REBIOL

Revista Cientfica de la Facultad de Ciencias Biolgicas

Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Per

Vol 32, N 1, Enero-Junio, 2012, pp. 24-103

Aislamiento y seleccin de bacterias nativas de

rizobios fijadores de nitrgeno, a partir de
ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris.
Isolation and selection of rhizobia native bacteriae nitrogenfixing from Phaseolus vulgaris root nodules.
Eva E. Villanueva Tarazona y Anbal Quintana Daz
Departamento de Microbiologa y Parasitologa. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Per

RESUMEN
La presente investigacin tuvo como objetivo aislar, seleccionar, y conservar bacterias nativas
de rizobios a partir de ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris frijol, para lo cual se utiliz la
metodologa sugerida por Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y la de Somasegaran y
Hoben, los cuales tienen en cuenta las caractersticas morfolgicas, bioqumicas y metablicas de los
cultivos, logrndose aislar y seleccionar cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrgeno de
crecimiento rpido y lento con caractersticas similares a lo descrito en el manual de bergey's, que
concuerdan con los gneros de Rhizobium y Bradyrhyzobium. Determinndose la predominancia de
rizobacterias de crecimiento rpido pertenecientes al gnero Rhizobium en comparacin con las de
crecimiento lento del gnero Bradyrhyzobium. Posteriormente los cultivos obtenidos se conservaron
por el mtodo de subcultivos peridicos en refrigeracin, ya que existe una potencial riqueza de
rizobios cuya diversidad no ha sido an estudiada con un potencial uso agronmico.
Palabras clave: Rhizobium, Bradyrhyzobium, rizobios
ABSTRACT
The present study aimed to isolate, select, and retain native rhizobia bacteria from root nodules of
Phaseolus vulgaris "bean", for which we used the methodology suggested by the International Center
for Tropical Agriculture (CIAT) and the Somasegaran and Hoben, which take into account the
morphological, biochemical and metabolic crop, achieving isolate and select crops native rhizobia
nitrogen-fixing fast growing and slow with similar characteristics as described in Bergey's Manual's,
consistent with the Rhizobium and Bradyrhyzobium genres. Determining the predominance of rapid
growth rhizobacteria belonging to the genus Rhizobium compared with slow growing
Bradyrhyzobium genus. Subsequently the cultures were maintained by periodic subculturing method
refrigerated, since there is a wealth of potential diversity rhizobia which has not yet been studied with
a potential agronomic use.
Keywords: Rhizobium, Bradyrhyzobium, rhizobia
INTRODUCCIN
La necesidad de disminuir el uso de agroqumicos para aumentar las respuestas de la agricultura en
la alimentacin humana han orientado las investigaciones hacia el desarrollo de nuevas biotecnologas
y en los ltimos aos ha habido un inters creciente en el estudio de los microorganismos fijadores de
nitrgeno, que convierten el nitrgeno gaseoso a amonio mediante reacciones enzimticas; esta es una
caracterstica exclusiva de procariontes y se encuentran distribuidas en muchos gneros de bacterias 1.
Tales microorganismos pueden ser de vida libre o simbitica como los del gnero Rhizobium que se

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asocian a leguminosas esta asociacin Rhizobium - Leguminosa contribuye entre 1/3 y un 1/2 del
nitrgeno fijado de la atmsfera y se basa en el intercambio de carbono por nitrgeno entre ambos
simbiontes2.
Las leguminosas son ricas como fuente de protenas tanto para la alimentacin humana como para
el ganado. La produccin de plantas leguminosas depende en gran medida de la fijacin de nitrgeno
molecular que realiza en simbiosis con especies especficas de Rhizobium. Existen cerca de 19,000
especies de leguminosas2, y la mayora an no son aprovechadas por el hombre. Solo se conocen los
simbiontes para alrededor del 1% de las leguminosas que forman ndulos fijadores de nitrgeno 3.
El gnero Rhizobium incluye especies importantes para la agricultura, han sido empleados como
biofertilizante. Fue el primer gnero bacteriano producido a gran escala para ser utilizado como
inoculante en diversos cultivos agrcolas; esta prctica ha sido realizada durante aos. Se estima
adems que la biodiversidad de los rizobios que an no son conocidos, representa un importante
recurso biolgico debido a que las leguminosas constituyen un grupo grande y diverso que se
encuentran distribuidas en distintos ecosistemas4.
En el ao 2000 se obtuvieron 58 nuevas cepas de Rhizobium aisladas de ndulos de races de frjol
comn cultivado en suelos originarios de diferentes reas agroecolgicas en Senegal y Gambia (este
de frica)5. En el 2002 se aislaron 28 cepas rizobianas nodulantes del frjol caup, en una relacin de
1:3 entre la presencia de cepas de crecimiento rpido frente a las de crecimiento lento6; una relacin de
1: 9 y 1: 7 entre los aislamientos7,8, lo que habla de la gran diversidad existente segn el lugar de
muestreo. Estos datos brindan la factibilidad de aislar Rhizobium spp. a partir de suelos en los que se
cultivan leguminosas.
Se sabe que existen diversos factores que pueden afectar la relacin simbitica impidiendo la
aparicin de ndulos y como consecuencia de ello la leguminosa puede morir, salvo en suelos muy
ricos en derivados nitrogenados. Entre los factores qumicos destacan la concentracin de cloruro de
sodio, metales, pH, niveles txicos de aluminio o manganeso y bajos niveles de calcio, magnesio,
potasio y molibdeno8. Entre los factores fsicos: la temperatura, la erosin, presencia de malezas,
hidromorfismo y compactacin9. Entre los factores biolgicos se pueden mencionar la presencia de
virus, y bacterias como Bdellovibrio que inhiben la nodulacin10.
La bsqueda de nuevas alternativas ecolgicas que ayuden a disminuir los costos de la produccin
agrcola, cuidar el ambiente y por ende lograr un desarrollo sostenible obliga a estudiar la posibilidad
de utilizar el potencial que tienen las bacterias que nodulan en las races de las leguminosas y en
especial de las que se consideran no especializadas o promiscuas, de suerte que puedan utilizarse para
inducir nodulacin y fijar nitrgeno en otras leguminosas que pueden ser de mayor efectividad. El
seleccionar cepas autctonas con alta capacidad de competencia en lugar de introducir cepas que
aunque competitivas provienen de ndulos o suelos ajenos al sitio en cuestin, constituye una
excelente alternativa. A pesar de la determinante influencia que tiene la poblacin de Rhizobium
autctona en los campos de cultivo, compite con las cepas forneas introducidas y da lugar a un menor
rendimiento11,12; entonces, puede ser ventajoso utilizar los rizobios nativos aislados como
biofertilizantes, en cantidades adecuadas. Esto constituye una alternativa para el enriquecimiento de
los suelos agrcolas.
En la actualidad, la taxonoma de los rizobios se basa en un enfoque polifsico que incluye
caracterizacin morfolgica, bioqumica, fisiologa, gentica y filogenia; no es factible adelantar
estudios de tipo gentico si no se han identificado sus propiedades fenotpicas 13. Se estima que los
rizobios no conocidos en el mundo representan un recurso biolgico importante porque las
leguminosas constituyen un grupo grande de plantas que se encuentran distribuidas en distintos
ecosistemas4.
Uno de problemas fundamentales que enfrenta la humanidad es la produccin de alimentos en
cantidad suficiente para la poblacin que se incrementa en forma progresiva. Para solucionar este
problema se ha recurrido a la llamada revolucin verde que se basa en el uso de fertilizantes qumicos,
los cuales se aplican cada vez en cantidades mayores generando severos daos ecolgicos,
contaminando los suelos y cuerpos de agua. Ello ha motivado a estudiar diversos sistemas biolgicos
para poder modificar las prcticas agrcolas y para que la fijacin biolgica del nitrgeno sea la que
reemplace al nitrgeno extrado del suelo por los cultivos. Por tanto, debido a que existe una potencial
riqueza de rizobios cuya diversidad no ha sido estudiada, se realiz este estudio con el fin de aislar
rizobios a partir de ndulos radiculares de Ph. vulgaris frijol, cultivados en el distrito de Laredo y
seleccionar aquellos con el mejor potencial agronmico para ser utilizados como bioinculos en la

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agricultura, para lo se plante el problema Qu bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrgeno se

aislarn y seleccionarn a partir de ndulos radiculares de Ph. vulgaris frijol cultivados en el distrito
de Laredo, La Libertad, Per, de enero a julio del 2012? , con los siguientes objetivos generales y
especficos.
MATERIAL Y MTODOS
Material Biolgico
Races, con ndulos, de plantas de frijol Phaseolus vulgaris
Recoleccin de ndulos radiculares
Las races, con ndulos, se colectaron a partir de plantas de frijol en bolsas de primer uso. Cada
muestra se acondicion y rotul segn el cdigo asignado y fue trasladada al laboratorio para su
posterior procesamiento.
Procesamiento de las muestras
Las races se procesaron en primer lugar, contando el nmero de ndulos de cada una de ellas.
Luego se seleccionaron los ndulos viables en base a sus caractersticas morfolgicas14. Los ndulos
viables fueron acondicionados en frascos de vidrio con algodn y silicagel, y conservados en
refrigeracin hasta su posterior tratamiento.
Aislamiento de bacterias nativas de rizobios
Los ndulos fueron procesados utilizando la metodologa sugerida por Somasegaran y Hoben 14. La
desinfeccin de los ndulos se realiz por inmersin sucesiva en alcohol al 95% por un minuto e
hipoclorito de sodio al 3% durante tres minutos, posteriormente, se enjuagaron con agua destilada
estril (ADE) hasta que no se perciba el olor a leja
Los ndulos desinfectados fueron colocados en placas Petri y machacados adicionando una gota de
ADE por ndulo. Muestras del machacado fueron sembradas por estra en placas conteniendo Agar
Manitol Extracto de Levadura-Rojo de Congo (LMA-RC) y se incubaron a 28C por 2 10 das. Se
observ diariamente el crecimiento de las colonias caractersticas de rizobios de acuerdo al manual del
CIAT (CIAT, 1988).
Las colonias tpicas de rizobios fueron resembradas en placas Petri conteniendo LMA-RC y se
incubaron a 28C por 2 10 das. Se verifico la pureza de los cultivos. Los cultivos fueron aislados en
tubos conteniendo LMA-RC e incubados a 28C.
Seleccin primaria e identificacin de cepas nativas de rizobios.
Los cultivos seleccionados fueron analizados tanto en sus caractersticas macroscpicas y
microscpicas. Se evaluaron el color, el dimetro, la apariencia y la forma de las colonias, la cantidad
de goma producida y la textura. se realizaron coloraciones simple y de Gram15.
Adems, se evalu el crecimiento de los cultivos aislados en agar peptona glucosa (PGA), agar
Luria Bertani (LLA) y agar manitol (LMA). Despus de la incubacin a 28C, se realizaron las lecturas
y se identificaron los rizobios15.
Conservacin de cepas nativas de rizobios.
Las cepas nativas aisladas fueron, selladas, rotuladas y conservadas en agar manitol (LMA) en
condiciones aspticas de refrigeracin.
Anlisis de Datos
El nmero de bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrgeno aislados, seleccionados e
identificados, a partir de ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris frijol sern procesados y
organizados en tablas y figuras.
RESULTADOS
Se encontraron 10 cultivos nativos de rizobios, aislados a partir de ndulos radiculares de Ph.
vulgaris, en agar manitol extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28C (Tabla 1). Cuando
se determinaron las caractersticas micromorfolgicas de las bacterias, se encontr que eran Gram y
Maneval negativas (Tabla 2).
Cuando se determinaron las caractersticas macromorfolgicas se encontr que tenan tamao
variable entre 1 y 7mm, borde entero, consistencia gelatinosa, de color blanquecino a rosado y tiempo
de generacin entre 3 y 10 das (Tabla 3). Por su lado, las caractersticas culturales determinaron

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crecimiento en Medio Lactosa Extracto de Levadura y ausencia de crecimiento en Medio Luria

Bertani (Tabla 4) habindose hallado que el gnero ms frecuente (60%) fue Rhizobium (Tabla 5)
Tabla 1. Cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrgeno, aislados a partir de ndulos radiculares de
Phaseolus vulgaris, en agar manitol extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28C.

N DE
CULTIVOS
AISLADOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

MUESTRAS

Ndulos
radiculares
de

Phaseolus
vulgaris.

CDIGO
MITPhv1
MITPhv2
MITPhv3
MITPhv4
MITPhv5
MITPhv6
MITPhv7
MITPhv8
MITPhv9
MITPhv10

MITPhv = Microbiologa Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris

Tabla 2. Caractersticas micromorfolgicas de los cultivo nativos de rizobios fijadores de nitrgeno, aislados a
partir de ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris.
CARACTERSTICAS
MICROMORFOLGICAS
Gram
Maneval
Forma

TODOS LOS CULTIVOS

(del MITPhv1 al MITPhv10)
Negativos
Cpsula presente
Bacilar y Bacilos Pleomrficos

MITPhv = Microbiologa Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris

Tabla 3. Caractersticas macromorfolgicas y tiempo de crecimiento de los cultivos bacterianos nativos de

rizobios fijadores de nitrgeno, aislados a partir de ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris, en agar manitol
extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28C.
CULTIVO N
Caractersticas
Macroscpicas
Dimetro(mm)
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consistencia
Color
Detalles pticos
Cant. de goma
Tiempo de
crecimiento
(das)

MITPhv1

MITPhv2

MITPhv3

MITPhv4

MITPhv5

MITPhv6

MITPhv7

7mm
Circular
Entero
Convexa
Lisa
Gelatinosa
Blanquecina
Opaca
abundante
3

2mm
Puntiforme
Entero
Elevada
Lisa
Ligosa
Rosadas
Translcida
escaso
10

1mm
Puntiforme
Entero
Plana
Lisa
Gelatinosa
Rosadas
Translcida
escaso
10

1mm
Puntiforme
Entero
Plana
Lisa
Gelatinosa
Rosadas
Translcida
escaso
10

6mm
Circular
Entero
Convexa
Lisa
Gelatinosa
Blanquecina
Opaca
abundante
3

4mm
Circular
Entero
Convexa
Lisa
Gelatinosa
Rosadas
Translcida
abundante
3

1mm
Puntiforme
Entero
Convexa
Lisa
Ligosa
Rosadas
Translcida
escaso
10

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Tabla 4. Seleccin de cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrgeno, a partir de pruebas bioqumicas y de
crecimiento para la determinacin de pureza de los cultivos aislados de ndulos radiculares de Phaseolus
vulgaris.
MUESTRA

Ndulos radiculares
de Phaseolus
vulgaris.

CULTIVO

PRUEBA BIOQUMICA
LLA
PG-PBC
LB
+ (SC)
Escaso
+(SC)
+(SC)
+(SC)
+ (SC)
Escaso
+(SC)
+(SC)
+(SC)
+(SC)
+(SC)
Escaso
-

MITPhv1
MITPhv2
MITPhv3
MITPhv4
MITPhv5
MITPhv6
MITPhv7
MITPhv8
MITPhv9
MITPhv10

GENERO

Rhizobium
Bradyrhizobium
Bradyrhizobium
Bradyrhizobium
Rhizobium
Rhizobium
Bradyrhizobium
Rhizobium
Rhizobium
Rhizobium

LLA = Medio lactosa extracto de levadura

PG-PBC = Medio peptona glucosa-prpura de bromocresol
LB = Medio Luria Bertani
+ = Crecimiento
- = Ausencia de crecimiento
SC = Sin cambio de color

Tabla 5. Frecuencia de cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrgeno, Rhizobium sp. y Bradyrhizobium sp.,
encontrada a partir de aislados de ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris.
MUESTRAS

Ndulos radiculares
de Phaseolus vulgaris.

CULTIVOS

GNERO

N DE
CULTIVOS

MITPhv 1, 5 , 6, 8, 9, 10.

Rhizobium

60

MITPhv 2, 3, 4, 7.

Bradyrhizobium

40

MITPhv = Microbiologa Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris

DISCUSIN
El uso de fertilizantes nitrogenados a nivel mundial ha sido indispensable para mantener o
incrementar las reservas de nitrgeno del suelo; no obstante, su abuso ha conducido a problemas de
contaminacin ambiental, por tal motivo, la FBN ha atrado a los cientficos interesados en la nutricin
vegetal, la cual es de bajo costo y no causa dao ambiental16.
La bsqueda, el aislamiento y seleccin de bacterias fijadores de nitrgeno es muy importante
desde el punto de vista agronmico, ya que se requiere como base para la produccin de inoculantes
bacterianos que estimule la produccin vegetal. Existe una gran diversidad de microorganismos
presentes en el suelo que se encuentran interactuando entre s y con otros organismos del medio, de
ellos tenemos un grupo de gran importancia por su relacin sinrgica con las plantas en la fijacin
biolgica del nitrgeno (FBN), y por su gran potencial uso biotecnolgico en la agricultura. En los
ltimos aos se ha observado un gran inters a nivel mundial en el estudio de estas interacciones
planta-microorganismo, fundamentalmente enfocado a generar nuevos conocimientos bsicos
aplicables a los sistemas de produccin17.
Del estudio realizado, se puede observar en la Tabla 1, que se aislaron y seleccionaron 10 cultivos
de rizobios nativos fijadores de nitrgeno a partir de ndulos radiculares de Phaseolus vulgaris, 6 de
los cuales segn las pruebas realizadas perteneceran al gnero Rhizobium y 4 del gnero
Bradyrhyzobium tal como se observa en las Tabla 3 y 4, los cuales se caracterizaron por ser
hetertrofos, con metabolismo aerbico, al microscopio se observaron en forma de bacilos no
esporulados, Gram negativos, y sus clulas presentaron formas irregulares o pleomrficas en forma de
X o de Y, llamados bacteroides, creciendo a una temperatura ptima de 28 C. y un pH de 7,0.

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Las especies del gnero Rhizobium encontradas, se caracterizaron por tener un crecimiento rpido
(3 a 5 das), de reaccin cida en un medio con sales minerales conteniendo manitol, fueron
productores de abundante lipopolisacridos extracelulares, por consiguiente formaron colonias de
aspecto mucilaginoso; semitranslcidas y opacas, circulares, convexas, de color blanco o ligeramente
rosadas, midiendo de 2 a 7 mm de dimetro a los 3- 5 das de incubacin en medio ELMA (Agar
Manitol Extracto de levadura). Asimismo, es importante mencionar que dentro del gnero Rhizobium
existen nueve especies definidas: R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R.
huatlense, R. mongolense, R. tropici y R. leguminosarum18.
Para el gnero Bradyrhyzobium las especies seleccionadas se caracterizaron por el crecimiento
lento que presentaron (3 a 10 das) con colonias pequeas circulares puntiformes y midiendo de 1 a 2
mm de dimetro y produciendo una reaccin alcalina en el medio. Estas caractersticas encontradas
durante el aislamiento y seleccin de bacterias nativas de rizobios. son similares y concuerdan con lo
descrito en el Manual de Bergey para los gneros de Rhizobium y Bradyrhyzobium18.
Al mismo tiempo, realizando un anlisis porcentual de los rizobios que se muestran en la Tabla 5,
se puede observar que existe una predominancia de rizobacterias de crecimiento rpido pertenecientes
al gnero Rhizobium en comparacin con las de crecimiento lento del gnero Bradyrhyzobium.
Adems, los miembros del gnero Rhizobium se distingue de Mesorhizobium por diferencias en su
tasa de crecimiento, en tanto que con Allorhizobium o Sinorhizobium slo se distingue por sus
caracteres fenotpicos individuales de cada especie. El gnero Agrobacterium se diferencia de los
dems gneros sealados anteriormente por la produccin de la enzima ketolactasa19,20,21.
La taxonoma de los rizobios ha cambiado considerablemente durante los ltimos 30 aos, la
familia Rhizobiaceae en la 8va Edicin del Manual de Bergey de Bacteriologa Sistemtica incluye a
Bradyrhizobium como un nuevo gnero, basado en la rapidez de crecer en un medio de cultivo 22. Los
rizobios actualmente abarcan un rango de gneros, que incluyen Rhizobium, Bradyrhizobium,
Sinorhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium yAzorhizobium, que pertenecen a diferentes familias
dentro de la clase Alpharizobiales y los cuales establecen simbiosis con plantas leguminosas21.
La FBN puede ser llevado a cabo por microorganismos que viven libremente o formando
asociaciones. Los microorganismos asociados o simbiticos usan los productos de la fotosntesis de la
planta para fijar el N2 atmosfrico por lo que es un proceso muy eficiente para la bacteria, siendo los
ms eficaces en la FBN. Este tipo de simbiosis es muy comn entre bacterias fijadoras de nitrgeno y
plantas leguminosas23.
Son muchas ventajas de las asociaciones simbiticas ya que, la planta puede autoabastecerse del
nitrgeno fijado por los bacteroides encontrados dentro de los ndulos, elevando de manera
considerable su contenido de protenas; as mismo, los bacteroides reciben de la planta toda la energa
necesaria para su multiplicacin. A pesar de estas indiscutibles ventajas, los rizobios no siempre se
encuentran en el suelo, estn en poblaciones relativamente bajas o si se encuentran presentes, muchas
veces son de baja efectividad, por lo que una de las estrategias para incrementar la fijacin de
nitrgeno ha sido el aislamiento y la seleccin de cepas y la posibilidad de introducir estos
microorganismos en el suelo a travs de la inoculacin y favorecer as la simbiosis. Adicionalmente,
cabe destacar que inocular las semillas de leguminosas tiene un bajo costo para el productor, con un
valor promedio estimado en slo un 5% sobre el costo de la semilla24,25.
Finalmente, los cultivos nativos de Rhizobium y Bradyrhyzobium aislados y seleccionados segn
las pruebas realizadas, fueron conservados en refrigeracin, utilizando el mtodo de subcultivos
peridicos en el medio agar manitol extracto de levadura proceso que se realiz en condiciones
aspticas, posteriormente fueron selladas, rotuladas y agrupados segn su gnero, este proceso de
preservacin de cultivos es muy importante ya que nos permitir en el futuro disponer de bacterias
nativas de rizobios fijadores de nitrgeno seleccionados para posteriores estudios y ser proporcionados
a los agricultores para promover el uso de inoculantes microbianos.
CONCLUSIONES
Se aislaron 10 cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrgeno, a partir de ndulos
radiculares de Phaseolus vulgaris.
Se seleccionaron 6 cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrgeno del gnero Rhizobium .
Se seleccionaron 4 cultivos nativos
de rizobios fijadores de nitrgeno del gnero
Bradyrhyzobium.

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