Filial Norte

INFORME DE PROYECTO

Actividad antimicrobiana in vitro del extracto etanlico de los

frutos de Schinus molle (molle), frente a Streptococcus Bhemoltico y Pseudomonas aeruginosa
1. Personal investigador
1.1 Alumnos
Marchena Tirado, Martn
Mendoza Lingn, Wesley
Moncada Saavedra, Fabricio
Monge Rojas, Anbal
Oblitas Vsquez, Nathaly
Pisfil Chafloque, Ana
Prez Ortiz, Ronald
Surez Peche, Marie
Vargas Tineo, Luz.
1.2 Docente
Microbilogo. Siadn, Max.
2. Carrera Profesional
Medicina Humana

1. REALIDAD PROBLEMTICA

La Organizacin Mundial de la Salud estima que casi el 80% de todos

los habitantes de la tierra, confan en medicinas tradicionales para
resolver sus principales problemas de salud.

La medicina tradicional peruana, herencia de tiempos precolombinos y

herencia de nuestros antecesores incas que utilizaban plantas, flores
con fines medicinales y que sigue siendo la primera instancia de
consulta y tratamiento en gran parte de nuestro pas. En ella las plantas
medicinales ocupan un rol muy importante, con una variada flora de
aproximadamente 80,000 especies, gracias a los diversos pisos
ecolgicos y microclimas que presenta el suelo peruano.
Hemos usado en el presente trabajo el extracto etanlico del fruto de
Schinus molle por su efecto inhibitorio frente a streptococcus B
hemoltico y pseudomonas aeruginosa.

Uno de los temas que ms preocupa a la comunidad cientfica en

medicina humana es la constante emergencia de cepas bacterianas
refractarias a uno o ms antibacterianos, lo que constituye, actualmente,
un problema creciente de salud pblica a nivel mundial (OMS, 2001).

La presencia de estos patgenos relacionados con enfermedades

prevalentes, como son la enfermedad diarreica aguda, las infecciones
respiratorias agudas y las infecciones intrahospitalarias, le dan el
carcter de problema prioritario.

2. OBJETIVOS

2.1. General:
Determinar el poder inhibitorio que presenta el extracto etanlico del
futo de Schinus molle frente a streptococcus B-hemoltico y
Pseudomonas aeruginosa.

2.2 . Especficos:
Recoleccin e Identificacin de frutos de Schinus molle.
Obtener el extracto etanlico de los frutos de Schinus molle.

Aislar Streptococcus B-hemoltico y Pseudomonas aeruginosa a

partir de muestras clnicas.
Comprobar el efecto inhibitorio de Schinus molle frente a cepas de
Streptococcus B-hemoltico y Pseudomonas aeruginosa.

3. MARCO TEORICO: ANTECEDENTES

El descubrimiento de cepas bacterianas resistentes a los antibiticos surgi

poco despus de iniciado el uso de la penicilina. Ya en 1944 se reportaron
cepas

de Staphylococcus

aureus productora

de

betalactamasas

que

hidrolizaban la penicilina y la hacan inefectiva. Aunque inicialmente este tipo

de resistencia slo suceda espordicamente, rpidamente se propag. En
1946

el

14%

de

los Staphylococcus

aureus nosocomiales

producan

betalactamasas, en 1950 la cifra ascenda al 59%, y actualmente, en Espaa,

un reporte indica que el 95% de las cepas de S. aureus son productoras de
betalactamasas.

La industria farmacutica desarroll nuevos frmacos, derivados a partir de

los iniciales, para obviar este problema: nuevas penicilinas, cefalosporinas,
combinaciones con inhibidores de betalactamasas, y carbapenemes. Sin
embargo, la introduccin de nuevos antibiticos da lugar a la seleccin de
cepas resistentes. Ahora tenemos cepas de Staphylococcus aureus resistentes
a meticilina (MRSA) o resistentes a oxacilina (ORSA), que muestran resistencia
a todos los derivados betalactmicos mencionados. Las primeras cepas de
MRSA se describieron a principios de los aos 60 pero no fue hasta fines de la
dcada de los 70 y en los 80 cuando empezaron a causar serios problemas.
Existen reportes de estas cepas en los Estados Unidos, Japn y Europa, con
los

porcentajes

ms

altos

en

Grecia

(53%)

Japn

(60%).

Un problema an ms alarmante es la aparicin de cepas de S.

aureus resistentes a vancomicina. El primer aislamiento de una cepa de S.
aureus con sensibilidad intermedia a vancomicina (VISA) tuvo lugar en Japn
en 1996. Posteriormente se reportaron casos de infecciones por VISA en los
Estados Unidos, Francia, el Reino Unido, Grecia, Alemania, Hong Kong y
Corea; en algunos casos se refieren a cepas heterorresistentes a vancomicina,
es decir, cepas que presentan una subpoblacin bacteriana que muestra CMIs
intermedias a vancomicina, pero al realizar las pruebas habituales de
sensibilidad a toda la poblacin bacteriana, muestra CMIs sensibles. En el

Hospital de Juntedo, en Japn (donde se haba descrito el primer caso) se

encontr que del total de cepas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) el
20%

eran

heterogneamente

resistentes

vancomicina.

Otro microorganismo que est mostrando resistencia a la vancomicina es

el Enterococcus. En los Estados Unidos, el NNIS (National Nosocomial
Infections Surveillance) report en 1989 un porcentaje de Enterococcus
resistentes a Vancomicina (VRE) del 0,3%; pero ya en el 2000 esta cifra lleg
al 14%; mientras que en Espaa el porcentaje oscila entre 1 y 4%18 segn las
regiones. En el Per un estudio realizado en 1997 reporta un 11,1%
de Enterococcus

resistentes

vancomicina.

En cuanto a los microorganismos gram negativos, tenemos que las

enterobacterias estn desarrollando resistencia frente al aztreonam y las
cefalosporinas de tercera y cuarta generacin mediante la produccin de
betalactamasas de espectro extendido (ESBLs). El primero de estos casos se
report en Alemania en 1983. Luego este tipo de resistencia se fue difundiendo
y

actualmente Klebsiella

pneumoniae y Escherichia

coli son

los

microorganismos ms frecuentemente asociados con produccin de ESBLs. La

incidencia es variable; por ejemplo tenemos un estudio en los Estados
Unidos donde se encontr que el 9% de 906 aislados de Enterobacterias eran
cepas

productoras

de

ESBLs.

Otros microorganismos que fcilmente desarrollan resistencia frente a

cualquier antibitico son Pseudomonas y Acinetobacter. En Espaa se han
reportado casos en los que solamente quedaba la opcin de usar colistina
contra estos microorganismos.

Mtodos para la Deteccin de Bacterias Resistentes a los Antibacterianos; los

ms empleados actualmente son: difusin en disco, caldo de microdilucin,
dilucin en agar, dilucin en gradiente de agar (E-test) y diversos mtodos
automatizados o semi-automatizados.

Los mtodos genticos, como sondas de ADN y reaccin en cadena de

polimerasa, pueden usarse para detectar secuencias de ADN asociadas con
genes de resistencia antimicrobiana. Sin embargo, no es frecuente el uso de
estos

mtodos

por

su

alto

costo.

Mediante el mtodo de difusin en disco se dan resultados cualitativos:

sensible, sensibilidad intermedia y resistente, en relacin con los dimetros de
la zona de inhibicin para cada antibitico y de acuerdo a las recomendaciones
de la NCCLS. Los mtodos de dilucin, incluidos los automatizados,
comnmente generan resultados en trminos de concentracin inhibitoria
mnima (CIM), adems del resultado cualitativo.

Actividad antibacteriana del Schinus molle cultivado en Italia

Mara Gualtieri, Mara Araque, Juan Carmona, Mara Garcia, Mara Di
Bernardo, Nurby Ros, Ciro Villalobos, Yilen Fung, Nstor Uscategui4,
Frank Sosa.
El objetivo de esta investigacin fue determinar la actividad antibacteriana del
extracto etanlico de las hojas y el extracto hexanoico obtenido de los frutos del
Schinus molle
.
La actividad inhibitoria de los extractos de S. molle fue probada contra
bacterias Gram positivas: Staphylococcus y Enterococcus faecalis y bacterias
Gram negativas: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas
aeruginosa, cultivadas durante la noche a 37C en caldo infusin de cerebrocorazn (BHI) y ajustadas a un estndar de 0,5 Mac Farland (105-6 UFC/mL).
Schinus molle mostr una buena actividad antibacteriana contra bacterias
Gram positivas (S. aureus y E. faecalis) inhibicin del crecimiento bacteriano
fue observado solo en las cepas gram positivas, reportndose valores
inhibitorios mayores a 16 /mL. Por el contrario, las bacterias Gram negativas
ensayadas permanecieron viables en presencia de concentraciones mayor de
128 g/mL de los extractos etanlicos y hexnicos, mientras que la inhibicin
del crecimiento de la bacteria fue solamente observado con cepas Gram
positivas tales como S. aureus y E. faecalis
Estos resultados coinciden con lo reportado en Schinus molle L. cultivado en
Turqua, en donde la CIM y CBM mostraron la misma actividad inhibitoria y
bactericida contra las bacterias testadas en los extractos hexanoicos de hojas y
frutos. De igual forma, Padin et al. Reportaron que el extracto etanlico de
Schinus molle demostr actividad inhibitoria (CMI: 24 g/mL) frente a
Salmonella entrica, S. aureus, E.coli y especies de Bacillus y valores de CBM
entre 2 a
15 /mL.
Schinus molle L., mostr una buena actividad antibacteriana contra bacterias
Gram positivas (S. aureus y E. faecalis) con una CMI 16 g/mL. El rango de
CBM de estas bacterias estuvo entre 32 y 64 mg/mL, respectivamente.

EVALUACIN IN VITRO DEL EFECTO ANTIBACTERIANO DE LOS

EXTRACTOS DE Bidens pilosa, Lantana camara, Schinus molle Y
Silybum marianum
Anastasia Cruz-Carrillo1, Natalia Rodrguez N.2, Carlos Eduardo Rodrguez3
En el presente estudio, se evalu la actividad antibacteriana de los extractos
etanlicos de B. pilosa, L. camara, S. molle y S. marianum, frente a tres cepas
bacterianas patgenas: S. aureus, Escherichia. Coli y P. aeruginosa. El
experimento, se desarroll en dos fases: la primera, relacionada con la
preparacin de los extractos vegetales y, la segunda, relacionada con la
aplicacin de las pruebas microbiolgicas.
Los extractos etanlicos de las hojas de L. camara, S. marianum, B. pilosa y S.
molle mostraron actividad inhibitoria contra Staphylococcus aureus,
comprobado por los diversos mtodos aplicados en este estudio. Por el
contrario, al realizar el enfrentamiento de las cepas de E. coli y P. aeruginosa
evidenci que stas no fueron sensibles ante ninguno de los extractos
ensayados en todas las pruebas. Se puede suponer que los extractos
etanlicos de las plantas, objeto de estudio, no tienen actividad sobre bacterias
Gram negativas, posiblemente, porque las bacterias Gram negativas presentan
compuestos anfipticos que operan como bombas de expulsin de diversas
sustancias, por lo cual, el antibacteriano es expulsado de manera inmediata,
sin alcanzar a cumplir el efecto (Domingo & Lpez, 2003). Otras posibles
explicaciones corresponden a la posibilidad que el compuesto activo no
alcance el sitio blanco de accin o bien, la estructura de las porinas impida el
paso del principio activo al interior de la clula bacteriana (Soto, 2003). Este
hallazgo difiere de lo reportado por otros autores, quienes indican que los
extractos etanlicos de Chipaca (B. pilosa) y de L. cmara, tienen efecto contra
E. coli (Rojas et al. 2006; Samy&Ignacimuthu, 2000; Valsara jet al. 1997).

4. JUSTIFICACINDEL PROBLEMA

ETICO:

El presente proyecto se realizar de tal manera que no involucre

riesgos o posibles daos tanto al personal investigador como a la
comunidad, respetando las normas de bioseguridad mnimas y
conservando los valores ticos y morales en cada una de sus etapas.

NUEVA U ORIGINAL:

Porque no existen estudios previos que se enfoquen en la

Accin inhibitoria frente a Streptococcus B-hemoltico y Pseudomonas
a partir de plantas de uso tradicional como el Schinus molle

RELEVANTE O PERTINIENTE:

El Per cuenta con una gran variedad de especies botnicas,

muchas de ellas se han venido usando empricamente en el tratamiento
de infecciones a lo largo del tiempo, adems se ha reportado que
plantas como el molle, presentan actividad antimicrobiana, frente a
algunas bacterias patgenas.

FACTIBLE:

Debido a que la resistencia a los antibacterianos, se traduce en

ineficacia de los tratamientos generando un importante impacto en la
salud, y en respuesta a la necesidad de conseguir alternativas eficaces
para el control de las infecciones bacterianas se acepta que las plantas
son una valiosa fuente de sustancias activas con propiedades
antibacterianas, en este caso el extracto etanlico de los frutos de
Schinus molle se presenta una propuesta viable para dar solucin a
dichos problemas de inters mundial.

5. PROBLEMA CIENTFICO

Cul es la actividad inhibitoria del extracto etanlico de los frutos de

Schinus molle, (molle), frente a Streptococcus B -hemoltico

Pseudomonas aeruginosa?

6. HIPTESIS

El extracto etanlico de Schinus molle (molle)

inhibitoria

tendr

actividad

frente a Streptococcus B hemoltico y Pseudomonas

aeruginosa.

7. MATERIALES

a.

i.

Materiales

Material biolgico

El material biolgico estar conformado por frutos de Schinus molle, y

cultivos puros de Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus Bhemoltico.
Material de laboratorio
Frascos de vidrio
Probetas
Matraces de vidrio
Papel filtro
Asa bacteriolgica
Placas Petri
Tubos de ensayo
Viales estriles

 Lminas portaobjeto
Mechero
Baguetas
Pinzas

ii.

Medios de cultivo
Agar Sangre.
Agar cetrimide.
Agar Mueller - Hinton.

iii.

Reactivos, colorantes y otros

Colorantes para tincin GRAM.
Agua destilada estril

8. MTODOS

i.

Identificacin de Schinus molle

Se recolectar frutos de molle.

ii.

Obtencin del Extracto Etanlico (segn Harrison en

Arrascue y Zuta, 1996)
a) Se disecar los frutos de Schinus molle molle a temperatura
ambiente por 4 das y luego en estufa a 37C por 24 horas.
Posteriormente este material seco se triturar en un molino,
hasta obtener un polvo fino (pulverizado de las hojas)
b) Se macerar 50 gr. de fruto molido hojas previamente
desecados y pulverizados en 150 ml de alcohol etlico de 96
por 24 horas a temperatura ambiente.

c) Pasadas las 24 horas de maceracin se realizar la primera

extraccin, filtrando sobre un tocuyo fino estril. El residuo se
volver a macerar en otros 150 ml de alcohol etlico de 96 por
24 horas, posteriormente se filtrar y se macerar con otros
150 ml de alcohol de 96 por 24 horas. El residuo obtenido se
descartar.
d) Se reunir los filtrados y se evaporar en una estufa de 5060C hasta concentrarlo.
e) El

extracto

concentrado

se

pondr

en

refrigeracin,

protegindolo de luz solar directa, hasta la utilizacin.

iii.

Aislamiento e Identificacin de las especies bacterianas.

Las

cepas

bacterianas

Streptococcus

B-hemoltico

Pseudomonas aeruginosa, se aislaron a partir de muestras

clnicas,

secrecin

farngea

exudado

de

herida

respectivamente.

iv.

Preparacin y Estandarizacin del Inoculo Bacteriano

(DIFCO, 1987)
Las

cepas

bacterianas

previa

identificacin,

fueron

estandarizadas por turbidometra al tubo N 0,5 del nefelmetro

de Mac Farland (1,5x108 bacterias/ml.), de tal manera que se
trabajar con una biomasa estndar en todos los ensayos, lo
que es considerado importante pues in vitro la actividad de los
agentes

antimicrobianos

disminuye

en

medida

que

se

incrementa la biomasa lo cual no permitira un verdadero

anlisis de la actividad bacteriana del extracto etanlico del
molle.

v.

Prueba de Susceptibilidad Bacteriana a los antibiticos.

(Manual INS, 2002)
La susceptibilidad de las cepas bacterianas los antibiticos se
determinar teniendo como referencia el mtodo de difusin en
Disco de Kirby - Bauer.
Las

cepas

bacterianas

previa

estandarizacin

(1,5x10 8

bacterias/ml.), sern enfrentadas a los diferentes antibiticos,

se usarn discos comerciales tiles para las pruebas de
susceptibilidad rutinarias en los hospitales.

vi.

Preparacin de los Discos de Sensibilidad con extracto de

molle.
Utilizando papel filtro se obtendrn discos de 5 mm de dimetro
con ayuda de un perforador, los cuales se esterilizarn.
Despus de esterilizarse, se sumergir en el extracto etanlico
por espacio de 5 minutos; quedando as embebido para el
enfrentamiento con los microorganismos.

vii.

Prueba de Susceptibilidad Bacteriana al extracto de molle.

(Koneman, 1987)
La susceptibilidad de las cepas bacterianas al extracto
etanlico de molle se determinar teniendo como referencia el
mtodo de difusin en Disco de Kirby - Bauer.
En cada una de las placas estriles conteniendo Agar Mller Hinton se sembrar uniformemente con ayuda de un hisopo
estril embebido con un cultivo joven de la cepa previamente
estandarizada, se dejar secar el inoculo durante 5 minutos,
para despus colocar los discos embebidos con el extracto

etanlico de molle y un disco control embebido con agua

destilada estril.
Despus de 10 a 15 minutos se invertirn las placas para ser
incubadas a 37C por 24 horas. Trascurrido el tiempo se
medir los halos de inhibicin formados alrededor del disco,
con una regla milimetrada, se realizar 3 repeticiones con cada
una de las 2 cepas bacterianas en estudio.

9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

OMS | Organizacin Mundial de la Salud [Internet]. [citado 11 de

septiembre de 2014]. Recuperado a partir de: http://www.who.int/es/

Cepas bacterianas refractarias a uno o ms antibacterianos [Internet].

[citado 11 de septiembre de 2014]. Recuperado a partir de:
http://search.who.int/search?q=cepas+bacterianas+refractarias+a+uno+
o+m%C3%A1s+antibacterianos&ie=utf8&site=default_collection&client=
_es_r&proxystylesheet=_es_r&output=xml_no_dtd&oe=utf8

Saccsaquispe, R. y J. Velzquez. 2002. Manual de procedimientos para

la prueba de sensibilidad antimicrobiana por el mtodo de disco difusin.

Instituto Nacional de Salud, serie de Normas Tcnicas N30. Lima
Per.

Home - Portal Instituto Nacional de Salud [Internet]. [citado 11 de

septiembre
de
2014].
Recuperado
a
partir
de:
http://www.ins.gob.pe/portal