PRACTICA 4

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LINFOCITOS Y NEUTROFILOS

HUMANOS
I. INTRODUCCIN
La densidad de una clula es la principal caracterstica fsica que es
usada para la purificacin y separacin de poblaciones celulares por
medio de centrifugacin isopicnica. La densidad refleja la composicin
qumica promedio de una clula mas que su tamao o alguna
caracterstica de su superficie. Los principales componentes celulares
difieren sustancialmente en sus densidades. Sin embargo, ya que
muchas clulas tienen similares proporciones de estos componentes, el
rango de densidad de las clulas es relativamente estrecho. La
separacin es conseguida simplemente por centrifugacin de una clula
con la suficiente fuerza

centrfuga y por un periodo

de tiempo

suficiente para que alcance su densidad isopicnica en la gradiente, que

se define como la localizacin en la gradiente donde la densidad de la
clula es la misma que la densidad de la gradiente.
Este mtodo es simple y rpido y toma ventajas de las diferencias de
densidad entre las clulas mononucleares, polimorfonucleares y otras
clulas encontrados en la sangre. Primero las clulas son sedimentadas
en dextrano y luego hay una separacin diferencial en una gradiente de
densidad discontinua de ficollhypaque. En el dextrano los eritrocitos
forman roulex y de este modo sedimentan ms rpidamente que los
granulocitos En el ficollhypaque las clulas mononucleares y plaquetas
son colectadas en la parte superior de la capa de, debido a que estas
clulas

tiene

una

baja

densidad.

En

contraste

(neutrfilos) tienen una densidad mayor que el

los

granulocitos

ficollhypaque y son

colectados en la parte inferior de la capa ficollhypaque las plaquetas

son separadas de las clulas mononucleares por subsecuentes pasos de
lavados y centrifugacin

II. OBJETIVOS
- Aislar linfocitos y neutrfilos humanos utilizando dextrano y una
gradiente de densidad con ficollhypaque
- Cultivar linfocitos y neutrfilos humanos en medio de cultivo RPMI
1640
III. REACTIVOS Y MATERIALES
Materiales
- Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)
- Centrfuga
- Micropipetas
- Tubos eppendofts
- Hemocitometro
Reactivos
- Ficoll hypaque
- dextrano
- medio de cultivo RPMI 1640
- PBS
- Sangre con anticoagulante ( EDTA )
- Azul de trypan
- NaCl 1,8 %
IV. PROCEDIMIENTO

A. Obtencin de la Sangre

1. Colectar 20ml de sangre en tubos de vidrio con anticoagulante

(EDTA)
2. Mezclar bien la sangre con el anticoagulante.
B. Sedimentacin en dextrano
1. Anadir 2.5 ml de dextrano al 10% por cada 20ml de sangre
2. Mezclar suavemente por inversin 10 veces
3. Dejar sedimentar durante ~40 minutos en posicin vertical
4. Recuperar la capa superior (sobrenadante) y colocarla sobre el
ficollhypaque, La relacin Ficoll sobrenadante debe ser 1:2.
C.

Preparacin de la gradiente de densidad con ficoll

hypaque
1. Colocar 5 ml de ficollhypaque en un tubo de falcon
2. Colocar lentamente 10 ml del sobrenadante obtenido en la etapa

anterior, sobre el ficollhypaque evitando la mezcla de ambas

soluciones
D.

Separacin de las clulas

1. Centrifugar a 2000 rpm durante 20 min ( 200 C )
2. Retirar los tubos de la centrfuga lentamente evitando mezclar las
fases
3. Colectar la interfase de leucocitos mononucleares ubicada entre

la capa de ficollhypaque y la capa de plasma y transferirla a un

nuevo tubo falcon
4. Luego colectar el pecipitado, conteniendo los neutrfilos, ubicado

por debajo de la capa de ficollhypaque y transferirlo a un nuevo

tubo falcon
3. Agregar 10ml de PBS

4. Centrifugar a 2000 rpm durante 4 min Si el pellet esta

contaminado realizar um shock osmtico
5. Eliminar el sobrenadante y Resuspender el precipitado celular en
1-2 ml de medio de cultivo completo (RPMI 1640 ) con suero
humano AB+ AL 10 %, penicilina 100 u / ml, estreptonicina 100 g /
ml
6. Contar las clulas y determinar la viabilidad celular por el mtodo
de azul de trypan.
Shock osmtico: Agregar um volumem de agua destilada
a las clulas
mezclar por pipeteo , no mas de 28segundos y luego
agregar un volumem
igual de NaCl 1,8 %,

E. Cultivo primario de linfocitos y neutrofilos

1.

Colocar 3 x 106 clulas ( 1 x106 clulas 1 cm2 ) en placas de

cultivo de 60 mm. de dimetro con 4 ml de medio de cultivo
completo

2.

Incubar las clulas a 370 C con 5 % de CO 2 95 % de

humedad.

V. RESULTADOS
1.

Esquematice el procedimiento de aislamiento y cultivo de

linfocitos y neutrofilos humanos

2.

Determinar la viabilidad y el numero de linfocitos y neutrofilos

humanos obtenidos por mililitro

VI. CUESTIONARIO

1. Indique el fundamento del aislamiento de linfocitos y neutrofilos

humanos con ficollhypaque.
2. Qu caractersticas fsicas de las clulas de la sangre permiten
la distribucin de las clulas de la sangre en distintos capas?.
3. Qu es una gradiente de densidad?
4. indique los tipos de linfocitos que se encuentran en la sangre
5. Qu es una centrifugacion isopicnica?
6. Indique que otros medios de densidad se puede utilizar para la
separacion de linfocitos?
7. Indique cual es la composicin del medio de Cultivo RPMI-1640
en indique la importancia de sus componetes
8. Porque se utiliza CO2 en el cultivo de Clulas animales o
humanas cual es su funcion? Que buffer se puede emplear en vez
del CO2?