Avanos e desafios na identificao de compostos volteis que medeiam

interaes entre plantas e artrpodes

INTRODUO
At recentemente, no era de conhecimento comum que as plantas tm uma maneira de se
expressar. Eles principalmente faz-lo por odores emissores ea composio qumica ea
intensidade desses odores podem levar informaes sobre o estado fisiolgico das plantas e
sobre os esforos que esto sendo submetidos. Na verdade, as plantas libertam uma enorme
gama de compostos orgnicos volteis (VOCs). Actualmente, mais do que 1000 desses
compostos orgnicos de baixo peso molecular, so conhecidos, que vo desde os terpenides,
derivados de cidos gordos, e benznicos fenilpropanodicos, compostos C5 ramificados e
vrios compostos que contm azoto e enxofre. Alguns destes compostos orgnicos volteis so
constitutivamente emitida por plantas saudveis intactos, mas geralmente induz danos
herbvoros plantas emitem quantidades muito maiores e podem mesmo causar vrios compostos
orgnicos volteis para ser sintetizados de novo (Fig. 1). Estes volteis de plantas herbvoros
induzidas (HIPVs) so conhecidos por ser emitida por vrias partes da planta, incluindo as
folhas e flores, assim como razes. No s a alimentao por insectos herbvoros um induz a
libertao de HIPVs; ainda a deposio de ovos de insectos herbvoros tem sido mostrado
induzir a planta para emitir HIPVs. Alm disso, a emisso HIPV no est limitado ao local do
dano, mas ocorre sistemicamente por toda a planta, tambm a partir de folhas no danificadas.
Muitos insetos so bem conscientes desta linguagem perfumada das plantas e evoluram
maneiras de explor-lo (Fig. 2). Recentemente, os pesquisadores tambm se tornaram
conscientes disso e agora as emisses HIPV tm sido objeto de um nmero crescente de
investigaes que revelaram um importante papel de HIPVs em comunicao e auto-proteo.
Apesar de abordagens moleculares e genticas j so freqentemente aplicada para revelar os
meandros de interaes planta-mediadas, as anlises qumicas de HIPVs continuam a ser uma
parte integrante de praticamente todos os estudos.
Abaixo fornecemos um breve resumo do que se sabe sobre o papel fisiolgico e ecolgico de
HIPVs nas interaes entre plantas e outros organismos (para revises recentes ver ref 18-21.),
Revisamos os mtodos mais comumente usados por bilogos para coletar e analisar HIPVs e
destacar os desafios que ainda precisam ser enfrentados nesta rea de pesquisa. O foco sobre
as tcnicas utilizadas para estudar a importncia de tais HIPVs para a atrao de artrpodes na
superfcie, e propomos alguns mtodos que podem ser teis em estudos futuros, incluindo a
anlise de HIPVs abaixo do solo. Mais detalhes sobre essas tcnicas e sobre as tcnicas
utilizadas para analisar compostos orgnicos volteis de plantas, em geral, tm sido descritos e
analisados em outro lugar (por exemplo, ref. 22-26). Por fim, discutir e ressaltar a importncia
de testar a relevncia biolgica da HIPVs com bioensaios comportamentais apropriadas e
propomos que a sensibilidade notvel dos quimiorreceptores de insetos para VOCs torn-los
explorveis como ferramentas para pesquisas futuras sobre os odores de plantas.
Fisiologia, ecologia e aplicao de HIPVs biologicamente relevantes
HIPV-misturas so complexos e so constitudos por uma grande variedade de compostos
orgnicos volteis divergentes, incluindo alcanos, alcenos, lcoois, aldedos, cetonas, teres,
steres e cidos carboxlicos. pouco provvel que todos os VOC emitido por plantas serve um

papel ecolgico ou fisiolgicos e ainda h discordncia sobre a histria e funo de VOCs

plantas evolutiva.
Sem dvida, HIPVs desempenham um papel central na mediao de interaces entre as plantas
e os herbvoros, entre herbvoros e seus inimigos naturais, entre as plantas e microorganismos,
mas tambm entre as prprias plantas. Por exemplo, estudos de laboratrio mostraram que
HIPVs impedir a oviposio por herbvoros artrpodes, atrair inimigos naturais desses
herbvoros e at mesmo induzir genes de defesa e de emisso de VOC em plantas ou primeiras
plantas vizinhas para responder mais rapidamente s futuro ataque herbvoro. Em estudos de
campo, HIPVs demonstraram ter o potencial para reduzir os danos por pragas de vrias plantas,
incluindo plantas de cultura.
Vrios estudos tm proporcionado um conhecimento detalhado sobre a base fisiolgica e
molecular da sntese de volteis de plantas e respostas de defesa em plantas indiretos (revisado
por ref.1, 18,19). Ainda assim, nossa compreenso de como as vias biossintticas so induzidos
e interagir uns com os outros rudimentar, provavelmente porque a induo e emisso de
HIPVs depende da interao entre fatores biticos, como hormnios vegetais, indutores
herbvoro derivados, microorganismos associados e fatores abiticos , tais como O3 ferindo e
concentrao de CO2, temperatura e luz, radiao UV e de muitos outros factores. Aplicao de
vrias tenses simultaneamente para obter um melhor entendimento de como diferentes vias
interagem, ser um dos desafios em futuros estudos sobre a fisiologia de volteis de plantas.
H um boom atual do interesse entre os ecologistas para incluir as interaes subterrneos em
estudos sobre plantas e organismos associados, e VOCs foram encontrados tambm estar
envolvido em abaixo do solo sinalizao tritrfica. Chen et ai. caracterizada sintese de um
terpeno numa regio especfica da raiz de Arabidopsis responsvel pela formao do
monoterpeno voltil 1,8-cineol, que possivelmente est envolvida em interaces subterrneos.
Recentemente, Rasmann et al.9 identificado um sesquiterpeno, (E)-b cariofileno, como um sinal
induzido herbvoros voltil no subsolo, que atrai nematides, que infectam e matam as larvas de
verme da raiz do milho, Diabrotica virgifera virgifera, uma praga voraz de milho. Outro desafio
em estudos futuros ser determinar como tais interaes subterrneos acima do solo podem
influenciar as emisses volteis e vice-versa.
Coleta e anlise de HIPVs
Amostragem na Superfcie
A literatura sobre HIPVs liberados por partes vegetativas vasto e est crescendo
continuamente. Na maioria dos casos, desconhecida que os compostos tm actividade
biolgica e, por conseguinte, na maior parte bilogos tentar amostragem e anlise de toda a
gama de HIPVs. Isto normalmente alcanado atravs da recolha de VOCs no espao superior
das plantas herbvoro-induzidos que so colocados em cmaras de coleta utilizando um material
adsorvente com um relativamente amplo espectro de adsoro (por exemplo, ref. 4,99).
Posteriormente os volteis recolhidos podem ser analisados por cromatografia em fase gasosa
(GC) e espectrometria de massa (MS) ou uma combinao de ambos (GC / MS).
FIG. 3 mostra a freqncia com que os mtodos de amostragem mais comumente usados foram
aplicados na pesquisa de HIPVs durante os ltimos 10 anos. Embora esta pesquisa bibliogrfica
provavelmente inclui apenas parte de todos os estudos sobre volteis herbvoro-induzidos,
claro que a cobrana em adsorventes seguido por dessoro com solventes tem sido o mtodo

mais comumente usado. Uma vantagem associada com o solvente de dessoro que resulta em
amostras de lquidos, que podem ser armazenados, o que pode ento ser utilizado vrias vezes.
Isto pode ser muito til para anlises repetidas em CG, CG / MS e CG-EAD (cromatografia em
fase gasosa e deteco eletroantenogramas), para fraccionamento adicional, para coinjections
intensificao de pico e para bioensaios. Adsorventes e solventes utilizados nestes estudos
variar, mas o polmero poroso Super Q (80-100 mesh, Alltech, Deerfield, Illinois, EUA) e o
solvente diclorometano amplamente utilizado por muitos grupos. Embora esta combinao de
adsorvente solvente provou altamente eficaz na HIPV de adsoro e dessoro, Harper
argumenta que mais de um adsorvente, pode ser necessria para cobrir diferentes classes de
compostos, tais como aminas, aldedos e hidrocarbonetos aromticos. Existe uma vasta gama de
materiais adsorventes que podem ser utilizados para este fim, incluindo carvo activado,
Anasorb 747, carboxens, slica gel, crivos moleculares de carbono e polmeros porosos como
Tenax, cromosorb. Escolhendo uma combinao de adsorventes apropriados podem aumentar o
nmero de compostos encontrados na HIPV-misturas. Ainda assim, apenas um pequeno volume
dos compostos desadsorvidas podem ser injectadas no GC, deixando compostos minoritrios
no detectado, e o pico do solvente pode mascarar alguns compostos muito volteis. Estes
problemas podem ser evitados usando um mtodo de dessoro, sem solvente, tal como
dessoro trmica, ou microextraco em fase slida (SPME).
A tcnica emprega um pequeno SPME fibra revestida com um material adsorvente e encontrou
aplicao disseminada em muitos campos, principalmente para anlises qualitativas e semiquantitativa em anlises ambientais e de alimentos, mas tambm quantitativamente em qumica
analtica. SPME tambm ganhou popularidade crescente em anlises de amostras biolgicas
vivas, incluindo VOCs planta (Fig. 4). Ela tem uma srie de vantagens, como simplificar a
preparao da amostra, aumentando a fiabilidade, a selectividade e sensibilidade e reduz o
tempo de anlise. Uma variedade de materiais de revestimento para as fibras de SPME esto
disponveis, e a escolha da fibra apropriada e condies de amostragem so cruciais para que
esta tcnica seja eficaz. Ainda assim, a maior limitao do SPME em estudos sobre HIPVs
que a amostra perdido aps anlise e no podem ser utilizados para outras anlises, GC-EAD,
bioensaios ou fraccionamento.
Maior selectividade e sensibilidade tambm podem ser obtidas usando tcnicas especificamente
adaptadas para os compostos com grupos funcionais conhecidas. Por exemplo, plantas Allium
danificadas produzem e liberam enxofre contendo compostos orgnicos volteis,
presumivelmente para evitar a herbivoria de insetos. Para analisar os verdadeiros volteis
cebola, Arnault et al. utilizada uma combinao de SPME-GC/MS e extraco de solvente,
seguido por GC / MS anlises desenvolvidos especificamente para estes compostos. Outros
compostos podem ser presos por microqumicos usando tcnicas tais como os mtodos de
derivatizao e de degradao.
Tais tcnicas tm desempenhado um papel crucial na determinao da estrutura de feromonas
de insectos e so amplamente utilizados em anlises do ar ambiente. Em estudos de feromnio,
micro-reaes tem trs usos principais: derivao para ajudar propriedades cromatogrficas,
modificao de grupos funcionais para ajudar com a determinao da estrutura de MS e de
atribuio de configurao absoluta dos centros quirais. Em anlises de HIPVs raramente so
utilizadas estas tcnicas, apesar do facto de tais tcnicas parece ideal para a amostragem de
pequenas quantidades de COV ou altamente reactivos, que so difceis de provar com qualquer
outra tcnica. Por exemplo, os aldedos podem ser amostrados utilizando um 2,4
dinitrofenilhidrazina (DNPH) revestido de filtro, e as aminas com um filtro revestido com

isotiocianato de 1-naftilo. Filtros pr-tratados esto disponveis a partir de diversas companhias

(por exemplo, Supelco, SKC) e pode ser facilmente adaptado para adsorver selectivamente
HIPVs com um grupo funcional especfico. Na nossa investigao, utilizou-se slica-DNPH
revestido (Supelco) para adsorver selectivamente 3 - (Z)-hexenal e 2 - (E)-hexenal, as duas
principais aldedos emitidos pelas plantas de milho sob lagarta ataque (ver abaixo e figura 5).
Um outro problema enfrentado em anlises de HIPVs que a libertao de alguns compostos
altamente dinmico, dependendo do tempo aps a planta est danificada, mas tambm sobre a
hora do dia e mesmo temporada. Insetos podem perceber pequenas mudanas no odor
quantidade e qualidade. Portanto, uma boa compreenso da cintica de formao e libertao de
HIPV altamente desejada. Sistemas de coleta de headspace especificamente projetados e
automatizado e GC-anlises permitem a coleta dependente do tempo de compostos volteis de
plantas, e at mesmo novas tcnicas permitem anlises de emisso de VOCs em tempo real. Por
exemplo, a espectrometria de massa do prton-transfer-reao (PTR-MS) 128-130 e narizes
artificiais portteis permitem amostragem rpida e em tempo real (uma medio por segundo)
anlises de volteis de plantas e, assim, fornecer novas percepes sobre a cintica de
lanamentos volteis de plantas . Estas tcnicas tm a limitao de que no distinguir entre
diferentes COV com a mesma massa. No entanto, Penuelas, Filella e colaboradores mostram
que a tcnica PTR-MS pode ser usado para monitorar pequenas volteis, como o metanol
liberado pelo Succisa pratensis deixa infestados com lagartas de Euphydryas aurinia. Tais
compostos altamente volteis tendem a romper a partir de tubos absorventes ou so mascarados
pelo pico de solvente na amostra lquida GC-anlises e raramente so relatados em estudos
HIPV utilizando armadilhas absorvente.
Para entender completamente como HIPVs so produzidas e liberadas, so necessrias
abordagens metabolmica mais abrangentes. Schmelz et ai. introduziram uma tcnica elegante
baseado em extrao em fase vapor e anlise por ionization-GC/MS qumicos que analisa
simultaneamente fitormnios, fitotoxinas, e compostos orgnicos volteis em plantas. Tcnicas
de derivatizao so amplamente utilizados no perfil metablico (134 na ref.) E combinando
metablica e anlise de transcritos poderia proporcionar novas perspectivas sobre os genes que
esto envolvidos na produo de HIPVs.
Decidir sobre qual a tcnica de usar permanece difcil, pois vrias comparaes de diferentes
tcnicas de amostragem podem resultar em diferenas quantitativas e qualitativas. Sugere-se que
os resultados mais fiveis em HIPV-anlises podem ser esperados a partir da utilizao de uma
combinao de abordagens diferentes, incluindo as tcnicas especificamente desenvolvidos e
calibrado para a quantificao de compostos com grupos funcionais conhecidos. Conhecendo as
quantidades relativas exactas pode ser essencial porque as relaes entre os diferentes
compostos, muitas vezes pode ser importante na determinao da capacidade de atraco de
odor misturas para insectos.
Estudos sobre interaes subterrneos trazem novos desafios para o desenvolvimento de coleo
e mtodos analticos. At agora, a investigao sobre a seguir aleloqumicos de solo utilizado
principalmente extractos de exsudato de raiz, mas outros mtodos de anlise de amostras de solo
COV tambm esto disponveis. Como nas anlises de VOC areas, comparando vrios
mtodos de amostragem pode levar a diferentes quantidades de COV. , por conseguinte,
pertinente para incluir mais do que um mtodo nas coleces subterrneos. O solo muito mais
heterognea do que as diferenas de ar e grande porte em propriedades do solo e as
concentraes de COV pode ocorrer em distncias extremamente curtas, as quais devem ser

levadas em conta durante a amostragem. Fatores biticos e abiticos que so conhecidos por
afetar a quantidade ea qualidade dos HIPV-misturas acima do solo so susceptveis de afectar
significativamente volteis subterrneos tambm. Portanto, um grande desafio para as anlises
de solo abaixo HIPVs no ser apenas para escolher amostragem adequada e ferramentas de
anlise, mas tambm obter conhecimento detalhado sobre sua cintica, concentraes e
distribuio no solo. Provavelmente uma boa maneira de comear analisar HIPVs em, tipos de
solo homogneas relativamente bem definidos e, em seguida, repetir as medies em solos mais
complexos, bem como em experimentos de campo. Por exemplo, para determinar o papel do
inseto induzida (E)-b-cariofileno a partir de razes de milho como um atrativo para os
nematides, foi feita uma comparao inicial entre insetos danificados e sem danos razes de
milho, utilizando razes pulverizadas. Em testes subsequentes, foi confirmado que o (E)-bcariofileno, difunde-se rapidamente atravs da areia e atrai os nemtodes, e finalmente a
capacidade de atraco de sesquiterpeno esta foi testada em experincias de campo, em
condies naturais.
Bioensais e Analises Estatsticas dos HIPVs
Usando HIPVs como novas ferramentas de proteo de cultivos implica no s uma necessidade
de conhecimento detalhado sobre a biossntese e liberao de compostos orgnicos volteis de
plantas, mas tambm sobre a percepo ea explorao destes sinais qumicos pelos animais. A
identificao dos compostos especficos, comportamentalmente activos dentro de uma complexa
mistura tem provado ser difcil. Normalmente, esses compostos so identificados com uma
combinao de estudos comportamentais e anlises qumicas das misturas testadas odor. Outro
mtodo frequentemente praticado a cromatografia de gs combinadas com deteco
eletroantenogramas (GC-EAD) ou com gravaes de clula nica (SCR-GC), em que a
extremidade da coluna de GC dividida, e uma parte das passagens de efluentes para o detector
de ionizao de chama normal (FID) e a outra parte passada atravs de uma antena ou de um
nico sensillum olfactivo do insecto estudo. Com a utilizao de elctrodos e amplificadores as
respostas dos receptores antenares podem ser medidos e registados. Correlacionando estas
respostas com o cromatograma obtido com deteco FID, revela compostos que so percebidas
pelo antenas. Avanos na metodologia que permitem a gravao ser feita no interior do sistema
nervoso central, em combinao com a nova tcnica de in vivo calciumimaging ter ajudado a
iniciar neurobiologists compreender como COV plantas so detectados e processados por
insectos.
Embora mtodos como GC-GC-EAD ou SCR pode dar informaes sobre se um composto
percebido pelo sistema olfativo de um animal, apenas testes comportamentais vontade
mostram que os animais so atrados ou repelidos efectivamente por um composto particular.
At agora, os mtodos para testar a atratividade do odor misturas para artrpodes consistia
principalmente de bioensaios de ar dinmicas utilizando olfatmetros, tneis de vento, ou
bioensaios ar esttico. Nestas experincias, os artrpodes so libertadas a uma distncia definida
a partir de uma fonte de odor e o seu comportamento e atraco gravado. Na maioria dos casos
de informaes qumicas sobre as fontes de odor teve de ser obtida em estudos analticos
separados. No entanto, as misturas naturais HIPV-exibem no s uma alta variabilidade intra e
inter-especfica, mas a quantidade e qualidade dos compostos depende tambm do grau e do
tempo depois da infestao. Para explicar tal variao, se aproxima mais recente tentativa de
padronizar as misturas de odores e de ligao estreita perfis qumicos com o comportamento do
inseto. Por exemplo, ns desenvolvemos um olfatmetro em que seis fontes de odor podem ser

testados simultaneamente por sua atratividade relativa, e durante os ensaios de parte de cada
mistura odor pode ser preso por mais analyses.175 Este dispositivo no apenas oferece uma
ligao direta entre o produto qumico perfil eo comportamento de insetos, mas tambm permite
a comparao direta da atratividade de uma multiplicidade de fontes de odor com abordagens
estatsticas multivariadas, incluindo a anlise de componentes principais (PCA) e anlise de
redundncia (RDA). As anlises multivariadas so amplamente aplicados em anlises de
compostos volteis de alimentos e tambm pode fornecer informaes adicionais nas anlises de
HIPVs e revelar compostos principais que atraem os artrpodes.
Outra maneira de se estudar a importncia de COV individuais dentro de uma mistura complexa
comparar a capacidade de atraco de misturas volteis, diferindo em apenas alguns
compostos conhecidos. Estas misturas podem ser obtidos por meio de diferentes produtos
qumicos indutores e inibidores ou por silenciamento de genes envolvidos na defesa indireta.
Adicionando volta VOCs falta de misturas incompletas uma boa maneira de estudar a
importncia dos compostos individuais. Por exemplo, o caro predador Phytoseiulus persimilis
prefere um salicilato de metila (MESA) - contendo mistura voltil, induzida pelo caro
Tetranychus urticae a uma mistura semelhante, mas mesa-livre, induzida por jasmonic acid.152
Adicionando sinttico Mesa mistura Mesa-livre aumentou significativamente a atrao para
este odor, sugerindo um papel importante para a mesa como uma sugesto de forrageamento
para este artrpodes predadores.
Foi usada uma abordagem adicional para obteno de misturas que diferem em apenas alguns
compostos conhecidos, 103 para a qual foi modificada a seis brao olfactmetro descrito por
Turlings et ai. , a fim de instalar os tubos de filtro de adsoro entre os vasos de origem do odor
e os braos dos olfatmetros. Ao passar a mistura voltil induzida ao longo destes tubos de
filtro, alguns compostos podem ser retidos pelo material adsorvente, enquanto outros penetram
e pode ser testado para a atraco (Fig. 5). Alm disso, os compostos sintticos podem
facilmente ser acrescentados HIPV-mistura e, assim, so capazes de avaliar a importncia de
um indivduo ou grupos de compostos especficos. Esta nova tcnica revelou uma importncia
inesperada de compostos menores para a atrao de vespas parasitas ao complexo HIPVmisturas, enquanto que vrios dos compostos dominantes parecem ser importantes apenas aps
as vespas aprender a associ-los com a presena de hosts.103 Estes experimentos mostraram
uma vez mais no sentido de que as respostas HIPVs no so fixas. De facto, bem conhecido
que as respostas de insectos a VOCs so altamente plstico, dependendo do estado fisiolgico
dos animais e em experincias anteriores com fontes de odor. Diferentes formas de
aprendizagem podem modificar a percepo de compostos qumicos ea resposta dos insetos para
fontes de odor. Esta flexibilidade nas respostas dos insectos, bem como a uma grande
variabilidade no odores produzidos complica devidamente a elucidao dos principais
atractivos, e as experincias de aprendizagem devem ser includos em ensaios comportamentais.
Concluses e perspectivas
HIPVs desempenham um papel crucial nas interaes entre os diversos organismos. Uma boa
compreenso dos compostos-chave envolvidos nessas interaes no s fornecer importantes
conhecimentos ecolgicos fundamentais, mas tambm deve nos permitir manipular algumas
dessas interaes para a nossa vantagem, especialmente na agricultura. A complexidade e
variabilidade de misturas volteis emitidos pelas plantas infestadas herbvoros provaram
complicam grandemente a identificao dos principais compostos que medeiam as interaces
entre as plantas e organismos emissores associados. Novos esforos devem ser feitos para

integrar e adaptar as tcnicas mais recentes em qumica analtica para esta finalidade. A escolha
de mtodos adequados de amostragem e anlise HIPVs crucial. Pode ser possvel explorar
diretamente o olfato eo comportamento dos insetos para desenvolver novos biossensores
seletivos e sensveis. Quimiorecepo Insecto conhecido por ser mais sensvel e especfica do
que qualquer sistema de deteco qumica disponvel hoje. Por exemplo, a lagarta de
Spodoptera littoralis, uma mudana na frequncia de batimento cardaco pode ser desencadeada
quando menos de seis molculas de um componente-chave de feromonas acertar as antenas do
insecto. Assim, os insetos si pode ser mais capaz de nos informar sobre quais so as
substncias-chave que eles usam em seu comportamento. Incluindo bem desenhados bioensaios
eletrofisiolgicos e comportamentais podem fornecer informaes adicionais sobre compostos
bioativos essenciais que no podem ou mal pode ser detectado em anlises qumicas. Em
estudos futuros, incluindo tcnicas biosensoriamento narizes eletrnicos pode adicionar para
anlises qumicas clssicas de HIPVs. Se bilogos, qumicos e engenheiros unir foras neste
esforo que vai, sem dvida, ser capaz de desvendar totalmente o fascinante mundo das
interaes quimicamente mediadas entre as plantas e seu meio ambiente bitico. Tal viso,
ento, abrir o caminho para manipular as interaes para nosso prprio benefcio.