Practica n7: Numeracion de coliformes totales y

coliformes fecales por el mtodo de numero mas probable

(NMP) en muestras ambientales. Numeracion de
enterobacterias por el mtodo de recuento en placa

INTEGRANTES:

Juan Reynaldo Ranilla Yanac

PROFESOR:

Prof. Martin Martnez

Objetivos

Evidenciar la presencia y realizar recuento de coliformes totales y coliformes fecales por el

mtodo de nmeros mas probable
Manejar la tcnica de (NMP) y su correcta interpretacin en el anlisis microbiolgico de
muestras ambientales
Realizar el recuento directo de enterobacterias y coliformes por medio de placas de agar (VRBA)

Introduccin
RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA
Es un mtodo muy utilizado cuando se necesita determinarel tamao de la poblacin
bacteriana de una muestra.
El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno desarrollar una
colonia visible. Pero debido a que una muestra no es totalmente homognea con respecto
a su composicin microbiolgica, es posible que una colonia se origine de un
microorganismo o de cientos de ellos, dando en este ltimo caso un recuento menor del
real.
Tambin es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan
crecer en las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.).En
este caso el recuento tambin ser inferior al real. Lo que si se sabe es que cada colonia
observada se form a partir de por lo menosun microorganismo. Esta es una condicin
necesaria y suficiente. Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia
(ufc) a los efectos de los clculos. Se admite, por lo tanto, que en los mtodos de recuento
de microorganismos vivos, son inevitables los errores. Especialmente cuando se examinan
muestras pequeas, es posible cometer grandes errores.
METODO DE NUMEROS MAS PROBABLE

El mtodo del Nmero ms probable (NMP) tambin conocido como el mtodo de los
ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de
elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia
eficiente para estimar densidades de poblacin que se emplea cuando una evaluacin
cuantitativa de elementos individuales no es factible.
El mtodo se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos
especficos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir
de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una nica clula
viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El mtodo requiere la realizacin de
una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado
para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se
incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos
tubos que recibieron una o ms clulas microbianas procedentes de la muestra, se

pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern
transparentes.
Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrn
tan slo un microorganismo y otros tubos no contendrn ninguno. Al calcular la
probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna clula, se puede estimar el
nmero ms probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de
una tabla estadstica.1
La precisin del mtodo del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que
se usan; cinco tubos por dilucin se considera como una relacin adecuada entre precisin
y economa.
Una condicin del mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo especfico de la
poblacin en el medio de crecimiento que se emplee. La estimacin de la densidad
poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en
serie y el empleo del clculo probabilstico.2
Hay muchas entidades discretas que son fciles de detectar pero difciles de contar. Una
aplicacin es el de cualquier clase de reaccin de amplificacin o reaccin de catlisis que
impide una cuantificacin fcil, pero permite que su presencia sea detectada de modo
muy sensible. Algunos ejemplos comunes son: crecimiento de microoganismos, accin
enzimtica, o catlisis qumica. El mtodo del NMP supone tomar la disolucin original o
muestra y subdividirla en un factor (frecuentemente 10 veces,o 2 veces) y evaluar la
presencia/ausencia en mltiples subdivisiones.
El grado de dilucin para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos
se han diluido tanto que hay muchas submuestras en las que no aparece. Un juego de
repeticiones para cualquier concentracin dada permite una resolucin ms fina, para
usar el nmero de muestras positivas y negativas que estiman la concentracin original
dentro del apropiado orden de magnitud.
Medios de cultivo:

Lauril Sulfato Caldo: Medio recomendado por A.P.H.A. para deteccin y recuento de
coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos. Es un medio rico en nutrientes,
que permite un rpido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la
lactosa,
an
de
los
fermentadores
lentos.
La triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la lactosa es
el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el
cloruro
de
sodio
mantiene
el
balance
osmtico
Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora

acompaante.
Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se evidencia al
utilizar las campanas Durham.

Materiales y equipos:

Los requisitos mecnicos para la preparacin y dilucin de la muestra de alimentos y suelos

Incubadora 35 37 c / Bao mara 44.5 c
Asa de siembra /inoculacin
Caldo lauril sulfato triptosa (LST) volumen 10 ml en tubos de 15 x 100 mm, conteniendo tubos de
fermentacin invertidos ( campanas dunhan) de 75 x 10 mm
Caldo verde brillante bilis (2 %) Lactosa ( caldo BM1LM), volumen de 10 ml en tubos de 15 x 150
mm, conteniendo tubos de germen
Agar endo

Procedimiento experimental

Hacer diluciones sucesivas de

,
Preprar
en tres tubos que contienen prueba de caldo lst
Preparar 3 tubos de igual manera para
Incubar 35 37 c /24 48 hrs
Estriar en agar endo las colonias rojas redondeadas, apreciar el brillo metalico
el caldo brila contar tubos positivos y comparar con table de NMP
el caldo EC, incubar a 44.5 +0.2c
contar numero de tubos positivos y comparar con tabla MNP
Sembrar en agar nutitivo 2 y caldo lactosado y aplicar la pruebas de rojo de metilo sim citrato y
en el caldo lactosado coloracin gram

Resultados experimentales
EC
muestra

turbiedad
3 turbios
3 turbios
3 turbios
1 turbios

+
3
2
3
0

0
1
0
3

BRILA
muestra

turbiedad
A, poco gas B, regular
A mucho gas , B y C
poco gas
B y C regular gas
B poco gas

+
3
3

0
0

2
3

1
0

Conteo de colonias

descripcin
incontable
incontable
incontable
12 colonias
nulo

Observaciones / conclusiones

Hay no coliformes expansivos y difunden por bacilos en

Colonias coliformes roja:
o Halo de precipitacin
o Son coliformes
o Son enterobacterias

Bibliografa

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-vpmedio.htm

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp5.pdf
Anexos