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INTRODUO
VANTAGENS
DESVANTAGENS
1 - PREPARAO DE AMOSTRAS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Amostras
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
Transferncia (Blotting)
Marcao
Deteco
Imagens
Anlises de Imagens
Be gentle! Stay
cool!
Sonicao ou
fora mecnica
20/03/2012
EXTRAO DE PROTENAS
Detergentes
Lise por congelamento e descongelamento
Shock osmtico
Ultrasonicao
Mtodos mecnicos
Digesto enzimtica
Tampes de lise e kits de preparao de amostras
Proteo de amostras
Limpeza de amostras (Sample clean up)
Quantificao
ELETROFORESE
ETAPA 2
GEIS DE POLIACRILAMIDA
ACRILAMIDA
(UNIDADE
MONOMRICA)
BISACRILAMIDA
CROSS LINK
ETAPA 2
CH2= CH
|
C=O
TAMANHO DO PORO
[ monmeros] determina
tamanho dos poros
C=O
|
CH2=CH
Metileno
bisacrila
mida
TAMANHO DO PORO
20/03/2012
PREPARAO DE AMOSTRAS
Eletroforese
SDS -
Desnaturante
Separao por peso molecular
No redutora
Redutora
Pontes S-S
Amostra
SDS
DTT
BMERCAPTANOL
No desnaturante (Nativa)
Separao por carga, peso e
forma
DTTbM
Preparo tampo da amostra
ACRILAMIDA
PREPARACAO DO GEL
Sistema descontinuo
TAMPES
20/03/2012
PROCESSO
3 - TRANSFERNCIA (BLOTTING)
FIXAR AMPERAGEM
NO FIXAR VOLTAGEM
Transferncia em Tanque
Transferncia
Membranas
20/03/2012
Controle de transferncia
4 - IMUNOMARCAO
A) Bloqueio: Protenas
Anticorpos Primrios
Anticorpos Secundrios
Anti - Anticorpos
Tipos de anticorpos
Monoclonais
Policlonais
Enzimas Conjugadas
20/03/2012
Enzimas
AP e HRP = Amplificao/Sensibilidade
Amplificao: Biotina/Estreptavidina
Etapas de incubao/lavagens
5 - DETECO
DAB /HRP
NBT/BCIP/AP
LUMINOL
20/03/2012
Colorimetric AP Systems
6 - IMAGENS
7 - ANLISES DE IMAGENS
Digital imaging
Chemiluminescence detection using film
Autoradiography
ImageQuant LAS
4000. Sistema de
Imagem
Multifuncional
20/03/2012
3/10/2011
ANLISES
DE IMAGENS
SDS-PAGEdesnaturante
e redutor
SDS-PAGE
o de protenas
o de protenas (Western blot)
nlise por MS
AUGUSTO 2011
-Acompanhar
purificao
de protenas
-Acompanhar
purificao
de protenas
-Acompanhar
expresso
de protenas
(Western
blot)
-Acompanhar
expresso
de protenas
(Western
blot)
-Isolar
protenas
para
anlise
-Isolar
protenas
para
anlise
porpor
MSMS
AUGUSTO 2011
AUGUSTO 2011
AUGUSTO 2011
COLORIMETRIC DETECTION
S-PAGE-EXPERIMENTAL
4%
10-15%
10-20 %
LUNINOL
Espcies ajustam [ ]
p/ mesma mobilidade
Cl- > P
P-SDS
SDS - > glicinato-
4%
Chemiluminescent detection
SDS-PAGE-EXPERIMENTAL
SENSIBILIDADE
ALTO CUSTO
REAPROVEITVEL
Muito baixa-concentrao
fica como banda estreita
na interface entre os
outros anions
SDS-PAGE-EXPERIMENTAL
livremente
poros
-Receber o gel preparado e aplicar
aspelos
amostras
AUGUSTO 2011
AUGUSTO 2011
4%
4%
10-15%
10-20 %
pI~6,0
HCOOHCOONH3+
NH2
Espcies ajustam [ ]
p/ mesma mobilidade
Cl- > P
P-SDS
SDS- > glicinato-
4%
Mobilidade seria
Glicinato- < P-SDS -< Cl-
Muito baixa-concentrao
fica como banda estreita
na interface entre os
outros anions
Gel separao pH>
Gilicinato- e Cl- migram
livremente pelos poros
AUGUSTO 2011
HIV
Multiplos Ags
Mesmoo MW
Pts de alta e baixa abundancia
20/03/2012
A western blot is also used as the definitive test for Bovine spongiform
encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease').
CDC
Description of lanes:
Lane 1 - molecular weight marker
Lane 2 - positive patient sample
Lane 3 - positive patient sample
Lane 4 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 5 - monoclonal antibodies for 41kD
band
Lane 6 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 7 - monoclonal antibodies for 31
and 34kD bands
Lane 8 - positive control pool
CRPRUDENCIO@USP.BR
MUITO OBRIGADO!!