El microscopio

La luz
La luz de acuerdo al enfoque actual, ms que una onda, es considerada de
manera ms exacta una oscilacin electromagntica que se propaga en el
vaco o en un medio transparente y que es capaz de ser percibida por nuestro
sentido de la vista

Espectro EM y luz visible

Lentes
El trmino lente es el nombre asignado a una pieza de vidrio, plstico u otro
material transparente, generalmente de dimetro circular, que posee dos
superficies pulidas y diseadas de una manera especfica para producir la
convergencia o divergencia de los rayos luminosos que la atraviesan. La
accin de una lente depende de los principios de refraccin y reflexin

Propiedades de la luz
Tipo
Reflexin

Definicion
Cambio de direccin de un rayo o una onda que
ocurre en la superficie de separacin entre dos medios,
de tal forma que regresa al medio inicial.

Refraccin

Es el cambio brusco de direccin que sufre la luz al

cambiar de medio.

Difraccin

Dispersin y curvado aparente de las ondas cuando

encuentran un obstculo

Polarizacin

Birrefringencia

Las caractersticas transmitidas por una onda se

filtran en una direccin de desplazamiento entre todas
las direcciones aleatorias inicialmente posibles.

Doble refraccin

Imgenes propiedades luz

Fundamentos microscopia
Se define microscopa como la tcnica que permite observar objetos con un
microscopio (simple o compuesto) y obtener una imagen aumentada del mismo
y para ello es necesario tener en cuenta estos tres elementos:
a.- El objeto a estudiar (preparado histolgico por ejemplo).
b.- Una fuente de iluminacin.
c.- Un sistema ptico.
Mecanismos
iluminacin

Trans
iluminacin

Epi
iluminacin

Esquema

Conceptos de microscopia ptica

Los microscopios son instrumentos diseados para producir
imgenes visuales o fotogrficas magnificadas de objetos pequeos. El
microscopio debe lograr tres funciones
a.- que las tareas produzca una imagen magnificada del espcimen
b.- separe los detalles en la imagen
c.- haga los detalles visibles al ojo o a la cmara fotogrfica humano.

Parmetros pticos (I)

Aumento
Relacion de tamao entre el objeto percibido a simple vista y el
apreciado al microscopio. Se obtiene multiplicando el aumento
individual del objetivo por el aumento del ocular.

Parmetros pticos (II)

Abertura numrica
Es una medida de su capacidad de recolectar la luz y de resolver el detalle fino
del espcimen en una distancia fija del objeto
Abertura numrica ( NA ) = n(sin m)

n del medio de la proyeccin de imagen

entre la lente delantera del objetivo y del
cristal de la cubierta del espcime
m , es la mitad del ngulo de aceptancia
mximo que puede entrar o salir de la lente.

AN (ejemplo)

Parmetros pticos (III)

Poder resolucin
El poder de resolucin de un objetivo es el valor de la mnima distancia
que puede haber entre dos puntos para poder identificarlos (resolverlos)
como independientes:
a.- Un poder de resolucin de 0,2 micras quiere decir que si dos puntos
estn separados por una distancia de 0,19 micras se vern como un
punto nico

Un objetivo con un gran poder de resolucin, tienen un valor

numrico de poder de resolucin lo ms bajo posible

Aberraciones (Poder resolucin)

Parmetros pticos (IV)

Profundidad de campo

Parmetros pticos (V)

Contraste
El nmero de sombras que se pueden observar en una imagen:
a.- imgenes de alto contraste slo tienen dos colores blanco y negro, sin
matices de gris.
b.- A mayor nmero de sombras habr menor contraste, pero esto
permite mayor informacin al poner de manifiesto otras estructuras,
esta ltima caracterstica se le denomina intervalo dinmico
luego:
a.- a mayor contraste menor resolucin
b.- a mayor iluminacin menor contraste y a menor iluminacin
mayor contraste.
c.- el enfoque correcto requiere la correcta combinacin de contraste,
resolucin e iluminacin

Ejemplos contraste.

Este grupo de instrumentos incluye no solamente diseos de la mltiple-lente con objetivos y condensadores, pero tambin los solos d

Introduccin
Los microscopios son instrumentos diseados para producir imgenes
visuales o fotogrficas magnificadas de objetos pequeos. El microscopio
debe lograr tres tareas:
a.- produzca una imagen magnificada del espcimen
b.- separe los detalles en la imagen
c.- hacer los detalles visibles al ojo o a la cmara fotogrfica humano
Este grupo de instrumentos incluye no solamente diseos de la mltiple
lente con objetivos y condensadores, pero tambin los solos dispositivos
muy simples de la lente que son a menudo hand-held

Tipos de microscopio

Tipos
Electrnicos

ptico
Claro o
compuesto

Campo
oscuro

Fase

Polarizacion

UV

TEM

SEM

ptico o fotnico
Este tipo de microscopios utilizan la luz como
fuente de energa y las propiedades de los lentes
pticos que permiten aumentar el tamao de los
objetos observados. El microscopio ptico ms
simple es la lente convexa doble con una distancia
focal corta.

Se utilizan microscopios compuestos que disponen de varias lentes con

las que se consiguen aumentos mayores.. Dentro de los microscopios
fotnicos existen varios tipos, distinguidos por pequeas diferencias, aunque
el principio bsico de funcionamiento es el mismo

Campo claro o compuesto

Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar
objetos transparentes, o cortados en lminas tan finas que se transparentan.
Se emplea para aumentar o ampliar las imgenes de objetos y organismos no
visibles a simple vista

Partes

Funcin

Mecnico

constituido por una serie de piezas en las que van, que

permiten el movimiento para el enfoque.

ptico

conjunto de lentes que aumentan la muestra

Iluminacin partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan

la cantidad de luz necesaria

Sistema mecnico
Partes

Pie

Funcin

Base sobre la que se apoya el microscopio

Columna

Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo

inferior se adapta al pie.

Tubo

Extremidad superior se colocan los oculares y en

extremo inferior el revlver de objetivos

Macromtrico

Enfoque rpido preparacin

Micromtrico

Enfoque exacto

Pltina

Coloca la preparacin u objeto que se va a observar.

Pinzas

Sujetar la preparacin

Revlver

Pieza giratoria provista de orificios en los que se

enroscan los objetivos

Sistema ptico
Partes

Funcin

Ocular

Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el

objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de
aumento van desde 5X hasta 20X.
En la cara externa llevan una serie de
ndices que indican el aumento que
producen, la abertura numrica y otros
datos
6X, 10X, 20X, 45X y 60X

Secos

Objetivos

Inmersin

objetivos son de 100X y se distingue por

uno o dos crculos o anillos de color negro
que rodea su extremo inferior

Existe una clasificacin alternativa

Clasificacin objetivos
Tipos

Correccion

Naturaleza

aberraciones

medio

Acromtico

Apocromtico

Semi
apocromtico

Seco

Inmersin

Oculares y Objetivos

Ocular caractersticas

Objetivo caractersticas (I)

Objetivo caractersticas (II)

Cdigos color objetivos

Definiciones (I)
Objetivos acromticos
Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja. Correccin de
esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color
verde y son ideales para microfotografa blanco y negro. .
Objetivos semi-apocromticos
Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en
cierto grado para el verde
Objetivos apocromticos
Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones y por ello, son ms
costosos. Presentan correccin cromtica para cuatro colores (azul oscuro,
azul, rojo y verde)

Valores para objetivos acromticos

Esquema objetivos

Definiciones (II)
Objetivos secos
El medio interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy
diferente del ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5).
Objetivos inmersin.
El medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un
lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms prximo al del vidrio. Este lquido
puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite de cedro, que posee un
ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o
eliminacin de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo,
en consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada, mientras que
en los objetivos secos, est disminuida.

Objetivos inmersin.

Sistema iluminacin (I)

Partes

Funcin

Fuente
iluminacin

Lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada. Por

delante se sita el diafragma

Espejo

Necesario si la fuente de iluminacin no est construida

dentro del microscopio

Condensador
(*)

Finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el

plano de la preparacin, formando un cono de luz con el
mismo ngulo que el del campo del objetivo

Diafragma

Est provisto de un diafragma-iris, que regula su

abertura para ajustarla a la del objetivo

(*) La abertura numrica mxima del condensador debe ser al menos igual
que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar todo su poder
separador

Tipos condensadores
Condensador de Abbe:
Es el ms simple, sin correccin de aberraciones y el ms econmico.
Compuesto de dos o ms lentes. Puede llegar a tener una apertura
numrica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observacin
de rutina y con objetivos de modesta apertura numrica y amplificacin.
Aplantico: Corrige aberraciones de esfericidad.
Acromtico: Corrige aberraciones cromticas.

Aplantico-Acromtico: Poseen el ms alto nivel de correccin y es el

condensador de eleccin para microfotografa a color con luz blanca.

Condensador tipo Abbe

Microscopio campo oscuro (MCO)

Es un microscopio ptico ordinario cuyo sistema condensador ha
sido modificado para dirigir la luz a la preparacin desde los lados, de
tal modo que slo la luz difractada por la preparacin pasa al ocular y
se hace visible.
A causa de esta disposicin, la muestra aparece iluminada sobre un
fondo oscuro.

Microscopio campo oscuro (MCO)

La iluminacin de campo oscuro se puede realizar tanto:
a.- luz transmitida (trans-iluminacin)
b.- luz incidente (epi-iluminacin).

Modelos de filtros de fcil realizacin para lograr la tcnica de campo

oscuro (izquierda y centro) e iluminacin oblicua (derecha, en cuarto
decreciente).

Ejemplos (I)

Ejemplos (II)

Ventajas-desventajas MCO
Ventajas
a.- Permite ver partculas dipersas en un medio homogneo.
b.- Hace posible la observacin del movimiento Browniano de las
partculas
c.- Se puede utilizar para la observacin de preparaciones sin colorear.
d.- Visualiza los bordes destacados delas muestras.
e.- Tcnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema
pallidum, espiroquetas con dimetros superior a 0.2 um.
Inconvenientes
a.- Inadecuada preparacin de la muestra.
b.- Alto costo.
c.- No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes celular.

T. pallidum (MCO)

Microscopio de fase (MCF)

El microscopio de contraste de fase permite observar clulas
transparentes y sin colorear, resultando especialmente til para clulas vivas.
Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las
distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido.
Consta de un dispositivo, situado dentro o debajo del condensador, que
produce una diferencia de un cuarto de longitud de onda en unos rayos
luminosos con respecto a otros
Origina unas variaciones de luminosidad en los elementos estudiados,
que permite diferenciarlos del resto de la muestra y observar con mayor
detalle su estructura interna

Partes MCF

Utilidad MCF
a.- cultivos celulares
b.- cortes histolgicos sin teir.
c.- sedimento de orina

Cristales orina

Microscopio polarizacin (MP)

Se basa en el empleo de dos filtros polarizadores,
a.- el primero de ellos, el polarizador propiamente dicho, sirve para generar
un haz de ondas luminosas que oscilan en un solo plano y que se hace
incidir en la muestra.
b.- El segundo, denominado analizador, se encuentra entre la muestra y el
ocular.
Si la muestra contiene sustancias que presentan anisotropa, se produce
birrefringencia y esta puede detectarse
Las sustancias anistropas presentan distintos valores de sus ndice de
refraccin en funcin de la direccin en que vobre la luz al atravesar el
cristal.

Partes de los filtros polarizantes (I)

Filtros polarizante

Utilidad MP
a.- sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto)
b.- sustancia amiloide
c.- colgeno
d.- cristales de uratos
e.- queratina
f.- otras de origen exgeno.

Microscopio fluorescencia
Fluorescencia
Es la propiedad que tienen ciertos elementos qumicos denominados
fluorforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una
radiacin intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de
onda determinada

Requerimientos
(I)
Fuente de luz:
a.- Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el
espectro especfico de cada fluorocromo.
b.- la fluorescencia es pasajera
c.- las clulas vivas pueden ser daadas por la intensa radiacin
d.- la luz debe ser de una longitud de onda corta.
e.- se emplean lmparas de mercurio a alta presin que funcionan de un
modo diferente a las lmparas de filamentos incandescentes.
f.- Tambin se utiliza luz ultravioleta y rayos laser.
g.- Muchos modelos funcionan con epi-iluminacin

Filtros
Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la
del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las
longitudes no deseadas.

Requerimientos (II)

La luz blanca emitida por

la fuente de luz es filtrada
dejando pasar por ejemplo,
solo la luz azul.
El espejo dicroico refleja
la luz de cierta longitud de
onda (en este caso azu

Utilidad (I)

Utilidad (II)

Se
emplearon
tres
fluorocromos:
a.- DAPI (emite luz azul)
para marcar cromosomas,
b.- GFP (protena verde
fluorescente intracelular
que emite luz verde)
c.- rodamina (luz roja) para
marcar microtbulos.

Microscopia ultravioleta
Es un microscopio en el que se usa la
luz ultravioleta, que es una radiacin
cuya longitud de onda es de
aproximadamente 200 nm y en
consecuencia permite un mayor poder
de resolucin que la luz visible.
La estructura del microscopio es
bsicamente igual a la del microscopio
de fluorescencia, con fuente de luz,
filtros, objetivos y espejos especiales;
estos ltimos son aluminizados.
La fuente luminosa corresponde a
lmparas de arco de mercurio o xenn.

Microscopia confocal (laser barrido)

Si una muestra gruesa es observada al microscopio fotnico, la imagen
que se enfoca se ve contaminada por la superposicin de los elementos
del tejido que estn fuera de foco, tanto por encima como por debajo del
plano enfocado; la imagen enfocada se deteriora a causa de las
estructuras superpuestas borrosas o no enfocadas

Caractersticas
El microscopio confocal
aade el principio de iluminar
el espcimen punto por punto
y elimina la luz proveniente de
los planos no enfocados.
Para ello se necesita una
fuente de luz muy potente, as
como tambin un filtro con un
agujero que se coloca en el
trayecto del rayo de luz

Configuracin CONFOCAL
(I)
Fuente de luz:
Generalmente emplea una fuente de luz muy poderosa (laser o lmpara de
arco). Se pueden utilizar sistemas de rayos laser multi-frecuencia (en el
rango ultravioleta, luz visible e infra-roja) adaptados a los tipos de
marcadores fluorescentes empleados para el contraste de los elementos
celulares

Sistema ptico
El sistema ptico de los microscopios est basado en los principios
fundamentales que se mantienen inalterados, sin embargo estn
complementados con los avances en ptica moderna y la tecnologa
electrnica.

Configuracin CONFOCAL (II)

Filtros de interferencia
Incluyen espejos dicromticos o dicroicos, barreras con agujero de
dimetro variable y diversos filtros de excitacin (para seleccionar la
longitud de onda de excitacin del fluorocromo).
Detectores
Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida. Para los
microscopios con mltiples rayos generalmente se usan cmaras CCD
(charge- coupled device)
Computadora
Configurada con los requisitos suficientes de memoria y procesador,
tarjetas de video de alta resolucin, complementadas con software de
captura, anlisis y procesamiento de imgenes

Micrografas comparativas

Microscopia electrnica
Los principios bsicos de los microscopios electrnicos son similares
a los microscopios pticos, las diferencias estn dadas en la fuente de
luz (electrones ) y en el tipo de lente, ya que los electrnicos emplean
lentes electromagnticas. La gran diferencia de los dos tipos de
microscopios es la potencia

T.microscopio
ptico
Electrnico

Caracterstica
aumentar unas 2000 veces y una
resolucin de 0,2 micrones
1000000 de veces con una resolucin de
0.1 nanmetros

Microscopio electrnico transmisin

Se utiliza para ver secciones o cortes de
tejidos, dirige un haz de electrones hacia el
objeto que se desea aumentar; una parte de
los electrones rebotan o son absorbidos por el
objeto y otros lo atraviesan formando una
imagen aumentada de la muestra.
Para utilizar un TEM debe cortarse la
muestra en capas finas con un grosor entre 50
a 200 nanmetros.
ste microscopio obtiene imgenes en dos
dimensiones,
que
luego
pueden
ser
plasmadas en fotografas

Microscopio electrnico barrido

Permite la observacin de superficies
sin la necesidad de realizar cortes
microscpicos, explorando la superficie de
la imagen punto por punto.
Su funcionamiento se basa en recorrer
la muestra con un haz muy concentrado de
electrones, de forma parecida al barrido de
un haz de electrones por la pantalla de una
televisin

Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un monitor

de televisin, cuanto mayor sea el numero de electrones contados por el
dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla

Diferencias entre microscopios