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VALIDATION SPREADSHEET: A NEW TOOL FOR ESTIMATING THE ANALYTICAL FIGURES OF MERIT FOR THE
VALIDATION OF UNIVARIATE METHODS. This work presents the VALIDATION SPREADSHEET, a public domain tool that
can be used to evaluate the figures of merit for univariate analytical methods. A real example of BTEX determination in environmental
samples is included to illustrate its use. The spreadsheet has been developed for Excel and Open Office, and is available on the
internet at http//lqta.iqm.unicamp.br.
Keywords: spreadsheet; figures of merit; validation.
INTRODUO
O bom desempenho de qualquer tcnica analtica depende
crucialmente de dois parmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatstica dos clculos envolvidos no seu
processamento. Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um mtodo durante as operaes de rotina de um laboratrio
estabelecendo os limites destes parmetros por meio da estimativa
das figuras de mrito, numa etapa conhecida como validao.
As figuras de mrito so, portanto, os indicadores quantitativos do escopo e do bom desempenho das tcnicas, e so descritas
na literatura especializada como: seletividade, ajuste da curva analtica e determinao da sua faixa de linearidade, sensibilidade do
mtodo, representada pelos limites de deteco (LD) e quantificao
(LQ), preciso, exatido e robustez1-8.
A estimativa destes parmetros pode variar de acordo com a
tcnica analtica empregada, ou com o protocolo de validao a ser
seguido. No intuito de padronizar estes procedimentos, a IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemstry) publicou
no final da dcada de 90 um guia para calibrao em Qumica
Analtica4. Ainda em 1990, as agncias regulatrias dos Estados
Unidos (FDA, Food and Drug Agency), Japo (MHLW, Ministry
of Health, Labour and Welfare) e Unio Europia (EMEA,
European Medicine Agency) passaram a organizar a Conferncia Internacional sobre Harmonizao (ICH, International
Conference on Harmonisation), para estabelecer padres para os
procedimentos de pesquisa e desenvolvimento de frmacos. Neste
contexto, o ICH elaborou um guia sobre validao de mtodos2,3
que tem sido utilizado tambm em outras reas de estudo que no
apenas a farmacutica. Na rea de Qumica Ambiental, os mtodos padres para anlise de contaminantes publicados pela Agncia de Proteo Ambiental Americana (EPA, Enviromental
Protection Agency) contm orientaes a respeito da validao
destes mtodos9.
No Brasil, os dois rgos que regulamentam a validao de
mtodos analticos so a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
*e-mail: marcia@iqm.unicamp.br
(1)
O ajuste da curva pelo mtodo dos quadrados mnimos fornecer os coeficientes de regresso, que no caso de um ajuste linear
e angular
(yi = a0 + a1xi) so os coeficientes linear (a0 = y - a1 x)
(a1 = [(xi - x)(y i - y)]/(x i - x) 2), em que x o valor mdio
(
165
Figura 2. Curva de calibrao com (a) alto resduo no sinal analtico e (b)
nveis de calibrao mal distribudos ao longo da faixa de calibrao
(N) utilizadas como padres de calibrao. Uma vez conhecidos, estes coeficientes podero ser utilizados para predizer a concentrao da
espcie de interesse em novas amostras a partir do seu sinal analtico.
A adequao do ajuste da curva fornecida pelo coeficiente de correlao, r, que a razo da covarincia entre a concentrao, x, e o
sinal analtico, y, (
os padres de x (
) e y (
),
conforme descrito na equao 2. O coeficiente de correlao apresenta uma faixa de magnitude entre -1 r 1, sendo que quanto mais
prximo de 1 ou -1, menor ser o erro em y e, portanto, melhor ser
o ajuste da funo matemtica escolhida curva de calibrao. Para
um ajuste linear, no caso hipottico de r = -1, todos os pontos da
curva de calibrao estaro contidos em uma reta com inclinao
negativa. No caso contrrio, se r = 1, todos os pontos da curva devero estar em cima de uma reta com inclinao positiva. Uma relao
no linear entre x e y resultar em um valor relativamente pequeno4,19,20.
(2)
166
Ribeiro et al.
(4)
A partir destes desvios estima-se a diferena entre as somas
quadrticas dos dois ajustes (DS2) segundo a Equao 5, em que N
o nmero de padres de calibrao utilizados na construo da
curva, e estima-se a significncia desta diferena em relao Sy22
com o auxlio de um teste F (Equao 6)4,15,21. Na Equao 6, F o
ponto de distribuio F no nvel de confiana escolhido, com f1 = 1
e f2 = N 3 graus de liberdade. Isto significa que se a razo S2 / sy22
F1,n-3, o ajuste linear mais adequado. Se, no entanto S2 / sy22 >
F1,n-3, considera-se um ajuste quadrtico mais apropriado15.
Quim. Nova
ra-se o LD como sendo a menor concentrao que pode ser detectada e que seja distinta do sinal analtico do rudo3,7.
Mtodo da relao sinal-rudo
Este mtodo pode ser aplicado em procedimentos analticos
que apresentam rudo da linha de base e estimado a partir da
comparao do sinal analtico obtido para uma amostra contendo
baixas concentraes da espcie de interesse com o sinal de uma
amostra do branco. Em geral, considera-se aceitvel uma relao
sinal-rudo de 3:1 ou 2:13,7.
Mtodo baseado em parmetros da curva analtica
Os dois mtodos descritos acima so muito utilizados pela sua
rapidez, mas apresentam como desvantagem o fato de basearem-se
em parmetros qualitativos. O mtodo de estimativa do limite de
deteco baseando-se em parmetros da curva analtica apresenta
maior confiabilidade estatstica, pois leva em considerao o intervalo de confiana da regresso. O LD neste caso definido como a
concentrao mnima de uma substncia que pode ser medida e
informada com 99% ou 95% de confiana3,6,8,17. No entanto, devido
complexidade dos clculos envolvidos nesta estimativa, este
mtodo tem sido menos utilizado que os dois mtodos anteriores.
Pela sua robustez, este foi o mtodo escolhido para a estimativa do
limite de deteco (LD) da planilha eletrnica.
A estimativa do sinal analtico a partir da equao de regresso
apresenta um erro padro, e o produto deste erro pelo valor apropriado de t da distribuio de Student21 permite calcular o intervalo de
confiana da curva analtica (Figura 4a), que tem a forma de duas
linhas hiperblicas ao redor da curva. O intercepto do limite superior do intervalo de confiana conhecido por y crtico (yc) e a sua
projeo no limite inferior uma estimativa da concentrao mnima que pode ser medida com um grau de confiana comprovado
estatisticamente, ou seja, o limite de deteco do mtodo (LD). As
Equaes 7 e 8 descrevem, respectivamente, o clculo de yc e LD3,4,15.
(5)
(6)
Sensibilidade do mtodo: o limite de deteco (LD) e o limite de
quantificao (LQ)
A sensibilidade de um mtodo definida pelos limites de
deteco (LD) e de quantificao (LQ)6,8,15,17. O LD a menor concentrao da espcie de interesse que pode ser detectada pela tcnica instrumental, enquanto o LQ a mais baixa concentrao que
pode ser quantificada dentro dos limites de preciso e exatido do
mtodo durante as operaes de rotina do laboratrio, em condies usuais1,6,15,17.
H trs formas de estimar os limites de deteco e de quantificao, e a escolha de uma delas deve levar em considerao a
tcnica analtica utilizada e o grau de confiabilidade estatstica
necessria: mtodo visual, mtodo da relao sinal-rudo, e mtodo baseado em parmetros da curva analtica3,4,7.
(7)
(8)
Mtodo visual
No mtodo visual, realiza-se a anlise de amostras contendo
baixas concentraes conhecidas da espcie de interesse. Conside-
Mtodo visual
O limite de quantificao determinado pela anlise de amostras com concentraes conhecidas da espcie de interesse, e
corresponde menor concentrao que pode ser quantificada dentro dos limites de exatido e preciso do mtodo1-3,6,17.
Mtodo da relao sinal-rudo
Este mtodo adequado para procedimentos analticos que
apresentam rudo da linha de base. Neste caso, o LQ estimado a
partir da comparao do sinal analtico obtido para uma amostra
contendo baixas concentraes da espcie de interesse com o sinal
de uma amostra do branco e estabelecendo a concentrao mnima
em que a espcie de interesse pode ser quantificada com confiabilidade. Em geral, considera-se aceitvel uma relao sinal-rudo
de 10:12,3,7.
Mtodo baseado em parmetros da curva analtica
O LQ tambm calculado a partir do intervalo de confiana da
curva analtica, e sua estimativa pode ser observada na Figura 4b,
em que xc o valor da concentrao (x) no ponto em que o valor de
a0 intercepta a reta de regresso, e yh o valor de y para a projeo
de xc no limite de controle superior. As estimativas de yh, xc e LQ
podem ser realizadas respectivamente, pela utilizao das Equaes 9, 10 e 112-4,15. Na Figura 4, xc a concentrao no ponto em
que yc intercepta a reta de regresso e seu valor ser igual ao de xc
somente no caso ideal de retas com inclinao igual a 45.
(9)
(10)
(11)
Preciso
O termo preciso fornece a disperso dos valores medidos em
torno de um valor mdio, e seu valor numrico estimado pelo
desvio padro relativo, ou DPR, para anlises de amostras contendo a mesma quantidade das espcies de interesse1-4,6,15,17. O DPR
ainda conhecido como CV (coeficiente de variao), ou ainda pela
sigla RSD proveniente do ingls relative standard deviation e
seu clculo realizado como descrito na Equao 12, em que s o
desvio padro (
) e x o valor mdio (
167
(14)
O guia ICH recomenda que a exatido dever ser estabelecida
ao longo de toda a faixa de calibrao especificada para o procedimento analtico somente aps a preciso e a linearidade terem sido
estimadas 3. A ANVISA estabelece que a exatido dever ser
verificada em trs nveis de concentrao, alta, intermediria e baixa,
e no mnimo com determinaes em triplicata1.
Robustez
A robustez de um mtodo a sua capacidade de resistir a pequenas variaes dos parmetros analticos sem alterar significativamente sua exatido e preciso, portanto, uma medida da quantidade de variabilidade que o mtodo pode suportar, sem perder a
confiabilidade, e sua estimativa depende do tipo de metodologia
analtica utilizada1,3,5,7.
A robustez de um mtodo pode ser estimada variando-se os
parmetros analticos e comparando a preciso obtida em cada determinao. A ANVISA1 e o ICH3 indicam uma lista de parmetros a
serem avaliados nos testes de robustez de metodologias analticas
para as tcnicas de preparo de amostras, espectrofotometria,
cromatografia lquida e cromatografia gasosa1. O INMETRO indica
o teste de Youden5.
168
Ribeiro et al.
MATERIAIS E MTODOS
A Planilha de Validao foi elaborada no software Excel da
Microsoft Office 200324 e testada nas verses 98, 2000 e XP, e
compatvel com a planilha eletrnica do pacote Open Office 2.025,
de domnio pblico. A planilha pode ser obtida no endereo eletrnico http://lqta.iqm.unicamp.br26.
Exemplo
A utilizao da planilha ser demonstrada por meio da estimativa das figuras de mrito para a implementao de uma metodologia
para determinao de BTEX em amostras ambientais, utilizando o
mtodo padro EPA8260B da Agncia de Proteo Ambiental
Americana17.
BTEX e a escolha da metodologia analtica
Os hidrocarbonetos volteis benzeno, tolueno, etilbenzeno e
xilenos so constituintes dos produtos derivados do petrleo, e esto freqentemente presentes no nosso modo de vida atual. Estes
compostos, em especial o benzeno, atuam como substncias
depressoras do sistema nervoso central e dependendo da concentrao e do tempo de exposio podem causar sonolncia, tontura,
fadiga, narcose e morte, alm de apresentarem um potencial
cancergeno quando absorvidos em alta quantidade27,28.
A contaminao de solo e guas subterrneas por vazamentos
de produtos derivados de petrleo, em especial os hidrocarbonetos
volteis, tem despertado cada vez mais a ateno dos rgos de
controle ambiental, devido ao risco que representam sade da
populao. Uma outra grande preocupao a facilidade com que
estes compostos se dispersam no meio ambiente, devido principalmente s suas caractersticas fsico-qumicas como baixo peso
molecular e relativa solubilidade em gua quando comparados com
outros hidrocarbonetos maiores, que permitem a sua rpida difuso por corpos aquticos e pela zona vadosa do solo27-29.
Os limites de potabilidade de gua definidos pelo Ministrio
da Sade (Portaria 518 de 25 de Maro de 2004) para estes contaminantes so baixos, 5 g/L para o teor de benzeno, 170 g/L para
tolueno, 200 g/L para etilbenzeno e 300 g/L para o teor total de
xilenos30, e a metodologia analtica para a sua quantificao deve
ser robusta tambm para baixos teores.
A metodologia sugerida pela Agncia de Proteo Ambiental
americana17 para anlise destes contaminantes em amostras de solo
e gua a cromatografia gasosa com deteco por espectrometria
de massas (CG/MS), que permite a identificao e quantificao
das espcies de interesse com aprecivel confiabilidade17. Neste
trabalho, utilizou-se esta metodologia com injeo de amostra por
headspace. A identificao dos compostos foi feita empregando-se
um detector de massas do tipo ion trap, e pela comparao com as
anlises de padres certificados.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes
Foram utilizados padres Supelco (Bellefonte, PA) e Accustandard, Inc (New Haven, CT) contendo benzeno, tolueno,
etilbenzeno e o-, m-, p-xilenos; padro interno Supelco (Bellefonte,
PA) contendo clorobenzeno-d5, fluorobenzeno, 1,4-diclorobenzenod4 e padro interno Accustandard, Inc (New Haven, CT) contendo
bromoclorometano, clorobenzeno-d5, 1,4-diclorobenzeno. As solues dos padres foram preparadas em metanol grau pesticida (Tedia,
Fairfield, OH), e para a soluo modificadora de matriz foram utili-
Quim. Nova
169
benzeno
tolueno
etilbenzeno
o-xileno
(m+p)-xileno
a1
Faixa Linear(ii)
-0,0076
0,0046
-0,0504
0,0322
-0,0686
0,0312
0,0442
0,0451
0,0488
0,0434
0,9998
0,9997
0,9992
0,9997
0,9992
0,6-92,8
0,6-92,8
0,6-92,8
0,6-92,8
1,3-184,8
95%
benzeno
tolueno
etilbenzeno
o-xileno
(m+p)-xileno(i)
(i)
2,8
3,5
5,8
3,8
12,0
LD (g/L)
99% 99,9%
3,8
4,7
7,9
5,1
16,3
5,1
6,2
10,2
6,7
21,6
95%
4,2
5,2
8,6
5,6
17,9
LQ (g/L)
99% 99,9%
4,7
5,8
9,7
6,2
20,0
5,4
6,6
11,0
7,1
22,8
170
Ribeiro et al.
Quim. Nova
Sensibilidade: LD e LQ
A aplicao de um mtodo analtico para anlises ambientais
Tabela 3. Preciso, exatido e robustez do mtodo
Nvel 1
Nvel 2
Nvel 3
Nvel 1
Nvel 2
Nvel 3
Cterica
(g/L)
Cpredita
(g/L)
24,7
24,7
24,7
23,6
22,8
23,3
23,2
1,7
48,4
45,7
45,8
46,6
3,3
72,3
72,0
75,1
73,1
2,3
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
48,3
48,3
48,3
71,4
71,4
71,4
Cterica
(g/L)
Cpredita
(g/L)
24,7
24,7
24,7
24,0
25,0
25,0
24,7
2,3
48,9
49,6
47,8
48,8
1,9
67,0
76,3
75,8
73,0
7,2
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
48,3
48,3
48,3
71,4
71,4
71,4
Benzeno
Exatido
Preciso
Robustez
(%)
Intermediria
-4,5
-7,7
-5,7
0,1
-5,5
-5,3
1,2
0,8
5,1
Nvel 2
Nvel 3
22,9
24,6
23,5
23,7
3,5
46,9
49,6
49,8
48,8
3,3
70,2
70,2
72,8
71,1
2,1
1
2
3
24,7
24,7
24,7
DPR
1
2
3
48,3
48,3
48,3
DPR
1
2
3
71,4
71,4
71,4
DPR
Etilbenzeno
Exatido
Preciso
Robustez
(%)
Intermediria
-2,8
1,2
1,2
1,2
2,6
-1,1
-6,2
6,8
6,1
Cterica
(g/L)
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
23,2
24,8
23,8
23,9
3,6
44,5
47,0
49,6
47,0
5,4
70,0
70,0
72,5
70,8
2,0
Cterica
(/L)
49,1
49,1
49,1
96,1
96,1
96,1
142,0
142,0
142,0
25,9
27,0
25,6
26,2
2,8
49,0
46,7
51,3
49,0
4,7
72,8
71,6
79,7
74,7
5,9
26,1
27,2
25,8
26,4
2,8
47,2
51,8
49,2
49,4
4,7
73,7
72,4
80,7
75,6
5,9
Cterica
(/L)
1
2
3
24,6
24,6
24,6
DPR
1
2
3
48,2
48,2
48,2
DPR
1
2
3
71,2
71,2
71,2
DPR
(m+p) - xileno
Cpredita
(g/L)
46,3
46,5
49,7
47,5
4,0
96,2
94,8
98,0
95,3
1,7
140,0
154,5
148,1
147,5
4,9
Tolueno
Cpredita Exatido
Preciso
Robustez
(g/L)
(%)
Intermediria
23,5
22,9
25,2
23,9
5,0
47,8
47,6
47,2
47,5
0,6
71,5
74,7
73,8
73,3
2,3
-4,9
-7,3
2,0
-1,1
-1,5
-2,4
0,1
4,6
3,3
23,3
24,9
24,4
24,2
3,4
46,1
48,7
50,3
48,4
4,4
71,5
71,9
74,3
72,6
2,1
23,1
24,7
24,2
24,0
3,4
48,4
50,1
51,0
49,8
2,6
71,2
71,6
74,0
72,3
2,1
o-xileno
Cpredita Exatido
Preciso
Robustez
(g/L)
(%)
Intermediria
22,8
23,2
24,3
23,4
3,3
46,0
46,5
47,3
46,6
1,4
72,9
75,9
71,7
73,5
2,9
-7,5
-5,8
-1,4
-4,6
-3,6
-1,9
2,3
6,5
0,6
23,8
25,3
24,9
24,7
3,2
47,2
47,1
51,3
48,5
4,9
70,3
71,0
74,3
71,9
3,0
23,7
25,2
24,8
24,6
3,2
46,9
51,0
51,5
49,5
4,5
70,0
70,7
74,0
71,6
3,0
Exatido
(%)
Preciso
Intermediria
Robustez
-5,7
-5,3
1,2
48,7
52,3
52,3
51,1
4,1
98,9
91,9
98,1
96,3
4,0
147,9
149,5
148,3
148,6
0,6
48,3
52,3
52,3
51,0
4,5
92,0
98,1
100,2
96,8
4,4
148,0
149,5
148,3
148,6
0,5
0,1
-1,4
2,0
-1,4
8,8
4,5
x = mdia dos valores de concentrao; DPR = desvio padro relativo dos valores de concentrao em %; a robustez foi avaliada pela
determinao de BTEX em amostras de solo.
171
AGRADECIMENTOS
Ao apoio financeiro do CTPETRO atravs da FINEP
(6400046000 REHISOL), Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientfico e Tecnolgico CNPQ (S. C. Morano e L. R. Silva) e
Coordenadoria de Aperfeioamento do Pessoal de Nvel Superior
CAPES (F. A. L. Ribeiro).
REFERNCIAS
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Material Suplementar
S2
Ribeiro et al.
Quim. Nova