marcadores tumorais
Imunofluorescncia (IFA)
Princpio da tcnica:
Anticorpos ou antgenos so conjugados a um fluorocromo,
que, quando excitado por radiaes luminosas em um
determinado comprimento de onda, emite luz no espectro
visvel.
A reao feita em lminas de microscopia e a observao
em um microscpio de fluorescncia
Principais fluorocromos: AMCA, GFP, FITC, Rodomina,
TRITC, Texas Red., DAPI, Iodeto de Propdeo.
Imunofluorescncia (IFA):
DIRETA (Ac diretamente conjugado ao fluorocomo):
Deteco direta de microrganismos em secrees, na urina, nas
fezes, em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem
de clulas tumorais, e doenas imunolgicas renais e de pele.
Imunofluorescncia (IFA):
IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA
IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA
Imunofluorescncia (IFA)
lmpada de mercrio
Imunofluorescncia
Treponema pallidum
Pneumocystis carinii
Tripanosoma cruzi
Giardia lamblia
Imunofluorescncia de tecido
-Mtodo muito usado em pesquisa cientfica para deteco de citocinas e
quimiocinas. Possibilita viso da distribuio espacial de clulas produtoras.
-Pode ser feito em cortes de tecido congelado o fixado em formol e emblocado em
parafina
puntiforme
Microscpico faz a de varredura da amostra
Fatiamento ptico produz qualidade de imagem superior da
Z
Y
Imunohistoqumica
-Mtodo muito usado em pesquisa cientfica, mesmo princpio da IFA porm
utiliza marcadores enzimticos (peroxidase, fosfatase alcalina).
Western Blotting
Western Blotting
Associao de tcnica de Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
celulares.
Western Blotting
praticamente um ELISA em fase slida
Aplicaes :
HIV I e II/AIDS, Human T Lymphotropic Virus (HTLV I/ II) ,
Simian Immunodeficiency Virus (SIV) e Helicobacter
pylori.
2) As protenas so
transferidas para uma
membrana de
nitrocelulose
*
*
ENV
CAP
alta
sensibilidade
e
especificidade;
reconhecimento de antgenos individuais em um extrato;
realizao de perfil de reconhecimento de antgenos e
determinao de protenas imunodominantes;
Citometria de Fluxo
CITO
METRIA
Clula
Medida
FLUXO
Movimento
Citometria de Fluxo
DEFINIO:
Tecnologia
que
mede
e
analisa
simultaneamente
caractersticas
fsicas
mltiplas em partculas (usualmente clulas) na
medida que fluem ordenadamente em frente a
um feixe de laser.
Citometria de Fluxo
Quais parmetros ?
Complexidade
Tamanho
Antgenos celulares
Metabolismo
Enzimas
DNA
Receptores
Citocinas
Citmetro - Princpio
Agulha de
injeo
Lquido de
envolvimento
Laser
Disperso laser
Ponto de Hidrofocagem
Citmetro Parmetros
Tamanho e
complexidade celular
Fluorescncia
(Ac monoclonais + fluorocromos)
Numero de eventos
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Intensidade de Fluorescncia
SSC - complexidade
Citometria de Fluxo
FSC e SSC
FSC - tamanho
Citmetro Fluorocromos
Definio: molculas capazes de absorver luz em um
determinado l e emitir em outro l.
Fluorescena
(FITC)
l = 488 nm
O
H
l = 525 nm
CO2H
Luz Incidente
(AZUL) de
maior energia
Fluorocromo
CD8CD4-
CD4+
Citometria de Fluxo
4) Anlise
de dados
2) Leitura no
citmetro
3) Processamento
de dados
15%
33%