ANTOLOGA BIOMEDICINA Dra.

Beatriz Eugenia Baca 2013

MUTACIN
En gran medida la gentica es el estudio de las diferencias heredadas. Pero adems, el
anlisis gentico no es posible sin el estudio de variantes organismos que presentan
diferencias en uno o varios caracteres particulares - . Como se originan stas variantes?
La respuesta es que el DNA o el material gentico no es considerado estable de manera
absoluta; cada base de ste exhibe cierta posibilidad de sufrir un cambio. Ese cambio se
denomina Mutacin. Estos cambios heredables cubren un amplio rango de clases de
cambios diferentes. En este curso nos enfocaremos a los eventos que tiene lugar en los
genes. mutaciones genticas.
Examinaremos las clases de alteraciones genticas que ocurren en la molcula del
DNA y las consecuencias de estos cambios en la estructura gentica y su funcin.
Estos eventos pueden ser tan simples como el cambio de una base por otra. O bien
una mutacin puede implicar el cambio en el nmero de copias de una secuencia
repetida (i.e. AGCAGCAGC que se cambia a: AGCAGCAGCAGCAGCAGC
AGCAGCAGC). Adems otras mutaciones son debidas a la integracin de DNA
que ha evolucionado especficamente con la capacidad de integrarse en algn sitio
en el genoma y por lo tanto se llaman elementos genticos mviles o elementos
transponibles
Tambin estudiaremos por cul mecanismo molecular las mutaciones se originan?
Consideraremos los mecanismos moleculares de ciertos agentes mutagnicos, que
aumentan la frecuencia de las mutaciones.
CATEGORAS MOLECULARES DE LAS MUTACIONES GNICAS
Consideraremos clases diferentes de mutaciones gnicas:
Mutaciones que afectan un simple cambio de una base. Llamadas mutaciones
puntuales _cambio de una sola letra del libro de DNA_. Las dos clases de
mutaciones puntuales son:
Mutaciones en el cual la base es cambiada por otra y se denomina mutacin
sentido errneo, y mutacin sin sentido, o bien
Mutaciones en las cuales un base extra se inserta, o una base se elimina (deleta).
Mutaciones alterando el nmero de copias de una secuencia pequea repetida en el
gene.
Mutaciones con un bloque grande de DNA que se incorpora a la secuencia normal
del DNA de un gene.
MUTACIONES PUNTUALES.
Las posibilidades en que una sola base puede cambiar es muy grande y varia de acuerdo a
la estructura y secuencia particular del gene. Su origen se dividen en mutaciones inducidas
y son aquellas que se originaron por el tratamiento con agentes mutagnicos, que se
conocen que aumentan la frecuencia de la mutacin. Mutaciones espontneas que se
originan en ausencia de un agente mutagnico conocido. Son las responsables de la
frecuencia basal de mutacin y presumiblemente la fuente ltima de variacin gentica en
las poblaciones. La frecuencia a la cual una mutacin espontnea se presenta es baja,
generalmente en el rango de 10-5-10-8 . Por lo tanto, si un nmero significativo de
mutaciones son necesarias para realizar un anlisis gentico, las mutaciones debern
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inducirse. La induccin de la mutacin se acompaa del tratamiento de las clulas por el
agente mutagnico. Los ms comunes son las radiaciones de alta energa o agentes
qumicos especficos; ejemplos de stos y su eficacia se dan en la siguiente tabla.
Frecuencias de mutacin obtenidas con varios agentes mutagnicos en Neurospora
________________________________________________________________________
Tratamiento
Tiempo
Sobre vida
Nmero de ad3 mutantes
De exposicin
(%)
po 106 clulas
Min.
_________________________________________________________________________
No tratamiento (espontneo)
100
~ 0.4
Amino purna (1-5mg/ml) durante el crecimiento
100
3
Etilmetano sulfonato (1%)
90
56
25
cido nitroso (0.05M)
160
23
128
Rayos X (2000r/min)
18
16
259
Metil metan sulfonato (20mM)
300
26
350
Rayos UV (600ergs/mm2/min)
6
18
375
Nitrosoguanidina (25mM)
240
65
1500
Acridina mostaza (5mg/ml)
480
28
2287
_________________________________________________________________________
La diferencia entre mutaciones inducidas es slo operacional. Las mutaciones inducidas se
pueden originar a travs de diferentes mecanismos.
Ocurren dos tipos de cambios puntuales en el DNA: Substituciones de bases y Adiciones o
deleciones de bases . Sustituciones de bases, cuando una base es reemplazada por otra. Se
dividen en dos subtipos: transiciones o transversiones. Transiciones sustitucin de una base
por otra de la misma categora qumica. Una transversin es el reemplazo de una base de
una categora qumica por otra de otra categora. La otra clase es la adicin o deleccin de
una sola base y se les llama indel.
Consecuencias de las mutaciones puntuales en la funcin de la protena:
Mutaciones sinnimos. El cambio del codn de un amino cido, es cambiado por un
codn que especifica el mismo amino cido.
Mutaciones de sentido errneo, el codn de un amino cido es cambiado por otro
codn que especifica otro amino cido. Sustitucin conservativa, cuando se
reemplaza un amino cido que es qumicamente similar, es probable que la
alteracin sea menos severa en la estructura de la protena y su funcin.
Sustituciones no conservativas, es ms probable que los cambios en la protenas
tengan consecuencias ms severas.
Mutaciones sin sentido, se cambia el codn de un amino cido por un codn que no
especifica amino cidos; son los codones sin sentido. Estas mutaciones tienen
efectos severos en la funcin de la protena porque terminan sta prematuramente.
Las mutaciones indel pueden tener consecuencias que se extienden ms all del
gene que afectan ya que cambian la fase abierta de lectura. Estas mutaciones
provocan que la secuencia traducida de la protena no tenga relacin con la
secuencia de la protena original. Estas mutaciones exhiben una prdida total de la
funcin.

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Las mutaciones obviamente pueden ocurrir en sitios que regulan la expresin gentica. Las
ramificaciones de las mutaciones que se presentan en sitios que no son expresadas son ms
difciles de predecir. En general, las consecuencias funcionales de una mutacin puntual en
esas regiones depende de su localizacin, i.e. que distorsione el sitio de unin a una
protena. Las mutaciones que alteran los sitios tienen cambios potenciales en el patrn de
expresin de un gene(s).

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MECANISMOS DE INDUCCIN DE MUTACIONES PUNTUALES.

Los agentes mutagnicos actan por medio de tres mecanismos. Pueden reemplazar una
base del DNA, alterar una base de tal manera de provocar errores en el apareamiento
normal de las bases, y daar la base para que no se unan como lo hacen en condiciones
normales.
Reemplazo de una base. Algunos compuestos qumicos son bastante similares a las bases
normales del DNA que ocasionalmente se incorporan en el DNA, en lugar de las bases
normales; estos compuestos se llaman anlogos de bases. Muchos de estos anlogos
tienen propiedades de apareamiento diferentes de las de las bases normales; por lo que,
producen las mutaciones por los apareamientos incorrectos durante la duplicacin del
DNA. Para entender la accin de los anlogos de bases, se debe de considerar la tendencia
natural de los anlogos para asumir formas diferentes.
La bases pueden existir en varios estados qumicos llamados tautmeros , los cuales son
ismeros que difieren en las posiciones de sus tomos y en las uniones entre los tomos.
Las formas estn en equilibrio. La forma en que se encuentran en el DNA es la ceto ,
mientras que la forma enol es rara. Una base que est en la configuracin enol puede
cambiar espontneamente a ceto, y lo contrario tambin sucede. Cuando esto es as se da
lugar a apareamientos raros. Provocando errores los cuales son la fuente de mutaciones
espontneas. Por ejemplo, la base guanina cambia a su forma enol en el momento en que
se copia durante la replicacin ( y vuelve a cambiar a su forma ceto). La forma enol se
unir a la timina. Por lo que se puede representar el proceso mutagnico de la siguiente
forma, en donde G* es la forma enol de la G:
G. C
G* . C. primera ronda de replicacin
G .T. y G . C
G.T
segunda ronda de replicacin
G.C y A.T
El cambio de G . C por A . T representa una transicin.

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Si en el curso de la replicacin la base que se incorpora sufre una enolizacin G* se unir a
una T en el DNA, la consecuencia es una transicin A . T
G.C:
A.T
primera ronda de replicacin
A . T y G* . T
G .T.
segunda ronda de replicacin
G.C y A.T
Los errores de apareamiento pueden originarse cuando las bases son espontneamente
ionizadas. El agente mutagnico 5-bromo uracilo (5-BU) es un anlogo de la timina que
tiene un Br en la posicin 5 en lugar del grupo CH3 de la T. Su accin mutagnica est
basada en la enolizacin y ionizacin de su estructura qumica. La forma ceto se une con la
A, como lo hace la T. Sin embargo, la presencia del tomo de Br altera la distribucin de
los electrones del anillo, lo que hace que el 5BU cambie frecuentemente de la forma enol a
la ionizada y as se aparee con la G. El 5BU provoca transiciones en el curso de la
replicacin dependiendo si est en la forma enol, o ionizado en la molcula de DNA o
como la base que va a ser polimerizada:
G.C
A.T o A.T
G.C
Otro anlogo muy utilizado como agente mutagnico es la 2-aminopurina (2-AP), la cual
es un anlogo de la adenina que se aparea con la T. Cuando est protonada, la 2-AP se une
con la C. Por lo tanto, genera transiciones A . T
G . C, por error en el
apareamiento con la 2-AP en la replicacin siguiente. O la 2-AP se incorpora con la C,
entonces G . C
A . T como resultado se observa una transicin, cuando la 2-AP
se une a la T en la replicacin siguiente. Los estudios genticos han demostrado que el 5BU y la 2-AP son especficos para producir transiciones.
Alteracin de las bases. Algunos mutgenos no son incorporados en el DNA, sino ms bien
alteran las bases, provocando un error de apareamiento. Los ms usados son los agentes
alquilantes como: el etil metano sulfonato (EMS) y la nitroso guanidina (NG)
O

CH3
O N N

H2C5-O-S-CH3

C N

EMS

NO2
NG

Estos agentes adicionan grupos metilo y etilo a las bases por ejemplo en el o-6 de la G para
dar la etil-G. La alquilacin conduce a un apareamiento errneo con la T, dando como
resultado en la siguiente ronda de replicacin transiciones de G . C
A . T. Los
agentes tambin pueden alquilar una base que se incorpore al DNA durante la replicacin.
Intercaladores. Los agentes que se intercalan en el DNA como la proflavina, naranja de
acridina y una clase de compuestos llamados ICR. Son molculas planas que imitan el
apareamiento de bases y son capaces de intercalarse entre las bases del DNA; al hacer esto
desestabilizan la doble hlice. Y al momento de la replicacin la DNApol introduce o
elimina un par de bases provocando deleciones o inserciones y alteran la fase abierta de
lectura.
Agentes que daan al DNA, ejemplos de stos tenemos a los rayos UV. Los cuales generan
un nmero de fotoproductos en el DNA, cuando ocurren dos pirimidinas adyacentes se
forman dmeros que distorsionan la estructura de la doble hlice. El resultado final es una
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transicin de C
T, aunque tambin pueden provocarse deleciones o cambios en la
fase de lectura abierta.
La aflatoxina B1 (AB1) es un poderoso agente cancergeno, producida por ciertos hongos.
La aflatoxina se une de manera covalente a la G en la posicin N-7. el producto generado
conduce a un rompimiento de la unin N-glucosdica y a una depurinizacin del sitio. El
sistema SOS de la clula repara el DNA lesionado, pero incorpora una A. Por lo que este
tipo de agentes conducen a transverciones G . C
T . A.
ELEMENTOS GENTICO MVILES Y MUTACIN
Otro mtodo de cambios en el DNA de un genoma es la transposicin, que es el
movimiento de DNA de un lugar a otro. Los segmentos de DNA capaces de efectuar este
fenmeno se denominan transposones. Estos elementos inicialmente se consideraron como
que se encontraban en pocas especies en sus genomas, sin embargo hoy se considera que
estn presentes en la mayora de especies y organismos. En efecto, en el genoma humano se
considera que ocupan alrededor de la mitad del mismo (activos o inactivos); mientras que el
de las plantas es sustancialmente la fraccin mayoritaria!! Se sabe que varios virus son
tambin elementos transposables, por ejemplo algunos retrovirus pueden integrarse en el
genoma para formar retrovirus endgenos. Los elementos mviles pueden moverse entre
los genomas (entre los individuos de la especie), entre el mismo genoma. Dada su
prevalencia sus funciones empiezan a ser conocidas.
Tiene efectos importantes sobre los genes y sus fenotipos, por lo que son sujetos a intensa
investigacin.
La transposicin se relaciona con la replicacin, reparacin del DNA y recombinacin. El
proceso de movilizar de un lugar a otro del genoma implica un tipo de recombinacin, la
insercin del elemento llega a causar mutaciones, y algunas transposiciones son
replicativas, generando una copia del mismo que permanece en el sitio original intacta.
Otros elementos no se replican y cuando se mueven el genoma que lo contena lo pierde.
Propiedades y efectos de los elementos transponibles.
La caracterstica esencial de los elementos translocables es su movilidad, es decir son
capaces de moverse de un sitio a otro del genoma. Estos presentan una considerable
diversidad. Algunos se mueven como intermediarios de DNA y otros a RNA (retrovirus).
Independientemente, de su mecanismo de movilidad todos los elementos translocables al
insertarse en los genomas rompen las cadenas de material gentico. Algunos eventos de
transposicin inactivan los genes, ya que la capacidad de codificacin expresin de los
genes es alterada por la insercin del elemento.
Los elementos genticos mviles (tambin llamados transponibles) codifican para catalizar
la transposicin del elemento de un sitio del genoma a otro. Los elementos mviles varan
en tamao de pocas a miles pares de bases de DNA; cuando se insertan en un gene
interrumpen su expresin y se altera completamente su funcin. En regiones reguladoras,
pueden alterar parcial o completamente inactivar el gene adyacente, dependiendo de cmo
interfieran con las interacciones entre los sitios reguladores y el promotor del gene.
Algunos elementos mviles portan sus propios elementos reguladores, la insercin de este
elemento puede provocar que el gene adyacente se exprese en condiciones donde
normalmente no lo hace. Esta expresin conduce a una ganancia de la funcin con un
fenotipo dominante de la mutante.
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Secuencias
Reguladoras

regin codificante
de la protena

Gene

Inicio de
la transcripcin

La insercin del transposn puede

daar o no la integridad de los
sitios de regulacin.

termino
de transcripcin

La insercin del transposn interrumpe

la secuencia de la protena

Ejemplos de elementos genticos mviles. La naturaleza de estos elementos fue descrita

inicialmente en bacteria y fagos.
Secuencias de insercin. Una de las ms sencillas clases de elementos mviles son las
secuencias de insercin (IS). Estos elementos se describieron en procariotes. El nico rasgo
gentico que portan es la capacidad de movilizarse en el cromosoma. Cuando se localiza en
el centro del gene lo inactivan. Se pueden visualizar al microscopio electrnico al construir
un heterduplex, o molcula hbrida de DNA con el alelo silvestre y el mutado que incluye
la secuencia IS. Se observar una asa, que corresponde en alrededor 800 base de largo. Este
ensayo constituye la prueba fsica de las mutaciones por el elemento IS insertado en el gene
mutado.
Existen diferentes familias de elementos IS, clasificacin basada en el tamao y la
secuencia de DNA. Los microorganismos procariotes las contienen en varias copias y
diferentes en sus cromosomas; por ejemplo E.coli contiene ocho copias de IS1, cinco de
IS2, y copias de otros tipos menos estudiados de IS
Secuencias de insercin

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Elementos de insercin
IS

Presencia en E. coli

Longitud
Invertidas repetidas
(pb)
(pb)
_________________________________________________________________________
IS1
IS2
IS3
IS4

5-8 copias en cromosoma

768
18-23
5 en cromosoma y 1 en F
1327
32-41
5 en cromosoma y 2 en F
1400
32-38
1 o 2 copias en el
Cromosoma
1400
16-18
IS5
No se conoce
1250
corta
_________________________________________________________________________
Los elementos IS llevan regiones de secuencias de identidad, que son los sitios de
recombinacin sitio especfica. Por ejemplo la recombinacin entre el cromosoma de E.
coli y el factor F.

Mecanismo de mutacin por insercin del transposon.

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Transposones Estos elementos fueron descritos por vez primera en la bacteria patgena
Shigella. Esta bacteria antes de los aos 50s del siglo pasado era sensible a los antibiticos
de eleccin para su tratamiento. Sin embargo, en hospitales de Japn, los pacientes con
disentera bacilar presentaban una Shigella resistente a muchos de los antibiticos
empleados corrientemente, que inclua a: penicilina, tetraciclina, estreptomicina
sulfonamidas y cloranfenicol. Este fenotipo de multirresistencia fue trasferido en conjunto a
una cepa de laboratorio y a otra cepa sensible de Shigella pero, tambin a varias cepas de
bacterias relacionadas. Desde el punto de vista gentico este evento original hasta entonces,
representaba una situacin muy interesante. El vector que portaba este fenotipo result ser
un plsmido similar al factor F. Este factor R (por resistencia) se encontr ser el primero
de muchos otros que posteriormente se han descrito. Estudios posteriores mostraron la
naturaleza gentica y fsica de este elemento mvil, el cual est constituido de elementos
mviles que portan los determinantes de resistencia y unas secuencias de DNA que lo
flanquean llamadas secuencias invertidas repetidas (IR) . Como un ejemplo est la
secuencia IS10, que lleva la resistencia a la tetraciclina. Las secuencias IR junto con los
genes que portan se denominan transposones (Tn) . Los transposones son por lo tanto, ms
largos que las IS. Aunque los elementos IS y los transposones son elementos encontrados
en procariotes, sus propiedades son tpicas de elementos encontrados tambin en eucariotes.
Los transposones pueden saltar de un plsmido a otro e inclusive a otro cromosoma. Cmo
ocurre la transposicin?
MECANISMOS DE TRANSPOSICIN
Varios mecanismos son empleados por los elementos mviles de procariotes. En E. coli se
han identificado dos mecanismos de transposicin: la replicativa y la conservativa (no
replicativa). En la replicativa, se genera una copia nueva del elemento durante el evento de
transposicin El resultado es que una copia se localiza en el sitio nuevo donde se alojar el
transposn y otra permanece en el sitio original. En la va conservativa el elemento se
escinde del plsmido o cromosoma original y se integra en su sitio nuevo.
Transposicin replicativa Cuando la transposicin de un locus a otro implica la replicacin
del elemento transponible, en estos casos la transposicin est asociada a la replicacin del
elemento. Este evento es mediado por una enzima denominada transposasa, la cual es
codificada por el elemento. Estudios genticos indica que una mutacin en el gene que
codifica para la transposasa es recesiva. Un transposn replicativo es el Tn3. La transposasa
acta participando en la integracin replicativa del Tn y se origina una forma intermediaria
llamada cointegrado. El crculo combinado est constituido por los dos genomas (el que
portaba originalmente el transposn y el que lo recibir). El cointegrado se resuelve por
evento de recombinacin que separa los dos genomas. El resultado final ser la obtencin
de dos genomas con una copia cada uno del Tn, uno localizado en su sitio original y el otro
en el nuevo sitio. Mutaciones en el gene de la enzima que resuelve el integrado, o en el
sitio donde se lleva a cabo la recombinacin llamado sitio interno de resolucin (IRS) ,
hacen que el cointegrado sea estable. El hallazgo de la estructura del cointegrado facilit la
comprensin del mecanismo de transposicin en estos elementos.
Transposicin conservativa. Algunos transposones como el Tn10, se escinden del
cromosoma o plsmido y se integran en el genoma blanco. En estos casos, el elemento no
se replica, y se pierde del sitio original.
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Consecuencias moleculares de la transposicin . Cuando el elemento transpone en el sitio
nuevo genera la secuencia repetida del DNA blanco en ambas transposiciones, conservativa
o replicativa. Por ejemplo la insercin de la IS1 duplica nueve pb. La secuencia blanco del
elemento transponible tiene una longitud caracterstica, puede ser tan pequea como dos pb.
La secuencia repetida es generada durante el proceso de integracin, presumiblemente
catalizada por la transposasa que genera cortes cohesivos en la doble cadena de DNA, en la
cual la cadena sencilla es usada como molde para crear una cadena complementaria. El Tn
se inserta entre estas dos oligmeros repetidos.

Mecanismos de transposicin

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Mutacin por empleo de la reaccin de la PCR.

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CLONACIN
La clonacin molecular se utiliza en una amplia variedad de experimentos biolgicos y las
aplicaciones prcticas van desde la toma de huellas dactilares a produccin de protenas a
gran escala.
En la prctica, con el fin de amplificar cualquier secuencia en un organismo vivo, la
secuencia a clonar tiene que estar vinculada a un origen de replicacin; que es una
secuencia de ADN.
Transfeccin
Se introduce la secuencia formada dentro de clulas.
Seleccin
Finalmente se seleccionan las clulas que han sido transfectadas con xito con el
nuevo ADN.
Inicialmente, el ADN de inters necesita ser aislado de un segmento de ADN de tamao
adecuado. Posteriormente, se da el proceso de ligacin cuando el fragmento amplificado se
inserta en un vector de clonacin: El vector se linealiza (ya que es circular),usando enzimas
de restriccin y a continuacin se incuban en condiciones adecuadas el fragmento de ADN
de inters y el vector con la enzima ADN ligasa.
Tras la ligacin del vector con el inserto de inters, se produce la transfeccin dentro de las
clulas, para ello las clulas transfectadas son cultivadas; este proceso, es el proceso
determinante, ya que es la parte en la que vemos si las clulas han sido transfectadas
exitosamente o no.
Tendremos que identificar por tanto las clulas transfectadas y las no transfectadas, existen
vectores de clonacin modernos que incluyen marcadores de resitencia a los antibiticos
con los que slo las clulas que han sido transfectadas pueden crecer. Hay otros vectores de
clonacin que proporcionan color azul/ blanco cribado. De modo, que la investigacin de
las colonias es necesaria para confirmar que la clonacin se ha realizado correctamente.

EMPLEO DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN PARA CONSTRUIR UN MAPA

Un mapa de restriccin es un mapa lineal con el orden y distancia de los sitios de corte de
las enzimas de restriccin, de un segmento de DNA. Un ejemplo de un mtodo para crear
un mapa de restriccin se da en la fig. En este ejemplo el DNA clonado es digerido en
tubos diferentes con enzimas endonucleasas de restriccin que cortan en secuencias
diferentes; as como se realizan cortes dobles con el juego de enzimas escogidas en el
primer ensayo. Los fragmentos generados se separan por electroforesis en geles de agarosa
y son visualizados por tincin con Bromuro de etidio Bet. Los fragmentos se miden y se
compara su longitud empleando un marcador de masa molecular. Con varias enzimas es
suficiente para construir el mapa, por la determinacin de la localizacin relativa de los
diferentes sitios de restriccin en el fragmento clonado.

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El mapa de restriccin resultante del DNA de varias clonas puede usarse para determinar el
camino ms eficiente a emplear en la etapa siguiente del caminado en el cromosoma. Una
vez que se tiene el mapa de restriccin de varias clonas se decidir la clona a secuenciar.
Adems el orden y se establece el grado de traslape, y el final del fragmento de la clona que
contiene la continuacin en se determina y de hecho se podr utilizar como sonda en la
siguiente etapa. As estas etapas se prolongarn tanto como sea posible. Es importante
destacar que el caminado en el cromosoma es una de las muchas aplicaciones del mapeo
con las endonucleasas de restriccin. En este sentido el mapa es una secuencia parcial de un
segmento de DNA, ya que cada sitio de restriccin es una secuencia determinada
dependiendo de la enzima que se trate. Adems, la tarea de la construccin de clonas para
un segmento particular se facilita si se conoce el mapa y pueden escogerse para emplearse
en ensayos subsecuentes.
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El bacteriofago y los extremos cohesivos. Posterior a la inyeccin en las clulas de E.

coli el genoma del fago forma un crculo unindose en los extremos donde se localiza una
secuencia denominada cos. En el modo lisognico, de replicacin el DNA de fago se
inserta en un sitio determinado denominado att (por sitio de unin), que se encuentran en
ambos genomas. Bajo estas condiciones el DNA se replica como un gen ms del
cromosoma bacteriano. Cuando se presentan condiciones de estrs como radiacin UV o
inanicin el fago se escinde y se replica este es el ciclo ltico del fago. En las partculas
transductrices raras escisiones del fago llevan genes del cromosoma de E. coli, en el lisado.

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Caminado en el cromosoma, empleando una librera genmica de fago y cortes con

enzimas de restriccin.

Mapa de restriccin de un plsmido de un hongo, se muestran los sitios de restriccin para

seis enzimas diferentes.

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Ensayo con enzimas de restriccin para realizar un mapa fsico

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ETIQUETADO DE GENES

El etiquetado de genes es una estrategia muy empleada que permite obtener un gene a partir
de una mutacin del mismo. Para lo cual se emplean los transposones, los cuales se insertan
en el DNA interrumpiendo su funcin. La mutacin se selecciona y posteriormente,
podemos aislar secuencias del gene que flanquean a la resistencia portada por el transposn,
al utilizarla como sonda. La estrategia se explica en la fig. correspondiente. Se prepara una
librera de la mutacin.

Casi siempre se obtiene un evento de insercin. Se infiere que la clona seleccionada que
contiene la insercin lleva secuencias del gene que flanquean al cartucho de antibitico u
otro marcador gentico. El segmento de DNA puede ser clonado directamente en un vector
de secuencia y a partir de iniciadores diseados de las terminales del cartucho de Km por
ejemplo secuenciar los segmentos flanqueantes y definir el gene alterado.
Ejemplo:
Supongamos que deseamos clonar el gene A del hongo Aspergillus, por otra parte tenemos
clonas del gene x+, que emplearemos como la etiqueta. Por transformacin de DNA se
transforma Aspergillus x- en clulas x+. Muchas de las transformantes sern clulas
mutadas en donde x+, se ha insertado al azar. Si se generaron muchas mutantes podremos
encontrar algunas clulas que tengan el gene A mutado por la insercin de x+, en A el gene
que nos interesa clonar, y cuyo fenotipo ahora ser A-. El siguiente paso ser cruzar las
clulas de Aspergillus con clulas x- A+ para determinar si A- y x+, cosegregan. Si es as,
entonces la mutacin A- es causada por la integracin de x+,en el gene. Una librera
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genmica de esta mutante nos permitir obtener el gene usando como sonda el marcador x+.
Para recuperar el gene silvestre se utilizar como sonda los fragmentos obtenidos del gene
A a partir de la mutante.
DETERMINACIN DE LA SECUENCIA DE UN FRAGMENTO DE DNA
Obtener la secuencia final de un gene y del genoma es extremadamente informativa, para
entender el funcionamiento de una protena, la organizacin y regulacin del gene, su
relacin con otros genes, su papel en la interaccin con otros organismos etc. Ahora es ms
fcil obtener la secuencia del DNA de un gene para discernir la secuencia del polipptido.
Como en casi toda la metodologa de DNA recombinante, se explota la complementariedad
de bases, as como el conocimiento de la enzimologa y bioqumica de la replicacin del
DNA. Se han desarrollado esencialmente dos tcnicas, pero la desarrollada por Sanger, o la
dideoxi secuencia es la que con mucho se emplea ms frecuentemente, el trmino dideoxi
proviene del reactivo que se emplea en la tcnica.
La lgica de la tcnica es la siguiente un segmento de DNA es sintetizado como cadena
simple (digamos 5000pb), se desnaturaliza el DNA, o bien si se clon como simple cadena
empleando el DNA del fago M13. Se sintetizar una cadena de DNA en direccin 5
3
Empleando como molde precisamente la cadena complementaria. Se incorpora un cebador,
o iniciador (un oligonucletido de ~ 20 b), se agrega el tampn adecuado y la taq pol. Para
que la reaccin se lleve a cabo es necesario agregar los deoxinucletidos normales
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y una pequea cantidad de un dideoxinucletido especial para
cada una de las cuatro bases (i.e. dideoxiadenina trifosfato, para la reaccin dATP). Como
la sntesis de la cadena complementaria procede, si el dideoxinucletido se incorpora en
lugar del nucletido adecuado, la reaccin se detiene en se preciso punto. Supongamos
que se va a secuenciar la siguiente secuencia de DNA :
5 ACGGGATAGCTAATTGTTTACCGCCGGAGCCA 3
Se har la secuencia a partir de la cadena complementaria con el oligonucletido iniciador
5 ACGGGATAGCTAATTGTTTACCGCCGGAGCCA 3
3
GGCCTCGGT 5
Direccin de la sntesis de DNA
Usando la mezcla de sntesis de DNA especial con ddATP, por ejemplo tendremos un
conjunto de fragmentos sintetizados, cada uno de los cuales tiene el mismo inicio, debido a
que comienzan con el mismo iniciador, pero difieren en cuando al sitio en dnde el ddATP
se incorpora, en lugar del dATP y por lo tanto en dnde la cadena de DNA se detiene. En el
siguiente esquema se ejemplifica el resultado de la reaccin (A* indica el
ddDeoxinucletido).
Se hace un arreglo de los fragmentos para cada uno de los cuatro nucletidos, en cuatro
reacciones separadas (con ddATP, ddGTP, ddCTP, finalmente con ddGTP). Cada una de
ellas originar arreglos de fragmentos de longitudes diferentes. Posteriormente se resuelven
los fragmentos en geles de poliacrilamida, ensayo que permite que los fragmentos se
ordenen de acuerdo con su longitud aumentados por una base cada vez. Al final del proceso
tendremos los fragmentos arreglados de acuerdo con su tamao, y ordenados. Como las
nuevas cadenas estn marcadas se podr hacer una autoradiografa para visualizar despus
que se han separado de acuerdo a su longitud por la electroforesis del gel. Ya sea por el
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marcado radiactivo del iniciador o por un marcado fluorescente de los dideoxinucletidos
individuales terminales.
5' ATGGGATAGCTAA1TGT1TACCGCCGGAGCCA 3' DNA molde de la clona
3'
CGGCC TCGGT 5' iniciador de la sntesis
. Direccin de la sntesis de DNA
3' *ATGGCGGCCTCGGT 5'
Dideoxy fragment 1
3' * AA TGGCGGCCTCGGT 5'
Dideoxy fragment 2
3' *AAATGGCGGCCTCGGT 5'
Dideoxy fragment 3
3' * ACAAA TGGCGGCC TCGGT 5'
Dideoxy fragment 4
3' *AACAAATGGCGGCCTCGGT 5'
Dideoxy fragment 5
3' *A1TAACAAATGGCGGCCTCGGT 5' )
Dideoxy fragment 6
3' *ATCGA1TAACAAATGGCGGCCTCGGT 5' C
Dideoxy fragment 7
3' *ACCCTATCGA1TAACAAATGGCGGCCTCGGT 5' Dideoxy fragment 8

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Mtodo de secuenciacin del DNA empleando el reactivo dideoxinucletido trifosfato

correspondiente. Un iniciador marcado radiactivamente (diseado a partir de la secuencia
que se va a determinar, o bien y ms comunmente de inicadores universales, que se
encuentran en las regiones de sitio de multiclonacin de los vectores de secuenciacin). El
iniciador se emplea para iniciar la sntesis de DNA. La adicin de los cuatro diferentes
dideoxinucletidos en sus correspondientes cuatro reacciones, detendr azarozamente la
reaccin. Los fragmentos resultantes separados por electroforesis en genes de
poliacrilamida y sujetos a autoradiografa. Se muestra tambin un gel de secuencia, para
observar su potente resolucin.
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Cal es la razn por la cual el ddNTP detiene la reaccin como se ve en la fig. no tiene el
3OH indispensable para continuar la polimerizacin. Por lo que la DNApol no podr
catalizar el siguiente enlace fosfodiester. Por lo tanto, la reaccin se detiene en ese punto.
En lugar de emplear marca radiactiva se utilizar un colorante flourescente con el que se
marca a los dNTP. Cuatro diferentes colorantes flourescentes se utilizan que corresponden
a los cuatro dNTPs. Como cada base est marcada diferentemente se utiliza un solo tubo en
la reaccin y se usa para correr separadamente y leer el gel. Adems esto tiene la ventaja
que la deteccin se realiza de una manera automatizada, en las maquinas secuenciadoras de
DNA. Estas maquinas pueden hacer el ensayo en placas de geles o an ms recientemente
en tubos capilares. Por razones tcnicas los capilares han resultado ser ms fcilmente
ledos por la maquina que la placa de gel. Gracias a estas maquinas las velocidad en que se
hace la secuencia aumentado considerablemente. En la fig. siguiente se muestra un
electroforetograma de una reaccin de secuenciacin.

Hoja impresa de un electroforetograma de una secuencia realizada por un secuenciador

automtico, que emplea las bases marcadas flourescentemente. Cada uno de los cuatro
colores representa una base diferente. N representa una base que no pudo ser asignada,
porque los picos no tienen la resolucin adecuada.

La secuencia de nucletidos ser examinada para encontrar el gene o los genes que
contenga. La secuencia es analizada en la computadora, la cual entonces hace un recorrido
en las bases emplendo un algoritmo basado en seis posibles fases abierta de lectura: tres en
una direcccin y tres en la otra, con el fin de encontrar las regiones posibles de
codificacin para una protena, con el codn de inciacin ATG, el final con el codn de
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terminacin. Esto se denomina ORF fase abierte de lectura. Que representan los candidatos
de genes.
Cualquier fragmento de DNA tiene seis posibles fases abiertas de lectura, tres en cada
direccin. La computadora nos ayuda a definir cal corresponde a las ORFs, en el ejemplo
anotado corresponde a una secuencia de un plsmido de un hongo, en donde se localizaron
dos ORFs, y que podran ser dos genes potenciales.

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