Bioqumica I Mini-relatrio

Reaes caractersticas dos

Glcidos

Alexandra Teixeira N 45667

2 de Maio de 2014

Lcia Prados N 44760

Licenciatura em Bioqumica

PL 2 Grupo 4

Bioqumica I

1. Resumo
Esta atividade experimental teve como objetivo a verificao de algumas reaes coradas
dos glcidos que se baseiam no seu carter redutor e/ou na sua estrutura qumica.
Pretendemos ainda determinar o contedo em glcidos redutores de farinhas alimentares
atravs da aplicao do mtodo do 3,5-dinitrosalicilato (DNS).
Nos resultados finais do teste de Benedict, que identifica glcidos redutores, conclui-se que
a xilose, a glucose, a frutose e a lactose apresentam resultados positivos, ou seja, possuem
glcidos redutores.
O teste de Barfoed, que permite distinguir oses de disidos redutores, apresentou
resultados positivos para a xilose, a glucose e a frutose, comprovando que se tratam de oses
redutoras.
Por ltimo, o teste do iodo apresentou resultados positivos apenas para a presena de
glucognio no caso do amido e do glucognio. Os restantes tubos de ensaio no apresentaram
qualquer reao.
Por fim, determinamos o contedo em glcidos redutores da farinha alimentar, aplicando
para tal o mtodo de DNS, que se baseia na reao do 3,5-dinitrosalicilato com glcidos
redutores, formando um composto corado que pode ser doseado espetrofotometricamente a
540 nm. Conclumos que a percentagem de glcidos redutores na farinha alimentar de 82,2 %.

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2. Apresentao e Discusso de Resultados

2.1 Testes de Identificao de Glcidos
Como sabemos, existem diversas reaes coradas dos glcidos que se baseiam no seu carcter
redutor e/ou na sua estrutura qumica. Estas reaes permitem identificar diversos tipos de
glcidos atravs da realizao de vrios testes (Benedict, Barfoed e Iodo). De seguida
apresentada , de forma esquematizada, uma chave dicotmica de identificao de glcidos que
apresenta os glcidos que cada teste identifica, o resultado positivo caracterstico de cada teste
e os glcidos ou grupo de glcidos que do um resultado negativo no respetivo teste.

Aps a realizao dos diferentes testes, e de forma a resumir os resultados obtidos

elaboraram-se trs quadros (cada um referente a um dos trs testes realizados) onde so
apresentadas as diferentes observaes e resultados de cada soluo de glcidos testada.

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Quadro 1 Resultados referentes ao teste de Benedict

Teste

Soluo

Observaes

Resultado

Soluo de cor azul (sem

Negativo

Estudada
gua

precipitado)
Xilose

Soluo avermelhada com

Positivo

formao de precipitado
Glucose

Soluo avermelhada com

Positivo

formao de precipitado
Frutose

Soluo cor de laranja-

Benedict

Positivo

avermelhada com formao de

precipitado
Sacarose

Soluo de cor azul (sem

Negativo

precipitado)
Lactose

Cor Laranja avermelhado Lmpida

Positivo

Com precipitado
Amido

Soluo de cor azul (sem

Negativo

precipitado)
Glucognio

Soluo de cor azul (sem

Negativo

precipitado)

O reagente de Benedict uma soluo alcalina de CuSO4 com Na2CO3 e citrato de sdio, que
permite identificar glcidos redutores. O io citrato forma um complexo com o io Cu2+,
impedindo assim que este precipite da soluo sob a forma de Cu(OH)2 (de cor azul) ou CuO
(de cor preta). O Cu2+ do reagente de Benedict oxida os glcidos redutores presentes numa
soluo, reduzido a Cu+ e precipita sob a forma de Cu2O (xido cuproso), dando origem a um
precipitado de cor vermelha.
O facto de um glcido ser ou no redutor est relacionado com a extremidade do carbono
anomrico (carbono que esteja envolvido numa ligao osdica) estar livre ou no para reduzir
o cobre do reagente de Benedict.

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Foram ento testadas 7 solues de glcidos. O tubo 1, que continha gua e reagente de
Benedict (cor azul) foi usado como controlo, visto que o prprio reagente de Benedict
preparado em gua destilada. Como seria de esperar, o resultado foi negativo (a gua no
contm qualquer glcido).
Os tubos que apresentaram um resultado positivo foram apenas os da xilose, glucose, frutose
e lactose (onde se observou uma cor vermelho-alaranjada com formao de precipitado).
Deste modo podemos afirmar que este glcidos so de facto redutores. A xilose, frutose e
glucose so consideradas monossacridos, ou seja, no esto ligadas a nenhuma outra ose.
Deste modo, o seu carbono anomrico est livre para poder reagir com o Cobre, reduzindo-o a
Cu+. devido reduo do cobre que se observa a mudana de cor de azul para
laranja/vermelho (e a formao de precipitado).
Tambm a lactose deu um resultado positivo,visto que apesar de ser um disido (constituda
por glucose e galactose), o carbono anomrico da glucose est livre para reagir com o cobre do
reagente de Benedict.
A sacarose um disido e apresentou um resultado negativo, como seria de esperar, visto que
os carbonos anomricos, quer da glucose quer da frutose participam na ligao glicosdica.

Deste modo no vo estar disponveis para reagir com o cobre do reagente.

Nos restantes tubos no se apresentaram qualquer alteraes, o teste foi negativo e no
houve formao de precipitado.
O amido e o glucognio so ambos polisidos com estruturas em forma de hlice, logo os seus
grupos redutores esto virados para o interior desta mesma hlice o que vai impedir o cobre
de ser reduzido. Deste modo o resultado foi negativo para ambos os polisidos.

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Quadro 2 Resultados referentes ao teste de Barfoed

Teste

Solues
testadas
gua
Xilose
Glucose
Frutose

Barfoed
Sacarose
Lactose
Amido
Glucognio

Observaes

Resultado

Azul translcido
Sem precipitado
Azul Translcido com formao de
precipitado vermelho
Azul Translcido com formao de
precipitado vermelho
Azul Translcido com formao de
precipitado vermelho
Azul translcido
Sem precipitado
Azul translcido
Sem precipitado
Azul translcido
Sem precipitado
Azul translcido
Sem precipitado

Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

O teste de Barfoed permite distinguir oses de disidos, a partir da sua velocidade de reao
numa soluo de acetato de cobre em cido actico, isto , os disidos apresentam uma
velocidade de reao muito inferior quando em contacto com o reagente de Barfoed. Tal como
no Teste de Benedict, as oses so oxidadas, e o Cu2+ presente no reagente de Barfoed
reduzido a Cu+, precipitando sob a forma de Cu2O de cor vermelha.
Verifica-se uma diminuio da capacidade redutora de oses e dos disidos redutores que
provocada pelo meio cido, ao contrrio do que acontece no teste de Benedict.
Foram testadas novamente as 7 solues de glcidos usadas no teste anterior, e o tubo 1 foi
usado como controlo (continha gua e reagente de Barfoed), dando um resultado negativo,
visto que mais uma vez a gua no contm nenhum glcido.
Dos restantes tubos, apenas trs deram um resultado positivo, o da glucose, o da xilose e o da
frutose. Isto aconteceu tal como previsto, visto que j sabemos que tanto a glucose, como a
xilose e frutose so oses redutoras (tal como foi comprovado pelo teste anterior) capazes de
reagir com o reagente de Barfoed, ocorrendo a formao de um precipitado de cor vermelha.
Nos tubos da sacarose e da lactose obtiveram-se resultados negativos e no se observou
formao de precipitado tal como seria de esperar, uma vez que se tratam de disidos e o seu

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carbono anomrico est menos disponvel para reagir que o das oses redutoras. No entanto,
sendo a lactose um disido redutor, se tivssemos aquecido a soluo durante mais tempo
poderamos obter um falso positivo, visto que ocorreria a reduo do cobre do reagente de
Barfoed e a formao do precipitado de cor vermelha.
Nos tubos do amido e do glicognio no se verificou qualquer alterao, como seria de esperar
visto que so ambos polisidos e tendo em conta a sua estrutura os seus carbonos anomricos
no esto disponveis para reagir, portanto no h reduo do Cu2+.
Quadro 3 Resultados referentes ao teste do Iodo

Teste

Solues

Observaes

Resultado

gua

Amarelo-alaranjado

Negativo

Xilose

Amarelo-alaranjado

Negativo

Glucose

Amarelo-alaranjado

Negativo

Frutose

Amarelo-alaranjado

Negativo

Sacarose

Amarelo-alaranjado

Negativo

Lactose

Amarelo-alaranjado

Negativo

Amido

Castanho Escuro

Positivo

Glucognio

Castanho-avermelhado

Positivo

testadas

Iodo

O teste do Iodo deteta a presena de polisidos em soluo, visto que quando tratados com
uma soluo de iodo em KI originam uma cor caracterstica.
O amido, um polisido ramificado, produz uma cor azul intensa que devida formao de
um complexo amido-iodo. Deste modo, os polisidos ramificados que apresentam hlices
interrompidas originam complexos de cores menos intensas; enquanto que os polisidos
muito ramificados, formam complexos castanho-avermelhados pouco intensos.
O controlo usado foi novamente gua com soluo de Iodo, que apresentou um resultado
negativo.
Neste teste, tal como seria de esperar, os nicos tubos que apresentaram um resultado
positivo foram os do amido e do glucognio, visto que ambos so polisidos. No entanto o
amido um polisido menos ramificado pelo que supostamente vai apresentar uma colorao

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menos intensa, enquanto que o glucognio (um polisido muito ramificado) vai apresentar
uma colorao mais intensa.
Porm, o observado aps a realizao do teste foi o contrrio e o amido apresentava uma
colorao mais intensa que o glucognio. Isto pode ter ocorrido devido a erros sistemticos,
tais como erros de medio ou talvez devido ao uso de uma pipeta ou soluo contaminadas.

De seguida so apresentadas as estruturas de alguns dos glcidos testados.

Figura 1 Estruturas de alguns dos glcidos estudados

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2.2 Doseamento de glcidos redutores numa farinha alimentar

Fluxograma Comentado
Pesar aproximadamente 80 mg de
farinha alimentar e reduzi-la a p fino
utilizando um almofariz

Pesar aproximadamente 50 mg da
amostra, registando a massa at ao
dcimo de mg

m = 49,4 mg

Transferir o material pesado para um

tubo de ensaio e adicionar 10 mL de
H2SO4 1,5 M

Aqucer o tubo de ensaio num banho

de gua em ebulio durante 20
minutos, agitando de vez em quando

Arrefecer o tubo torneira e transferir

o seu contedo para um erlenmeyer
de 50 mL com rolha

Lavar o tubo de ensaio com 12 mL de

NaOH a 10% e transferir a soluo
para o erlenmeyer anterior

Aquecer ligeiramente o erlenmeyer e

filtrar o hidrolisado, enquanto quente,
para um balo de 50 mL

Lavar o erlenmeyer com gua

destilada quente e filtrar novamente,
de modo a que o hidrolisado seja
todo transferido

A farinha reduzida a p fino de forma a

maximizar a rea de superfcie e assim facilitar a
reao de hidrlise, e tambm a permitir uma
pesagem mais rigorosa;
A massa da farinha reduzida a p deve ser
registada at ao dcimo de mg, de modo a
permitir o clculo rigoroso da concentrao de
glcidos redutores presentes na farinha
alimentar;
A adio de cido sulfrico tem um papel
importante na hidrlise cida dos polisidos,
obtendo-se assim oses redutoras. Promove
tambm a desnaturao das protenas,
biomolculas que neste caso no pretendemos
estudar e que podero interferir com as leituras
de absorvncia;
O aquecimento do tubo de ensaio tem tambm
como objetivo promover a hidrlise dos
polisidos.

A adio de NaOH tem como finalidade

neutralizar o meio, que se encontra cido devido
presena de H2SO4. Fornece tambm a
basicidade necessria para que ocorra a reao
do DNS com os glcidos redutores presentes em
soluo;
Aquecendo a amostra a filtrao far-se- mais
rapidamente, permitindo a recolha de oses
redutoras, enquanto que os polisidos no
hidrolisveis ficam retidos no papel de filtro.

Perfazer o volume do balo at 50 mL

e agitar bem

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Pretendemos determinar o contedo em glcidos redutores na farinha alimentar

atravs da aplicao do mtodo do 3,5-dinitrosalicilato. Em meio bsico, e quando aquecido na
presena de glcidos redutores, o DNS forma um produto de reduo castanho-avermelhado, o
3-amino-5-nitrosalicilato, que pode ser doseado espetrofotometricamente a 540 nm. Tal como
mostra a seguinte reao qumica:

Figura 2 - Reao do 3,5-dinitrosalicilato (DNS) com a glucose

Curva de calibrao do mtodo do DNS

Tubo N
[

]
Abs540nm

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,140

0,039

0,056

0,104

0,001

0,009

0,026

0,066

0,099

0,112

0,152

0,039

0,058

0,115

Quadro 1 - valores de absorvncia registados para cada tubo de ensaio e respetivas concentraes de
glucose calculadas

A fim de determinar a curva de calibrao, calculmos a concentrao de glucose para os

tubos de ensaio 1 a 6, aos quais foi adicionada soluo padro de glucose de concentrao 5
mg/mL. Exemplificaremos os clculos efetuados unicamente para o tubo de ensaio 1,
procedendo-se de forma semelhante para os restantes tubos de ensaio, variando apenas o
volume de soluo padro adicionado.
ci Concentrao da soluo padro de glucose (5mg/mL)
cf Concentrao de glucose no balo volumtrico
Vi volume da soluo padro de glucose adicionado ao tubo de ensaio
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Vf volume total contido no balo volumtrico (25 mL)

Tubo de ensaio 1
Vi = 0,1 mL

Em seguida, apresentamos o grfico de disperso que relaciona os valores de

concentrao de glucose dos tubos de ensaio 0 a 6 com os respetivos valores de absorvncia
registados. Desta forma, determinmos a equao da reta que melhor se ajusta aos pontos
experimentais que definem o grfico.

Absorvncia a 540 nm

Mtodo do DNS
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

y = 1.1727x - 0.0073
R = 0.9747
Series1
Linear (Series1)

0.05

0.1

0.15

Concentrao de glucose (mg/mL)

Figura 3 - grfico que relaciona a concentrao de glucose com os valores de absorvncia dos tubos de
ensaio 0 a 6. Encontra-se representada a reta que melhor aproxima os pontos experimentais
2

representados e sua respetiva equao. O valor de R encontra-se bastante prximo de 1, indicando

uma boa aproximao da reta aos pontos experimentais

Tendo em conta a equao da reta, y = 1,1727x - 0,0073, possvel calcular a

concentrao de glucose no hidrolisado adicionado aos tubos de ensaio 7 a 9. Os clculos
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efetuados sero exemplificados apenas uma vez para o tubo de ensaio 7, procedendo-se de
forma semelhante para os restantes tubos de ensaio.
Tubo de ensaio 7
Abs540 nm 0,039

Volume = 25 mL

Volume de hidrolisado adicionado = 1,3 mL

Volume inicial = 50 mL de hidrolisado

de glcidos redutores no hidrolisado inicial

Tubo de ensaio 8
m = 43,75 mg de glcidos redutores no hidrolisado inicial
Tubo de ensaio 9
m = 65 mg de glcidos redutores no hidrolisado inicial
Devido ao facto de este ltimo valor da massa de glcidos redutores presentes no
hidrolisado apresentar um grande desvio dos restantes, conclumos que provavelmente foram
cometidos erros na preparao das amostras com o hidrolisado. O erro determinante ter sido
aquando da lavagem do tubo de ensaio que continha o hidrolisado com NaOH. Parte desta
soluo foi derramada enquanto estava a ser transferida para um erlenmeyer, resultando na
perda de algum do hidrolisado que ainda se encontrava nas paredes do tubo de ensaio, e
consequentemente tambm de algum hidrxido de sdio indispensvel para manter o meio
bsico e garantir que o DNS reage com os glcidos redutores.

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Decidimos ento desprezar este ltimo valor obtido, realizando apenas os clculos
com as massas obtidas dos tubos de ensaio 7 e 8.
Mdia da massa de glcidos redutores

Percentagem de glcidos redutores na soluo preparada

mamostra = 0,0494 g
mglcidos redutores = 0,0406 g
%(m/m) =

x 100 %=

x 100% =82,2 %

% (m/m) registada na embalagem da farinha alimentar = 84,7%

O valor da percentagem (m/m) obtido experimentalmente foi bastante prximo do

valor que se encontra registado na embalagem da farinha alimentar utilizada para preparar as
amostras. No entanto, no podemos afirmar que a experincia decorreu sem erros, visto que
j alguns foram referidos anteriormente, tais como: perda de volumes significativos tanto de
hidrolisado como de solues durante a atividade, nomeadamente na transferncia de uns
recipientes para outros.

3. Bibliografia

QUINTAS Alexandre, PONCES Ana Freire, HALPERN Manuel J., Bioqumica Organizao
Molecular da Vida, LIDEL 2008, Lous, pp. 321 (acedido a 8/05/2014 pelas 16:07)
http://pt.wikipedia.org/wiki/Carbono_anom%C3%A9rico (acedido a 8/05/2014 pelas
13:04)
Protocolo das aulas prticas de Bioqumica
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAA8XgAE/acucar-redutor
(acedido
a
8/05/2014 pelas 14:50)
Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition (acedido a 8/05/2014 pelas 17:09)
http://www.fat.uerj.br/intranet/disciplinas/Processos%20Bioquimicos/APOSTILA%
20PR%C1TICA%20DE%20PROCESSOS%20BIOQU%CDMICOS_vers%
E3o2.pdf (acedido a 8/05/2014 pelas 16:07)

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4. Questes a desenvolver
4.1. A forma predominante da glucose em soluo a estrutura em anel representada pela
projeo de Haworth. Porque que a glucose d um resultado positivo, reagindo
completamente, nas reaes caractersticas da sua forma em cadeia aberta?
A ciclizao da glucose uma reao rpida em gua, existindo um equilbrio entre a
forma linear e a forma cclica, no entanto, a forma mais abundante da glucose em soluo
aquosa a cclica que deriva de uma reao intramolecular entre um hidroxilo e o grupo
aldedo, podendo gerar um anel de cinco ou seis membros. A forma cclica dos glcidos
encontra-se representada por projees de Haworth.
Durante a atividade experimental obtivemos resultados positivos para a glucose nos
testes de Benedict e de Barfoed. A ocorrncia de reaes inerentes aos dois testes comprova a
existncia de glucose na sua forma de cadeia aberta. A introduo de um reagente especfico
no sistema (reagente de Benedict e de Barfoed) leva a um consumo de estruturas em cadeia
aberta. Segundo o Princpio de Le Chtelier, o sistema vai reagir contrariando o consumo de
glucose na sua forma linear, promovendo a abertura dos anis da glucose cclica. Este processo
repetir-se- at que toda a glucose tenha reagido.

4.2. Apesar de possurem uma extremidade redutora, o amido e o glucognio do um

resultado negativo nos testes de deteo de glcidos redutores. Justifique
O amido constitudo por dois polissacardeos: amilopectina e amilose. A
amilopectina, a amilose e o glucognio so polisidos constitudos por resduos de glucose.
A amilose constituida por 250 a 300 resduos de D-glicopiranose, ligados por ligaes
glicosdicas do tipo -1,4. Estas ligaes conferem molcula uma estrutura helicoidal.
A amilopectina um polmero ramificado constitudo por cerca de 1400 resduos de glucose ligadas entre si por ligaes glicosdicas do tipo -1,4. A estrutura do glucognio
idntica deste polmero, sendo ainda mais ramificada.
Podemos concluir ento que estes polisidos diferem apenas nas ligaes estabelecidas
entre os resduos de glucose. Estas ligaes so efetuadas pela extremidade redutora de cada
resduo. Deste modo, cada polisido apresenta apenas uma extremidade redutora livre
correspondente ao ltimo resduo de monossacardeo. No entanto, este resduo final
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encontra-se virado para o interior da hlice estrutural, tornando-se inacessvel aos agentes
oxidantes. Sendo assim os agentes oxidantes apenas tm acesso aos grupos no redutores que
se encontram orientados para o exterior da hlice.
Para alm disso, preciso ter em conta que estes polisidos possuem dimenses
elevadas, existindo uma quantidade elevada de resduos de glucose. E dadas as concentraes
reduzidas de amido e glucognio utilizadas, as extremidades redutoras presentes em soluo
no foram suficientes para obter um resultado positivo nos testes.
4.3. Como explica a obteno de um falso resultado positivo se efetuar um aquecimento
prolongado de algumas solues de glcidos no teste de Barfoed?
Ao efetuarmos um aquecimento prologando das solues de glcidos pode ocorrer rutura das
ligaes osdicas, deste modo os disidos iriam dar origem a oses. As oses tm ento as suas
extremidades redutoras disponveis para reagir, sendo oxidadas. Assim, so reconhecidas pelo
teste de Barfoed apresentando um resultado positivo. No entanto, o teste de Barfoed
indicando para detetar a presena de oses, e no especfico para disidos e polisidos, pelo
que estaramos a obter um falso-positivo.
Pode ainda ocorrer alterao da conformao da estrutura dos glcidos se estes forem sujeitos
a grandes variaes de temperatura. Deste modo o amido e o glucognio podem sofrer
alteraes na sua estrutura, ficando os grupos redutores voltados para o exterior e podendo
reagir.
4.4. Porque foi necessrio proceder hidrlise cida da farinha alimentar previamente
aplicao do mtodo do DNS?

Foi necessrio proceder hidrlise cida da farinha alimentar para quebrar as ligaes osdicas,
formando-se uma molcula de gua. A farinha alimentar constituda por amido que devido
hidrlise cida vai dar origem a oses que ficam com o seu carbono anomrico livre para reagir
com o DNS, e deste modo h uma quantificao mais eficaz dos glcidos.

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