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Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa

2010-2011

Biologia Celular

Baseado nas aulas tericas, na sebenta j existente (principalmente), no The Cell, Biologia
Celular e Molecular, Molecular Cell Biology

Pedro Jogo

2010-2011

FACULDADE DE FARMCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA

Aula 1
1) Fundamentos da Biologia Celular
a) Panormica Geral das clulas
i) Dos procariotas aos eucariotas
Primeira clula surge h 3,8 bilies de anos, aproximadamente 750 milhes de
anos aps a formao da Terra;
Surgiu RNA com capacidade de auto-replicao, evoluindo posteriormente as
relaes entre os aminocidos e o RNA, sendo o RNA substitudo pelo DNA;
Contudo, a primeira clula propriamente dita dever ter consistido em RNA
isolado do meio exterior por uma membrana fosfolpidica;
Existiram evolues e mudanas externas clula e levou formao dos
procariotas e, posteriormente, dos eucariotas;
Os eucariotas devero ter surgido por uma endossimbiose entre clulas e
bactrias. Factos que apoiam: mitocndrias e cloroplastos tm DNA prprio,
tm um tamanho semelhante a bactrias, apresentam diviso por
cissiparidade sintonizada com a replicao do DNA mittico
Caracterstica
Ncleo
Dimetro
Citosqueleto
Organelos citoplasmticos
N. de pares de bases do DNA
Cromossomas

Procariotas
Ausente
1 m
Ausente
Ausente
6
6
1 X 10 a 5 X 10
Molcula de DNA circular

Eucariotas
Presente
10 100 m
Presente
Presente
7
9
1.5 X 10 a 5 X 10
Mltiplas molculas de DNA lineares

As clulas procariotas tm uma organizao interna muito simples; (A) Micrografia electrnica de uma seco fina
de E. Coli; (B) Micrografia electrnica de uma clula do plasma, um glbulo branco que segrega anticorpos;

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ii) Noo de tamanho e superfcie em sistemas biolgicos

preciso achar a melhor relao superfcie volume de modo a, por um lado, no comprometer a sobrevivncia da
espcie, por outro, melhorar a competitividade entre outras espcies

iii) Compartimentao: os organitos

Estrutura das clulas animal e vegetal. Ambas esto rodeadas por uma membrana
plasmtica que contm um ncleo, um citosqueleto, e muitos organelos
citoplasmticos em comum. As clulas vegetais so rodeadas por uma parede celular e
contm cloroplastos e largos vacolos

iv) Sistema endomembranar


Compreende todas as membranas existentes na
clula, cuja distribuio ajuda a compartimentar o
citoplasma;
Este sistema inclui a membrana nuclear, a
membrana
citoplasmtica,
o
retculo
endoplasmtico, o complexo de Golgi, os lisossomas
e os vacolos;

Representao
do
retculo
endoplasmtico rugoso e liso

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b) Ferramentas da Biologia Celular


i) Microscopia fotnica
(1) Vulgar: a luz passa atravs da clula e a distino das diferentes
partes depende do contraste resultante da absoro dos
diferentes componentes da clula. Da corar as amostras.
(2) Confocal: a imagem obtida filtrada pois estamos a falar de um
tipo de microscopia de fluorescncia onde existe muita
sobreposio de cores. A imagem fica, assim, mais ntida ao
filtrar alguns raios.
(3) DIC (Differencial Interference Contrast): evidencia apenas o
contorno de grandes organelos como o ncleo ou os vacolos.
Tira partido dos ndices de refraco para formar a imagem.
(4) TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence): usado para
mostrar interaces entre simples molculas e a membrana
celular ou at mesmo para observar molculas. Tira partido do
ndice de refraco e do ngulo crtico da luz.
(5) FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy): consiste num feixe
laser que reflectido por um espelho dicrico na objectiva no
microscpio. O feixe vai variando a sua intensidade e quando as
partculas existentes florescem, essa radiao atravessa o

(6)

(7)

(8)

(9)

espelho dicrico chegando ao detector. Pode ser feita uma


anlise fluorescncia vs tempo de rastreamento.
LSM (Laser Scanning Microscopy): permite obter imagens de
determinadas profundidades, ou seja, s fatias, com a ajuda
de um laser que posteriormente focado. A imagem, ao ser
reflectida, conduzida a um detector que gera um sinal
elctrico que permite a reconstruo da imagem.
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer): podem-se
obter imagens de localizao de protenas com uma resoluo
espacial alm dos limites do microscpio convencional.
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching): tcnica
ptica capaz de quantificar a difuso lateral de uma fatia de
molculas marcadas fluorescentemente ou para examinar
clulas isoladas.
FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy): tcnica de
imagiologia para produzir uma imagem baseada nas diferenas

de decaimento na fluorescncia.
(10)PFM (Photonic Force Microscope):a luz dispersa e aquela que
alterada pela amostra so recebidas por uma lente e projectada
num QPD (Quadrant Photo-Diode. A interferncia entre a lente e o QPD emite
sinais que permitem localizar tridimensionalmente os vrios locais de
refraco da amostra e reconstruir a imagem a trs dimenses.

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ii) Microscopia electrnica (resoluo cem vezes melhor que a fotnica)


(1) TEM (Transmission Electron Microscopy): um feixe de electres
transmitido por uma amostra ultrafina. A interaco dos
electres com a amostra ampliada e focada num dispositivo
de imagem.
(2) SEM (Scanning Electron Microscope): consegue-se obter uma
imagem em trs dimenses, graas interpretao feita de
acordo com a energia dos electres.
(3) cryoEM (Cryo-Electron Microscopy): permite, atravs de
microscopia electrnica, ver as amostras sem qualquer tipo de
fixao, mas sim a temperaturas baixas, sendo para isso
preservadas em azoto lquido. Permite tambm observar o
interior da clula pois a criopreservao gera o afastamento da
membrana celular.
iii) Fraccionamento subcelular: atravs da centrifugao diferenciada
obtm-se sedimentos de vrias partes da clula. O objectivo
isolar organelos de clulas eucariotas.
iv) Cultura de clulas: fibroblastos e HeLa (tipo de clulas de uma linha
imortal) so clulas muito utilizadas em culturas celulares.
v) Viroses: muito utilizadas para colocar pedaos de DNA ou RNA em
clulas que se esto a estudar.
vi) Microinjeco: processo mecnico no qual uma agulha de 0.5 a 5
micrmetros de dimetro penetra na membrana celular ou
envelope celular.
vii) Engenharia gentica: utilizada de modo a possibilitar a expresso de
um gene num ser vivo para aumentar a sua utilidade.

c) Clulas como modelos experimentais


i) E. coli e outras bactrias: utilizadas para o estudo de muitos
aspectos fundamentais da bioqumica e da biologia molecular. So
teis pois o seu crescimento pode ser controlado mediante
determinadas condies laboratoriais e devido ao seu rpido
crescimento.
ii) Leveduras: utilizadas para o estudo de aspectos fundamentais da
biologia das clulas eucariticas. O seu crescimento rpido e o
facto de serem eucariticas permite aproximar concluses tiradas
das leveduras a outras clulas eucariticas.
iii) Dictyostelium discoideum: um eucariota primitivo que durante o
seu ciclo de vida para de uma coleco de amibas unicelulares para
um conjunto multicelular e, posteriormente, para um corpo
frutificante. So utilizadas devido ao seu curto ciclo de vida.
iv) Caerhabditis elegans: um nematide (verme) que devido sua
simplicidade e fcil reproduo em laboratrio se tornou til
para estudar processos relativos multicelularidade.
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v) Drosophila melanogaster: mais conhecida por mosca-da-fruta,


tem elevada importncia em laboratrio pois so utilizadas para
experincias de engenharia gentica. A facilidade de manter em
laboratrio e o curto ciclo de vida so factores favorveis sua
utilizao.
vi) Arabidopsis thaliana: uma planta utilizada para o estudo do
desenvolvimento das plantas devido facilidade com que se
reproduz em laboratrio e sua pequena complexidade.
vii) Vertebrados: apesar da dificuldade em estud-los,
principalmente devido sua complexidade, interessa estud-los
pois esto mais perto (em termos de complexidade) do
organismo humano e um interessa intrnseco
compreendermos o nosso organismo.
viii) Xenopus laevis: uma r cujos ovos so anormalmente
grandes (cerca de 1 mm cada) e, por isso, todas as fases de
desenvolvimento ocorrem no exterior da me, podendo ser
acompanhadas. Alm disso, consegue-se obter um elevado
nmero de ovos facilmente. Este possibilita a execuo de
estudos a nvel dos mecanismos moleculares de controlo do
desenvolvimento, da diferenciao e da diviso de clulas
de embries.
ix) Zebrafish: um peixe que facilmente se mantm em
laboratrio e que facilmente se reproduz. O embrio
desenvolve-se fora da me e transparente, podendo ser
observado. Promete ser a ponte entre os invertebrados
simples e os humanos.
x) Medakafish: um peixe que tem um curto perodo de
gestao e so muito proliferativos em termos
reprodutivos. Facilmente se fazem medakafish transgnicos,
da a sua utilizao.
xi) Ovos de galinha: o desenvolvimento embrionrio da galinha
e do homem tm muitas semelhanas e pelo facto do
desenvolvimento do embrio da galinha se dar
externamente me, possvel estud-lo e tirar concluses
aplicveis ao homem.
xii) Ratos transgnicos: a ttulo de exemplo, num ser em que
tenha sido perdida uma parte do corpo (ex: orelha),
possvel recolher os genes que codificam essa parte e
introduzi-los num rato. Esse rato ir produzir um rgo em
muito semelhante ao do ser original

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Aula 2
2) Membranas biolgicas
a) Introduo
Uma clula viva e o seu mecanismo de auto-replicao esto delimitados pela
membrana celular uma fina camada de lpidos que no pode ser vista
directamente ao microscpio ptico. Todas as clulas do planeta usam a
membrana para separar e proteger os seus constituintes qumicos do ambiente
exterior. Sem membranas no existiram clulas e, com consequncia, no existiria
vida. Assim, de considerar que a primeira clula surgir simultaneamente com a
capacidade de separar uma srie de compostos qumicos do meio que o rodeia.
A membrana celular tem uma
forma simples: a sua estrutura
baseada numa dupla camada de
lpidos com cerca de 5 nm de
espessura. As suas propriedades
que so curiosas: serve de (e
principalmente)
barreira
(prevenindo o contedo de
escapar e misturando o meio
circulante) mas tambm (de
modo a permitir a sobrevivncia
e crescimento da clula) permite
a troca de nutrientes e produtos de excreo entre o meio intracelular e o meio
extracelular. Para permitir isto, a membrana perfurada por canais e bombas
altamente selectivos que permitem a entrada de certas substncias enquanto
outras saem. Alm disto, existem molculas proteicas que actuam como sensores,
permitindo dar resposta a alteraes do meio envolvente. Tambm as
propriedades mecnicas da membranas so de destacar: quando a clula cresce
ou altera a forma, tambm a membrana o faz (aumentando a rea por adio de
nova membrana sem perder a sua continuidade). Se a membrana for perfurada,
ela no rompe como um balo ou permanece dividida: ela veda rapidamente a
perfurao.
A bactria mais simples tem apenas uma nica
membrana (membrana plasmtica) enquanto as
clulas eucariticas incluem uma profuso de
membranas que delimitam os compartimentos
intracelulares. Estes
compartimentos so
construdos pelo mesmo princpio da membrana
plasmtica, servindo tambm de barreiras
selectivas. Estas membranas mantm as
diferentes caractersticas relativamente
composio e funo dos vrios organelos. Estas
membranas internas no servem apenas de barreiras mas tambm tm diferenas
subtis entre elas, especialmente a nvel das protenas constituintes de cada uma.
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b) Breve histria dos estudos da estrutura da membrana plasmtica


Anos 20
E. Gorter e F. Grendel descobriram que os lpidos, nas membranas biolgicas, se
organizam em bicamada. Verificaram tambm que a quantidade de lpidos da
membrana plasmtica igual ao dobro das dimenses superficiais da mesma (no
caso da experincia, de glbulos vermelhos)
Anos 40
H. Davson e J. F. Danielli reforam a interpretao de Gorter e Grendel mas
adicionando uma camada de protenas de ambos os lados da membrana
Anos 60
Por difraco de raios X e por microscopia electrnica de transmisso concluiu-se
que na membrana os lpidos mais abundantes so os fosfolpidos, seguidos pelo
colesterol e pelos glicolpidos
1972
Nicolson e Singer postulam o modelo do mosaico fluido, em que um mosaico de
molculas proteicas est colocado numa camada fluida de lpidos
c) Estrutura
A organizao estrutural das membranas biolgicas comum
na maior parte das clulas:
Bicamada lipdica: de natureza antiptica (impermevel
gua e a molculas solveis em meios aquosos) com
protenas associadas
Protenas: estruturas termodinamicamente estveis, cuja
manuteno no requer a hidrlise de ATP. So responsveis por muitas funes
especializadas e podem atravessar inteiramente a espessura da bicamada ou
podem estar associadas apenas a um dos seus folhetos
d) Constituio
i) Lpidos
Os lpidos constituem cerca de 50% da massa de maior parte das
membranas biolgicas.
Membranas plasmticas: 50% lpidos, 50% protenas
Membranas mitocondriais: 25% lpidos, 75% protenas
reflecte a abundncia de complexos proteicos envolvidos no
transporte de electres e fosforilao oxidativa
(1) Fosfolpidos (mais abundantes)
Estas molculas combinam duas propriedades importantes: cabea hidrofilca
(grupo fosfato) e duas caudas hidrofbicas (cido gordo).
Uma propriedade importante dos fosfolpidos da bicamada lipdica o seu
comportamento como fluido bidimensional que permite a
livre rotao e o movimento lateral (difuso lateral). Tambm
pode ocorrer (raramente) o movimento de flip-flop em que
dois fosfolpidos de folhetos diferentes trocam de posio.
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Observao: Em solues aquosas, os fosfolpidos


formam espontaneamente bicamadas. A isto est
associada a formao de lipossomas (que tm uma
verdadeira bicamada) e no de micelas (que no
tm uma verdadeira bicamada).
(a) Glicerofosfolpidos
(i) Fosfatidilcolina no apresenta carga a pH fisiolgico
(ii) Fosfatidiletanolamina no apresenta carga a pH fisiolgico
(iii) Fosfatidilinositol menor quantidade, apresenta carga negativa,
importante nos rafts
(iv) Fosfatidilserina apresenta carga negativa

(b) Esfingomielina no apresenta carga a pH fisiolgico

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(2) Colesterol (segundo mais abundante)
Inserem-se na bicamada com o seu grupo hidroxilo
polar perto da cabea hidrofbica dos fosfolpidos
Aumenta a rigidez da membrana atravs da interaco
dos anis de hidrocarbonados do colesterol com as
regies das cadeias de cidos gordos dos fosfolpidos
adjacentes
Assume importncia nos rafts
rigidez permeabilidade tolerncia a baixas temperaturas
Nota: as membranas procariticas no tm colesterol
(3) Glicolpidos
Os glicolpidos apenas se encontram no folheto
exoplasmtico da membrana celular das clulas
eucariticas.
No tm capacidade de fazer movimento flip-flop
Podem actuar como receptores especficos de
molculas presentes fora da clula ou terem efeito
protector
Podem ligar-se a componentes de natureza
intercelular
Os principais so: glicose, galactose, manose,
fucose, N-acetil-glucosamina, cido slico
Assumem importncia nos rafts
Rafts: agregados de esfingolpidos (esfingomielina e glicolpidos) e colesterol que
se move lateralmente na membrana, formando domnios; no tm funes no
processo de movimentao das clulas e so importantes na sinalizao celular

1.Non-raft membrane; 2.Lipid raft; 3.Lipid raft associated transmembrane


protein; 4.Non-raft membrane protein; 5.Glycosylation modifications (on
glycoproteins and glycolipids); 6.GPI-anchored protein; 7.Cholesterol; 8.Glycolipid

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ii) Protenas
Constituem 25% a 75% da massa de vrias membranas de uma clula
Desempenham numerosas funes como a formao de canais de passagem,
transporte activo de ies e pequenas molculas, expresso de receptores
envolvidos na actividade celular ou em fenmenos de endocitose, a
ancoragem da membrana a elementos do citosqueleto, etc.
Possuem movimento de rotao e difuso lateral mas no de flip-flop
(1) Integrais
(a) Transmembranares: grande dificuldade de separao
(b) Ligadas a lpidos: ligao covalente mais forte
(2) Perifricas
(a) Ligadas a protenas
o Ligao no covalente, logo, muito fraca
o Separam-se por mtodos simples
o A camada lpidica, embora removidas protenas, mantm-se intacta

e) Funes das protenas


Podem desempenhar diversas funes nomeadamente de transportadores,
receptores, enzimas, ligao ao citosqueleto, interaco celular, etc.

f)

Propriedades da bicamada
i) Fluidez
Corresponde ao movimento lateral a que os fosfolpidos e protenas esto sujeitos
ao longo do plano de cada um dos dois folhetos da bicamada.
O arranjo geomtrico das extremidades hidrofbica dos fosfolpidos condiciona o
seu movimento de lateralidade no plano das membranas, bem como a sua fluidez,
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alterando tambm a temperatura a que preciso descer para induzir a transio
de fase lquida para fase cristalina da membrana.
Os fosfolpidos saturados apresentam uma difuso lateral mais rpida na
membrana e atingem uma transio de fase a temperaturas menos baixas que os
fosfolpidos insaturados
Composio em lpidos
esfingolpidos + colesterol + glicerofosfolpidos fluidez
Estrutura das caudas dos fosfolpidos
grau de insaturao + comprimento fluidez
Temperatura
temperatura consistncia fluida

ii) Assimetria
Deve-se diferena de composio molecular entre as duas camadas da
membrana, pois os fosfolpidos e as protenas no se encontram distribudos de
forma equivalente nos dois folhetos da membrana, estando os glicolpidos
presentes apenas no folheto exoplasmtico da bicamada fosfolipdica.

Constituintes predominantes
Face exoplasmtica
Face protoplasmtica
Esfingomielina
Fosfatidilserina
Fosfatidilcolina
Fosfatidilinotisol
Glicolipidos
Fosfatidiletanolamina
Nota: o colesterol apresenta-se em propores idnticas em ambas as faces
iii) Impermeabilidade
A bicamada fosfolipidica tem uma permeabilidade selectiva

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g) Tcnica de criofractura
A criofractura d-se pelo congelamento rpido de uma clula ou tecido que ser
fracturado de seguida
A fractura tende a ocorrer nas regies com ligaes mais fracas: interaces
hidrofbicas
Rompe-se a bicamada em duas monocamada: P e E
Faz-se um molde das regies fracturadas com metal pesado (ex: platina) e destrise o material biolgico
Os moldes so examidados ao microscpio electrnico e mostram salincias
correspondendestes s protenas transmembranares, comprovando a sua
existncia
A maioria das protenas fica na face P

Protenas integrais:
o Atravessam o plano hidrofbico da membrana e so observadas nas
faces de fractura
o Segmentos membranares das protenas integrais organizam-se,
habitualmente, em hlices do tipo (ou cadeias polipptidicas que se
curvam sobre si prprias formando um poro -barril)
o Contm segmentos hidrofbicos na sua molcula e porinas (protenas
que formam canais na membrana externa de algumas bactrias)
o So de purificao mais difcil que as protenas perifricas.
o O seu isolamento requer uma ruptura da bicamada fosfolpidica
o Tratando com detergente Ligam-se s regies hidrofbicas destas
protenas Separando as extremidades no polares Forma micelas
Protenas perifricas:
o No atravessam o plano hidrofbico da membrana e so observadas
nas superfcies de membranas intactas
o A sua purificao mais fcil: basta preparar solues de salinidade
elevada, no sendo, portanto, requerida disrupo prvia da bicamada
fosfolpidica
o Temos as glicoprotenas e as protenas ligadas a lpidos (GPI) tm um
comportamento semelhante s protenas integrais.
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h) Movimento das protenas


i) Mosaico fludo
Denominao utilizada para fazer referncia
ao conceito actual de estrutura dinmica das
membranas
biolgicas,
onde
estas
apresentam na sua estrutura protenas
inseridas na bicamada lpidica. O movimento
por difuso lateral das protenas e dos lpidos
d um suporte para este modelo. Foi
apresentado por Singer e Nicolson em 1972.
Modos de comprovar o modelo:
Fuso

Marcao fluorescente com anticorpos especficos para o


reconhecimento de protenas membranares humanas e de rato
o Fuso de clulas humanas e de rato num meio de cultura que permita
a formao de clulas hbridas humano-rato
o Imediatamente aps, ocupam locais diferentes e separados na
membrana
o Algum tempo depois, estavam misturadas, mostrando o livre
movimento das protenas na membrana plasmtica
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

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Marcar todos os lpidos com fluorescncia, queimar (bleach) uma


rea e verificar que algum tempo depois j estavam misturados

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ii) Domnios
As clulas tm modos particulares de confinar a protenas da membrana
plasmtica a uma localizao especfica, criando regies especializadas a que se
chamam domnios membranares, podendo existir na superfcie da clula ou na
superfcie de organelos
(1) Clulas epiteliais

O domnio apical e o domnio basolateral tm funo e composio


diferentes.
(2) Rafts
Tal como j mencionado, raft um agregado de esfingolpidos (esfingomielina
e glicolpidos) e colesterol que se move lateralmente na membrana, formando
domnios; no tm funes no processo de movimentao das clulas e so
importantes na sinalizao celular

Os rafts apresentam composio e funo diferentes de outras partes da


membrana logo, so considerados domnios
O principal composto que difere dos rafts para a restante membrana o
colesterol
iii) Funes
Devido existncia de vrios domnios, a membrana apresenta vrias funes:
Isolamento
Reaces enzimticas
Compartimentao intracelular
Ancoragem para o citosqueletp
Transporte
Reconhecimento celular
Receptores para sinalizao celular
Motilidade

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Aula 3

Transporte

3) Transporte atravs de membranas celulares


a) Introduo
A nossa unidade bsica da vida, a clula, precisa de produzir energia de modo a dar
procedimento s vrias actividades metablicas que mantm a nossa homeostasia.
Para tal imperativo que, por um lado, seja transportada matria-prima para o
interior de modo a produzir a energia (cuja molcula base para ns o ATP) e, por
outro, sejam transportados para o exterior produtos de excreo de modo a manter a
homeostasia da prpria clula.
De modo a compreender o funcionamento da prpria clula, devemos estudar o modo
como se d o transporte das matrias-primas e dos produtos de excreo.
Os vrios tipos de transporte aparecem resumidos no seguinte esquema:

Passivo
A favor do gradiente

Difuso Simples
Molculas pequenas e sem
carga

"carrier proteins"
Molculas grandes e polares,
ies

Difuso facilitada
Canais inicos
Molculas grandes e polares,
ies
Bombas inicas
Activo
Contra gradiente
Simporte e antiporte

Nota: os transportes atravs da membrana permitem a existncia de gradientes de


carga e gradientes de concentrao

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A permeabilidade selectiva das biomembranas para pequenas molculas permite


que a clula mantenha a sua composio interna:
o Apenas pequenas molculas sem carga atravessam a bicamada
fosfolpidica (molculas apolares, por exemplo O2 e CO2)
o Pequenas molculas apolares no carregadas, por exemplo H2O

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O transporte das molculas pequenas e sem carga feito por difuso simples (T.P)
o As molculas de maiores dimenses, polares e no carregadas (por
exemplo, a glicose), no podem passar. O mesmo acontece com os ies
(difuso facilitada de menor eficcia)
Apesar dos ies e a maior parte de molculas polares no conseguem atravessar a
biomembrana por difuso, o facto que vrias molculas como a glicose
aparecem dentro da clula. Ou seja, atravessaram a membrana. Este transporte
ocorre por aco de protenas transmembranares especficas, que funcionam
como transportadoras. Tais protenas transportadoras determinam a
permeabilidade selectiva da biomembrana e possuem um papel muito importante
no funcionamento da membrana.
Existem vrias regies de cruzamento na membrana que formam uma passagem
atravs da bicamada lipdica permitindo que as molculas polares ou carregadas
atravessem a membrana atravs de um poro proteico sem interagir com as
cadeias hidrofbicas dos cidos gordos dos fosfolpidos da membrana.
Essas protenas transportadoras podem ser de dois tipos que mais frente sero
abordadas: as protenas de canal (channel proteins) e as carrier proteins.

b) Transporte passivo

i)

No ocorre consumo de energia


A favor do gradiente, ou seja, do mais concentrado para o menos concentrado (se
as clulas forem neutras)
Difuso simples
Atravessam a membrana (dissolvem-se e difundem-se directamente, sem
protenas transportadoras
No tem especificidade

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ii) Difuso facilitada


(1) Carrier proteins protenas transportadoras
Ligam-se selectivamente a pequenas molculas especficas (por exemplo,
a glicose) e transportam-nas
Funcionam como enzimas para facilitar a passagem de molculas
especficas atravs das membranas
Ao ligarem-se sofrem mudanas conformativas que abrem os canais
atravs dos quais a molcula pode passar a ser libertada para o outro lado

(2) Channel proteins canais inicos


Permitem a passagem de vrios ies inorgnicos atravs das membranas
Permitem um transporte rpido e altamente selectivo

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Quando abertos, formam pequenos poros atravs dos quais ies do


tamanho e carga apropriados podem passar por difuso simples
Podem ser selectivamente abertos ou fechados em resposta a sinais
extracelulares
Os motivos de fecho so os da imagem acima: voltagem (diferenas de
potencial), ligao de um ligante ou por stress

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iii) Selectividades dos canais de Na+ e K+


Os canais de Na+ so cerca de dez vezes mais permeveis ao Na+ do que ao K+
Explicao: o canal de Na+ ser estreito o suficiente para dificultar a passagem
de K+ mas no de Na+

Os canais de K+ so cerca de mil vezes mais permeveis ao K+ do que ao Na+


Explicao: apesar de ter poros apertados, era de esperar que, pelo menos, o
io de Na+ passasse pelo canal. Contudo, este canal possui um filtro selectivo
com grupos carbonilo (C=O). Isto faz com que quando um io de K+ entra no
filtro selectivo o grupo carbonilo interaja com o K+ hidratado, desidrate-o e
permita a entrada do io K+ desidratado atravs do poro. Em contraste, o io
Na+ mantm-se ligado gua, sendo demasiado grande para passar o poro.

iv) Tcnica patch-clamp


Esta tcnica permite o estudo dos canais inicos
Recorre-se a uma micropipeta com um dimetro aproximado a 1 m para
isolar uma pequena parte da membrana, permitindo a passagem de ies
atravs de um nico canal que est a ser analisado, aumentando a preciso
dos estudos actividade dos canais inicos

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c) Gradientes inicos e potenciais de membrana

O fluxo de ies atravs da membrana faz-se de acordo com o gradiente


electroqumico:
o Concentrao
o Potencial
A equao de Nernst d-nos quantitativamente a relao entre a concentrao de
ies e o potencial da membrana
Potencial de equilbrio:
V potencial de equao (V); R Constante de gases; T- Temperatura
absoluta; F Constante de Faraday; Co concentrao dos ies no exterior;
Ci concentrao dos ies no interior

Nas clulas em repouso h um potencial de membrana


Todas as clulas, incluindo nervos e msculos, contm bombas de ies que usam
energia proveniente da hidrlise do ATP para o transporte activo de ies atravs
da membrana plasmtica
O transporte de ies resulta no estabelecimento de um gradiente elctrico atravs
da membrana (normalmente 60 mV)

d) Canais inicos: clulas nervosas


A conduo do impulso nervoso um dos casos em que o transporte de ies
atravs da membrana (neste caso do axnio) bem patente

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Segue-se uma descrio da transmisso do impulso nervoso ilustrado no grfico


acima

Os potenciais de aco so geralmente mediados por canais de Na+ activados por


voltagem

e) Clulas nervosas e musculares

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Quando fechado, o poro do canal est bloqueado por cadeias hidrofbicas do


aminocido num local chamado gate
Quando a acetilcolina se liga, induz uma alterao conformacional de tal modo
que as cadeias hidrofbicas saem do gate, podendo haver passagem de ies
carregados.
O canal continua impermevel a ies com carga negativa porque tem um
revestimento com ies negativos

Transporte activo
Move solutos contra os seus gradientes
electroqumicos: necessita de energia
O transporte activo depende da energia do ATP
(Adenosina Tri-Fosfato), que ocorre em bombas
inicas, ou da energia que resulta do fluxo
electroqumico de ies que passam a favor do
gradiente, que ocorre por simporte e antiporte

Transporte activo

O receptor acetilcolina

22

A despolarizao de regies adjacentes da membrana plasmtica permite a


propagao de sinais elctricos pelos axnios, resultando numa rpida transmisso
A chegada de potenciais de aco ao terminal de muitos neurnios desencadeia a
libertao de emissores (por exemplo, a acetilcolina faz passagem de um sinal
entre clulas em sinapse)
Os neurotransmissores so libertados pelas clulas pr-sinpticas e ligam-se aos
receptores das membranas ps-sinapticas, provocando a abertura dos poros dos
canais inicos (por exemplo, o receptor de acetilcolina de uma clula muscular)
A ligao da acetilcolina abre o canal inico que permevel tanto para ies Na+
como para K+ e permite um rpido fluxo de Na+ que despolariza a membrana da
clula muscular e activa o potencial de aco
Esta alterao leva activao do canal de Ca2+ por voltagem, levando a um
aumento da concentrao de Ca2+ num meio intracelular que sinaliza uma
contraco

i)

f)

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Hidrlie de ATP
Ex: Bombas inicas
Gradientes inicos
Ex: Simporte e antiporte

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i)

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Bombas inicas
Muitas vezes, a clula tem de transportar molculas contra o seu gradiente de
concentrao
De modo a contrariar a direco energeticamente favorvel, temos de usar
energia proveniente do ATP para contrariar o gradiente.
Um bom exemplo de uma bomba inica a de Na+/K+
(1) Bomba inica de Na+/K+

A concentrao de Na+ aproximadamente dez vezes superior no interior


da clula, sendo a de K+ superior no interior.
Estes gradientes so mantidos pelas bombas de Na+/K+ contra o gradiente
Os ies se sdio ligam-se zona de afinidade no interior da clula
Ocorre a hidrlise do ATP e a fosforilao da bomba, havendo uma
alterao conformacional e ficando o io de sdio para o exterior,
diminuindo a sua afinidade
Os ies de sdio vo para o meio extracelular e os ies de potssio ligamse bomba
Esta ligao leva a uma alterao conformacional, colocando o io potssio
no interior da clula e diminuindo a sua afinidade com a bomba
A bomba tem trs locais de ligao para o io Na+ e dois para o io K+. Ou
seja, saem 3 ies de sdio e entram 2 de potssio por 1 molcula de ATP
Estima-se que o consumo de 25% do ATP das clulas animais se deva a
esta bomba
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(2) Equilbrio osmtico

Em muitos animais, a bomba de Na+/K+ mantm o equilbrio osmtico e o


volume da clula
Devido s diferenas de presso osmtica originada por outros compostos
(molculas orgnicas, etc.), necessrio encontrar um equilbrio, caso
contrrio a clula romperia
Assim, a bomba de Na+/K+ muitas das vezes a responsvel por manter o
equilbrio osmtico

ii) Simporte e antiporte

(1) Simporte
Diferentes molculas so transportadas na mesma direco (por exemplo,
a glicose e o io sdio na membrana aplical do intestino)
As clulas epiteliais do domnio apical usam o transporte activo para
passagem de aucares dietticos e aminocidos
No caso da glucose, ocorre um transporte que coordena o transporte de
dois ies Na+ e uma molcula de glucose para o interior da clula
No h consumo de energia uma vez que a energia proveniente do
gradiente electroqumico do io Na+ a suficiente para mediar este
transporte
Posteriormente, a glucose libertada para baixo do tecido conjuntivo que,
por conter capilares sanguneos na superfcie basolateral do epitlio
intestinal, transportado por difuso facilitada, diminuindo o gradiente de
concentrao

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(2) Antiporte
H transio de duas substncias diferentes em direces opostas
Um exemplo disto o transporte de ies Ca2+ e Na+ nas clulas cardacas
O Ca2+ exportado das clulas no s pelas suas bombas inicas mas
tambm por Na+/Ca2+ antiporte, que transporta Na+ para o interior da
clula e Ca2+ para o exterior
iii) Transporte atravs dos epitlios
No epitlio intestinal e no epitlio estomacal ocorrem vrios tipos de
transporte, salientamos estes dois pois so aqueles que nos permitem a
obteno dos nutrientes para manter a homeostasia

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Aula 4
4) Citosqueleto microtbulos e filamentos intermdios
a) Introduo
Como j dito, os organelos das clulas eucariticas conferem-lhe um elevado nvel de
organizao. Mesmo assim, um nvel de organizao superior atingido graas ao
citosqueleto, que consiste numa rede de filamentos proteicos que se estendem pelo
citoplasma de todas as clulas eucariticas. Estes servem de mecanismo estrutural
para a clula, sendo um factor determinante no tamanho das clulas, na posio dos
organelos e da organizao do citoplasma em geral. Para alm disto, o citosqueleto
responsvel pelo movimento da clula (no s da clula em si mas tambm todo o
transporte interno de organelos e outras estruturas pelo citoplasma).
O citosqueleto composto por trs tipos de filamentos proteicos: filamentos de actina
(microfilamentos), filamentos intermdios e microtbulos, estando eles ligados aos
organelos e membrana plasmtica por uma variedade de protenas acessrias.

b) Microtbulos (terceiro componente principal)


Estruturas cilndricas rgidas de centro oco com
aproximadamente 25 nm, sendo observados na clula
sob a forma de feixes paralelos
Constitudos por uma nica protena globular (tubulina)
de -tubulina e -tubulina
Os dmeros de -tubulina e -tubulina formam uma
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parede constituda por 13 protofilamentos alinhados longitudalmente


So estruturas polarizadas com duas extremidades distintas: a positiva (onde se d
o crescimento e uma associao de dmero) e a negativa (onde se d o
encurtamento e uma dissociao de dmeros)
A polimerizao ou despolimerizao (extremidade positiva e negativa,
respectivamente) depende da concentrao dos dmeros de tubulina e da ligao
do dmero ao GTP (Guanosine triphosphate)
O GTP liga-se -tubulina favorecendo a polimerizao. Contudo, se o GTP for
hidrolisado para GDP verifica-se o enfraquecimento da afinidade da ligao da
tubulina com as protenas adjacentes, levando despolimerizao

Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1203.html

A polimerizao dos microtbulos desempenha um papel fundamental na


determinao do movimento ao longo dos microtbulos, podendo dizer-se que
apresentam uma instabilidade dinmica devido forma imprevisvel como tendem
a polimerizar e despolimerizar

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Devido instabilidade dinmica j abordada, a maioria dos microtbulos estaria


frequentemente desagregados. Contudo, este comportamento consegue ser
controlado por interaces dos microtbulos com MAPs (Microtubule Associated
Proteins).
Tm a funo de estabilizar os microtbulos, diminuindo a concentrao crtica
necessria formao dos microtbulos e favorecendo a taxa de adio de
tubulina em relao sua taxa de dissociao
Verificou-se a existncia de quatro tipos de protenas MAP
o Presentes nos neurnios
MAP-1
MAP-2
Tau
o Presentes em todas as clulas no-neuronais dos vertebrados
MAP-4
Na maioria das clulas os microtbulos estendem-se a partir do centro organizar
de microtbulos (MTOC Microtubule Organization Centre)
Nas clulas animais propagam-se atravs do centrossomo
O centrossomo tem um papel determinante e essencial na organizao intracelular
dos microtbulos - o centro de iniciao da formao dos microtbulos,
localizando-se nele as extremidades negativas dos microtbulos

28

A importncia do centrossoma deve-se a um polipptdo chamado -tubulina


O centrossoma, para alm da -tubulina, tambm constitudo por um par de
centrolos orientados perpendicularmente a circundados pelo material
pericentriolar

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Os microtbulos so responsveis por uma grande variedade de movimentos na


clula: transporte intracelular, posicionamento de vesculas da membrana e de
organelos, separao dos cromossomas durante a mitose e movimento dos clios e
dos flagelos
O movimento ao longo dos microtbulos est dependente de duas grandes
famlias de protenas motoras: as cinesinas e as dineinas, deslocando-se ao longo
dos microtbulos em sentidos diferentes
As cinesinas deslocam-se no sentido da extremidade positiva (do centrossomo
para a periferia)
As dinenas deslocam-se no sentido da extremidade negativa (da periferia para o
centrossoma)

Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1204.html

Os clios e os flagelos so projeces da membrana plasmtica constitudas por


microtbulos, sendo responsveis pelo movimento de vrias clulas eucariticas
Os clios e os flagelos so semelhantes a nvel do dimetro (aproximadamente 0.25
m) mas diferem a nvel do comprimento: os clios com cerca de 10 m e os
flagelos podem atingir os 200 m
A estrutura principal de ambos designa-se axonema, sendo constitudo
microtbulos e dinenas

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O seu arranjo baseia-se num par central de microtbulos rodeado por nove
dmeros de microtbulos, estando os pares de microtbulos exteriores associados
entre si e ligados radialmente ao par central por uma protena chamada nexina
A extremidade negativa dos microtbulos que formam os clios e os flagelos
aderem clula atravs do corpo basal, cuja estrutura semelhante do centrolo

O movimento dos clios e dos flagelos resulta do deslizamento entre os dmeros de


microtbulos do axonema promovido pelas dinenas do axonema

Os clios oscilam num movimento de trs para a frente (responsveis pelo


transporte de fldos e mucos ao longo da superfcie de tecidos epiteliais dos
animais) e os flagelos possuem movimento ondulatrio (deslocamento de vrios
protozorios e tambm dos espermatozides)

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A capacidade dinmica dos microtbulos verifica-se tambm ao nvel da mitose: o


arranjo de microtbulos desfaz-se e a tubulina reorganizada segundo um novo
padro (o fuso mittico).
De modo a ocorrer esta reestruturao, ocorre a duplicao do centrossomo,
existindo dois centros organizadores distintos em plos opostos da clula

Em interfase, d-se a duplicao do centrossomo. Em prfase, a ascenso polar


dos diferentes centrossomos, gerando dois plos do fuso mittico
O fuso mittico formado por trs tipos de microtbulos
o Cinetocoros: aderem aos cromossomas condensados ao nvel do
centrmero, desempenhando um papel fundamental na separao dos
cromossomas
o Polares: no aderem aos cromossomas mas partem dos dois centrossomas
e sobrepem-se no centro da clula
o Astrais: partem do centrossomo em direco periferia da clula, junto
membrana celular
Os cromossomas alinham-se na placa equatorial e separam-se devido ascenso
polar, feita pelas protenas motoras associadas aos microtbulos
Devido ao papel que os microtbulos tm, substncias que afectam a juno dos
microtbulos so teis no s como ferramenta experimental mas tambm no
tratamento do cancro
o Colchicina e colcemida: ligam-se tubulina e inibem a polimerizao dos
microtbulos, podendo bloquear a mitose
o Vineristina e vimblastia: usadas na quimioterapia do cancro, inibem de um
modo selectivo a diviso de clulas
o Taxol: estabiliza os microtbulos em vez de inibir a sua formao,
bloqueando a diviso celular. utilizado como agente anticancergeno e
como ferramenta em experincias
o Nocodazol: inibe a polimerizao dos microtbulos

c) Filamentos intermdios
Constituintes do citosqueleto com dimetro entre os microtbulos e os
microfilamentos: entre os 8 e os 11nm
Esto presentes na maioria das clulas eucariticas, sendo os elementos mais
estveis do citosqueleto e os menos solveis de toda a clula
Formam uma rede perinuclear que se estende desde o ncleo at membrana
plasmtica e podem ocorrer em pequenos feixes ou aglomerados de feixes
compactos (por exemplo, nas clulas epiteliais)
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As protenas que os constituem so fibrosas, possuindo um domnio central em
hlice e as suas extremidades apresentam duas pores globulares cujas
dimenses e sequncias so variveis, conferindo s diferentes estruturas
caractersticas especficas, originando diferentes tipos de filamentos intermdios
O domnio central comummente composto por cerca de 310 a 350 aminocidos,
sendo o responsvel pela manuteno de uma estrutura idntica entre os
diferentes tipos de filamentos

Os diferentes tipos de filamentos intermdios resultam de diferentes protenas


que os constituem
o Tipo I:essencialmente constitudo por citoqueratinas cidas, presentes nas
clulas epiteliais
o Tipo II: essencialmente constitudo por citoqueratinas bsicas ou neutras,
presentes nas clulas epiteliais
o Tipo III: constitudo por vimentina (clulas do mesnquima), desmina
(clulas musculares), protena cida fibrilar glial (clulas gliais e astrcitos)
e periferina (neurnios do sistema nervoso perifrico)
o Tipo IV: constitudo por protenas dos neurofilamentos (NF-L, NF-M, NF-H)
presentes no tecido nervoso perifrico maduro e tm a importante funo
de conferir suporte e estabilidade mecnica aos outros componentes do
citosqueleto no axnio das clulas nervosas, principalmente nos neurnios
motores. Tambm constitudo pela internexina (presente no tecido
nervoso em crescimento)
o Tipo V: constitudo por lminas nuclear A, B e C, presentes no invlucro
nuclear e exclusivas do ncleo
o Tipo VI: constitudo por nestinas, protenas das clulas neuroepiteliais

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Na formao de um filamento
o Um monmero emparelha com outro, dando origem a um dmero que
mantm as regies homlogas emparelhadas na forma helicoidal
o Os vrios dmeros alinham-se dois a dois de modo antiparalelo, formando
um tetrmero, composto por quatro cadeias polipptidicas
o Um tetrmero corresponde a um protofilamento e apresenta 2 a 3nm
o Quando quatro protofilamentos se enrolam entre si sob a forma helicoidal
do origem a protofibrilas que, por sua vez, originam filamentos
intermdios (10nm) quando se associam quatro a quatro

Os filamentos intermdios desempenham variadas funes relacionadas com a


resistncia mecnica das clulas e da prpria membrana plasmtica nos locais de
contacto com outras clulas, participando tambm na organizao das clulas
aquando a formao de tecidos, bem como no transporte de macromolculas e
vesculas. So importantes para a estabilidade estrutural e posicionamento do
ncleo e tambm na prpria arquitectura da clula e dos tecidos
Para desempenhar estas funes, os filamentos intermdias associam-se e/ou
interagem com outras estruturas
o Junes de adeso (desmossomas e hemidesmossomas) responsveis pela
arquitectura e estabilidade estrutural da clula, bem como pela resistncia
a traces e estabilidade estrutural dos tecidos e das ligaes entre o
epitlio e o mesnquima subjacente

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Os filamentos intermdios parecem estar indirectamente envolvidos na


ligao que estabelecida entre os vrios organelos, nomeadamente
entre a mitocndria e o ncleo. A ligao entre o ncleo e a membrana
plasmtica tambm feita atravs dos filamentos intermdios e acreditase que estes estejam na base da transmisso de sinais da superfcie celular
para o ncleo. Os filamentos que se inter-relacionam com o ncleo so
maioritariamente filamentos intermdios constitudos por vimentina.
Existem tambm protenas associadas aos filamentos intermdios (IFAP)
o Ligaes cruzadas entre os filamentos (estando tambm associadas com a
especificidade tecidular): as filagrinas e loricrina (dos epitlios).

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o

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Ligaes entre os filamentos e outros componentes celulares:


desmoplaquinas (protenas que se encontram nas placas dos
desmossomas) e lmina B (invlucro nuclear)
Ligaes entre os filamentos e a membrana: anquirina e espectrina, ou
mesmo ocorrer directamente sem interferncia das protenas referidas

Muitas doenas do foro oncolgico, bem como doenas da pele (epidermlise


bolhosa simples), msculos e sistema nervoso (esclerosa amiotrfica lateral) esto
relacionadas com alteraes nos filamentos intermdios ou das suas ligaes a
outros componentes celulares. Assim, uma vez que as protenas associadas aos
filamentos intermdios so dotadas de uma distribuio muito caracterstica,
tornam-se teis na deteco de muitas doenas, bem como na escolha do
tratamento mais adequado

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Aula 5
5) Citosqueleto Filamentos de actina (microfilamentos)
O principal constituinte do citosqueleto , na maioria das clulas, a actina. Atravs
de finos e flexveis filamentos de actina (microfilamentos) de 7nm de dimetro e
vrios micrmetros de comprimento
So particularmente abundantes junto membrana plasmtica de modo a agir
enquanto suporte mecnico da clula e possibilitando a migrao de clulas
(movimento celular), a internalizao de partculas (endocitose/fagocitose) e a
diviso celular. So ainda importantes no trfego intracelular, na contraco
muscular, na sinalizao intracelular e comunicao entre clulas, nas
microvilosidades e na citocinese
Constitudos por protenas globulares com 375 aminocidos
Apresentam locais de ligao que permitem a formao de longas cadeias de
filamentos de actina, segundo um padro de hlice de dupla cadeia, levando
formao de uma cadeia polar (gerando um plo positivo e um plo negativo) que
confere propriedades fundamentais que permitem um arranjo especfico dos
filamentos de actina e um movimento da miosina numa nica direco
O ciclo dinmico de actina comporta vrias fases
o Polimerizao da actina: formao de agregados de 3 monmeros
o Crescimento da cadeia: ocorre de forma reversvel em ambas as
extremidades (treadmilling), sendo que a extremidade positiva cresce 5 a
10 vezes mais depressa que a extremidade negativa
o Ligao dos monmeros a ATP: pode ou no ocorrer mas, caso ocorra,
favorece a polimerizao; o ATP mais tarde hidrolisado, formando ADP,
que enfraquece a ligao qumica e leva a um novo arranjo do filamento

Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1201.html
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A taxa pela qual os monmeros livres so polimerizados proporcional s suas


concentraes existindo, portanto, uma concentrao crtica ma qual a taxa de
polimerizao idntica de despolimerizao
Se a concentrao de monmeros livres de actina for superior concentrao
crtica, a cadeia cresce. Caso contrrio, decresce
Alteraes de forma e movimento celular so, grandemente, possibilitados pelo
descrito. Contudo, h outras protenas que se ligam aos filamentos de actina e
influenciam a sua polimerizao:
o Citocalasina: liga-se extremidade positiva do filamento de actina,
impedindo a adio de monmeros livres de actina, inibindo, assim,
qualquer movimento celular
o Faloidina: liga-se fortemente aos microfilamentos impedindo a dissociao
destes em monmeros de actina
Verificou-se que a sntese de filamentos de actina in vitro muito mais lenta do
que a nvel celular e isolaram-se outras protenas (actin-biding proteins):
o Cofilina: liga-se aos filamentos de actina e promove a dissociao de
monmeros na extremidade negativa, permanecendo posteriormente a
cofilina ligada aos monmeros de actina com ADP, impossibilitando a
incorporao destes no filamento
o Profilina: liga-se aos monmeros de actina e trocam o ADP por ATP,
promovendo a polimerizao
o Arp2/3: protena que serve de local de nucleao para iniciar o arranjo de
novos filamentos
Nota: a aco destas protenas regulada por sinalizao celular como
resposta a estmulos exteriores
Padres de organizao dos filamentos de actina
o Feixes de actina: os filamentos esto estreitamente ligados segundo
planos paralelos. As protenas envolvidas (protenas empacotadoras de
actina) so pequenas e rgidas, obrigando os filamentos de actina a
ficarem prximos e alinhados, existindo dois tipos
Padro segundo planos paralelos bastante prximos uns aos
outros
Nestes filamentos todos tm a mesma polaridade com a
extremidade negativa ligada membrana plasmtica. Um exemplo
de protena envolvida nestes feixes a fimbrina, que se liga como
um monmero actina e mantm juntos dois filamentos
Ex: microvilosidades: protenas empacotadoras: vilina e fimbrina;
Ligao membrana plasmtica: braos laterais compostos por
associaes de calmodulina; extremidade negativa: ancorada ao
crtex da actina, que interliga e estabiliza as vilosidades

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Padro mais fraco, sendo realizadas aces de contraco


Estes padres verificam-se no anel contrctil na citocinese,
devendo-se distncia que separam os diferentes filamentos de
actina. A protena mediadora a -actinina

Redes de actina: os filamentos esto organizados segundo um padro


ortogonal que gera uma malha tridimensional

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As protenas envolvidas so flexveis e podem ligar filamentos


perpendiculares
So mantidos por protenas que se ligam aos filamentos
de actina, como a filamina estas protenas tm dois
locais de ligao actina e uma estrutura bastante flexvel
em forma de V

Os filamentos de actina encontram-se preferencialmente junto das regies


perifricas das clulas, junto das membranas plasmticas, associada a protenas,
denominando-se crtex e estando envolvido em vrias actividades da superfcie
celular
Ao contrrio de algumas clulas que no tm de se ligar matriz extracelular (ex:
glbulos vermelhos), outras tm de efectuar essa ligao (ex: fibroblastos),
existindo locais prprios para essa ligao. Essa ligao viabilizada pelas por uma
protena chamada integrina, em locais discretos (focos de adeso) e os filamentos
de actina produzidos no interior da clula para que a membrana se estenda e
possa atingir a matriz so chamadas de fibras de stress

Mas as ligaes no se fazem s com a matriz extracelular: h ligaes clulaclula (junes de adeso). Nestes casos, a protena transmembranar a caderina
que, por sua vez, formam protenas citoplasmticas (cateninas) que se associam
aos filamentos de actina

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Os filamentos de actina esto geralmente associados a miosina e so responsveis
por uma srie de movimentos celulares (miosina: prottipo de molcula motora
que transforma o ATP em energia cintica, tal como na contraco muscular)
Alguns msculos so constitudos por clulas longas cujo citoplasma constitudo
por miofibrilas (feixes cilndricos com dois tipos de filamentos: compactos de
actina e finos de actina). Assim, cada miofibrila est organizada como uma cadeia
de unidades contrcteis denominadas sarcmeros

A titina e a nebulina contribuem para a estruturao e estabilidade do sarcmero:


mantm a tenso de reposo e a retraco do msculo se este for superestendido

Contraco (cada sarcmero contrai-se):


o Os discos Z ficam masi prximos
o Deslizamento dos filamentos de actina por entre os filamentos de miosina,
para dentro da banda A e da zona H
o As bandas I e a zona H praticamente desaparecem e a banda A no sofre
alterao na sua largura

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A miosina envolvida neste processo a miosina II,


constituda por duas cadeias pesadas idnticas e por
dois pares de cadeias leves

A regio globular da miosina est ligada actina,


formando pontes entre os filamentos finos e espessos.
A actina encontra-se ligada ao disco Z atravs da sua
extremidade positiva, sendo que aquando da contraco,
a miosina desloca-se no sentido da extremidade positiva,
transformando energia qumica e levando aproximao
dos filamentos finas da linha M (regio central do
sarcmero), gerando a contraco muscular
A contraco muscular mediada atravs de impulsos
nervosos que estimulam a libertao de Ca2+ do retculo
sarcoplasmtico. Isto induz um sinal de contraco, j que
este
io
se
liga
ao
complexo
proteico
tropomiosina/troponina, que se encontram ligados aos
filamentos de actina

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Visitar:
http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1202.html

A miosina e a actina tambm desempenham um papel importante no anel


contrctil que permite a citocinese, sendo fcil entender o funcionamento vendo a
imagem abaixo

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O movimento celular grandemente influenciado pelos filamentos de actina, tal
como a fagocitose e a distenso dos axnios de clulas nervosas durante o
desenvolvimento do sistema nervoso
Um processo de grande importncia o deslizamento celular, envolvendo trs
etapas:
o Emisso de projeces (pseudpodes): por processos de polimerizao e
interligao de filamentos de actina
o Adeso ao substrato
o Destacamento da extremidade posterior da clula e sua retraco

Nota: em clulas de movimento lento, a deso envolve a formao de um


foco de adeso. Nas clulas de maior velocidade as ligaes estabelecidas
so mais difusas e no to especficas

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Aula 6
6) Integrando clulas em tecidos
a) Introduo
Existem quatro tecidos bsicos: nervoso, muscular, conjuntivo (menos diferenciado e
preenche os espaos entre os restantes tecidos) e epitelial (cobre as superfcies
internas e externas do organismo estando sobre a lmina basal).
No nosso prprio desenvolvimento, integrao de clulas nos tecidos assume enorme
relevncia pois aps a diferenciao de uma clula temos de a agarra a algum lado.
Essa adeso poder ocorrer entre clulas (ou seja, uma adeso clula-clula) ou com a
matriz extracelular (uma adeso clula-matriz extracelular).

b) Mecanismos de adeso de molculas de superfcie


As ligaes entre as molculas de superfcie podem ser de trs tipos: homotpica,
heterotpica ou por meio de uma molcula extracelular

c) Molculas de adeso celular (CAMs)


A adeso clula-clula e clula-matriz extracelular processam-se atravs de molculas
de adeso celular (CAMs). Estas possibilitam a associao de clulas em tecidos e
permitem a troca de informaes entre os meios intra e extracelular, podem estar
distribudas ao longo da membrana ou associadas em junes.

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Caderinas (dependentes de ies Ca2+, ligam o citosqueleto de clulas adjacentes)


So as principais responsveis por adeses clula-clula, tm interaces
homoflicas e necessitam de ies de clcio para formar ligaes estveis e fortes,
sendo importantes para a formao e manuteno de
tecidos. Os tipos mais importantes so:
E-caderina (caderina endotelial): responsvel
pelas interaces entre clulas epiteliais,
podendo a sua perda levar a cancro
P-caderina (caderina placentria): ligao entre
clulas da placenta
N-caderina (caderina neural): interaces entre os
neurnios
Como so selectivas, tm um papel importante na
embriognese
ii) Selectinas (dependentes de ies Ca2+, formam adeses transitrias)
Participam em interaces heteroflicas, possuindo um domnio conservado de
lectina (na extremidade virada para o meio extracelular) que na presena de clcio
se liga a oligossacridos especficos. Existem trs tipos:
L-selectinas (leuccitos): reconhece oligossacardeos de outras superfcies
celulares
P-selectinas (plaquetas): ligam-se aos oligossacardeos dos leuccitos
E-selectinas (clulas endoteliais): tem o mesmo efeito que as P-selectinas
Desempenham um papel importante na resposta inflamatria (medeiam as
interaces transitrias entre as clulas dos capilares e leuccitos) durante a
migrao dos leuccitos para os locais inflamados do tecido:
o A parede dos capilares activada como resposta a sinais qumicos dos
tecidos vizinhos que esto lesados pelo que as suas clulas se tornam
mais receptivas adeso de neutrfilos (mediada por selectinas P e E)
o Formam-se adeses transitrias que abrandam o neutrfilo
o Vo rolando e acabam por activar as integrinas que se vo ligar s
ICAMs (Immunoglobulin Celular Adhesion Molecules)
o Os neutrfilos param e aderem firmemente parede
o Mudam a forma e passar para o tecido lesado diapedese
i)

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iii) Integrinas (dependentes de ies Ca2+, formam adeses transitrias)


Actuam como receptores da membrana, constituindo os principais receptores para
as protenas da matriz (colagnio, fibronectina e laminina) s quais se ligam por
interaces heteroflicas. So heterodmeros, tm uma subunidade e uma .
Regulam a forma, orientao, migrao e ancoramento das clulas matriz
participando tambm na sinalizao clulas (podem activas uma cascata de
quinases)
iv) Imunoglobulinas (no so dependentes de ies Ca2+, formam adeses transitrias)
Protenas membranares na superfcie de linfcitos que esto envolvidos na
resposta imunitria, participando em interaces homoflicas e heteroflicas
(ligao s integrinas). Intervm na sinalizao celular para o interior da clula.
As N-CAMs (molculas de adeso de clulas nervosas) realizam ligaes
homoflicas levando formao de adeses selectivas entre clulas nervosas
durante o desenvolvimento

d) Junes celulares

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i)

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Interaces clula-clula
Formar canais e permitir a comunicao entre clulas adjacentes, passando a
funcionar como um todo
Permitir uma forte ligao mecnica entre clulas (adeso celular) conferindo
rigidez aos tecidos
(1) Junes de ancoramento
(a) Ligaes de Aderncia (desmossomas circulares)
Ligam o citoesqueleto de actina
(na forma filamentosa) de clulas
adjacentes atravs de caderinas
formando uma banda que
circunda completamente a clula
na
superfcie
interna
da
membrana
As pores extracelulares das
caderinas ligam-se umas s outras
enquanto a parte citoslica se liga
directamente -catenina, estando associada protena P120 que
estabiliza as junes. A -catenina ainda se liga -catenina que, por
sua vez, est ligada aos filamentos de actina e a protenas associadas a
estes filamentos como a vinculina.
Podem intervir nectinas na recruta de protenas para formar as
junes.
Conferem suporte interno s clulas nos tecidos epiteliais (ex:
intestino), situando-se abaixo das junes apertadas, sendo
responsveis pela inibio de contacto.
Um dos oncogenes frequentemente encontrado no cancro do clon
parece ser uma verso mutada de uma protena que normalmente
interage com as cateninas. A perda de junes de aderncia funcionais
pode levar metstase de tumores.
Nota: Inibio de contacto - processo natural de paragem do
crescimento ou diviso celular quando duas clulas contactam uma
com a outra, atravs da libertao de factores inibidores que se ligam
a receptores na superfcie da clula, impedindo a sua proliferao para
alm das necessidades do organismo
(b) Desmossomas pontuais
So estruturas de adeso descontnuas constitudas por duas placas
densas (uma mais externa e outra mais interna), na poro citoplasmtica,
adjacentes clula, que suportam os filamentos intermdios. Funes:
Manter a integridade estrutural do epitlio, fazendo com que as
clulas actuem como um todo coeso (ex: pele)
Manter a flexibilidade das clulas o que lhes permite resistir ao stress
mecnico (ex: msculo cardaco)

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Os filamentos intermdios de
queratina das clulas ligam-se
desmoplaquina
(placa
mais
interna) que se liga parte
citoslica das caderinas desmocolina e desmoglena atravs da placofilina e da
placoglobina
(placa
mais
externa).
As
pores
extracelulares das caderinas
ligam-se
por
interaces
heteroflicas.
Aparecem mais frequentemente perto da zona basal da clula, sendo a
sua ligao depende da concentrao de Ca2+.
A disrupo destes desmossomas, na pele, pode ser causada por uma
doena auto-imune Pnfigo (Phemphigus vulgaris) em que o paciente
produz anticorpos contra a desmoglena, levando ao aparecimento de
bolhas.
(2) Junes apertadas
Funes principais:
Manter a polaridade da clula: ao
ocorrer a separao do domnio
apical e basal das membranas
impedida
a
difuso
de
constituintes membranares
Barreira entre compartimentos
fluidos: impedida a passagem
livre de molculas ou ies entre
as clulas, sendo o material
obrigado a passar por difuso ou
transporte activo
As protenas que participam nestas junes so as ocludinas, as claudinas e
vo-se ligar a protenas semelhantes nas clulas adjacentes. As nectinas
podem participar na formao destas junes
So as mais fortes e localizam-se abaixo da superfcie apical entre clulas
epiteliais adjacentes em ductos e cavidades corporais (ex: intestino), formando
selas em pontos intermitentes da membrana

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(3) Junes comunicantes
Participam conexinas, protenas transmembranares
que ao formarem grupos de seis originam canais
(conexes) que vo abrir ou fechar conforme a
concentrao de clcio e o pH (o aumento da
concentrao de Ca2+ e a diminuio do pH
intracelular fecham o canal)
Permitem a difuso livre de ies inorgnicos e de
pequenas molculas hidroflicas entre clulas vizinhas
Impedem a passagem de protenas e cidos nucleicos
Permitem a ligao elctrica e metablica entre as
clulas: os sinais iniciados numa clula podem
propagar-se rapidamente para as clulas vizinhas
Exemplos:
o o potencial de aco no msculo cardaco passa de clula para clula
permitindo a contraco rtmica do corao
o nalgumas sinapses no crebro permitem a chegada de um potencial
de aco aos terminais sinpticos para depois ser transmitido para a
clula ps-sinptica sem o atraso implicado na libertao de um
neurotransmissor ou seja aceleram o processo)
o iniciam as contraces fortes e coordenadas do msculo liso do tero
antes do parto
o esto envolvidas nos movimentos peristlticos do intestino e
embriognese
Os genes que codificam as conexinas podem sofrer mutaes que esto na
origem de vrios doenas hereditrias como deficincias cardacas congnitas
e surdez congnita
Nota: Plasmodesmata - conexes citoplasmticas
anlogas s junes comunicantes. Em cada
plasmodesma (singular), a membrana plasmtica
de uma clula contnua com a da clula vizinha
formando um canal entre os citoplasmas. Uma
extenso do retculo endoplasmtico liso passa
por um poro deixando um anel de citoplasma
circundado por onde passam livremente ies e pequenas molculas. Clulas
adjacentes mantm-se unidas por uma espcie de cola, as lamelas mdias,
que so regies especializadas da parede celular ricas em pectinas

ii) Interaces clula-matriz


A maioria das clulas dos animais vertebrados no
consegue sobreviver se no estiver fixada matriz
extracelular. Esta capacidade normalmente
perdida quando a clula se torna cancerosa.
(1) Hemidesmossomas
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Placa que liga as clulas epiteliais lmina basal da matriz formando regies
de unio pontual
Possuem uma estrutura semelhante aos desmossomas mas so qumica e
funcionalmente distintos
Nas junes os filamentos de queratina ligam-se a integrinas, atravs da
plectina, que por sua vez se ligam laminina

(2) Adeses focais


Ligam os feixes de actina matriz extracelular
atravs de integrina (que est ligada a
protenas adaptadoras como a vinculina, a
talina, a filamina ou a alfa-actinina), estando
os feixes ancorados poro citoplasmtica
da sua subunidade
A poro extracelular das integrinas vai ligarse a componentes da matriz: a laminina,
fibronectina ou o colagnio
So contactos dinmicos que influenciam a
migrao celular: quanto maior o nmero de
adeses focais menor a mobilidade da clula
A formao de adeses focais regulada por quinases que se ligam a
integrinas e promovem a sinalizao que modela o crescimento, sobrevivncia
e migrao celular

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Resumindo:

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Aula 7
7) Matriz extracelular
A maioria dos tecidos dos animais est numa matriz extracelular
que preenche os espaos entre as clulas e mantm os tecidos
juntos. Existe alguns tipos de tecido conjuntivo, dependendo da
variedade das protenas e polissacardeos produzidos
a) Definio
Conjunto de protenas e polissacardeos secretados,
depositados e degradados pelas clulas que preenche os
espaos entre aquelas e entre os tecidos, mantendo-os unidos
b) Interaces clula-matriz (algumas j foram faladas)
Existe uma relao bidireccional entre as clulas e a matriz: o tipo de clulas
determina o tipo de matriz e o tipo de matriz influencia as funes inerentes a
cada tecido
Apesar do papel essencialmente estrutural da matriz celular, ela regula fenmenos
biolgicos tais como a adeso, migrao e proliferao celulares. Logo, funciona
como meio de comunicao entre as clulas, modificando o seu padro de
expresso gnica e influenciando a diferenciao.
c) Aspectos funcionais
Organizao das clulas em tecidos
Proteco de agentes patognicos
Coordenao de funes celulares por activao da sua sinalizao intracelular,
controlando o crescimento, proliferao e expresso gentica
d) Compartimentos
i) Intersticial
Apresenta sobretudo funo estrutural ao nvel do tecido conjuntivo denso
(caracterstico pela resistncia e elasticidade dada pelo colagnio e elastina) e ao
nvel do tecido conjuntivo laxo (caracterizado por agregados de proteoglicanos
que mantm um ambiente hidratado nos tecidos)
ii) Pericelular
Constitudo por fibronectinas, proteoglicanos e outras protenas multifuncionais
Responsvel pela modulao do comportamento celular
Responsvel por influenciar a expresso gentica das clulas
e) Constituio
i) Protenas estruturais
Constituem o sistema elstico, o qual concede resistncia e flexibilidade aos
tecidos
(1) Colagnio
Protena mais abundante nos tecidos dos animais
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Tem mais de 19 tipos diferentes


Caracteriza-se pela existncia de trs cadeias
polipeptdicas (cadeias alfa) em torno umas das outras,
formando uma tripla hlice
A unidade estrutural uma sequncia de aminocidos
Gly-X-Y (Gly glicerina e X e Y podem ser quaisquer
aminocido mas geralmente prolina e hidroxoprolina,
respectivamente). A glicina actua ao nvel do
empacotamento enquanto os outros dois aminocidos
ao nvel da estabilizao
Tm capacidade de polimerizar espontaneamente e de
uma forma ordenada (fibrilas fibras feixes)
Biossntese
o Sintese de cadeias alfa
o Hidroxilao e glicolisao de alguns aminocidos
o Condensao das molculas de procolagnio em vacolos
o Secreo em vesculas para o exterior da clula
o Clivagem extracelular dos procolagnios
o Polimerizao ordenada do colagnio
(2) Elastina
Componente amorfo: no exibe subestrutura,
constitudo sobretudo por elastina
Componente microfibrilar
o Constitudo por fibrilas tubulares e pelo menos
5 protenas importantes, sendo a mais
importante a fibrilina
o Permite a flexibilidade e elasticidade
necessrias a estruturas como os vasos, a
traqueia, etc.
ii) Glicosaminoglicanos (GAGs) e proteoglicanos (substncia gelatinosa hidratada)
Os GAG so polissacardeos constitudos por
unidades repetitivas de dissacardeos (um dos
dissacardeos pode ser tanto o N-acetilglicosamino
com N-acetil-glactosamino e o outro dissacardeo
geralmente um cido, ou o glicornico ou o
idurnico)
Os mais abundantes so o cido hialurnico,
heparina e sulfatos de condrotina, dermatano,
queratano e heparano
Todos tm carga negativa (excepto o hialuronano)
Os proteoglicanos so muito diversificados, uma vez
que se ligam a muitas protenas diferentes
Tm funo de reteno de gua, resistncia
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compresso, ligao a fibras de colagnio (originando redes) e adeso celular


(promovendo a migrao de territrios de clulas embrionrias
iii) Protenas de adeso ou multifuncionais (ligao das clulas matriz)
Possuem um nmero varivel de regies ou domnios, tendo grande
diversidade de interaces
Interagem entre si, com outros molculas extracelulares e com receptores
celulares, desempenhando um papel estrutural adesivo
O prottipo deste tipo de molculas e principal
protena de adeso de tecidos conjuntivos a
fibronectina (glicoprotena dimrica, constituda por
duas cadeias de polipeptdicas associadas atravs de
pontes de sulfureto, possuindo pontos especficos para a
ligao com o colagnio e com os GAGs e tem um local
especfico reconhecido pelos receptores da superfcie
celular adeso de clulas matriz extracelular)
A laminina uma glicoprotena em forma de cruz
composta por trs cadeias polipeptdicas (, , 2) que
existe em abundncia na lmina basal, possuindo vrias
zonas de ligao aos elementos da matriz
As interaces entre as clulas e as protenas de adeso
do-se por receptores de superfcie celular denominados de integrinas
f)

Degradao da matriz
A degradao est a cargo de uma srie de enzimas: enzimas de serina (resduos de
serina no centro activo) e metaloenzimas (dependem de metais para terem actividade)
Fisiolgica: como exemplo o deslocamento dos neutrfilos durante a resposta
inflamatria
Patolgica: como exemplo os processos de metstases

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Aula 8
8) Mitocndrias e peroxissomas
a) Mitocndrias
i) Constituio, composio e a sua gentica
Duas membranas diferentes: externa
e interna
A regio limitada pela membrana
interna: por matriz mitocondrial
(existem protenas, ribossomas e
DNA, que tm uma funo
importante
no
processo
de
respirao celular e no processo de fosforilao oxidativa)
A membrana externa delimita o espao intermembranar, apresentando ainda
canais transmembranares formados por porinas, que tornam a membrana
bastante permevel maioria das molculas de dimenses reduzidas
A membrana interna bastante maior que a externa, formando uma srie de
invaginaes que se projectam para o espao interior cristas mitocondriais
(onde existem as partculas F1, que confere assimetria membrana, os
factores de acoplamento e grande actividade enzimtica)
Os principais fosfolpidos que constituem as membranas so: fosfatilcolina,
fosfatiletanolamina e a cardiolipina. So constitudas por protenas, lpidos,
cidos nucleicos e pequenas molculas como co-factores e subtractos
A membrana externa que constituda por 50% de lpidos e 50% de protenas,
a membrana interna, menos espessa, constituda maioritariamente por
protenas (76% contra 24% de lpidos)
Nos lpidos destaca-se a cardiolipina (molcula que reduz a permeabilidade da
membrana passagem de protes)
Quanto s protenas podemos destacar 3 tipos:
o as intervenientes na cadeia citocromica
o integradas na fosforilao oxidativa
o integradas na impermeabilidade a pequenos ies e permeabilidade a
metabolitos.
Possuem um genoma prprio e toda a maquinaria para a transcrio e
traduo, sendo capazes de se reproduzir autonomamente (confirmando a
teoria endossimbitica)
O genoma constitudo por uma molcula de DNA circular em cadeia dupla,
podendo localizar-se na matriz da mitocndria ou na membrana interna
Verifica-se que as mitocndrias do embrio foram herdadas exclusivamente da
me (uma vez que o espermatozide no contribui com praticamente nenhum
citoplasma para o zigoto) sendo o DNA mitocondrial muito utilizado nos
estudos forenses para determinao/confirmao da maternidade

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ii) Funes
A principal fonte energtica das clulas animais a glicose. Este composto tem de ser
processado numa srie de reaces respirao celular que tem como objectivo
transformar este composto noutros mais simples que so utilizados pela clula e ao
mesmo tempo produzir energia resultante da sua degradao. Assim, so necessrios
vrios passos diferentes:

Gliclise - decorre no citoplasma. Consiste na degradao da glicose em cido


pirvico. designada a fase anaerbia da respirao (exactamente igual ao
processo com o mesmo nome que decorre na fermentao). Ocorre a
transformao da glicolise em aldedo fosfoglicrico, depois a isomerizao e,
por ltimo, a formao do cido pirvico. A oxidao do cido pirvico decorre
ainda no citoplasma e produz acetilcoenzima A

glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 NADH + 2 cido pirvico + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+

Formao de acetil- CoA : ocorre na matriz da mitocndria. O cido piruvico


sofre descarboxilao e oxidao por aco enzimtica da piruvatodesidrogenase e NAD+, reagindo com a coenzima-A, formando-se acetil-CoA,
CO2 e NADHReaco global:

2 cido pirvico+ 2 NAD+ + 2 CoA 2 acetil-CoA + 2 ATP + 2 CO2 + 2 H+


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ciclo de Krebs : ocorre na matriz mitocondrial. A molcula de acetil-CoA sofre


um conjunto de reaces (descarboxilao e reduo de FAD em FADH2 e de
NAD+ em NADH). O NADH e o FADH2 vo servir de transportadores de
electres na fosforilao oxidativa pois so coenzimas muito energticas.
Nesta fase formam-se apenas duas molculas de ATP.

fosforilao oxidativa: formao de ATP por transferncia de electres, ao


longo de uma cadeia respiratria, ocorrendo reaces redox. Os dadores de
electres so as molculas de NADH e FADH2 e o aceptor final o O2. Ao
receber electres o oxignio reduzido e forma duas molculas de H2O

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cadeia respiratria: ocorre um fluxo de electres atravs de complexos


enzimticos ligados a grupos prosteticos, localizados na membrana
mitocondrial interna. A uibiquitina e o citocromo C medeiam a transferncia
de electres entre os vrios complexos. Durante este fluxo so libertados
protes para o espao intermembranar. Isto leva a uma diminuio do pH o
que vai criar um potencial osmtico no sentido do espao intermembranar
matriz. Os protes, atrados pela membrana interna onde se encontra o
complexo ATPsintetase, saem sintetizando ATP. Forma-se H2O quando os H+
reagem com O2-.

Uma outra funo da mitocndria a produo de calor: no tecido adiposo castanho


(o nome deriva da cor castanha devido ao grande nmero de mitocndrias existentes)
as mitocndrias diferem das de outros tecidos na constituio da sua membrana
interna e no metabolismo energtico - as membranas tm especializao cuja funo
especificamente a produo de calor (a protena termogenina funciona como uma
passagem de protes do espao intermembranar para a matriz mitocondrial pelo
potencial de concentraes, bloqueando a funcionalidade da ATP-sintetase, levando a
um decrscimo na produo de ATP, sendo o metabolismo mais lento. Atravs da
passagem de protes pela termogenina, o NADH oxidado em NAD+ sem produo de
ATP, libertando energia sob a forma de calor.
Na mitocndria tambm ocorre a sntese de protenas, nomeadamente do grupo
heme. Esta sntese d-se atravs da unio da succinil-coenzima A e glicina, que se
condensam, so descarboxilados e formam cido aminolevlico. Este migra para o
citoplasma e aps reaces forma o coproporfirinognio III migra para a matriz onde
vai ser descarboxilado pela coproporfirinognio III-oxidase para produzir a
protoporfina. Por ltimo, a ferroquetalase promove a ligao do io Fe2+
protoporfina, produzindo o grupo heme.

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A mitocndria est tambm envolvida em processos de envelhecimento celular. Neste


organito produzem-se radicais livres de oxignio (ROS, reactive oxygen species), o
radical superxido (O2-), perxido de hidrognio (H2O2) e o radical hidroxilo (OH-)),
altamente oxidantes, responsveis por graves danos ao nvel celular. A sua aco lesiva
exerce-se sobre a bicamada fosfolipdica da membrana das clulas (peroxidao
lipdica), ao nvel das protenas mitocondriais e ainda ao nvel do DNA: o radical livre
provoca a ionizao de vrios aminocidos que tero tendncia a ligar-se entre si
(formando cross links que, em circunstncias normais, no ocorreria). D-se uma
alterao na estrutura da protena e consequente perda de funcionalidade, tornando a
mitocndria incapaz de fornecer a energia necessria clula, provocando a sua
falncia. Tambm pode ser atacados, como dito, os fosfolpidos da membrana celular.
As mitocndrias desempenham ainda importantes funes ao nvel da apoptose
(morte celular programada): verifica-se que a mitocndria o nico organelo que se
mantm intacto ao longo de todo o processo apopttico, devendo-se isso ao facto de
ser necessria para fornecer energia clula para a apoptose. A mitocndria liberta o
citocromo c (factor que ir activar a protena Apaf-1, responsvel pela activao de
uma cascata de caspases) mas a actividade da mitocndria depende da protena prapopttica bax, que permite a formao de canais de membrana externa da
mitocndria que induzem um fluxo de ies que levam libertao do citocromo c e de
outros factores que induzem a apoptose para o citoplasma.

O fenmeno de permeabilizao da membrana (ou abertura do PTP, permeability


transition pore) pode ocorrer por aco de outros factores como a elevada
concentrao em Ca2+, ROS, lpidos, entre outros. O fenmeno ocorre devido perda
do potencial da membrana e consiste no inchao da mitocndria (swelling),
ocorrendo a abertura da membrana interna, ruptura da externa e libertao dos
solutos para o espao extracelular.
iii) Importncia do clcio na mitocndria
Controlo da taxa de metabolismo celular (existem enzimas da mitocndria cuja
regulao depende deste io)
O clcio leva despolarizao e permeabilizao da membrana
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Influenciar o tipo de morte celular que ir ocorrer: apoptose caso a sua


concentrao seja moderada e ainda haja ATP para realizar este processo,
necrose caso a concentrao em clcio seja muito superior e no haja ATP para
realizar apoptose
Fenmenos de sinalizao celular, estando tambm relacionado com o
aumento da produo de radicais livres de oxignio por parte da clula

iv) Doenas associadas ao mau funcionamento das mitocndrias


Se a apoptose no for eficiente, pode verificar-se o aparecimento de doenas
como o cancro, Alzheimer, Parkinson ou ainda imunodeficincias como o HIV.
Por outro lado, caso a deficincia seja ao nvel da cadeia respiratria, as
doenas associadas podem ser: Parkinson, Alzheimer, problemas cardacos,
respiratrios e envelhecimento celular, entre outras.
b) Peroxissomas
i) Constituio e composio
Pequenos organitos citoplasmticos
constitudos por uma nica membrana,
sendo esta simples e permevel gua
e a outras molculas de pequenas
dimenses
A sua matriz moderadamente densa
(o seu contedo um estroma
finamente
granular
que
pode
condensar-se e formar um ncleo
opaco e homogneo)
Contm no interior da sua matriz frequentemente uma incluso de tipo
cristalino designada nucleide, bem como enzimas envolvidas numa grande
variedade de reaces metablicas (estas podem agrupar-se em oxidase,
catalase, acetiltransferase, desidrogenase, amino-transferases e enzimas de
snteses vrias, sendo todas produzidas nos ribossomas livres no citosol, e s
depois so translocadas para os peroxossomas)
No tm o seu prprio genoma e as protenas que se encontram no seu
interior so sintetizadas a partir do genoma do ncleo e de ribossomas livres
no citoplasma sendo importadas como cadeias polipeptdicas completas
Encontram-se normalmente prximo de gotculas lipdicas, mitocndrias e
cisternas do retculo endoplasmtico
Microperoxissomas - organitos semelhantes aos peroxissomas mas de
menores dimenses, no apresentando nucleide
ii) Funes
Respirao: produo de perxido de hidrognio (atravs de 3 enzimas: uratooxidase, aminocido-oxidase e -hidroxil-cido-oxidase), txico para as clulas,

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sendo necessrio degrad-lo. A catalase converte o perxido de hidrognio
em gua e oxignio
2H2O2 2H2O + O2
ou ento utiliza-o para oxidar outros compostos orgnicos
H2O2 + compostos orgnicos 2H2O + produto oxidado
A catalase produzida no citosol sob a forma de um percursor monomrico
(apoenzima) sendo depois translocada para os peroxissomas. No organelo lhe adicionado o grupo heme, transportador de ferro, surgindo a holoenzima.
Assim, a catalase funciona como uma vlvula de segurana relativamente
produo excessiva de H2O2.
Oxidao em beta dos cidos gordos de cadeia longa: os electres do NADH e
FADH2, produzidos durante a oxidao dos cidos gordos, so transferidos
para o O2 regenerando o NAD+ e FAD, formando o H2O2 que a catalase
decompe. A oxidao peroxissomal dos cidos gordos no est ligada
formao de ATP a libertao de energia convertida em calor. O acetil-CoA
formado durante a oxidao peroxissomal dos cidos gordos transportado
para o citoplasma onde usado na biossntese de colesterol e outros
metabolitos. Assim, os peroxissomas so o principal organito que oxida os
cidos gordos, nas clulas animais.
Metabolismo de aminicidos, glicoxilato, cidos biliares, colesterol e dolicol
e lpidos usados para a produo de mielina: a D-amino oxidase est
envolvida no metabolismo de aminocidos, permitindo a converso dos Daminocidos em -cetocidos; as enzimas envolvidas no metabolismo de
glicoxilato so capazes de catalisar a transferncia de um grupo amina da
alanina para o glicoxilato formando glicina e cido pirvico, que permitem a
oxidao do glicoxilato em oxalato. Alm de participarem na sntese de lpidos
utilizados na produo de mielina, estes organelos esto tambm envolvidos
na sntese de colesterol e dolicol, bem como na sntese de cidos biliares,
derivados do colesterol, que ocorre no fgado.
Catabolismo: catalisam as primeiras etapas da sntese de plasmalgenos
(famlia de fosfolpidos em que uma das cadeias hidrocarbonadas se liga ao
glicerol por uma ligao ster). Tambm participam no catabolismo de
purinas, permitindo a degradao de nucletidos pricos que contenham
adenina e guanina, cujo produto final cido rico no ser humano e alantoina
na maioria dos outros mamferos
Glucognese (degradao do glicognio em glicose) e termognese
De todas estas funes, as mais importantes so a respirao e a oxidao em
beta dos cidos gordos de cadeia longa.

iii) Biognese
As protenas peroxissomicas contm sinais PTS (peroxisome targeting signal):
o PTS1 3 aminocidos (serina, lisina, leucina)
o PTS2 5 aminocidos (arginina, leucina, X5, histidina, glutamina)
Os peroxissomas formam-se a partir de outros j existentes, logo a clula
inicial j tem que conter peroxissomas
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iv) Doenas associadas aos peroxissomas


So vrias as doenas peroxissmicas, estando a maioria relacionada com a
ausncia, quase total, dos peroxissomas nas clulas ou na deficincia na
sntese da sua membrana e na entrada de protenas para os peroxissomas
(incapacidade para a beta-oxidao dos cidos gordos). Ex: sndrome de
Zellweger

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Aula 9 e 10
9) Sistema endomembranar e trfego intracelular e modificaes ps-traduo no RE e Golgi
Retculo Endoplasmtico
Geralmente, nas clulas eucariticas, a maior mebrana a que envolve o retculo.
Estende-se desde a membrana nuclear, prolongando-se pelo citosol. O retculo um
sistema contnuo e interconectado de tbulos e envolvidos por membranas e sacos
(tambm designadas por cisternas).
O retculo tem um grande nmero de funes, mas as mais importantes so a sntese de
lpidos e protenas e ainda a secreo de protenas. Podem-se distinguir o Retculo
endoplasmtico liso (tem este nome devido inexistncia de ribossomas) e o retculo
endoplasmtico rugoso.
Principais diferenas entre retculo endoplasmtico liso e rugoso:

Associado
ribossomas
Funes

Mais
desenvolvido
em

Liso
a No
Metabolismo
de
lpidos
(colesterol,
fosfolpidos,
triglicridos,
hormonas),
metabolizao de drogas e
substncias txicas
Clulas
com
hepatcitos,
adipcitos e adrenocorticais

Rugoso
Na superfcie externa
Processamento
protenas

de

Clulas
secretoras:
pancreticas, musoca
intestinal, linfcitos

Retculo Endoplasmtico Liso Funes


Sntese de hormonas
Sntese de triacilgliceris (so armazenados no lmen do retculo nos adipcitos
servindo de fonte energtica)
Libertao da glicose a partir do glicognio, por aco da enzima glucose-6-fosfatase
Estabelecimento de gradientes de clcio vai conduzir sinalizao celular, secreo
celular, excitao nervosa e contraco muscular
Desentoxica a clula: oxida substncias estranhas via oxidases de funo mista (OFM)
atravs do uso do citocromo P450, transformando as substncias hidrofbicas em
hidrosolveis, que so mais facilmente excretveis
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Sntese de lpidos membranares


A sntese de fosfolpidos no lado citoslico da membrana do retculo permite que as
cadeias hidrofbicas dos cidos gordos permaneam inseridas na membrana enquanto
enzimas ligadas membrana catalisam as suas reaces com percusores solveis em gua
no citosol.
O retculo assim responsvel pela sntese tanto dos produtos finais (fosfatidilserina,
fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol) como dos percusores (colesterol e
ceramida - esta ser convertida em esfingomielina) dos principais lpidos de membranas
eucariticas.
Sntese de lpidos membranares

Coenzimas A (so transportadores) vo-se ligar aos cidos gordos


Transferncia dos cidos gordos da coenzima A para o glicerol-3-fosfato
Insero dos fosfolpidos resultantes (cido fosfatdico) na membrana.
Converso do cido fosfatdico em diacetilglicerol mediado por uma fosfatase
Enzimas existentes no lado citoslico da membrana catalisam a adio de diferentes
grupos na cabea polar do diacetilglicerol (formando fosfatidilcolina, fosfatidilserina e
fosfatidiletanolamina). A formao do fosfatidilinositol d-se a partir do cido
fosfatdico e no do diacetilglicerol.
Atravs deste processo, a sntese dos fosfolpidos apenas se d na metade citoslica
da membrana. Para que a membrana se mantenha estvel, alguns destes lpidos tm
de ser transferidos para a outra metade da membrana. Esta transferncia mediada
por protenas transportadoras de fosfolpidos, as flipases.

Retculo Endoplasmtico Rugoso Funes


Sntese de protenas (o RE desempenha um papel fundamental no processamento e
dobramento das protenas - sendo aqui que elas adquirem a sua conformao
tridimensional final)
Todas as protenas comeam a sua sntese em ribossomas livres no citosol mas podem:
Terminar a sua sntese no retculo endoplasmtico rugoso
Ser totalmente sintetizadas no citosol
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Protenas
sintetizadas

Nos
ribossomas
livres do citosol vo

Permanecer no citosol
Ncleo
Mitocndrias
Cloroplastos
Peroxissomas
Protenas da face interna da membrana citoslice

Nos
ribossomas
ligados membrana
do RE vo

Integrar a membrana do RE

Integrar a membrana nuclear

Integrar o Golgi

Integrar lisossomas

As protenas dirigem-se para um determinado local dependendo de um sinal intrnseco


que o RNA que as codificam possui. Este sinal vai dirigir as protenas para os locais
especficos onde vo actuar (teoria do sinal Gunter Blobel). De acordo com esta teoria, a
traduo de codes do RNA que possuam este sinal, gera uma sequncia no grupo amino
terminal, chamado sequncia sinal. Esta sequncia sinal vai fazer com que o ribossoma
pare a traduo do RNA e se ligue membrana, membrana essa que vai servir como
proteco da integridade da protena durante a sua deslocao para o local da clula onde
vai actuar.
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Sntese de protenas no RER


Ao dar-se a sntese da protena em ribossomas livres no citosol, pode haver no RNA uma
sequncia de sinal. Essa sequncia vai fazer com que a traduo da protena pare e que o
conjunto ribossoma-protena seja direccionado para a membrana do retculo
endoplasmtico rugoso, onde reconhecido pela SRP (signal recognition particle
partcula reconhecedora do sinal), nos devidos receptores. Esse reconhecimento vai
permitir a entrada da sequncia sinal dentro do canal de membrana (consiste num
complexo de 3 protenas transmembranares Sec61), onde a sequncia sinal pode ser ou
no clivada por uma peptidase sinal. Depois disto, a traduo da protena segue e o
polipptido libertado no lmen do retculo.
Protenas que tenham como destino as membranas do RE, do complexo de Golgi ou a
membrana citoplasmtica tm origem no RE. Estas protenas no so libertadas no lmen
do RE durante a sua traduo, mas so sim inseridas na sua membrana, percorrendo toda
a via secretora ou parte dela como protenas transmembranares e no como protenas
solveis. As protenas encontram-se inseridas na membrana atravs das regies de hlice e, diferentes protenas integrais vo dar origem a diferentes formas de insero das
protenas na membrana.

A insero das protenas na membrana vai envolver:


Uma sequncia sinal amino terminal clivvel que inicia o transporte atravs da
membrana
Uma sequncia de stop de transferncia, pra a transferncia que liga a protena
membrana
As protenas tambm podem estar ligadas membrana do retculo atravs de
sequncias sinal internas que no so clivadas pelas peptidases sinal
As protenas podem atravessar a membrana uma vez (unipass) ou vrias vezes
(multipass)
Protenas que cruzam vrias vezes a membrana podem estar inseridas como resultado
de uma srie alternada de sequncias sinal internas e sequncias stop de transferncia
Dependendo da sequncia sinal, as protenas inseridas na membrana podem ter o seu
grupo amino terminal (N) parte hidroflica- ou carboxi terminal (C) parte
hidrofbica - exposto para o citosol
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Sntese de protenas em ribossomas livres do citosol


As protenas destinadas s mitocndrias, peroxissomas, ncleo, cloroplastos e ainda
membrana citoplasmtica, sobrem traduo em ribossomas livres do citosol. Aps a sua
traduo, so encaminhadas para o RE atravs das suas sequncias sinal que so
reconhecidas por diferentes receptores de protenas. Elas entram no lmen do RE atravs
dos chaperes, que se mantm ligados protena depois da sua traduo, impedindo que
estas adquiram uma conformao antes de entrarem no RE.
Algumas das protenas sintetizadas nos ribossomas livres do citosol tm como destino a
face interna da membrana citoplasmtica. Para que se insiram na membrana, vo-se
associar a lpidos, formando lipoprotenas, por processos de N-miristoilao, isoprenilao
e palmitoilao. Nestes processos vai-se dar a adio de cidos gordos s partes finais das
cadeias polipeptdicas. Na N-miristoilao, adiciona-se cido mirstico ao resduo de glicina
situada em N-terminal. Na isoprenilao adiciona-se o cido palmtico aos resduos de
cistena na cadeia polipeptdica. No ltimo caso, d-se a adio de grupos prenil (tipos
especficos de lpidos) ao C-terminal dos resduos de cistena na cadeia.

Dobramentro de protenas e processamento do RE


As protenas so transportadas atravs da membrana do retculo como cadeias
polipeptdicas no dobradas (sem forma tridimensional) enquanto a sua traduo est em
progresso. Assim que acaba a sua traduo, o retculo vai catalisar o dobramento e a
montagem de polipeptdios. Este processo envolve:
Dobramento de protenas (as protenas adquirem a conformao mais correcta)
com o auxlio de chaperes, que so protenas da famlia das BIP e vo estar
envolvidas na aquisio da conformao mais correcta das protenas
Montagem de protenas como subunidades mltiplas, que podem ser unidas por
ligaes dissulfureto (essas ligaes so promovidas por uma enzima existente no
RE chamada protena dissulfureto isomerase)
Formao de estgios iniciais de glicosilao (N-glicosilaes e transferncia para o
dolicol)

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No RE, a glicosilao d-se durante a traduo da protena. O oligossacardeo que se vai


ligar protena, forma-se enquanto se encontra ancorado a um suporte lpidico da
membrana o dolicol. Este oligossacardeo transferido do dolicol para um receptor na
protena a ser traduzida a asparagina - por uma enzima, a oligossacaril transferase. O
oligossacardeo une-se protena atravs do N-acetilglucosamina.

Ancoragem ao GPI
As protenas podem-se ligar s diferentes membranas das clulas. Uma forma de elas o
fazerem, atravs da ancoragem ao GPI (glicosilfosfatidilinositol, que um glicolpido
ancorador). O GPI constitudo por 2 cadeiras de cidos gordos e por uma de
oligossacardeo. As protenas, quando j se encontram totalmente sintetizadas, ligam-se
atravs do grupo carboxi terminal, ficando assim apenas ligada ao GPI. Isto leva a uma
fluidez da protena na membrana, sendo importante no estabelecimento de
microdomnios na face extracelular da membrana citoplasmtica.

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Controlo de qualidade no Retculo


Apenas as protenas que foram correctamente sintetizadas e que possuem uma
conformao correcta saem do RE. As protenas que no possuem uma correcta
conformao permanecem ligadas a chaperes e so depois eliminadas pela via secretora.
A permanncia das protenas no RE determinada por sequncias intrnsecas nas
protenas. Essas so sequncias KDEL (para protenas solveis, ou a sequncias C terminal
curtas que contm 2 residuos de lisina) e sequncias KKXX (para protenas integrais).
Experincias demonstraram que ao ser retirada a sequncia KDEL, a protena exportada
(transporte antergrado); no entanto a adio dessa mesma sequncia faz com que as
protenas fiquem retidas no RE. As protenas solveis, mesmo contendo esta sequncia,
podem ser incorporadas em vesculas mas, ao serem reconhecidas no Golgi, voltam para o
RE (transporte retrgrado). As protenas s saem do RE se possurem uma conformao
correcta.
Se a conformao das protenas no estiver correcta, estas percorrem o chamado caminho
proteoltico. A este tipo de protenas iro ligar-se outro tipo de protenas, as ubiquitinas,
que vo estar envolvidas na degradao das protenas que foram incorrectamente
sintetizadas ou que possuem uma conformao errada.
Se estes processos no forem bem efectuados, pode levar a doenas neurodegenerativas.

Via secretora de protenas


Todas as molculas que so exportadas do retculo, tanto lpidos como protenas, so
exportadas em vesculas que emergem da membrana, sendo transportadas inicialmente
para um complexo intermedirio RE-Golgi (tambm chamado ERGIC) e s depois para o
Golgi. As etapas seguintes envolvem o transporte entre os vrios compartimentos do Golgi
e deste para os lisossomas ou para a membrana citoplasmtica.
Complexo de Golgi
O complexo de Golgi, denominado
dictiossoma nas plantas, constitudo por
um conjunto de sacolos de parede lisa e
empilhados e por vesculas que lhe esto
associadas.
Pode ser divido em 3 pores: Cis (poro
inicial), Medial, e Trans (poro final). Nas
diferentes pores vo ocorrer diferentes
reaces que envolvem as protenas. Na
primeira poro d-se a fosforilao de
oligossacdeos lisossomais (tetrxido de
smio). Na poro medial d-se a remoo
de manose e a adio de Nacetilglucosamina (uma N-glicosilao). Na
poro final d-se a adio de galactosamina

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e NANA (cido silico) fosfatase cida. nesta fase tambm que se d a sada e secreo
dos produtos do Golgi para os locais onde cada protena vai actuar. As zonas trans do Golgi
onde se faz a secreo de vesculas so as chamadas trans golgi network.
O complexo de golgi desintegra-se na presena de brefeldina A.
Transporte antergrado de protenas ao longo do Golgi
O transporte de protenas ao longo do Golgi explicado por um modelo em que diz que o
contedo progride dentro da mesma cisterna, no sentido de cis para trans e que, o
contedo das cisternas modificado por enzimas trnasportadas em vesculas que se
deslocam retrogradamente, ou seja, deslocam-se de uma cisterna mais trans para uma
mais cis.
Quando uma protena possui uma sequncia KDEL, esta ir sofrer transportao
retrgrada, e ir do Golgi para o RE.
Glicosilao de protenas no Golgi
A glicosilao a adio de acares a protenas. Este processo vai ocorrer tanto no RE
como no Golgi.
No RE h modificao de oligossacardeos N-ligados que so adicionados s protenas, vai
haver adio de um oligossacardeo e ainda so removidos dos polipeptdeos trs resduos
de glicose e um de manose.
No Golgi, os oligossacardeos N-ligados das glicoprotenas que provm do RE vo sofrer
alteraes adicionais. Diferentes glicoprotenas sofrem diferentes transformaes
medida que atravessam o Golgi, dependendo da sua conformao e da quantidade de
enzimas presentes no Golgi das diferentes clulas.
A glicosilao pode ser:
Por ancoragem ao GPI
Com ligao N o oligossacardeo liga-se ao grupo amina da protena
Com ligao O o oligossacardeo liga-se ao grupo carboxilo da protena
N-glicosilao ocorre em protenas que se destinam membrana citoplasmtica ou a
serem secretadas e iro dar-se segundo uma sequncia ordenada de reaces, explicado
na fig.4.
O-glicosilao d-se quando as protenas so transformadas pela adio de hidratos de
carbono, atravs da serina e da trionina que se encontram normalmente ligadas a uma Nacetilgalactosamina, qual outros acares se podem ligar. Ao se ligarem diferentes
acares, vai-se estar a formar diferentes glicoprotenas, o que via estar envolvido nos
diferentes tipos sanguneos. Em protenas que se destinam a serem incorporadas em
lisossomas, vai haver fosforilao da manose. Para que isto ocorra, primeiro adicionam-se
fosfatos de N-acetilgucosaminas a manoses especficas. Quando se remove a Nacetilglucosamina, a manose torna-se manose-6-fosfato. Esta manose fosforilada
reconhecida pelo seu receptor na fase trans do Golgi que ir direccionar o transporte
destas protenas para lisossomas.

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Sntese de esfingomielina e glicolpidos


Tanto a esfingomielina como os glicolpidos so formados a partir da ceramida no Golgi.
A esfingomielina sintetizada atravs da transferncia de um grupo de
fosforilcolina de uma fosfatidilcolina para a ceramida
Os glicolpidos so sintetizados atravs da adio de hidratos de carbono
ceramida

Vias de secreo no Golgi


Estas vias podem ser:
Constitutiva envia os componentes necessrios formao dos diferentes organitos
(esto envolvidas na formao de vesculas de transporte); leva secreo contnua e
descontrolada de protenas (por exemplo, nos domnios basolateraisda membrana
citoplasmtica das clulas epiteliais)
Regulada o contedo armazenado em vesculas secretoras para depois ser libertado
por exocitose. Esta secreo s ocorre aps um estmulo (como por exemplo, uma
hormona neurotransmissora) da membrana plasmtica; protenas especficas so
secretadas em resposta a sinais do meio
Lisossomas
Os lisossomas so organelos envolvidos por membranas que contm uma enorme
variedade de enzimas capazes de hidrolisar todos os tipos de polmeros biolgicos. Esto
envolvidos em processos de endocitose e autofagia.
Os lisossomas iro adquirir enzimas hidroflicas, bombas protnicas de vesculas
provenientes das TGN (trans golgi network) ou por fuso com vesculas endocticas.
Os lisossomas ainda iro conter hidrolases cidas, que so direccionadas para os
lisossomas atravs de resduos de manose-6-fosfato, sendo reconhecidas por receptores
da manose-6-fosfato. Uma das alteraes durante a maturao dos endossomas a
diminuio do pH interno, o que vai activar as hidrolases cidas, j que vai permitir a
dissociao destas dos receptores, sendo as hidrolases libertadas para o lmen do
endossoma. Atravs disto, pode-se verificar a forma como os lisossomas vo relacionar a
via secretria com a via endoctica e como so importantes para o aproveitamento das
macromolculas endocitadas pela clula.
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Aula 11
11) Trfego intracelular: direccionalidade do transporte via vesculas
O primeiro passo no transporte de vesculas a sua formao a partir de invaginaes da
membrana citoplasmtica. A superfcie exterior da membrana da vescula revestida por
determinadas protenas que se pensam ser factores de conduo da vescula at ao local
de chegada pretendido.
Transporte antergrado transporte do RE (reculo endoplasmtico) para o complexo
de Golgi
Transporte retrgrado transporte do Golgi para o RE

Coat Proteins
Protenas que esto nas
membranas das vesculas
ou as envolvem

Envolvida por Clatrina


Vesculas de secrao
regulada nas quais as
substncias foram
criteriosamente
guardadas

Transporte
memb. plasmticaendossoma
Golgiendossoma
Lisossomavacolo
Golgi (face trans)lisossomas

COP (COat Protein)

COP I
Transporte retrgrado
GolgiRE

COP II
Transporte antergrado
REGolgi

As vesculas intracelulares detm vrias funes muito importantes na vida e metabolismo


celulares: digesto de molculas, transporte e distribuio de molculas, armazenamento
de enzimas, locais onde ocorrem reaces qumicas especficas. As vesculas so originadas
a partir no complexo de Golgi, retculo endoplasmtico ou membrana plasmtica.
a) Vesculas revestidas por clatrina
Esta capa composta por dois complexos proteicos diferentes:
clatrinas (no lado exterior da membrana da vescula)
adaptadores proteicos (no lado citoslico da vescula)
O processo decorre da seguinte forma (exemplo de um transporte de protenas do
complexo de Golgi para lisossomas):
Protenas que sofreram processos de maturao no complexo de Golgi esto
prontas a ser utilizadas em lisossomas
Ligam-se manose-6-fosfato que se encontra na membrana da face trans do
Golgi
Adaptadores proteicos como AP-1 (adaptor protein-1) ligam-se a receptores da
manose-6-fosfato e a clatrina liga-se a iniciando uma rede que vai revestir
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uma vescula do Golgi contendo as


protenas funcionais destinadas ao
lisossoma
A formao da vescula com clatrina requer
dinamina que juntamente com uma
hidrlise de um GTP provoca uma toro
que obriga a vescula a separar-se num
corpo nico.

Funes da clatrina:
Providenciam um eficiente processo para transportar macromolculas
especficas do meio extra para o meio intracelular
Identificar alguns receptores
Seleco macromolculas especficas para transportar para dentro da clula
Proporcionam um transporte extremamente selectivo.

b) Vesculas revestidas por COPs


Estas tambm induzem a formao da vescula, tal como a clatrina.
Para que o processo de revestimento de vesculas por protenas COP se efectue
necessria a presena de trs elementos: COP (I ou II), adaptadores proteicos e
protenas ligveis a GTP (com a mesma funo que a dinamina)
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i)

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Vesculas revestidas por COP I


Transporte retrgrado (Golgi - Retculo endoplasmtico)
Elementos intervenientes: COP I, adaptadores proteicos, protenas ligveis a
GTP: ARF (ADP-ribosylation factor)
Processo:
o Associao do ARF com GDP na membrana do Golgi
o Protenas do Golgi promovem a substituio do GDP por GTP
o Protenas COPI ligam-se ao complexo ARF/GTP
o Invaginaes da membrana ocorrem com posterior revestimento por
um casaco de COPI
o A hidrlise do GTP converte ao estado inicial que ARF/GDP o que
leva perda do revestimento de COPI. Esta catalizada por uma
protena enzimtica
ARF varia entre os estados
o ligado a GDP: ligao membrana do Golgi
o ligado a GTP: ligao s COPI
As vesculas COP I transportam protenas que contenham a sequncia
denominada KDEL. As protenas que no a tm so transportadas para a face
cis do Golgi.

ii) Vesculas revestidas por COP II


Transporte antergrado (Retculo endoplasmtico - Golgi)
Elementos intervenientes: COPII, adaptadores proteicos, protenas ligveis a
GTP: Sar-1
O processo praticamente o mesmo mudando apenas os intervenientes. Sar-1
tambm varia entre os estados ligado a GDP ou ligado a GTP.
c) Endocitose e formao de lisossomas
Os lisossomas so organelos celulares das clulas eucariticas que contm enzimas
digestivas destinadas a fragmentar macromolculas
So originados a partir do complexo de Golgi com pH = 4,8, ou seja, mais cido do
que o pH citoslico (7)
As enzimas lisossomais so na sua maioria hidrolases cidas que s esto activas
apenas em pH cido (assim, mesmo que a membrana dos lisossomas se rompa no
h perigo para o meio intracelular pois este no tem o pH adequado aco
destes compostos)
i)

Formao de lisossomas
A partir da fuso de vesculas da face trans do golgi com endossomas que contm
molculas endocitadas para o interior da clula. Cruzamento entre a via de
secreo celular e a via endoctica.
Pormenorizando:
Formao de uma vescula endoctica revestida por clatrina
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Fuso da vescula com um endossoma precoce (cuja membrana muito


semelhante citoplasmtica)
Componentes das membranas excedentes so reciclados
Endossoma precoce matura para endossoma tardio (precursor do lisossoma),
havendo acidificao do meio interno durante esta maturao
Hidrolases presentes no complexo de Golgi so dirigidas ao lisossoma por
revestimento com clatrina, havendo posteriormente perda do revestimento
Fuso das vesculas descritas com o endossoma tardio (o pH cido faz com que
as hidrolases transportadoras se dissociem da manose-6-fosfato proveniente
da vescula revestida por clatrina e os receptores dessa manose so reciclados
no Golgi)

d) Endocitose mediada por receptores (vesculas de clatrina)


Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1304.html
Esta endocitose destina-se a molculas especficas e muito selectiva. A endocitose de
molculas de colesterol em mamferos um modelo chave para perceber este
processo, nomeadamente do LDL

Colesterol

LDL (Low Density Lipoprotein)


Deposita-se nos vasos
HDL (High Density Lipoprotein)
No se deposita nos vasos

Uma molcula de LDL - uma molcula que circula e contm:


No interior: 1500 molculas de colesterol
No exterior: 500 molculas de colesterol, 800
molculas de fosfolpidos, 1 molcula de apoprotein
B100
Processo:
Ligao do LDL a receptores especficos que esto
concentrados em regies especializadas da
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membrana plasmtica conhecidas por clatrin-coated pits


Internalizao do LDL por endocitose
O receptor reciclado pela membrana plasmtica
LDL transportado para o endossoma precoce e, posteriormente, para o
endossoma tardio em vesculas maiores que se movem pelos microtbulos
Vesculas transportadoras de hidrolases do complexo de Golgi fundem-se ao
endossoma tardio que matura para lisossoma onde o LDL degradado e o
colesterol libertado

e) Reciclagem de vesculas sinpticas


A chegada de um potencial de aco parte terminal da maioria dos neurnios sinaliza
a fuso de vesculas sinticas com a membrana plasmtica das clulas ps-sinpticas
Processo:
A vescula sinptica funde-se com a membrana plasmtica
recuperada por endocitose (numa vescula revestida por clatrina)
Vescula endoctica funde-se com o endossoma precoce
Vescula sinptica regenerada por invaginaes deste endossoma e carregada
novamente de neurotransmissores que se encontrem livres no citosol.

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f)

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Transcitose: transporte para a membrana plasmtica de clulas polarizadas


Este processo consiste no transporte intracelular de macromolculas para domnios
diferentes da clula. Assim, o material interiorizado por um lado da clula atravessam
o citoplasma e sai por exocitose do lado oposto.
Processo (exemplo numa clula epitelial):
Uma protena destinada ao domnio apical da membrana plasmtica
transportada a partir do complexo de Golgi para o domnio basolateral
endocitada e selectivamente transportada para um endossoma precoce
finalmente transportada para o domnio apical
Ex: o vrus Influenza (vrus da gripe) sofre transcitose em clulas polarizadas.

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g) Caveolina e os caveolae
Caveolae: pequenas invaginaes da membrana plasmtica em forma de cesto, muitas
vezes repetidas, de dimetro 50 a 80 nm, ricos em rafts lipdicos com colesterol e
esfingolpidos. Possuem um revestimento distinto formado por protenas designadas
caveolinas. Os caveolae esto envolvidos em processos de sinalizao celular e
endocitose sem recorrer clatrina. So muito comuns nas clulas intestinais.

h) Fuso de vesculas: a hiptese SNARE


Segundo a hiptese SNARE, a fuso de vesculas mediada por interaces entre pares
especficos de protenas transmembranares chamadas SNARE (soluble Nethymaleimide-sensitive factor (NSF) attachment protein receptors) na vescula e na
membrana alvo.
v-SNARE tipo de protenas que est na membrana vesicular mal ela se forma no
organito dador que orienta a vescula para o seu destino (existem vrias v-SNARES,
cada uma especfica)
t-SNARE protena que est na membrana do organito receptor (membranas
alvo/target), recebendo a v-SNARE (so especificas para uma determinada vSNARE)
Processo:
Ligao de vescula com v-SNARE Rab correspondente, formando um complexo
v-SNARE/Rab, deslocando-se depois para uma vescula com t-SNARE
Ligao do complexo v-SNARE/Rab t-SNARE forma o complexo SNARE/SNARE (a
formao do complexo SNARE/SNARE fornece energia suficiente para aproximar
as membranas das vesculas, destabilizando-as)
Ocorre a fuso
Recrutamento do NSF/SNAP para a membrana para ajudar a vescula a fundir-se
com a membrana-alvo (este complexo actua depois da fuso para dissociar o
complexo SNARE/SNARE, permitindo reutilizao)
Dissociao do SNARE/SNARE
v-SNARE e t-SNARE livres para recomear o processo
Protenas Rab
Encontram-se no citosol ou associadas fase citoslica das membranas dos
organitos envolvidos no transporte intracelular
So a fonte de especificidade do transporte, induzindo o transporte das vesculas
ao respectivo destino
Existem vrios tipos de Rab
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O seu verdadeiro papel facilitar e catalisar as interaces entre as v e t-SNARES
Uma protena Rab ou uma combinao de Rabs marcam diferentes organelos
celulares e transportam diferentes vesculas. Assim, a sua localizao correcta na
respectiva membrana a chave para estabelecer um transporte vesicular
especfico
As Rab so transportadas no citosol e:
o So activas quando ligadas a GTP
o So inactivas quando ligadas a GDP
Exemplos
o A Rab 5 especfica da fuso entre a v-Clatrina e o endossoma precoce
o A Rab 7 especfica da fuso entre o endossoma tardio e o endossoma
precoce ou outro tardio
o A Rab 9 especfica da fuso entre o endossoma precoce e a face trans do
Golgi
o A Rab 11 especfica da fuso entre a faze trans do golgi e a parte apical
ou basolateral das clulas.

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Aula 12
12) Endocitose, fagocitose e autofagia
A endocitose divide-se em trs formas:
a) Endocitose (visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1303.html)

i)

Pinocitose
Ingesto de fluidos
Induzida por protenas, aminocidos e ies
Apresenta semelhanas com a fagocitose
Ocorre uma invaginao da membrana
plasmtica, formando-se uma vescula pinoctica
Transporte a curta distncia

ii) Endocitose mediada por receptores


a forma mais caracterstica de pinocitose e
permite
a
captao
selectiva
de
macromolculas especficas
As macromolculas ligam-se inicialmente
a receptores especficos da superfcie
celular.
Estes
receptores
esto
concentrados em zonas especficas da membrana plasmtica regies
cobertas por clatrina (protena)
Estas regies formam pequenas vesculas revestidas por clatrina que contm
os receptores e delimitam as macromolculas
As vesculas revestidas por clatrina fundem com endossomas precoces,
processo mediado por Rab-GTPases (binding proteins protenas Rab ligadas a
GTP)
A clatrina reciclada para a parte citoslica da membrana plasmtica
As substncias constituintes do fluido extracelular so distribudas para os
endossomas tardios, que se fundem com vesculas provenientes do trans-Golgi
As macromolculas so degradadas pelos lisossomas

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Os receptores que no sofrem reciclagem so, tambm, incorporados com as


macromolculas nos endossomas tardios e degradados pelos lisossomas
transcitose
Para compreender melhor este processo de endocitose, temos como exemplo
a internalizao do LDL (lipoprotenas de baixa densidade), cuja digesto
resulta na libertao do colesterol
Exemplo: internalizao do LDL
O LDL ligado ao seu receptor inserido em vesculas cobertas por clatrina
que soltam as clatrinas a elas ligadas e posteriormente se fundem com
endossomas precoces
O pH dos endossomas precoces cido e o LDL dissocia-se dos seus
receptores
O LDL transportado dos endossomas precoces para os tardios em
grandes vesculas que se movimentam atravs de microtbulos
As vesculas que tm enzimas hidrolticas/lisossomais do complexo de
Golgi fundem-se com os endossomas tardias, que se transformam em
lisossomas
Nos lisossomas o LDL degradado e o colesterol libertado
O receptor do LDL reciclado a partir dos endossomas precoces para a
membrana plasmtica
iii) Fagocitose
As clulas envolvem grandes partculas, como
bactrias ou restos celulares
A ingesto (fagocitose) ocorre pela interaco
sequencial da membrana, nomeadamente dos
seus receptores, com a superfcie da partcula.
Entre os receptores, destacam-se os da fraco Fc
das imunoglobolinas (FcR) e os do complemento
(CR). A existncia destes receptores facilita s
molculas (imunoglobulinas e complemento) a
ingesto de partculas. Estes receptores
designam-se por opsoninas
A ligao de uma partcula aos receptores da
superfcie de uma clula fagoctica leva emisso
de pseudpodes movimento da superfcie
celular mediado por filamentos de actina e
miosina
Os pseudpodes circundam as partculas e as suas membranas fundem-se para
dar origem a um fagossoma
Os fagossomas associam-se a microtbulos e migra dentro de clula e sofrem
um processo de maturao sequencial que depende da interaco do vacolo
fagoctico, com vesculas intracelulares pr-existentes (endossomas) e com
lisossomas. Este processo regulado por GTPases e Rab
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o
o
o

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Rab5 Dirige o trfego intracelular


TfR (receptor da transferrina) marcador da fase precoce
Lamp1 marcador do lisossoma (condensa as protenas para que elas
no estejam no seu estado activo).

No endossoma tardio o interior da vescula vai acidificando medida que matura


(esta acidificao auxiliada pelas bombas protnicas)
Os fagossomas fundem-se com os lisossomas, originando fagolisossomas, nos
quais o material ingerido digerido por aco das hidrolases cidas dos
lisossomas (enzimas lisossomais)
Durante a maturao do fagolisossoma algumas protenas da membrana
envolvida so recicladas para a membrana plasmtica.
A fagocitose uma funo de dois tipos de glbulos
Fagcito
brancos: macrfagos e neutrfilos fagcitos
profissionais. Ambos os fagcitos eliminam
microrganismos de tecidos infectados. Os neutrfilos Neutrfilo
so clulas de vida curta, que depois de circularem na
corrente sangunea, durante algumas horas, sofrem
apoptose e so removidas pelos macrfagos. Os
macrfagos eliminam clulas exaustas ou mortas de
Macrfago
tecidos.

Esquema

O modelo de maturao nos fagcitos designa-se por kiss and run e tem por
base a fuso de um endossoma precoce com o lisossoma precoce, aps a partcula
ter sido envolvida por emisso de pseudpodes. Posteriormente, a maturao
continua com a aco das GTPases e Rab.

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Nota: a sequncia dos acontecimentos da imagem da direita faz-se no sentido dos


ponteiros do relgio, iniciando no moldurado
A endocitose tem trs caminhos que levam aos lisossomas: endocitose, fagocitose e
autofagia

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Endocitose
Nota: Lisossomas: Organelos envolvidos por membranas que contm uma variedade
de enzimas capazes de hidrolisar todos os tipos de polmeros biolgicos protenas,
cidos nucleicos, carbohidratos e lpidos (funcionam como um sistema digestivo da
clula, degradando material captado no exterior da clula e digerindo componentes da
prpria clula). So formados pela fuso de vesculas de transporte, provenientes do
trans-Golgi, com os endossomas que contm molculas captadas por endocitose na
membrana plasmtica
o O material do exterior captado em vesculas endocticas cobertas por clatrina
e depois fundem-se com os endossomas precoces
o Os componentes da membrana so reciclados para a membrana plasmtica e
os endossomas precoces maturam, gradualmente, em endossomas tardios,
que so precursores dos lisossomas

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Durante a maturao do endossoma a diminuio do pH interno para cerca de 5,5


que tem um papel-chave na entrega de hidrolases cidas lisossomais da rede de transGolgi
o As hidrolases cidas so direccionadas para os lisossomas atravs de resduos
de manose-6-fosfato, que so reconhecidos por receptores de manose-6fosfato da rede de trans-Golgi e envolvidos em vesculas cobertas por clatrina
o Aps a remoo do revestimento de clatrina, essas vesculas de transporte
fundem-se com endossomas tardios, e o pH cido interno leva as hidrolases a
se dissociarem dos receptores de manose-6-fosfato
o As hidrolases so ento libertadas para o lmen do endossoma, enquanto os
receptores permanecem na membrana e so eventualmente reciclados para o
Golgi
o Os endossomas tardios amadurecem, ento, quando adquirem um
complemento cheio de hidrolases cidas, que digerem as molculas
originalmente captadas por endocitose.

Autofagia
A autofagia induzida e, de seguida, surge uma dupla membrana, no citosol, que
cresce e envolve uma poro do citoplasma, incluindo mitocndrias, ribossomas e
protenas, componentes estes que vo ser posteriormente degradados. Ainda hoje no
se sabe ao certo a origem desta dupla membrana, mas foi convencionado que a
mesma tem origem na membrana do retculo endoplasmtico.

Aps os componentes terem sido envolvidos, forma-se um autofagossoma ou vescula


autofgica. Este autofagossoma dirige-se at ao lisossoma (depsito de resduos e
centro de reciclagem da clula) com o qual se funde, libertando o seu contedo no
interior do lisossoma, para posterior degradao por parte das vrias enzimas
lisossomais.

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Paralelismo entre fagocitose e autofagia

Na fagocitose grandes partculas (como bactrias) so captadas para dentro de


vacolos fagocticos ou fagossomas. Na autofagia, organelos internos (como as
mitocndrias) so envoltas por uma dupla membrana do RE, formando
autofagossomas. Tanto os fagossomas como os autofagossomas, fundem-se com
lisossomas para formar grandes fagolisossomas, nos quais o seu contedo digerido.

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Clulas fagocticas
As clulas fagocticas tm actividade como:
o Quimiotaxia: so atradas por microorganismos atravs de qumicos (ex:
microbianos)
o Adeso: aderem aos microorganismos
o Internalizao: estendem projeces que envolvem o organismo de modo a
interniz-lo
Existem organismos intracelulares que foram a fagocitose. Por exemplo, a Salmonela
e a Shigella injectam molculas que modificam o citoesqueleto de actina e as clulas
passam a emitir pseudpodes, eliminando estes patogenes.
Por outro lado, existem bactrias que sobrevivem por conseguirem evitar a fagocitose.
Uma delas a Yersina, que injecta componentes que neutralizam o citoesqueleto de
actina impedindo a produo de fagossomas (macrfagos).

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Tuberculose
o O bacilo da tuberculose sobrevive dentro do macrfago, uma vez que
consegue inibir a fuso da membrana que une o fagossoma macrfago,
como o lisossoma. Desta forma, em vez de ser destrudo, o organismo
envolvido sobrevive e multiplica-se com o macrfago.
o Este bacilo, alm de bloquear a actina, produz catalases e peroxidases que
resistem aos radicais livres emitidos pelos receptores da superfcie celular. Os
receptores FC fraco constante das imunoglobulinas, e C3R, induzem a
formao de radicais livres, os quais matam em segundos os bacilos
fagocitados. No entanto, a quantidade de radicais libertada aquando do
contgio no suficiente para matar 100% dos bacilos, a no ser que os
macrfagos estejam activados pelo IFN interfero .

Parasitas que sobrevivem intracelularmente

Bloqueiam a
maturao

Ficam num
vacolo RE like

Microbactrias
Salmonella

Clamdia
Brucella

Escapam do
fagossomo para o
citosol
Shigella
Listeria

Leishmania
(promastigotas)

Legionella

Vaccinia

Resistem ao
lisossoma
Coxiella
Leishmania
(amastigostas)

Tocoplasma gondi

Explorao das vias de autofagia para a destruio do bacilo da tuberculose


o Um sinal relacionado com um ambiente de stress conduz induo da
autofagia e captao de componentes citoslicos dentro de autofagossomas
o Estes autofagossomas fundem com uma membrana vacuolar, onde o
contedo degradado. Esta via conduz morte intracelular do bacilo da
tuberculose.

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Papel da actina nas fases tardias da fagocitose/movimento de vesculas


o Modelo actin track
A aproximao das vesculas, para posteriormente se fundirem ou tocarem
para troca de componentes feita por filamentos de actina.

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Aula 13
13) Organizao funcional do ncleo e transporte ncleo-citoplasma
a) Ncleo
i) Estrutura e funo

O ncleo celular contm o DNA da clula e constitui-se como o centro de controle


celular, permitindo que a expresso gentica seja regulada por mecanismos
anteriores transcrio (devido ao invlucro nuclear) e, ao limitar o acesso de
protenas ao material gentico, controlando tambm a expresso gentica ao nvel
da transcrio.
Sendo delimitado pelo invlucro nuclear, que separa os componentes do ncleo
dos do citoplasma, este organito celular comunica com o citoplasma atravs de
complexos de poros nucleares que se formam a partir da fuso da membrana
externa e interna do invlucro nuclear.
O interior do ncleo composto pelo nucleoplasma, um lquido altamente viscoso
semelhante ao citoplasma, contendo cromossomas e o nuclolo.
Os cromossomas contm informao gentica DNA associada a histonas e a
protenas no histnicas, formando a cromatina. O nuclolo uma subestrutura
proeminente que se constitui como o stio de transcrio e processamento do
rRNA e de juno do ribossoma (fbrica de produo de ribossomas para
responder necessidade de produo de RNAs ribossomais e juntar as
subunidades ribossomais).
ii) Nucleosqueleto ou matriz celular
A matriz nuclear uma estrutura residual
complexa obtida a partir de ncleos aps
tratamento com:
o Altas concentraes de sais (0.25M
sulfato de amnia)
o Detergentes no-inicos
o DNAase

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As matrizes assim obtidas, tambm denominadas nucleosqueletos, alm de
funcionarem como o citoesqueleto do ncleo so o suporte de toda a funo
nuclear, tendo uma capacidade de sntese de DNA e de RNA comparvel dos
ncleos intactos, o que comprova a ntima relao entre as actividades de
replicao e transcrio e a matriz nuclear.

iii) Ncleo como organito organizado


O ncleo tem uma estrutura interna que organiza o material gentico e localiza
algumas funes nucleares em stios distintos. Apesar de no haver separao
atravs de membranas ou vesculas existem territrios funcionais para:
o Organizao de cromossomas/diviso
o Replicao do DNA
o Transcrio
o Processamento dos RNAs (splicing)
o Produo de rRNAs (nucleolo)
Alguns dos micro-domnios funcionais do ncleo so: eucromatina e
heterocromatina, locais de replicao, maturao dos RNAs, corpos de Cajal e
nuclolo.
iv) Eucromatina e heterocromatina
As molculas de DNA encontram-se no ncleo
associadas a protenas (histonas), formando a
cromatina.
A heterocromatina distribui-se preferencialmente pela periferia do ncleo, junto
ao invlucro nuclear, periferia do nuclolo e, algumas vezes em massas dispersas
no nucleoplasma. Permanece altamente condensada no sendo transcrita e
contendo sequncias de DNA muito repetitivas. A heterocromatina bem visvel
ao microscpio.
Em contraste, a eucromatina relativamente descondensada distribuindo-se por
todo o ncleo. Os genes so transcritos e o DNA replicado.
v) Organizao de cromossomas
Cromossomas individuais ocupam territrios distintos dentro
dos ncleos de clulas de mamferos. Os cromossomas ocupam
territrios distintos, separados por domnios intracromossomais
nos quais se acredita que o processamento e o transporte do
RNA ocorram.
vi) Stios agrupados de replicao do DNA
Os ncleos das clulas dos mamferos contm stios de
replicao de DNA agrupados, dentro dos quais ocorre a
replicao de mltiplas molculas de DNA que tm sido
identificados atravs de inmeras experincias,
nomeadamente pela marcao de clulas com
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bromodeoxidurina que incorporada no lugar da timina permitindo a deteco de


DNA recm-sintetizado pela imunoinfluorescncia aps adio de anticorpo contra
a bromodeoxidurina.
Pela imagem, a replicao de DNA d-se em quase todo o ncleo sendo que,
parece ocorrer grandes estrutura contendo complexos de replicao que se
organizam em domnios funcionais fbricas de replicao.
vii) Locais de componentes de splicing
Genes activamente transcritos esto distribudos por
todo o ncleo, no entanto componentes de splicing
esto concentrados em domnios distintos. Em vez de
estarem localizados uniformemente em todo o ncleo
estes componentes esto concentrados em 20 a 50
estruturas distintas pontos nucleares.

viii) Corpos de Cajal


Os corpos de Cajal ou corpos espiralados so
estruturas de fibrilas entrelaadas existentes
perto do nuclolo, ricos em RNPs nucleolares
e funcionam como stio de reunio de uma
pequena RNP nucleolar. Todos os snRNP na
reaco de splicing se concentram nestes
domnios, logo, supe-se que os corpos
espiralados estejam envolvidos no ciclo do
spliceossoma.
ix) Estrutura do nuclolo
Morfologicamente os nuclolos so compostos de
trs regies diferentes: centro fibrilar, componente
fibrilar densa e componente granular (acredita-se
que estas diferentes regies representam stios de
estgios progressivos da transcrio, processamento
e juno ribossomal do rRNA. Os cromossomas
nucleolares apresentam uma regio especfica que
corresponde a uma sequncia nucleotdica de rRNA
regio do organizador nucleolar (NOR), na qual se
localizam genes ribossomais. a partir das NOR que
se inicia a formao de nuclolos durante a
transcrio (rDNA -> rRNA). As primeiras molculas
sintetizadas acumulam-se volta das NOR originando uma parte mais clara e
granulo-fibrilar centro fibrilar, onde esto alojadas as NOR.

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x) Transcrio dos genes de rRNA


Cada regio de organizao
nuclear contm um grupo de
genes de rRNA repetidos em
srie que so separados um do
outro por DNA espaador no
transcrito. Cada um dos genes
dispostos em srie circundado
por cadeias de RNA em
formao,
formando
uma
estrutura que parece uma
rvore de Natal.
A transcrio dos genes de rRNA ocorre no limite entre o centro fibrilar e o
componente fibrilar denso. Neste inicia-se o processamento de pr-rRNA que
termina na componente granular, onde as protenas ribossomais de unem ao
rRNA.
xi) Processamento do pr-rRNA
O processamento do
pr-rRNA requer a
aco de protenas e
RNAs localizadas no
nuclolo. Os nuclolos
contm
grande
quantidade
de
pequenos
RNAs
nucleolar que actuam
no processamento do
pr-rRNA.
O transcrito do pr-rRNA ento, processado atravs de uma srie de clivagens
para produzir RNAs ribossomais maduros, estas clivagens encontram-se
responsabilidade dos pequenos RNAs nucleolares.
Aps a transcrio do rRNA, este associado a protenas e h uma acumulao de
partculas de ribonucleoprotenas na componente granular, estas partculas vo,
depois, ser transportadas separadamente atravs de complexos de poros
nucleares.
xii) Unio de ribossoma
A formao de ribossomas envolve a unio de RNA ribossomal com protenas
ribossomais e com rRNA 5S. Os genes que codificam as protenas ribossomais so
transcritos fora do nuclolo, produzindo RNAs mensageiros que so traduzidos em
ribossomas citoplasmticos. As protenas ribossomais so transportadas do
citoplasma para o nuclolo, onde se juntam com os RNAs ribossomais para formar
partculas pr-ribossomais. Os RNAs ribossomais 5S so, ento, unidos em
partculas pr ribossomais dentro do nuclolo. Esta juno de protenas
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ribossomais com o rRNA inicia-se ainda enquanto o pr-rRNA est a ser


sintetizado. Algumas destas protenas juntam-se ao rRNA ainda antes da sua
clivagem, sendo que, as restantes de unem j durante a clivagem do rRNA.

As partculas pr-ribossomais amadurecem e so transportadas para o citoplasma


em duas subunidades. a juno destas duas subunidades que torna o ribossoma
activo.
xiii) Invlucro nuclear
O invlucro nuclear tem
uma estrutura complexa.
Consiste
em
duas
membranas nucleares: a
lmina que envolve o
ncleo, e os complexos
de poros nucleares. O
ncleo envolvido por
um sistema de duas
membranas concntricas
membrana nuclear
interna e membrana
nuclear externa, sendo
que a membrana nuclear externa contnua ao retculo endoplasmtico (RE),
assim, o espao entre a membrana interna e externa do ncleo liga-se ao lmen
do reticulo endoplasmtico. A membrana externa do ncleo semelhante
funcionalmente membrana do RE e tem ribossomas ligados sua superfcie
citoplasmtica. Em contraste, a membrana interna transporta protenas
especficas do ncleo.
As membranas nucleares agem como barreira que separa os componentes do
ncleo dos do citoplasma, so bicamadas fosfolipdicas permeveis para pequenas
molculas no polares, sendo as restantes molculas incapazes de se difundirem
pela bicamada. A membrana externa e interna so unidas em complexos de poros
nucleares nicos canais atravs dos quais pequenas molculas polares e
macromolculas so capazes de atravessar o invlucro nuclear.
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xiv) Lmina nuclear


A lmina nuclear diz respeito a uma rede fibrosa que
fornece suporte estrutural ao ncleo. composta por
uma ou mais protenas lminas.
Todas as lminas esto relacionadas a protenas
filamentosas intermedirias do citoesqueleto. Assim,
associam-se umas com as outras para formar filamentos.

Passos para a associao de protenas:


o Interaco de duas lminas para formar um dmero, regies -helicais de duas
cadeias polipeptdicas esto enroladas corda enrolada.
o Os dmeros associam-se para formar filamentos que constituem a lmina
(associao cabea cauda para formar polmeros lineares e, depois
associao de polmeros lado a lado para formar filamentos). As laminas ligamse s protenas da membrana nuclear interna, que auxiliam a organizao dos
filamentos de lminas em rede e so responsveis por mediar as suas ligaes
membrana.
Para fornecer suporte estrutural ao ncleo acredita-se que a lmina seja um stio
de ligao de cromatina. A cromatina dentro do ncleo organiza-se em grandes
alas de DNA q parecem ligar-se ao invlucro nuclear, as lminas parecem mediar
essa interaco.

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xv) Complexos de poros nucleares


Os complexos de poros nucleares so os nicos
canais que permitem a deslocao entre o ncleo
e o citoplasma de pequenas molculas polares e
de macromolculas (protenas e RNAs) uma
estrutura grande (aprox. 30 vezes o tamanho de
um ribossoma). composto por 50 a 100 protenas
diferentes (nucleoporinas), tendo um papel
fundamental na fisiologia das clulas.
Os RNAs sintetizados no ncleo so eficientemente
exportados para o citoplasma, onde actuam na
sntese proteica. Em contraste, as protenas
necessrias para funes nucleares devem ser
transportadas para dentro do ncleo a partir dos
locais da sua sntese no citoplasma. Desta forma, o
trfego regulado de protenas e RNAs atravs dos
poros nucleares determina a composio do
ncleo e muito importante na expresso
gentica.
Os poros nucleares exportam, nomeadamente,
mRNAs, ribossomas e tRNAs e, importam:
histonas, enzimas, etc.
As molculas podem deslocar-se pelo poro de dois
modos, dependendo do seu tamanho. Molculas
pequenas e algumas protenas passam livremente
atravs do invlucro nuclear em qualquer sentido
difundindo-se passivamente atravs de canais
aquosos abertos. No entanto a maioria das
protenas e RNAs no conseguem passar atravs
desses canais, sendo ento deslocadas atravs dos
complexos de poros nucleares por transporte
activo. No qual as protenas apropriadas e RNAs
so reconhecidos e transportados selectivamente em apenas uma direco
(ncleo citoplasma ou citoplasma ncleo). Os complexos de poros em resposta
a sinais apropriados abrem com um dimetro relativamente grande. atravs
destes canais regulados que as protenas nucleares so importadas para o ncleo e
os RNAs so exportadas para o citoplasma.
Os complexos de poros nucleares tm uma simetria
ctupla ao redor de um canal central grande (local onde
as protenas e os RNAs atravessam o invlucro nuclear).
Assim, o CPN consiste na unio de 8 colunas de
sustentao arranjadas ao redor de um canal central,
estando essas colunas conectadas aos anis da superfcie nuclear e citoplasmtica,
e a reunio das colunas sustentao anel est ancorada dentro do invlucro nos
stios de fuso da membrana nuclear externa e interna.
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Os
filamentos
proteicos
estendem-se a partir de
ambos os anis. Filamentos
citoplasmticos estendem-se
a partir do anel citoplasmtico
e filamentos formando uma
estrutura
de
cesta
estendem-se a partir do anel
nuclear.

b) Transporte de protenas do ncleo e para o ncleo


i) Sinais de localizao nuclear
As protenas importadas do citoplasma para o ncleo so responsveis pela
estrutura e funo do genoma, por exemplo, histonas, DNA polimerases, RNA
polimerases, factores de transcrio, factores de splicing, etc. Essas protenas so
transportadas para o ncleo por sequncias de aminocidos especficas sinais de
localizao nuclear que direccionam o seu transporte atravs do complexo de
poros nucleares e que so reconhecidos por receptores localizados no poro
nuclear.
Os receptores podem ser de dois tipos:
o importinas (transporte de protenas do citoplasma para o ncleo receptores
de NLS nuclear locatization signal)
o exportinas (transporte de protenas do ncleo para o citoplasma receptores
de NES nuclear export signal)
O sinal de localizao nuclear do
antigene T no citoplasma definido
pela sequncia de 7 aminocidos,
numa sequncia no s necessria
para o seu transporte para o ncleo
mas tambm para a sua adio a
outras protenas. O sinal de
localizao nuclear da nucleoplasmina consiste em duas partes, diz-se bipartida.
Pores bipartidas semelhantes funcionam como sinais de localizao de muitas
protenas.
ii) Importao proteica atravs do complexo de poros nucleares
A importao proteica pode ser dividida em dois passos.
o No primeiro no requer energia:as protenas que contm sinais de localizao
nuclear ligam-se ao complexo de poros mas no passam atravs dele. Nesse
passo os sinais de localizao nuclear so reconhecidos por importinas, que se
dividem em duas sub-unidades, uma que se liga aos sinais de localizao e
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outra que se liga aos filamentos citoplasmticos do complexo de poros


conduzindo a protena alvo ao poro nuclear.
O segundo passo da importao proteica (que diz respeito translocao
atravs dos poros) depende de energia que requer a hidrlise de GTP. Uma
componente chave neste processo uma pequena protena Ran. As enzimas
que estimulam a ligao da GTP Ran encontram-se do lado nuclear do
invlucro nuclear enquanto as enzimas que estimulam a hidrlise de GTP
esto no lado citoplasmtico.

Ento, forma-se um gradiente Ran/GTP atravs do invlucro nuclear, com alta


concentrao de Ran/GTP no ncleo e alta concentrao de Ran/GDP no
citoplasma. Esse gradiente determina a direco do transporte nuclear e a
hidrlise de GTP pela Ran responsvel pela maioria da energia necessria para a
importao nuclear.
Inicialmente forma-se um complexo entre protenas-alvo, importina e importina
no citoplasma onde a Ran se liga ao GDP, segue-se o transporte atravs do poro
nuclear a Ran/GTP liga-se importina e liberta-se a importina e a protenaalvo dentro do ncleo. A Ran/GTP importina deslocam-se novamente para o
citoplasma onde a protena activadora Ran GTPase estimula a hidrlise da
Ran/GTP formando Ran/GDP e libertando a importina.

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iii) Exportao nuclear


As protenas so marcadas para exportao por sequncias especificas de
aminocidos sinais de exportao nuclear. Estes sinais so reconhecidos por
exportinas.
Complexos entre protenas-alvo
(portadores de sinais de
exportao nuclear), exportinas
e Ran/GTP formam-se no
ncleo. Aps o transporte
atravs do poro nuclear a Ran
GAP estimula a hidrlise da GTP
ligada levando formao de
Ran/GDP e libertao da
protena-alvo no citoplasma.
Aps este processo, a exportina
regressa ao ncleo.

Existem aproximadamente 9 diferentes importinas e 5 diferentes exportinas


capazes de reconhecer os diferentes sinais:

c) Ncleo durante a mitose


O ncleo desmonta-se e forma-se novamente cada vez que as clulas se dividem. No
comeo da mitose, os cromossomas condensam-se, o nuclolo desaparece e o
envelope nuclear rompe-se (Profase), a maioria das componentes libertam-se para o
citoplasma. Na metfase os cromossomas alinham-se no centro do eixo, sendo,
depois, os cromossomas-filhos movidos para plos opostos do eixo (anafase). Depois,
no final da mitose ocorre o processo inverso, os cromossomas descondensam-se e os
invlucros nucleares formam-se novamente ao redor dos conjuntos separados dos
cromossomas-filhos (telofase). O processo controlado pela fosforilao e
desfosforilao reversveis das protenas nucleares.
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i)

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Condensao de cromossomas
A cromatina da interfase condensa-se para
formar os cromossomas compactos das
clulas mitticas. Esta condensao
necessria para permitir q os cromossomas
se movam ao longo do eixo mittico sem se
quebrarem durante a sua distribuio. O
DNA neste estado altamente condensado
no pode ser transcrito, sendo que a sntese
de RNA pra durante a mitose. Quando os cromossomas condensam e a
transcrio pra o nuclolo desaparece. As histonas atravs da sua fosforilao
contribuem para a condensao cromossmica nomeadamente as histonas H1 e
H3, sendo que a H3 mesmo imprescindvel para que haja condensao de
cromossomas. Existem tambm complexos proteicos condensinas que
funcionam pelo enrolamento de DA em volta de si mesmo, compactando os
cromossomas.

ii) Dissoluo da lmina nuclear

A lmina nuclear composta de protenas fibrosas laminas, que se associam


umas s outras formando filamentos. A dissoluo da lmina nuclear resulta da
fosforilao das laminas, que faz com que os filamentos se separem em dmeros
individuais de laminas. Esta fosforilao catalisada pela protena quinase Cdc2.
iii) Rompimento da membrana nuclear
Paralelamente com a dissoluo da lmina nuclear, a
membrana nuclear fragmenta-se em vesculas. Sendo que
um tipo de laminas permanecem associadas a essas
vesculas enquanto as restantes se dissociam da
membrana e so libertadas como dmeros no citosol. Os
complexos de poros tambm se dissociam em
subunidades como resultado da fosforilao de vrias
protenas do poro nuclear. Protenas integras da membrana tambm so
fosforiladas na mitose, o que importante para a formao de vesculas e para a
dissociao da membrana nuclear dos cromossomas e da lmina nuclear.
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iv) Reformao do envelope nuclear


O passo inicial da reformao do invlucro nuclear a ligao das vesculas
formadas durante o rompimento da membrana nuclear superfcie dos
cromossomas. Essa interaco de vesculas pode ser mediada por laminas e por
protenas integrais de membrana na membrana nuclear interna. Assim as vesculas
fundem-se para formar uma dupla membrana em redor dos cromossomas. Seguese a unio dos complexos de poros nucleares, nova formao da lmina nuclear e
descondensao cromossmica. As vesculas primeiro fundem-se para formar
membranas ao redor de cromossomas individuais que depois se fundem uns com
os outros para formar um ncleo nico completo.

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Aula 14
14) Sinalizao celular por receptores
Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1501.html
a) Etapas da sinalizao celular
Recepo do sinal: sinal qumico extracelular liga-se ao receptor da clula alvo
Transduo do sinal: passagem do sinal extracelular para intracelular
Resposta celular: resposta da clula ao sinal
b) Formas de sinalizao celular
i) Directa: ocorre quando 2 clulas esto muito prximas e os receptores entram em
contacto directo

ii) Secreo de molculas: um modo frequente, produzido um sinal que entra na


circulao at chegar clula alvo; um tipo de sinalizao feito distncia

iii) Endcrina
(1) Autcrina: a clula que produz o sinal a que vai receber

(2) Parcrina: o modo mais frequente, as duas clulas esto prximas; os sinais
so libertados no fluido extracelular das vizinhanas, ligando-se depois clula
alvo

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c) Molculas sinalizadoras
Hormonas adrenalina, cortisol, tiroxina
Factores de crescimento (GF growth factor) EGF(epidermal gf), PDGF(plateletderived gf), NGF(nerve gf)
xido ntrico ou monxido de azoto (NO)
Neurotransmissores acetilcolina
Antignios
Uma clula tm um elevado nmero de sinais, no entanto tem um nmero restrito de
receptores, o que faz com que a clula responda a um nmero limitado de sinais.

d) Complexidade da sinalizao celular


O mesmo sinal em diferentes clulas (portanto em diferentes receptores) induz
respostas diferentes nas clulas

Uma diferente combinao de sinais, numa mesma clula, gera uma diferente
resposta por parte da clula. Os sinais actuam em combinaes de modo a regular o
comportamento da clula.

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e) Cascatas de sinalizao
O receptor normalmente extracelular, mas nem sempre o
O receptor localizado na superfcie celular faz a transduo do sinal para um sinal
intracelular, iniciando uma cascata de sinalizao que transfere o sinal para o
interior da clula, amplificando-o e distribuindo-o ao longo da sua rota
Vrios passos da cascata de sinalizao podem ser modulados por outras
molculas ou eventos na clula. A cascata de sinalizao celular feita sobretudo
por protenas sinalizadoras que modulam o sinal

f)

Protenas sinalizadoras
Activadas por fosforilao
o O sinal entra e provoca a passagem do ATP para ADP atravs de uma
protena que se chama cinase e activa a resposta na clula
Activadas pelo GTP
o O sinal entra e faz com que o GDP passe a GTP o permite a activao da
resposta por parte da clula

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g) Receptores
i) Intracelulares
Pode ocorrer quando as molculas so pequenas e hidrofbicas
Hormonas esterides (ex: tiroxina ou estrognio): a hormona entre na
membrana e no citoplasma que se liga ao receptor mudando a sua
conformao. O complexo hormona/receptor ento transportado para o
ncleo atravs de poros nucleares

xido ntrico: o receptor acetilcolina liga-se ao receptor e d origem ao cido


ntrico que se difunde atravs das membranas que chega clula alvo.

ii) Da superfcie celular (mais comum, 99.9% dos casos)


A molcula sinalizadora quase sempre hidrofbica e no passa directamente
para dentro da clula
(1) Receptores acoplados a canais inicos
A molcula sinalizadora liga-se ao receptor e permite ou bloquia a passagem
de ies

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(2) Receptores acoplados a protenas G


Activa canais inicos ou enzimas

No caso ilustrado, o receptor atravessa a membrana 7 vezes em hlice


o Num estado no estimulado, o receptor e a protena esto inactivos
o Ao juntar um sinal extracelular ao receptor, a sua conformao muda,
que por sua vez muda a conformao da protena G que est ligada ao
receptor
o A alterao da subunidade alfa da protena G permite que o seu GDP
passe a GTP. Isto faz com que a protena G se divida em dois
componentes activos, uma subunidade alfa e um complexa beta gama.
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Ambos os componentes podem regular a actividade das protenas alvo
na membrana plasmtica. O receptor permanece activo enquanto o
sinal externo ficar ligado ao receptor, e pode catalisar a activao de
vrias molculas de protena G
(a) Protenas G Canais inicos

Ao ligar o neurotransmissor acetilcolina ao seu receptor ligado


protena G, em clulas do msculo cardaco, h a dissociao da
protena G no complexo e na subunidade
o O complexo activado liga-se e abre o canal de K+ na membrana
plasmtica das clulas do msculo cardaco
o A inactivao da subunidade causada pela hidrlise do GTP vai fazer
com que haja a reassociao desta subunidade com o complexo
para formar uma protena G inactiva, e assim permitir que o canal de
K+ feche
(b) Protenas G Enzimas
Cada enzima activada gera vrias segundas molculas mensageiras, razo
pela qual o sinal muito amplificado. O sinal vai passando atravs de
molculas mensageiras que se ligam a protenas alvo e a outras protenas
sinalizadoras na clula que influenciam a sua actividade, ou seja, geram
resposta celular

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(i) Adenililciclase

A adeniliciclase liga-se subunidade da protena G, gerando um


aumento do AMP cclico (2 mensageiro). Este vai activar uma cinase
A, que vai passar pelo poro para o ncleo. Esta fosforila uma protena
para que esta responda ao sinal.
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(ii) Fosfolipase C

So produzidas duas molculas mensageiras quando a membrana inositol fosfolpidica


hidrolisada pela activao da fosfolipase C. Inositol 1,4,5-trifosfato difunde-se
atravs do citosol e acciona a libertao do Ca2+ a partir do retculo endoplasmtico
pela ligao a para uma abertura especial de um canal de Ca2+ na membrana do
retculo endoplasmtico. O elevado gradiente electroqumico para o Ca2+ causa a
passagem do Ca2+ para o citosol. O diacilglicerol fica na membrana plasmtica e
juntamente com o Ca2+ ajuda a activao da protena cinase C (PKC) que recrutado
do citosol para a face citoslica da membrana plasmtica. O PKC depois fosforila um
conjunto de protenas alvo, dele prprio, propagando assim o sinal.
Nota: Calmodulina

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A molcula de calmodulina tem as duas extremidades globulares unidas por


uma alfa hlice longa e flexvel. Cada terminao tem dois domnios de ligao
do Ca2+
A partir da representao, visvel as alteraes com conformao

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(3) Receptores acoplados a enzimas

(a) Receptores cinases da tirosina

As duas molculas receptoras atravessam a membrana uma vez e esto separadas. A molcula
sinalizadora de domnio extracelular de um receptor tirosina kinase causa a associao das
duas molculas sinalizadoras num dmero. A formao do dmero faz com que o domnio
cinase de cada receptor se junte, o que provoca a activao das kinases e possibilita que estes
fosforilem em vrias zonas da cadeia de tirosina. Cada tirosina fosforilada serve como uma
zona especfica de ligao para uma diferente protena sinalizadora intracelular o que ajuda a
propagao do sinal no interior da clula
Ex:Activao da MAP cinase via RTK-Ras

Uma protena adaptadora liga-se a uma fosfatirosina especfica no receptor activado. O


adaptador recruta e estimula uma protena cmplice que funciona como uma activadora da
protena Ras. Por sua vez, esta protena estimula a Ras a mudar a zona com GDP por GTP. A
protena Ras activada percorre uma cascata de fosforilao de trs protenas cinases que
distribuem o sinal. A ltima cinase da cascata (MAP-cinase ou cinase III) fosforila vrias
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protenas alvo. Estas protenas alvo podem ser outras protenas cinases ou protenas
reguladoras de genes que regulam a expresso dos genes. Mudanas na expresso dos genes e
na actividade das protenas da origem a uma complexa mudana no comportamento celular
nomeadamente na proliferao e diferenciao celular.

(4) Receptores das citocinas, TFG, Hh, Wnt, Notch (apenas saber que existem e
que fazem parte dos receptores extracelulares)
h) Interaces entre as diferentes vias de sinalizao

O diagrama esquematiza as vias dos receptores ligados protena G atravs da adenilil


ciclase e atravs da e fosfolipase C e as vias dos receptores ligados a enzimas atravs
da fosfolipase C e atravs de Ras. As cinases nestas vias fosforilam vrias protenas,
incluindo protenas pertencentes a outras vias.
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i)

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Respostas celulares

Determinados tipos comportamento celular alterado, tais como o aumento do


crescimento e diviso celular envolve mudanas na expresso dos genes e na
sntese de novas protenas, portanto estes processo so relativamente lentos.
Outras respostas, tais como, mudanas no movimento, secreo ou metabolismo
celulares, no precisam de envolver os mecanismos nucleares e portanto ocorrem
mais rpido, estes envolvem a rpida fosforilao de protenas alvo no citoplasma
Transduo do sinal e citosqueleto
Sinalizao do desenvolvimento e diferenciao Ras/Raf/MAP; Hh e Wnt;
Notch
Regulao da morte celular programada (apoptose) envolve sinalizao
celular.

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Aula 15
15) Ciclo celular
a) Fases do ciclo celular
Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1601.html
O ciclo celular divide-se essencialmente em duas
partes: mitose e interfase. Mitose (diviso
nuclear) corresponde separao de
cromossomas filhos e normalmente termina
com a diviso celular (citocinese). No entanto, a
mitose e a citocinese duram apenas uma hora,
ento a clula est 95% do ciclo celular em
interfase perodo entre mitoses. Durante a
interfase os cromossomas so descondensados
e distribudos pelo ncleo, de modo que este
parea morfologicamente uniforme. No entanto,
a nvel molecular a interfase altura durante a
qual ocorre o crescimento da clula e replicao
celular, de modo a preparar-se a diviso celular.
A clula cresce at um estado de controlo na interfase;
O DNA sintetizado apenas numa parte da interfase;
A fase M do ciclo corresponde mitose qual normalmente se segue a
citocinese;
Fase G1 (gap 1) corresponde ao intervalo entre a mitose e a inibio da
replicao do DNA. Durante a G1 a celular activada metabolicamente e
cresce continuamente, mas no replica o seu DNA;
Fase S onde ocorre a replicao do DNA;
Fase G2 (gap2) fase durante a qual continua o crescimento celular e as
proteinas so sintetizadas na preparao para a mitose;
Para uma tpica clula humana o ciclo demora 24h (Fase G1 11h; Fase S
8h; Fase G2 4h e a mitose 1h);
Fase G0 (insere-se na fase G1, quando esta bloqueada) - em que as clulas
permanecem activas metabolicamente, mas no ocorre a proliferao da
clula, a no ser que sejam sinalizadas para tal, atravs de sinais
extracelulares apropriados.
b) Contedo em DNA
As clulas em diferentes estdios do ciclo celular podem ser
distinguidas atravs do seu contedo de DNA. Por exemplo, uma
clula animal em G1 diplide, o que significa que o seu contedo
de DNA de 2n. Durante a Fase S, a replicao do DNA aumenta a
quantidade de DNA para 4n, e assim se mantm pelas Fases G2 e M.
no entanto, diminui depois da citocinese, retomando o valor inicial
de 2n.

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c) Regulao por sinais extracelulares

A progresso das clulas durante o ciclo celular regulada tanto por sinais
extracelulares do ambiente circundante, como por sinais intracelulares;
Um exemplo de regulao por sinais extracelulares a recepo de um sinal
proveniente do efeito de crescimento celular de uma clula animal em
proliferao;
Diferentes processos celulares, como o crescimento das clulas, a replicao do
DNA, e a mitose, so coordenados durante a progresso do ciclo celular. Este facto
deve-se a vrios pontos de controlo que regulam a progresso das vrias fases do
ciclo celular;
O maior ponto de regulao ocorre em clulas que esto prestes a passar da Fase
G1 para a Fase S (este ponto ficou conhecido por START nas leveduras, chama-se
ponto de restrio nos animais)

Quando as clulas passam o START, elas esto prontas para entrarem na fase S e
consequentemente realizarem um ciclo de diviso celular.
Esta passagem bastante regulada por sinais externos, como a disponibilidade de
nutrientes e o tamanho da clula.
Quando as leveduras dispem de pouca quantidade de nutrientes, o seu ciclo
interrompido no START e entram numa fase de repouso em vez de prosseguirem
para a Fase S.
START representa um ponto de deciso onde a clula determina se existe a
quantidade de nutrientes suficiente para suportar a progresso do resto da diviso
celular.
Alm de ser um ponto de diviso, START um ponto onde a clula cresce
coordenadamente com a replicao do DNA e a diviso celular.
A importncia desta regulao do crescimento evitar a produo de clulas de
tamanhos diferentes: a clula me apresenta maiores dimenses que a clula
filha.
Esta regulao conseguida por um mecanismo de controlo que requer um
tamanho mnimo antes de ocorrer a passagem pelo START. Consequentemente, a
clula filha passa mais tempo em G1 e cresce mais do que a clula me.
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Ao contrrio das leveduras, a passagem das clulas animais ao longo do ciclo
celular regulada primeiramente por factores de crescimento extracelulares que
sinaliza a proliferao da clula, do que a disponibilidade de nutrientes.
Na presena de factores de crescimento apropriados, as clulas passam o ponto de
restrio e entram em fase S. Uma vez ocorrida esta passagem, as clulas esto
prontas para realizar a fase S e o resto da diviso celular, mesmo na ausncia de
estimulaes futuras dos factores de crescimento. Por outro lado, se os factores
de crescimento no esto disponveis em G1, a progresso do ciclo celular para no
ponto de restrio.
Esta fase de repouso denominada por fase G0, onde apesar de terem parado o
seu crescimento e a sntese de protenas, as clulas so metabolicamente activas.

As clulas continuaram em G0 at serem activadas para a proliferao por factores


de crescimento apropriados ou por outros sinais extracelulares.
Apesar da regulao da maior parte das clulas se realizar primeiramente em G1,
algumas clulas so controladas principalmente em G2. Como por exemplo as
leveduras Schizosaccaromyces pombe.
O ciclo celular da S. pombe regulado primeiramente pelo controlo de transio
da Fase G2 para a Fase M, considerado o ponto principal onde ocorre a
monitorizao do tamanho da clula e da disponibilidade de nutrientes.
No caso dos animais, um exemplo de controlo do ciclo celular em G 2 o ocito.
Visto que permanece em G2 durante um longo perodo de tempo e s entra na
Fase M depois de uma estimulao hormonal.
Sinais extracelulares podem controlar a proliferao da clula atravs da regulao
da progresso da Fase G2 para a Fase M, como tambm da fase G1 para a Fase S do
ciclo celular.

d) Pontos de controlo
Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1603.html
Os diferentes eventos que tomam lugar durante as fases do ciclo celular tm que ser
coordenadas umas com as outras para que ocorram numa ordem apropriada. Por
exemplo, importante que a clula no inicie a mitose sem antes tenha ocorrido a
replicao completa do genoma. Na maior parte das clulas, esta coordenao entre
as diferentes fases do ciclo celular dependente de uma srie de pontos de restrio
do ciclo celular que previnem a entrada na fase seguinte do ciclo celular at que os
eventos da fase actual estarem completos.
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Vrios pontos de restrio do ciclo celular tm


a funo de assegurar que no ocorra a
replicao de cromossomas danificados ou
incompletos e a sua passagem para as clulas
filhas. Estes pontos descobrem DNA danificado
ou no replicado e coordenam a seguinte
progresso do ciclo celular com a completao
da replicao do DNA ou a sua reparao. Por
exemplo, o ponto de restrio em G2 previne a
iniciao da mitose at que a replicao do
DNA esteja completa. Este ponto de restrio
em G2 descobre DNA no replicado, que gere
um sinal que leva paragem do ciclo celular. A operao do ponto de restrio em G2
previne ento a iniciao da fase M antes de se completar a fase S, assim a clula
permanece em G2 at replicao de todo o genoma. S depois se d a iniciao da
progresso da fase G2, permitindo a clula entrar em mitose e distribuir os
cromossomas completamente replicados pelas clulas filhas. O ponto de restrio em
G2 detecta o DNA danificado, como resultado, por exemplo, de uma radiao. Se este
DNA detectado, a paragem do ciclo celular neste ponto de restrio d tempo
suficiente para a reparao do dano, em vez de este ser passado para as clulas filhas.
O DNA danificado no parado somente em G2 do ciclo celular, mas tambm nos
pontos de restrio da fase G1 e da fase S. A paragem no ponto de restrio em G1
permite a reparao dos danos que ocorreram na clula antes desta entrar na fase S,
onde o DNA seria replicado. O ponto de restrio da fase S permite uma monitorizao
contnua da integridade do DNA para assegurar que DNA danificado seja reparado
antes de ser replicado. Este ponto de restrio tambm oferece uma qualidade de
controlo da monitorizao que promove a reparao de qualquer erro que ocorra
durante a replicao do DNA, como a incorporao incorrecta de bases ou a
incompleta replicao de segmentos de DNA.
As paragens nos pontos de restrio em G1, S, e G2 so mediadas por duas protenas
quinases, designadas ATM e ATR, que reconhecem o DNA danificado ou no replicado
e activas em resposta ao DNA danificado. A ATM e a ATR activam ento um caminho
de sinalizao que leva no s paragem do ciclo celular, como tambm a activao
da reparao do ciclo celular e, em alguns casos, a programao da morte da clula.
Outro importante ponto de restrio do ciclo celular que mantm a integridade do
genoma ocorre no final da mitose. Este ponto de restrio, denominado spindle
assembly checkpoint, monitoriza o alinhamento dos cromossomas na placa
metafsica, assegurando correcta distribuio de cromossomas para as clulas filhas.
Por exemplo, a falha de alinhamento de um ou mais cromossomas na placa
metafsica, antes da segregao dos cromossomas replicados para o ncleo das
clulas filha. Como resultado deste ponto de restrio (spindle assembly
checkpoint), os cromossomas no se separam at estarem todos bem organizados
para a distribuio pelas clulas filhas.

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e) Regulao do ciclo celular

f)

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Regulao do ciclo celular


O ponto de restrio do G2 previne a
iniciao da mitose antes da completao da
fase S, assim assegura a no distribuio de
DNA no replicado pelas clulas filhas.
igualmente importante para assegurar que a
replicao do genoma acontea apenas uma
vez por cada ciclo. Logo, uma vez que um
segmento de DNA replicado na fase S, tem
que existir um mecanismo de controlo que
impea uma nova replicao do mesmo
segmento at que o ciclo celular esteja
terminado e a clula atravessado a mitose.
O mecanismo molecular que restringe a
replicao do DNA, de modo a acontecer
uma vez por cada ciclo, envolve a aco de
protenas helicases MCM que se ligam
origem da replicao juntamente com a
origem do complexo de protenas de
reconhecimento (ORC). As protenas MCM
actuam como factores de licena que permitem o incio da replicao. A sua ligao

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ao DNA s possvel na fase G1 do ciclo celular, permitindo o arranque da replicao


do DNA quando a clula entra na fase S. Assim que se termine a replicao, as
protenas MCM so deslocadas da origem, para que a replicao no acontece at a
clula passar da fase da mitose e entrar em G1 do ciclo seguinte. A associao das
protenas MCM na fase S, G2 e M do ciclo celular bloqueada por protenas quinases
que regulam a progresso do ciclo celular.
g) Estrutura da MPF (factor promotor da maturao)
Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1604.html
O MPF um dmero de Cdc2 (o mesmo que Cdk1) e ciclina B.
Estudos realizados em leveduras mostraram que necessrio a
presena de Cdc2 para a entrada na mitose. Uma vez que,
organismos com mutaes nos genes que codificam esta
protena ficam bloqueados, no entrando na fase M.
Para a entrada na fase M necessria, assim, a sntese de uma protena chamada
ciclina B. Esta protena acumula-se na interfase e degradada no final da mitose.
A ciclina B uma subunidade reguladora necessria para a actividade cataltica da
protena quinase Cdc2. Conclui-se ento que a actividade do MPF controlada pela
acumulao e degradao peridica de ciclina B durante o ciclo celular.

Em clulas de mamferos, a ciclina B inicia a sntese na fase S. Esta forma ento


complexos com a Cdc2 durante a fase S e G2. Enquanto esses complexos se formam,
Cdc2 fosforilada em duas posies reguladoras criticas:
Uma fosforilao ocorre na treonina 161 e necessria para a actividade de Cdc2.
A segunda fosforilao a da tirosina-15 e da treonina-14, que inibe a actividade
de Cdc2 e leva acumulao do complexo Cdc2/ciclina B na forma inactiva
durante a fase S e G2.

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A transio de G2 para M ento causada pela activao do complexo Cdc2/ciclina B


como resultado da desfosforilao da treonina-14 e da tirosina-15 por uma protena
fosfatase chamada Cdc25. Uma vez activada, a protena quinase Cdc2 fosforila uma
variedade de protenas-alvo que iniciam os eventos da fase M. No final da mitose, a
ciclina B degradada no proteossoma (grande complexos de proteases que degrada
protenas ligadas pela ubiquitina), como resultado da protelise mediada pela
ubiquitina (protena que actua como um marcador que identifica outras protenas para
a sua rpida degradao). Esta destruio da ciclina B inactiva a Cdc2 conduzindo a
clula a sair da mitose.
h) Alvos do MPF
O MPF permite a condensao da cromatina, dado que a Cdc2 vai fosforilar as
condensinas (complexos proteicos fundamentais condensao da cromatina),
activando-as. A ruptura da membrana nuclear outro dos acontecimentos induzidos
pelo MPF, a Cdc2 vai actuar fosforilando a lamina (protena da membrana nuclear),
havendo uma despolimerizao da lmina nuclear e consequente fragmentao em
vesculas da membrana. De maneira semelhante, o retculo endoplasmtico e
complexo de Golgi tambm se vo fragmentar devido fosforilao e inactivao da
GM130 e da GRASP, protenas constituintes da matriz do Golgi. Alm disso o MPF
impele a formao do fuso mittico, resultado da polimerizao dos microtbulos.

i)

116

Regulao das CDKs

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j) Inibidores das Cdks (CKIs)
Inibidor
Cdk
ou
Cdk/ciclina
Famlia Ink4 (p15, p16, p18, Cdk4 e Cdk6
p19)
Famlia Cip/Kip (p21, p27, p57)
Cdk2/ciclina E
Cdk2/ciclina A

complexos Fase do
inibida
G1

2010-2011

ciclo

celular

G1
S

k) Factores de crescimento e a regulao de G1 Cdks


A proliferao de clulas animais regulada pela variedade de factores extracelulares
de crescimento que controlam a progresso das clulas ao longo do ponto de restrio
da fase G1. Na ausncia de factores de crescimento, as clulas esto impossibilitadas
de passarem o ponto de restrio e entram na fase de repouso conhecida como G0,
onde volta a entrar no ciclo celular em resposta a uma estimulao dos factores de
crescimento. Este controlo da progresso do ciclo celular por factores de crescimento
extracelulares implica que as cadeias de sinalizao intracelulares estimulem os
receptores de factores de crescimento, que finalmente actuar para regular os
componentes do mecanismo do ciclo celular.
Uma
importante
ligao
entre
sinalizao de factores de crescimento e
a progresso do ciclo celular fornecida
por ciclinas do tipo D. A ciclina D1
sintetizadora induzida em resposta
estimulao de factores de crescimento,
em parte, como resultado da sinalizao
atravs
das
cadeias
de
Ras/Raf/MEK/ERK, e continua a ser
sintetizada sempre que existir a
presena de factores de crescimento. No
entanto, a ciclina D1 rapidamente degradada, assim a sua concentrao intracelular
diminui rapidamente se os factores de crescimento forem removidos. Mas, enquanto
estiverem presentes os factores de crescimento na fase G1, os complexos de Cdk4,
6/ciclina D1 conduzem as clulas atravs do ponto de restrio. Por outro lado, se os
factores de crescimento forem removidos antes deste ponto-chave da regulao do
ciclo celular, os nveis de ciclina D1 rapidamente diminui e as clulas so impedidas de
passarem da fase G1 para a S, entrando na fase de repouso G0. A rpida alterao de
ciclina D1 integra a sinalizao dos factores de crescimento com o mecanismo do ciclo
celular, permitindo que a disponibilidade de factores de crescimento como controlo da
progresso das clulas ao longo da fase G1.
Como a ciclina D1 importante meio de sinalizao de factor de crescimento, de
esperar que alteraes na regulao da ciclina D1 possam contribuir para a perda da
regulao do crescimento que caracterstico nas clulas cancergenas. Consistentes
com esta expectativa, muitas clulas humanas cancergenas tm sido descobertas
como resultado de defeitos na regulao do ciclo celular, assim como outros
resultados anormais nas cadeias de sinalizao intracelulares activadas por receptores
117

2010-2011

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de factores de crescimento. Por exemplo, as mutaes resultantes de uma contnua


expresso no regulada da ciclina D1 contribuem para um desenvolvimento da
variedade de cancros humanos, incluindo o cancro da mama.
A ligao entre a ciclina D, controlo de crescimento, e o cancro mais tarde fortificado
pelo facto de um substrato proteico Cdk4, 6/ciclina D complexo encontrar-se muitas
vezes mutado em tumores humanos. Esta protena, designada Rb, foi primeiramente
identificada como produto de um gene responsvel por retinoblastoma, um tumor
raro nos olhos de um recm-nascido. Estudos futuros mostraram que mutaes
resultantes da falta de protena RB funcional atingiam tambm uma variedade de
cancros comuns. O Rb um prottipo de um gene supressor de tumores um gene
que leva inactivao do desenvolvimento do tumor. Enquanto as protenas
oncognicas como as Ras e ciclina D conduzem a proliferao da clula, as protenas
codificadas por muitos genes supressores de tumores actuam como traves que
abrandam a progresso do ciclo celular.
Os estudos futuros demonstraram que o Rb e membros relativos da famlia do Rb tm
um papel importante na combinao entre os mecanismos do ciclo celular e a
expresso dos genes necessria para a progresso da sntese de DNA. A actividade de
protenas de Rb regulada por alteraes na fosforilao enquanto a clula progride
no ciclo celular. Em particular, o Rb fosforilado pelo complexo Cdk4, 6/ciclina D
durante a passagem da clula no
ponto de restrio da fase G1.
Na sua forma no fosforilada
(presente na fase G0 e no incio
da fase G1), o Rb liga-se a
membros da famlia do factor de
crescimento E2F, que regula a
expresso de vrios genes
envolvidos na progresso do
ciclo celular, incluindo o gene que codifica a cliclina E. A E2F liga-se sua sequncia
alvo na presena ou ausncia do Rb. No entanto, o Rb actua como repressor, ento o
complexo RB/E2F suprime a transcrio dos genes regulados E2F. A fosforilao do Rb
pelo complexo Cdk4, 6/ciclina D resulta na dissociao do E2F, que activa ento
transcrio dos genes alvo. O Rb tambm actua como um interruptor molecular que
converte o E2F repressor para um iniciador de genes necessrio para a progresso do
ciclo celular. O controlo do Rb pela fosforilao do Cdk4, 6/ciclina D une
sucessivamente esta regulao critica da expresso gentica disponibilidade dos
factores de crescimento em G1.

118

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A progresso ao longo do ponto


de restrio e a entrada na fase S
mediada pela activao do
complexo Cdk2/ciclina E. A
sntese da ciclina E estimulada
pela E2F seguida da fosforilao
da Rb. Alm disso, a actividade da
Cdk2/ciclina E inibida em G0 e
na fase inicial de G1 pelo Cdk
inibidor p27, que pertence
famlia Cip/Kip. Esta inibio do
Cdk2 pelo p27 aliviada por
mltiplos mecanismos enquanto
a clula progride na fase G1.
Primeiro, a sinalizao de factores
de
crescimento
via
Ras/Raf/MEK/ERK e trajectria de
PI 3-quinase/Akt que reduzem a
transcrio e traduo do p27, diminuindo os nveis de p27 no interior da clula. O
aumento da sntese de ciclina D leva ligao do p27 ao complexo Cdk4, 6/ciclina D,
retirando-o da ligao que tinha com o cdk2/ciclina E. Uma vez ocorrida a activao do
Cdk2, inicia-se a degradao do p27 atravs da sua fosforilao e marcao para
ubiquitinao. Esta autoregulao positiva resulta na inteira activao do complexo
Cdk2/ciclina E ento inicia a fase S pela activao da protena helicase MCM na origem
da replicao, levando iniciao da sntese de DNA.
l)

Pontos de verificao do DNA danificado


A proliferao celular regulada tanto pelos factores de crescimento como tambm
pela variedade de sinais que inibem a progresso do ciclo celular. Os pontos de
verificao do DNA possuem um
papel importante na manuteno
da integridade do genoma, parando
o ciclo celular como resposta a DNA
danificado ou incompletamente
replicado.
Estes
pontos
de
verificao, que operam nas fases
G1, S e G2 do ciclo celular, do
tempo suficiente para a reparao
do DNA antes deste ser replicado
para que assim o ciclo possa
progredir, para tal obrigam a
paragem do mesmo ciclo.
A paragem do ciclo celular nos
pontos de verificao de DNA
danificado

iniciada
pelas
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protenas quinases ATM ou ATR, componentes de complexos proteicos que


reconhecem DNA danificado ou no replicado. A ATM activada principalmente por
pausas de duplas vertentes, enquanto a ATR activada por pausas de uma nica
vertente ou por DNA no replicado. Uma vez activadas por um DNA danificado, a
ATM e a ATR fosforilam e activam as quinases de pontos de verificao CHK2 e CHK1,
respectivamente, levando ao repouso do ciclo celular.
Ambas (CHK1 e CHK2) fosforilam e inibem a fosfatase Cdc25, que necessria para
activar o complexo Cdk/ciclina por remoo das fosforilaes inibidoras. Nos pontos
de verificao (restrio) das fases G1 e S, CHK1
e CHK2 fosforilam a Cdc25A, que necessria
para activar os complexos de Cdk2 e ciclinas A e
E. A fosforilao leva a uma degradao rpida
da Cdc25A, resultando a inibio da Cdc25C. No
ponto de verificao da fase G2, a CHK1 e CHK2
fosforilam e inibem a Cdc25C, que
responsvel pela activao dos complexos
Cdk1/ciclina B. Na ausncia da activao da
Cdk1, ocorre o bloqueio da mitose e a clula
mantm-se em repouso na fase G2.
Nas clulas dos mamferos, a paragem no
ponto de verificao (restrio) da fase G1
tambm mediado pela aco de uma protena
adicional conhecida por p53, que fosforilada
tanto pela ATM como pela CHK2. A fosforilao
estabiliza a p53, caso contrrio esta degradavase rapidamente, resultando num rpido
aumento nos nveis da p53 na resposta ao DNA
danificado. A protena p53 um factor de
transcrio, e o aumento da sua expresso leva
induo da Cdk inibidora p21 da famlia das
Cip/Kip. A protena p21 inibe os complexos
Cdk2/ciclina E, levando a uma paragem do ciclo
celular em G1.
O gene que codifica a p53 frequentemente
mutado nos cancros humanos. A perda da
funcionalidade da p53 tem como resultado mutaes que impedem a paragem do
ciclo celular como resposta ao DNA danificado, assim o DNA replicado e passado s
clulas filhas em vez de ser corrigido. Estas transmisses de DNA danificado provocam
um aumento da frequncia de mutaes e geralmente instabilidade no genoma
celular, que contribui para o desenvolvimento do cancro. As mutaes no p53 so
comuns em alteraes genticas em cancros humanos.

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Aula 16
16) Mitose
a) Fases da mitose
Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1605.html

b) A Cdk1/ciclina B e a progresso da metfase


A Cdk1/ciclina B (MPF) no
actua
somente
como
importante regulador da
transio da fase M, como
agente
fosforilador
e
activador de outras protenas
quinases, mas tambm actua
directamente
fosforilando
algumas protenas estruturais
envolvidas na reorganizao
celular.
A condensao da cromatina
da interfase para formar os cromossomas compactados das clulas mitticas um
evento muito importante da mitose, nomeadamente no movimento dos cromossomas
121

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ao longo do fuso mittico sem que ocorra o risco de se


quebrarem ou de se colarem um ao outro. A cromatina
condensa cerca de mil vezes, atingindo um grau de
condensao to elevado que no permite a transcrio, logo a
transcrio termina assim que a condensao inicia. Apesar da
importncia fundamental deste evento, no se conhece
totalmente a estrutura dos cromossomas da metfase e o
mecanismo molecular da condensao da cromatina. No
entanto, foi estabelecido que a condensao da cromatina
conduzida por complexos proteicos designados por codensinas,
que pertencem classe das protenas que garantem a
manuteno estrutural da cromatina (SMC) e desempenham
um papel importante na organizao dos cromossomas
eucariotas.
Tanto as condensinas como as coesinas
(outra famlia das protenas SMC)
contribuem para a segregao dos
cromossomas durante a mitose. As coesinas
ligam-se ao DNA na fase S e mantm ligao
entre os cromatdeos irmos durante a
replicao do DNA. Quando a clula entra
na fase M, as condensinas so activadas
pela fosforilao da Cdk1/ciclina B. As
condensinas vo substituir as coesinas ao longo da maior parte do comprimento do
cromossoma, ficando os cromatdeos ligados apenas na zona do centromero (atravs
das coesinas). As condensinas tambm induzem a condensao da cromatina, levando
formao dos cromossomas da metafase.
A desorganizao do invlucro nuclear envolve mudanas em todos os seus
componentes:
Fragmentao das membranas nucleares
Dissociao dos complexos dos poros
Despolimerizao da lmina nuclear (que resulta da fosforilao das laminas pela
Cdk1).

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A Cdk1 vai fosforilar certas


protenas que se encontram no
interior da membrana nuclear e do
complexo do poro, levando a
desorganizao
do
mesmo
complexo e a separao da
membrana interna do ncleo pelas
laminas
e
cromatina.
Acontecimentos evidenciam que a
membrana nuclear absorvida para
o
interior
do
retculo
endoplasmtico, onde permanece
intacto e se distribui pelas clulas filhas.
O aparelho de Golgi fragmenta-se em pequenas vesculas, que podem tambm ser
absorvidas pelo retculo endoplasmtico ou distribudas directamente pelas duas
clulas filhas. A quebra destas membranas , em parte, mediada por Cdk1,
fosforilando protenas da matriz do Golgi (como GM130 e GRASP-65), que eram
importantes por docking de vesculas COPI-coated para a membrana do Golgi.
A reorganizao do citoesqueleto culmina na formao do fuso mittico, resultante da
instabilidade dinmica dos microtbulos. No incio da profase, a activao da Cdk1 leva
separao dos centrossomas, que foram duplicados no decorrer da fase S. Os
centrmeros movem-se para o sentido oposto do ncleo e sofrem um processo de
maturao durante o qual estes aumentam e recrutam g-tubulina e outras protenas
necessrias para o fuso mittico. A maturao dos centrossomas e formao do fuso
envolvem a actuao de quinases das famlias Aurora e Polo-like quinase, que se
localizam nos centrossomas. Assim como Cdk1, as quinases Aurora e Pololike so
activadas nas clulas mitticas, sendo importantes para a formao do fuso, a funo
do cinetocoro e na citocinese. A taxa de inverso dos microtbulos aumenta
aproximadamente entre cinco a dez vezes, aumentando a despolimerizao e
diminuio dos microtbulos da interfase. Este facto deve-se fosforilao de
microtbulos associados a protenas, provocada tanto pela Cdk1 como pelas outras
protenas quinases mitticas, como a Aurora ou as Polo-like quinases. Assim os
microtbulos da interfase so substitudos por um grande nmero de pequenos
microtbulos que partem dos centrossomas.
Nessa altura, a desorganizao do invlucro
nuclear permite que os microtbulos
formem o fuso, ligando-se aos cromossomas
atravs dos seus cinetocoros., iniciando o
processo
de
movimentao
dos
cromossomas caracterstico da prometafase.
As protenas ligadas ao cinetocoro incluindo
as motoras dos microtbulos que dirigem o
movimento dos cromossomas ao longo dos
inmeros microtbulos que se encontram
ligados aos centrossomas, o fuso mittico. A aco destas protenas que atraem os
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cromossomas para os centrossomas oposta quela que exercida pelas protenas


motoras plus-end e pelo crescimento dos microtbulos do fuso, que afastam os
microtbulos dos plos.
Os microtbulos de plos opostos do fuso eventualmente acabam por unir os dois
cinetocoros dos cromatdeos irmos (que esto localizados em zonas opostas do
cromossoma), e equilibrar as foras que actuam nos cromossomas, levando assim, ao
seu alinhamento na placa da equatorial do fuso acromtico da metafase.
c) O ponto de controlo do fuso mittico e a progresso da anafase
O ponto de controlo do fuso mittico monitoriza o alinhamento dos cromossomas na
metafase. Se este processo conseguido com sucesso a clula inicia a anafase e
completa a mitose. A progresso da metafase para a anafase resulta de uma
ubiquitinao mediada por protelise de protenas reguladoras, desencadeada pela
activao de uma E3 ubiquitina ligase, denominada complexo promotor da anafase. A
activao deste complexo induz o incio da mitose, at que a activao da Cdk1/ciclina
B acaba por levar sua destruio. O complexo promotor da anafase permanece
inactivo at passagem da clula pelo ponto de controlo do fuso mittico, esta
passagem permite a sua activao atravs do sistema de degradao da ubiquitina,
que leva transio da metafase e da anafase e progresso ao longo da mitose.
O papel do ponto de controlo do fuso
acromtico importante na regulao da
fase M, pois a presena de qualquer
cromossoma que no se encontre alinhado
suficiente para inibir a activao do
complexo promotor da anafase. Este ponto
mediado por um complexo de protenas,
designado por protenas Mad/Bud, que se liga ao Cdc20 componente necessrio
para o complexo promotor da anafase. As protenas Mad/Bud formam um complexo
que se pode observar no cinetocoro. Acredita-se que quando as protenas Mad so
activadas no complexo, libertam-se na forma activa que inibe a Cdc20, mantendo o
complexo promotor da anafase num estdio inactivo. Uma vez que ocorra a ligao
dos microtbulos ao cinetocoro, o complexo separa-se e a Cdc20 activa-se, o que leva
actuao do complexo promotor da anafase.

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A activao do complexo promotor da anafase resulta da ubiquitinao e da


degradao de duas importantes protenas alvo. A entrada na anafase resulta da
degradao proteoltica dos componentes das coesinas, que mantm a ligao entre
os cromatdeos irmos enquanto estes esto alinhados na placa equatorial da
metafase. A degradao da coesina no catalisada directamente pelo complexo
promotor da anafase, em vez disso, degrada a securina que a subunidade reguladora
de uma protease (denominada separase). A degradao da securina resulta da
activao da separase, que por sua vez degrada a coesina. A clevagem da coesina
quebra as ligaes entre cromatdeos irmos, permitindo a segregao pelo
movimento para plos opostos atravs do fuso. A separao dos cromossomas
durante a anafase deve-se a aco de vrios tipos de protenas motoras associadas ao
fuso mittico.

A outra protena reguladora


que sofre a ubiquitinao e
degradao por parte do
complexo promotor das
anafase a ciclina B. A
degradao da ciclina B leva
inactivao da Cdk1, que
necessria para a clula
terminar a mitose e entrar
novamente em interfase.
Muitas alteraes celulares
envolvidas nestas transies
so simplesmente o inverso dos eventos induzidos pela Cdk1 durante a entrada na
mitose. Por exemplo, a reorganizao do invlucro nuclear (j ilustrado
anteriormente), a descondensao da cromatina, e o retorno dos microtbulos para o
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estdio de interfase provavelmente resultam da perda da actividade da Cdk1 e da


desfosforilao das protenas, que foram fosforiladas pela Cdk1 no incio da mitose.
d) Citocinese
A completao da mitose
usualmente acompanhada
pela
citocinese,
dando
origem s clulas filhas. A
citocinese inicia-se pouco
tempo depois do incio da
anafase e activada pela
inactivao da Cdk1, deste
modo coordena a diviso
nuclear e citoplasmtica da
clula. Esta fase mediada pelo anel contrctil (nas leveduras e clulas animais) de
actina e filamentos de miosina II que se formam por baixo da membrana
citoplasmtica. A localizao do anel determinada pela posio do fuso mittico,
ento a clula clivada no plano que passa na placa equatorial perpendicular ao fuso.
A clivagem d-se ao longo da contraco dos filamentos de actina-miosina e do
movimento do citoplasma para o interior das novas clulas em formao. A ligao
entra as duas clulas filhas quebra-se e as membranas plasmticas separam-se.
O mecanismo da citocinese diferente para as clulas vegetais
(visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1606.html).
Em vez de se formar o anel contrctil, estas clulas dividem-se
atravs da formao de novas paredes celulares e membranas
plasmticas no interior da clula.
No incio da telofase, algumas vesculas, que partem do Golgi,
possuem no seu interior precursores da parede celular e esto
associadas aos microtbulos do fuso, vo se acumular no centro da
placa equatorial. Estas vesculas vo-se fundir, formando uma
estrutura maior e os seus contedos polissacrdeos associam-se
formando a matrix da placa celular.
A placa celular expande-se do interior, perpendicular ao fuso, para o
exterior at se encontrar com a membrana plasmtica. As duas
membranas fundem-se e dividem a clula em duas clulas filhas.

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Aula 17
17) Meiose (visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1607.html)
Resulta na diviso de uma clula me dando origem a clulas filhas haplides, cada uma
contendo apenas um membro do par dos cromossomas homlogos que estavam
presentes na clula me, que era diplide. Esta reduo do nmero de cromossomas
acompanhada por dois ciclos sequenciais de diviso nuclear e celular Meiose I e Meiose
II, com um nico ciclo de replicao do DNA
a) Comparao
meiose/mitose
(visitar:
http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1608.html)

Tanto a meiose como a mitose


se iniciam aps a replicao de
DNA, de modo a que cada
cromossoma consista em duas
cromtides-irms. Na meiose I,
os cromossomas emparelhamse e dirigem-se para diferentes
clulas. As cromtides-irms
separam-se durante a meiose
II, a qual se assemelha a uma
mitose normal. Deste modo, a
meiose d origem a 4 clulas
haplides, ao contrrio da
mitose, que s origina 2.
127

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b) Fases
i) Interfase pr-meitica
(1) Replicao do DNA
ii) Profase I (visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1609.html)
(1) Leptteno

Incio da condensao dos cromossomas


Visualizao dos crommeros e dos nuclolos
Formao das placas de adeso
(2) Zigteno

Emparelhamento dos cromossomas homlogos


Formao de bivalentes
Formao do complexo sinaptonmico (C. S.)

Nota: Complexo sinaptonmico estrutura proteica que permite o alinhamento correcto dos
cromossomas homlogos que constituem o bivalente, isto , cada gene colocado diante do
seu alelo do cromossoma homlogo, permitindo o emparelhamento das regies exactamente
correspondentes. Fornece o suporte necessrio recombinao (crossing-over), no estando
envolvido nesse processo

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(3) Paquiteno

Emparelhamento total dos cromossomas homlogos


Formao de ndulos recombinantes ao longo do C.S.
Ocorre o crossing-over
Nota: Emparelhamento dos cromossomas sexuais os 2 cromossomas X
emparelham da mesma forma que todos os outros homlogos; quando um X
com um Y, existe uma regio homloga entre ambos os cromossomas,
permitindo o seu emparelhamento
(4) Diplteno

Repulso dos cromossomas homlogos dissoluo do C.S.


Cromossomas homlogos unidos por quiasmas
Pode durar meses ou anos
Nota: Quiasmas

(5) Diacinese

Condensao total dos cromossomas


Desagregao da membrana nuclear e dos nuclolos
Paragem da sntese de RNA
Telomerizao movimentao dos quiasmas para os telmeros

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iii) Metafase I

O fuso ocupa uma posio central


Alinhamento dos cromossomas no equador da clula
As 2 cromtides irms comportam-se como uma unidade funcional
(migrao correcta dos cromossomas)

Nota: Quiasma
Na metfase, os cinetocoros das cromtides-irms podem ser fundidos
ou adjacentes. Os microtbulos do mesmo plo do fuso so ento
ligados aos cinetocoros das cromtides-irms, enquando os
microtbulos do plo oposto se ligam ao cinetocoro dos cromossomas
homlogos. Os quiasma terminam na anafase I, e os cromossomas
homlogos movem-se oara os plos do fuso

iv) Anafase I

Separao dos cromossomas homlogos (ao acaso)


No h diviso dos centrmeros
Ocasionalmente h fenmenos de no disjuno (ex: sndrome de Down)
v) Telofase I

130

Chegada dos cromossomas homlogos aos plos

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vi) Citocinese

Diviso do citoplasma
vii) Profase II

Fase muito curta


Os cromossomas so constitudos por 2 cromtides
viii) Metafase II

Alinhamento dos cromossomas no equador da clula formando-se a placa


equatorial
ix) Anafase II

Diviso do centrmero as cromtides irms so arrastadas para os plos


x) Telofase II

Chegada dos cromossomas aos plos (cada grupo envolvido pela membrana
nuclear)
A cromatina descondensa, os nuclolos reaparecem e o fuso desaparece
Aps a diviso do citoplasma obtemos 4 clulas haplides

131

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c) Regulao
A meiose dos ocitos regulada em dois pontos nicos do ciclo celular.
O primeiro ponto regulador no estgio de Diplteno da primeira diviso
meitica.
Os ocitos podem permanecer bloqueados nesse estado
por longos perodos de tempo. Durante este bloqueio
em Diplteno, os cromossomas dos ocitos
descondensam-se e so activamente transcritos. Esta
actividade de transcrio reflecte-se num tremendo
crescimento dos ocitos durante este perodo
Os ocitos retornam meiose em resposta
estimulao hormonal e completam a sua primeira
diviso, com uma citocinese assimtrica.
A diviso celular aps a meiose I assimtrica,
resultando na produo de um pequeno corpsculo
polar e um ocito que retm o seu maior tamanho.
O ocito prossegue para entrar na meiose II sem ter formado novamente um
ncleo ou descondensado os seus cromossomas.
A maioria dos ocitos dos vertebrados novamente bloqueada na metafase II,
onde permanecem at fertilizao.
A meiose dos ocitos controlada pelo MPF, tal como na fase M das clulas
somticas.

132

Actividade do MPF
o A estimulao hormonal dos ocitos no Diplteno activa o MPF,
resultando no curso para a metafase I.
o A actividade do MPF diminui durante a transcrio da metafase I para a
anafase I.
o Aps a finalizao da meiose I, a actividade d MPF volta a surgir e
permanece alta durante o bloqueio da metafase II.

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Regulao do MPF
o A regulao do MPF durante a meiose dos ocitos responsvel pelo
bloqueio em metafase II.
o A estimulao hormonal dos ocitos bloqueados em Diplteno, bloqueia
inicialmente o recomeo da meiose por activao do MPF.
o Tal como na mitose, o MPF induz a condensao cromossmica, a ruptura
do invlucro nuclear e a formao do fuso.
o Um mecanismo regulador nico para os ocitos actua para permitir a
manuteno da actividade do MPF durante o bloqueio na metafase I,
prevenindo a transcrio de metfase para anafase da meiose II e
inactivao do MPF, que pode resultar na protelise da ciclina B durante
uma fase M normal.
o Uma serino/treonina quinase
conhecida por Mos sintetizada
especificamente em ocitos
durante a poca de concluso da
meiose I, sendo necessria para
o aumento da actividade do MPF
durante a meiose II e para a
manuteno da actividade do
MPF durante o bloqueio da
metafase II.
o A aco de Mos resulta na
activao da ERK MAP quinase
(papel central nas rotas de
sinalizao celular).
o Em ocitos, a ERK activa outra
protena Rsk que inibe a
aco do complexo de promoo
da anafase e bloqueia a meiose
em metafase II.
o Os ocitos podem permanecer neste ponto do ciclo celular meitico,
durante muitos dias, espera da fertilizao.

Regulao finalizao (fertilizao)


o O espermatozide liga-se ao receptor da superfcie do vulo e funde-se
com a membrana plasmtica do vulo, iniciando o desenvolvimento de um
novo organismo diplide contendo informaes genticas derivadas de
ambos os progenitores.
o induzido um nmero de mudanas no citoplasma do ovo.
o Estas alteraes activam o ovo levando concluso da meiose do ocito e
iniciao do ciclo celular mittico do embrio.
Processo
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Um sinal-chave resultante da ligao de um espermatozide ao seu receptor na
membrana plasmtica do ovo o aumento do
nvel de Ca2+ no citoplasma.
Este aumento conduz induo de alteraes
da superfcie que previnem a entrada
adicional de outro espermatozide no ovo.
Estas alteraes resultam do Ca2+ induzido na
exocitose de vesculas secretoras, presentes
em grande nmero abaixo da membrana
plasmtica do ovo.
A libertao do contedo dessas vesculas
altera a camada extracelular do ovo,
bloqueando
a
entrada
de
outro
espermatozide.
O aumento do Ca2+ citoslico seguido da
fertilizao tambm sinaliza a concluso da
meiose.
Nos ovos bloqueados na metafase II, a
transcrio da metafase para a anafase
desencadeada pela acivaao dependente de
Ca2+ do complexo promotor da anafase.
A inactivao resultante do MPF leva
concluso da segunda dvisao meitica, com
citocinese assimtrica (como na meiose I),
dando origem a um segundo pequeno
corpsculo polar.
Aps a concluso da meiose dos ocitos, o
ovo fertilizado zigoto contm dois ncleos
haplides (pr-ncleos, um de origem
materna e outro de origem paterna.
Nos mamferos, os dois pr-ncleos entram
em fase S e replicam os seus DNAs enquanto
migram um em direco ao outro. Assim que
se encontram, o zigoto entra na fase M da sua
primeira diviso mittica.

d) Significado biolgico da diviso meitica (a meiose permite)


Que se formem clulas sexuais com metade do nmero de cromossomas
caractersticos de cada espcie;
A sntese de mRNAs, rRNAs e protenas reguladoras, que so importantes para a
diferenciao dos gmetas e para o desenvolvimento embrionrio at ao estado
de blastocisto;
Contribui para a variabilidade gentica das clulas filhas entre si e em relao
clula me, devido ao crossing-over e separao ao acaso dos homlogos
134

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Resume dos mecanismos reguladores do ciclo:

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Aula 18
18) Replicao do DNA
a) Estrutura do DNA
Antes das experincias de Watson e Crick, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins
previram a estrutura helicoidal da molcula de DNA

136

Em 1953, James Watson e Francis Crick trabalhavam na construo de um modelo


para a estrutura do DNA sabendo que esta molcula era composta por
nucletidos, considerado como as unidades bases do DNA. Estes nucletidos
possuem uma pentose (desoxirribose: formada por 5 carbonos e possui menos um
oxignio que a ribose), um cido fosfrico (que confere caractersticas cidas
molcula) e uma base azotada (que no caso do DNA podem ser: bases pirimdicas com um anel simples timina e citosina; e bases pricas - com um anel duplo
adenina e guanina).

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Watson e Crick construram um modelo que consistia numa dupla cadeia (dupla
hlice), onde a pentose e o cido fosfrico estavam situados no exterior da cadeia,
enquanto as bases estavam orientadas para o interior da molcula. As ligaes
entre os nucletidos numa cadeia simples do-se a partir do cido fosfrico, que
est ligado ao carbono 5 da pentose e ao carbono 3 da pentose pertencente ao
nucletido que lhe antecede. A ligao entre as duas cadeias simples de DNA
feita atravs das bases azotadas complementares por meio de pontes de
hidrognio (duas ligaes de hidrognio no caso da T A, 3 ligaes, no caso C
G). Esta complementaridade importante foi importante para Erwin Chargaff, que
analisou a variedade de bases que se encontram no DNA. Descobriu,
experimentalmente, que a quantidade de Adenina igual quantidade de Timina
e, por sua vez, a quantidade de Guanina igual quantidade de Citosina (Regra de
Chargaff).

As duas cadeias da dupla hlice desenvolvem-se em sentidos opostos. Cada uma


delas inicia-se por uma extremidade 5 e termina 3, no entanto a extremidade 5
de uma das cadeias corresponde extremidade 3 da outra cadeia. Devido a este
facto, denominam-se de antiparalelas.

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b) Replicao semi-conservativa do DNA


A descoberta da complementaridade entre as bases da molcula de DNA
imediatamente sugeriu uma soluo molecular para a questo de como que o
material gentico se podia auto-replicar processo necessrio em cada diviso
celular. Foi proposto que as duas cadeias de uma molcula de DNA podiam
separar-se e servir de modelo para a sntese de uma nova cadeia complementar.
Este processo foi denominado de replicao semi-conservativa, porque cada
cadeia simples da molcula de DNA parental conservada em cada molcula de
DNA filha.

138

Um suporte directo replicao semi-conservativa foi obtido em 1958, como o


resultado de uma experincia de Matthew Meselson e Frank. Nesta experincia o
DNA da E. coli foi marcado com dois tipos de istopos (14N e 15N) que alteravam a
sua densidade. Primeiramente utilizou-se um istopo pesado (15N) para marcar o
DNA parental das bactrias, consideradas assim como a gerao zero da
experincia. Depois, estas bactrias foram transferidas para um meio de cultura
contendo azoto leve (14N), onde permaneceram durante um ciclo de diviso
(gerao 1), ou dois ciclos de diviso (gerao 2). Para se conseguir separar os DNA
de diferentes densidades utilizou-se um equilibrador de centrifugao (CsCl). No
fim deste processo, analisou-se as molculas de DNA provenientes da gerao 1,
que possuam uma cadeia de 15N e outra 14N. J na segunda gerao obtm-se 50%
de molculas de DNA com 15N14N e a mesma percentagem de molculas s com
14
N.

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A habilidade do DNA de servir como modelo na sua prpria replicao mais tarde
confirmada, com a demonstrao de que uma enzima purificada da E. coli (DNA
polimerase) podia catalisar a replicao do DNA in vitro. A DNA polimerase
permitiu a incorporao directa dos nucletidos na molcula complementar de
DNA.

c) DNA Polimerases - Identificada por Arthur Kornberg em 1956, na E. coli

A capacidade desta enzima em copiar o DNA de uma cadeia modelo deu um


conhecimento bioqumico para o modo de replicao do DNA que foi inicialmente
proposto por Watson e Crick, assim o isolamento desta enzima foi importante.
Ironicamente, a primeira DNA polimerase a ser identificada (DNA polimerase I) no
a responsvel mxima pela replicao de DNA na E. coli. Em vez disso, a
polimerase I est envolvida principalmente na reparao de danos no DNA, e
tornou-se bvio que tanto nas clulas procariotas como nas clulas eucariotas
contm mltiplas DNA polimerases distintas, que esto envolvidas tanto na
replicao com na reparao do DNA.
Nos procariontes, em especial na bactria E. coli, foram identificados trs tipos de
polimerases (I, II e II). As polimerases I e III so essenciais no processo de
replicao enquanto a actividade da polimerase II est mais ligada ao processo de
reparao.
Nos eucariotas, foram idetificadas cinco polimerases diferentes (, , g, e e d).
Com a excepo da polimerase g (localizada na mitocndria e responsvel pela
replicao daquela genoma) todas as outras polimerases esto localizadas no
ncleo e envolvidas na replicao e/ou reparao do DNA.
o Polimerases e e d: activadas em clulas em diviso, o que sugere uma
funo directamente relacionada com a replicao.
o Polimerase : funciona quer as clulas estejam ou no em diviso,
compatvel assim com uma funo mais relacionada com a reparao do
DNA.
Contudo todas as polimerases tm duas caractersticas em comum:
o Todas sintetizam DNA nos sentido 5 3, s podendo adicionara um novo
dNTP (desoxirribonuclesido) ao grupo 3-hidroxil (3-OH) localizada na
extremidade de crescimento. Isto obriga a que existam dois tipos de
replicao, uma contnua e outra descontnua

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o

Replicao contnua: ocorre na cadeia avanada, na qual o sentido de


replicao 5-3 coincidente com a direco de crescimento da cadeia
filha que est a ser sintetizada.
Replicao descontnua: ocorre na cadeia atrasada, em que o sentido de
replicao de 5-3 contrrio ao de crescimento da cadeia filha em
formao.

d) Forquilha de Replicao (http://www.sinauer.com/cooper5e/animation0601.html)


John Cairns realizou experincias em E.Coli que cresciam em meio que possuam
timidina radioactiva, permitindo a visualizao de novas molculas de DNA
replicadas atravs de autoradiografia. Em alguns casos, foi possvel observar
molculas circulares completas no processo de replicao. Estas molculas de DNA
continham duas forquilhas de replicao, que representavam regies onde existia
a sntese de DNS. Em cada forquilha uma cadeia simples parental era separada e
duas novas cadeias filhas eram sintetizadas. A sntese de novas cadeias de DNA
complementares em relao s cadeias parentais colocaram um importante
problema no conhecimento da bioqumica da replicao do DNA. Uma vez que as
duas cadeias da molcula do DNA so antiparalelas, a sntese contnua de duas
novas cadeias na forquilha de replicao requeria que uma fosse sintetizada na
direco 5-3, enquanto a outra sintetizada em sentido oposto (3-5). No
entanto, o DNA polimerase catalisa a polimerizao do dNTPs apenas na direco
5-3. Ento, como ser possvel que a outra cadeia de DNA fosse sintetizada?

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Este enigma foi resolvido por experiencias que demonstraram que apenas uma
cadeia simples sintetizada de uma forma contnua devido concordncia de
direces da cadeia e da DNA polimerase; a outra cadeia formada por pequenos
(1-3kb), descontnuos pedaos de DNA que foram sintetizados ao contrrio em
relao direco do movimento da forquilha de replicao. Estes pequenos
pedaos de DNA sintetizados (fragmentos de Okazaki) esto unidos pela aco da
DNA ligase, formando uma nova cadeia de DNA intacta. Assim, a cadeia que foi
sintetizada de uma forma contnua denominada por cadeia avanada, uma vez
que a sua elongao na direco do movimento da forquilha de replicao. A
cadeia que no pode ser sintetizada de forma continua, isto no polimerizada no
sentido 5 3, denominada por cadeia atrasada.

Apesar da descoberta do mecanismo da sntese descontnua, levantou-se outra


questo: uma vez que a DNA polimerase necessita de um primer e no consegue
iniciar a sntese de novo, como que se inicia ento a sntese dos fragmentos de
Okazaki? A resposta que pequenos fragmentos de RNA servem de primers para a
replicao do DNA. Ao contrrio da sntese de DNA, a sntese de RNA pode ser
iniciada de novo, e uma enzima chamada primase sintetiza pequenos fragmentos
de RNA complementares cadeia atrasada da forquilha de replicao. Os
fragmentos de Okazaki so ento sintetizados pela via de extenso destes primers
de RNA pela DNA polimerase.
Para formar uma cadeia contnua de DNA, os Rna primers precisam de ser
removidos dos fragmentos de Okazaki, sendo substitudos por DNA. Nos
procariotas, os RNA primers so removidos pela aco da polimerase I. Alm da
sua aco na polimerizao de DNA, esta actua como uma exonuclease que
consegue hidrolisar DNA (ou RNA), tanto no sentido 3 5 como no sentido
oposto (5-3). Esta aco de exonuclease (5 3) permite a remoo de
ribonucletidos da terminao 5 dos fragmentos de Okazaki, permitindo que
sejam substitudos por desoxirribonucletidos, para formarem uma cadeia
inteiramente constituda por DNA. Nas clulas eucariotas, os RNA primers so
removidos pela aco combinada da RNase H, uma enzima que degrada os
pedaos de RNA da cadeia hbrida de RNA-DNA, e exonucleases 5- 3. Como
resultado formar-se-o falhas na cadeia que sero tapadas pela polimerase d e por
fragmentos de DNA que so unidos pela DNA ligase, formando uma cadeia
atrasada intacta.

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Note-se que a DNA polimerase desempenha um papel distinto na forquilha de


replicao dos procariotas e dos eucariotas. Na E. coli, a polimerase III a principal
na polimerizao da replicao, actuando na formao de ambas as cadeias, a
avanada e a atrasada. Nas clulas eucariotas, esto envolvidas 3 distintas DNA
polimerases (, e e) na replicao do DNA nuclear. Os diferentes papis destas
polimerases foram estudados atravs de experincias. Anlises bioqumicas
estabeleceram que a polimerase encontrada num complexo com a primase, e
funcionam em conjunto para sintetizar pequenos fragmentos de RNA-DNA

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durante a construo da cadeia atrasada. A polimerase d pode ento sintetizar


ambas as cadeias, avanada e atrasada, actuando na extenso dos primers de
RNA-DNA inicialmente sintetizados pelo complexo polimerase primase. A
polimerase e um essencial gene na levedura, mas no necessria para a
replicao do Dna SV40 in vitro, ento o seu papel permanece desconhecido.
No so s as polimerases e as primases que actuam na forquilha de replicao,
existe tambm um nmero de outras protenas. Uma classe de protenas que so
necessrias para a replicao liga-se DNA polimerase, aumentando a actividade
da polimerase e obrigando estas a permanecerem ligadas cadeia de DNA
parental para que continue a ocorrer a sntese de uma nova cadeia. Ambas as
polimerases d e e (eucariotas) esto associadas a dois tipo de protenas acessrias
(protenas sliding-clamp e protenas clamp-loadin) que carregam a polimerase
at ao primer e mantm a sua associao com a cadeia molde. As protenas
clamp-loading (RFC) e as gliding-clamp (PCNA) formam um complexo que
especializado em reconhecer e ligar DNA nas junes entre o primer e o molde. A
RFC liberta ento a PCNA, que forma um anel volta do molde de DNA. Nesse
momento, carrega a DNA polimerase para a cadeia de DNA, nomeadamente para
juno primer-molde. O anel mantm esta associao e a replicao procede,
permitindo a sntese no interrompida de muitos nucletidos do DNA.

As Helicases so enzimas que catalisam o desenrolar


do DNA parental, que leva hidrlise de ATP, frente
da forquilha de replicao. As protenas singlestranded DNA-binding estabilizam ento o modelo
desenrolado de DNA, mantendo-o numa simples
cadeia estendida para que assim se consiga efectuar a
sua cpia atravs da polimerase.

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medida que as cadeias parentais de DNA se vo desenrolando, o DNA frente da
forquilha de replicao forada a rodar. Uma rotao no verificada pode causar
molculas de DNA circulares que se dobram sobre si prprias, impedindo a
replicao. Este problema pode ser resolvido atravs das topoisomerases, enzimas
que se associam cadeia parental e removem a tenso provocada pela toro da
cadeia dupla atravs de uma srie de cortes pontuais nas ligaes fosfodiester,
reformadas de seguida pela mesma enzima.
Existe dois tipos de topoisomerases: Topoisomerase tipo I que quebra apenas uma
cadeia simples da dupla hlice do DNA; Topoisomerase tipo II corta as duas
cadeias em simultneo, transformando um superenrolamento positivo em
negativo. Os cortes efectuados pelas topoisomerases tipo I e II permitem que a
dupla cadeia rode livremente para que a replicao continue sem que haja a troca
de DNA frente da forquilha de replicao. Apesar dos cromossomas dos
eucariotas serem compostos de uma forma linear em vez de molculas circulares
de DNA, a sua replicao tambm requer a presena de topoisomerases; caso
contrrio, os cromossomas completos teriam que rodar continuamente durante a
sntese de DNA.

Topoisomerases tipo II so necessrias no apenas para desenrolar o DNA, mas


tambm para desfiar as molculas de DNA circulares, que se encontram enroladas.
Nas clulas eucariotas, topoisomerase II aparenta estar envolvida na condensao
de cromossomas mitticos.
As enzimas envolvidas na replicao do DNA actuam de um modo coordenado
para que a sntese de ambas as cadeias, avanada e atrasada, do DNA ocorram em
simultneo na forquilha de replicao.
Nas clulas eucariotas, os nucleossomas so tambm desorganizados durante a
replicao do DNA. As histonas ligadas cromatina parental so divididas entre as
cadeias filhas, e novas histonas so ento adicionadas para a reorganizao dos
nucleossomas atravs de protenas que caminham ao longo da forquilha de
replicao.

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e) A fidelidade da replicao
A capacidade da replicao do DNA importante para a reproduo da clula, e as
taxas de mutaes de vrios genes revelam que a frequncia de erros durante a
replicao corresponde apenas a uma bases incorrecta por 108 a 109 nucletidos
incorporados. Esta frequncia mais pequena do que se esperava tendo em conta
apenas a complementaridade das bases emparelhadas. Particularmente, as
diferenas energticas que resultam das alteraes nas pontes de hidrognio
entre bases que se encontram correctamente colocadas e as que se encontram
trocadas, so suficientemente elevadas para favorecer a incorporao correta de
nucletidos. Consequentemente, a seleco de bases determinada
simplesmente pelas ligaes de hidrognio entre as bases complementares, onde
a frequncia de ocorrncia de um erro corresponderia a uma incorporao
incorrecta de uma base em 100-1000 nucletidos de uma nova cadeia de DNA.
Mas o mais elevado nvel de fidelidade de replicao atingido pela actividade das
DNA polimerases.
Um mecanismo que a DNA polimerase utiliza e que aumenta a fidelidade da
replicao a ajuda na seleco das bases correctas que devem ser incorporadas
na nova cadeia. A polimerase no catalisa simplesmente a incorporao de
qualquer nucletido que tenha uma ligao de hidrognio igual do molde. Em
vez disso, a sua actividade exclu bases que no apresentam uma conformao
correcta em relao ao molde. Esta habilidade da DNA polimerase em seleccionar
nucletidos complementares aumenta a capacidade de replicao, de tal forma
que reduz a frequncia de ocorrncia de um erro de 10-3 para 10-5 10-6.
O outro mecanismo responsvel pela capacidade de replicao do DNA a leitura
correcta da molcula de DNA efectuada pelas polimerases. As DNA polimerases
envolvidas na replicao tem uma actividade de exonuclease que pode hidrolisar o
DNA na direco 3 - 5. Estas exonucleases 3 5 operam no sentido inverso
sntese de DNA, e participam na leitura da nova cadeia. Esta leitura eficaz porque
a DNA polimerase necessita de um primer e no capaz de iniciar a sntese de
novo. Os primers que esto ligados cadeia molde so preferencialmente usados,
assim quando uma base incorrecta incorporada, a exonuclease 3 5 activada
e remove-a.
f)

Origem e iniciao da replicao


A replicao do DNA no procariontes e eucariontes inicia-se em locais especficos
designados por origem da replicao, que servem de locais de ligao para
protenas que iniciam o processo de replicao. A primeira origem a ser definida
foi a da E.coli, em que a anlise gentica indicou que a replicao inicia-se sempre
num nico local do cromossoma da bactria. A chave para a replicao a
replicao era a ligao de uma protena iniciadora especfica da sequncia de
DNA na origem de replicao. A protena iniciadora comea por desenrolar o DNA
da origem e recruta outras protenas envolvidas na sntese de DNA. A Helicase e as
protenas single-stranded DNA-binding actuam, ento, na continuao de
desenrolar da cadeia molde do DNA, expondo os seus nucletidos, para que as
primases possam iniciar a iniciar a sntese das cadeias avanadas. As duas
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forquilhas de replicao so formadas e movem-se em direces opostas ao longo
do cromossoma circular da E.coli.

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Apesar de no genoma das bactrias e vrus uma nica origem de replicao


suficiente, no genoma das clulas eucaritas so necessrias mltiplas origens de
replicao.
A presena de mltiplas origens de replicao nas clulas eucariotas foi
demonstrada pela primeira vez em cultura de clulas de mamferos que foram
expostas a timidina radioactiva em diferentes perodos de tempo, seguidamente
realizou-se autoradiografias para detectar a sntese de novas cadeias de DNA. O
estudo dos resultados indicam que o DNA sintetizado em mltiplos locais, onde
ai procede em ambas as direces ao longo do cromossoma.
As origens de replicao dos cromossomas eucariotas foram primeiramente
estudado nas leveduras S. cerevisize, onde se identificou as sequencias que podem
suportar a replicao de plasmdeos em clulas transformadas. Este facto fornece
uma funo para estas sequncias, e vrias elementares foram isoladas (ARSssequncias autnomas de replicao).

Os elementos funcionais do ARS possuem cerca 100 pares de bases, incluindo um


grupo de 11 pares de bases em sequncias que comum em maior parte dos
ARSs. Este grupo essencial para a funo de ARS e foi descoberto no local de
ligao de um complexo proteico (complexo de reconhecimento de origem ORC)
que necessrio para a iniciao da replicao do DNA nas origens da s.cerevisize.
O complexo ORC funciona como recruta de outras protenas (incluindo a MCM
DNA helicase) para a origem, levando iniciao da replicao do DNA na
s.cerevisize semelhante na bactria e nos vrus eucariotas; so protenas
iniciadoras que se ligam especificamente a sequncias de DNA que definem a
origem de replicao.

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g) Telmeros e telomerase: controlo dos terminais dos cromossomas


Porque as DNA polimerase estendem os primers na direco 5-3, estas no so
capazes de copiar as terminaes 5 das molculas lineares de DNA.
Consequentemente, necessrio um mecanismo especial para replicar as
sequncias terminais dos cromossomas lineares das clulas eucariotas. Estas
sequncias (telmeros) consistem em repeties de simples sequncias de DNA.
So controladas pela aco de uma nica enzima denominada telomerase, que
capaz de catalizar a sntese de telmerosna ausncia de modelos de DNA. A
telomerase uma transcriptase reversa, uma classe de DNA polimerase, que foi
descoberta em retrovirus, e sintetizam DNA a partir de um RNA que serve de
molde. importante saber que a telomerase transporta o seu prprio molde de
RNA, que complementar ao telmero, como parte do complexo enzimtico. O
uso deste RNA como molde permite telomerase gerar mltiplas copias das
sequencias telomricas repetidas, permitindo o controlo dos telmeros na
ausncia de um molde de DNA convencional para dirigir a sua sntese.
Em 1985, Carol Greide e Elizabeth Blackbur estudaram a Tetrahymena. A
telomerase da Tetrahymena composta por 159 nucletidos de RNA onde est
includa a sequncia 3- AACCCCAAC-5. Esta sequncia complementar com a
telomrica (5-TTGGGG-3) e serve como modelo para a sntese telomrica de
DNA. O uso deste RNA como modelo permite telomerase extender a terminao
3 do DNA cromossomal por uma repetida unidade para alm da original. A
complementaridade pode se sintetizada pelo complexo polimerase - primase
usando um primer convencional de RNA. A remoo do RNA primer leva a
terminaes 3 desemparelhadas do DNA, que podem formar curvas nos terminais
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dos cromossomas eucariotas. A introduo de genes RNA mutantes de telomerase
nas leveduras demonstrou que correspondia a alteraes nas sequencias
telomricas, demonstrando que a funo da telomerase manter a terminao
dos cromossomas eucariotas.
Defeitos na telomerase e no controlo normal das telomerases esto associados a
vrias doenas humanas. A actividade da telomerase regulada na diviso celular
para manter os telmeros no seu comprimento normal. No entanto este controlo
do tamanho pode no acontecer em clulas somticas pois os nveis de
telomerase no so suficientes. Consequentemente, os telmeros gradualmente
vo diminuir ao longo do tempo de vida da clula, levando sua morte. A perda
dos telmeros leva o envelhecimento das clulas e dos tecidos. Verifica-se que a
alterao na telomerase pode provocar um envelhecimento precoce ou o
aparecimento de clulas cancergenas.

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Aula 19
19) Cancro
a) Introduo
A primeira descrio de cancro remonta aos 3000 anos AC, registado num papiro
egpcio. A origem da palavra vem de carcinos, dada por Hipcrates. Actualmente,
uma importante causa de morte
i) Cancros mais frequentes nos EUA

ii) Cancros mais frequentes na Europa

b) Tipos
Carcinomas (90%): tumor maligno desenvolvido a partir de clulas epiteliais ou
glandulares, que tende a invadir tecidos circulares originando metsteses
Sarcomas (raros): tumor maligno do osso, cartilagem, gordura, msculo, vasos
sanguneos ou tecidos moles
Leucemias e linfomas (7%)
c) Factores
Genticos e epigenticos
Ambientais e estilo de vida
d) Causas
Exgenas (carcinogneos)
o Qumicos: benzopireno, aflatoxinas, ROS (Reactive Oxygen Species)
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o Fsicos: radiao ultra-violeta, radiao ionizante
o Biolgicos: HPV, HBV, Helicobacter pylori
Endgenas
o Replicao do DNA, reaces metablicas que geram ROS e inflamao
crnica

e) Alteraes celulares

i)

Estimulao do crescimento autcrino


Factores de crescimento exgenos so factores de crescimento produzidos pelas
prprias clulas o que faz com que possam proliferar indefinidamente.

As clulas com tumor tm uma enorme taxa de proliferao. Crescem umas


clulas sobre as outras. As clulas de tumores tm origem clonal provm todas
da mesma clula. A protena Ras est envolvida na sinalizao celular; a sua
alterao ou inibio altera a resposta por parte da clula, o que faz com que, em
determinados casos, se formem tumores.
ii) Perda da inibio de contacto
As clulas possuem mecanismos que permitem detectar se necessrio
multiplicar-se de modo a preencher o espao envolvente ou no. Esta capacidade
perdida nas clulas neoplsicas.

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iii) Bloqueia da diferenciao


Nos doentes com leucemia h um bloqueio da diferenciao celular dando origem
a um tumor com clulas indiferenciadas, cuja nica funo capaz de desempenhar
dividir-se. Nas adeses clula-clula e clula-matriz so necessrias caderinas E.
a sua ausncia facilita a invaso do tumor em tecidos adjacentes as clulas ficam
disponveis para que haja essa invaso, formando um aglomerado de clulas.

f)

Etapas de desenvolvimento tumoral

g) Principais caractersticas da neoplasia


Menor dependncia dos factores de crescimento presentes no meio de cultura
Imortalidade
Aneuploidia
Diferenciao incompleta ou ausente
Perda da inibio de contacto
Perda de dependncia do substracto
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h) Tumores benignos e tumores malignos


Benigno
Maligno
Cresce mais depressa que os tecidos normais, Cresce rapidamente e possui uma invaso
mas mais lentamente que os malignos
agressiva, capaz de lesar a estrutura e
inutilizar o tecido
menos evasivo e pode regredir
Tem a capacidade de se metastizar
A formao de um novo tecido regular sendo as So clulas anaerbias, perdendo na sua
clulas semelhantes em tamanho, forma e maioria funes especializadas do tecido
arranjo clula de origem
de origem
No h formao de uma massa tumoral isolada No so revestidos por cpsula ou esta
for fibras conectivas, constituindo uma cpsula, o incompleta ou irregular, tornando a sua
que facilita a sua remoo cirrgica
remoo mais complexa
i)

Doena gentica
O cancro uma doena do DNA que resulta de uma massa tumoral constituda por
fibras, vasos e estroma no qual esto clulas neoplsicas
As mutaes podem levar a que importantes genes sejam perdidos ou
silenciados. As mutaes afectam dois tipos de genes:
Supressores
Proto-oncogenes
i)

Proto-oncogenes
Genes de clulas normais dos quais os
oncogenes derivam
Genes com sequencias muito similares
aos oncogenes
Regulam a proliferao celular normal e
a diferenciao celular

ii) Oncogenes

152

Derivam da mutao dos proto-oncogenes


Produzem ciclinas e factores de crescimento que estimulam a proliferao
celular
Genes dominantes de tumores proporcionam o fentipo neoplsico
No sofrem apoptose
Codificam protenas que diferem em estrutura e funo daquelas codificadas
pelos seus homlogos
As mutaes podem ser:
o Mutaes pontuais diferem dos proto-oncogenes por mudanas
num nico nucletido. Nalguns casos, essas substituies de

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aminocidos levam actividade desregulada das protenas oncogene.


Ex: protenas RAS

Os oncogenes RAS no esto presentes em clulas normais: so gerados em clulas tumorais


como consequncia de mutaes que ocorrem durante o desenvolvimento do tumor. Os
oncogenes RAS diferem dos seus proto-oncogenes por mutaes pontuais resultando em
substituies de um nico aminocido em posies importantes. As mutaes que convertem
proto-oncogenes RAS em oncogenes so causadas por carcinogneos qumicos,
proporcionando uma ligao directa entre a aco mutagnica dos carcinogneos e a
transformao celular.
Os genes RAS codificam protenas de ligao ao nucleotdeo guanina que funcionam em
transduo de sinais mitognicos de uma variedade de receptores de factores de crescimento.
A actividade das protenas RAS controlada pela ligao de GTP/GDP (alteram entre os
estados activo e inactivo). As mutaes caractersticas dos oncogenes RAS mantm as
protenas RAS constitutivamente na conformao activa ligada GTP. Este efeito um
resultado de anulao de resposta de protenas RAS oncognicas para a GAP (protena de
activao da GTPase), que estimula a hidrlise da GTP ligada pela RAS normal. Devido
diminuio resultante da actividade da GTPase intracelular, as protenas RAS oncognicas
permanecem no estado activo ligado GTP e conduzem a proliferao celular desregulada.

Translocaes cromossmicas trocas de segmentos genticos entre


cromossomas. Ex: envolvimento do oncogene c-myc em linfomas de
Burkitt humanos e no plasmocitoma de camundongo (malignidades de
linfcitos B produtores de anticorpos). Ambos os tumores so
caracterizados por translocaes cromossmicas envolvendo genes
que codificam imunoglobulinas.

153

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A translocao do proto-oncogene abl do cromossoma 9 para o cromossoma 22 leva fuso


de abl com o seu par de translocao bcr no cromossoma 22. O resultado a produo de
uma protena de fuso Bcr/Abl na qual a regio amino terminal normal da protena protooncogene Abl foi substituda por sequncias de aminocidos de Bcr. A fuso de sequncia Bcr
resulta numa actividade desregulada da protena-tirosina quinase Abl, levando
transformao celular.

Exemplo:
Linfoma de Burkitt
Praticamente todos os linfomas de Burkitt tm
translocaes de um fragmento do cromossoma 8
para um dos loci do gene da imunoglobulina que
se localiza nos cromossomas 2, 14 e 22. As
translocaes activam um proto-oncogene do
cromossoma 8 inserindo-o nos loci da
imunoglobulina. O proto-oncogene c-myc o
ponto de quebra na translocao do cromossoma
8 em linfomas de Burkitt. Essas translocaes
inseriram c-myc num locus de imunoglobulina
onde foi expresso de uma maneira irregular. Tal
expresso descontrolada deste gene, que codifica um factor de transcrio normalmente
induzido em resposta estimulao de factor de crescimento, suficiente para levar
proliferao celular e contribuir para o desenvolvimento do tumor.

154

Leucemia

Amplificao gnica importante no crescimento rpido e no


aumento da malignidade de muitos tumores

Deleco mutao caracterizada pela remoo de um ou mais


nucletidos de um gene.

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(1) Funes dos oncogenes
o Inibio da apoptose
o Estmulo da proliferao celular
o Bloqueio da diferenciao celular

156

(2) Transduo de sinal e sobrevivncia celular


A maioria das protenas oncogene funciona como elementos das vias de
sinalizao que regulam a proliferao e a sobrevivncia celular em resposta
estimulao de factor de crescimento. Essas protenas oncogene incluem factores
de crescimento polipeptdicos, receptores de factores de crescimento, elementos
das vias de sinalizao intracelular e factores de transcrio.
A aco de factores de crescimento como protenas oncogene resulta da sua
expresso anormal, conduzindo uma situao na qual uma clula tumoral produz
um factor de crescimento para o qual ela tambm responde. O resultado a
estimulao autocrina da clula que produz o factor de crescimento, que conduz
proliferao celular anormal e contribui para o desenvolvimento de uma ampla
variedade de tumores humanos.
Um grande grupo de oncogenes codifica receptores de factores de crescimento, a
maioria dos quais so protena-tirosina-quinases. Esses receptores so convertidos
em protenas oncogenes por alteraes dos seus domnios amino terminais, que
normalmente poderiam ligar factores de crescimento extracelulares.
O receptor do factor de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) convertido
num oncogene em algumas leucemias humanas por uma translocao
cromossomica na qual o amino terminal normal do receptor PDGF substitudo
pelas sequncias amino-terminais de um factor de transcrio chamado Tel. Estas
sequncias da protena de fuso Tel/PDGFR resultante formam dimeros na
ausncia de ligao do factor de crescimento, resultando em actividade
constitutiva do domnio quinase intracelular e produo desregulada de um sinal
proliferativo da protena oncogene. Alternativamente, genes que codificam alguns
receptores protena-tirosina-quinase, como erbB-2, so activados por amplificao
gnica. Outros oncogenes (incluindo src e abl) codificam protena-tirosina-quinase

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no receptores que so activadas constitutivamente por deleces ou mutaes


de sequncias reguladoras.
As protenas Ras tm um papel fundamental na sinalizao mitognica por
acoplamento a receptores de factores de crescimento para a activao da protena
serina/treonina-quinase Raf, que inicia uma cascata de protenas quinases
conduzindo activao da MAP quinase ERK.
A via da MAP quinase conduz fosforilao de factores de transcrio e alteraes
na expresso gnica. Muitos oncogenes codificam protenas reguladoras de
transcrio que normalmente so induzidas em resposta estimulao de factores
de crescimento.
A transcrio do proto-oncogene fos
induzida como resultado da fosforilao de
Elk-1 pela MAP quinase ERK. O fos e o
produto de outro proto-oncogene, Jun, so
componentes do factor de transcrio AP-1,
que activa a transcrio de vrios genes alvo
em clulas estimuladas por factores de
crescimento. A actividade constitutiva de AP-1, resultante da expresso
desregulada das protenas oncogenes Fos ou Jun, suficiente para conduzir
proliferao celular anormal levando transformao celular.
A falha das clulas cancergenas em
sofrerem a apoptose um factor crtico
no desenvolvimento do tumor, e vrios
oncogenes codificam protenas que
actuam promovendo a sobrevivncia
celular. A sobrevivncia das clulas
animais dependente de estimulao de
factores de crescimento, de modo que
aqueles oncogenes que codificam factores
de crescimento, receptores de factores de
crescimento, e protenas de sinalizao,
tais como Ras, actuam no s para
estimular a proliferao celular, mas
tambm para prevenir a morte celular. A
via de sinalizao da quinase PI 3/Akt desempenha um papel importante na
preveno da apoptose de muitas clulas dependentes de factores de
crescimento, e os genes que codificam para quinase PI 3 e Akt actuam como
oncogenes em retrovirus e alguns tumores humanos. Os alvos da cascata de
sinalizao da quinase PI 3/Akt incluem um membro da famlia Bcl-2 (Bad), e
notvel que Bcl-2 foi descoberto como um oncogene em linfomas humanos. O
oncogene Bcl-2 gerado por uma translocao cromossmica que resulta numa
expresso elevada de Bcl-2, que bloqueia a apoptose e mantem a sobrevivncia da
clula sob condies que normalmente induzem a morte celular.

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iii) Genes supressores de tumor

Codificam protenas que inibem a proliferao e sobrevivncia celular


P-53: gene mais estudado que vigia o controlo celular, reparando os danos do
DNA e iniciando a apoptose
A perda ou inactivao destes genes permite que os centrossomas se
multipliquem em rplicas quando no o deveria fazer, levando aneuploidia
nmero de cromossomas de uma clula aumentado ou diminudo
So recessivos

(1) RB
(a) Regulao do ciclo celular pelo Rb
A Rb tem um papel importante
na ligao da maquinaria do
ciclo celular para a expresso de
genes necessrios durante o
ciclo celular e a sntese de DNA.
A Rb fosforilada e liga-se a
membros da famlia E2F,
reprimindo a transcrio do
gene de regulao de E2F. A fosforilao de Rb pelos complexos
Cdk4,6/ciclina D resulta na dissociao de Rb de E2F no final de G1. Assim,
E2F vai estimular a expresso dos seus genes alvo, que vo codificar
protenas necessrias ao ciclo celular.
158

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(b) Deleco do Rb
O desenvolvimento do retinoblastoma est associado a duas mutaes:
Perda de ambas as cpias funcionais do gene supressor de tumor Rb,
que estariam presentes em cromossomas homlogos de uma clula
diploide normal;
Segunda mutao somtica que leva perda do alelo Rb normal
restante.
A importncia do gene supressor de
tumor Rb estende-se alm do
Retinoblastoma, contribuindo para o
desenvolvimento de outros cancros.
A protena Rb um alvo-chave para
as protenas oncogenes de vrios
virus DNA de tumores, incluindo
SV40, adenovrus e papiloma vrus
humano, que se ligam a Rb e inibem
a sua actividade. Assim, a
transformao por esses vrus
resulta, em parte, de inactivao de
Rb no nvel da protena em vez da
inactivao por mutao do gene Rb.
No retinoblastoma hereditrio, uma cpia defeituosa do Rb (rb-) herdada de
um dos pais afectados. Uma segunda mutao somtica, que inactiva a nica
cpia normal (Rb+) em clulas da retina, leva ao desenvolvimento de
retinoblastoma. Em casos no hereditrios, dois genes Rb+ normais, so
herdados e o retinoblastoma desenvolve-se somente se duas mutaes
somticas inactivam ambas as cpias de Rb na mesma clula.

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(2) P53
O produto do gene p53 regula tanto a
progresso do ciclo celular como a apoptose.
O dano no DNA leva induo rpida do p53
que activa a transcrio do inibidor do p21 de
Cdk. Este inibidor bloqueia a progresso do
ciclo celular, tanto actuando como um inibidor
geral de complexos Cdk/ciclina como inibindo
a replicao de DNA pela ligao PCNA
(antignio nuclear da proliferao celular). O
ciclo celular interrompido resultante concede tempo para que o DNA seja
reparado antes de ocorrer sua replicao. A perda de p53 impede esta
interrupo no ciclo celular induzida por dano, levando a frequncias
aumentadas de nutao e a uma instabilidade geral do genoma celular. Tal
160

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instabilidade gentica uma propriedade comum de clulas cancergenas e


pode contribuir para alteraes adicionais em oncogenes e genes supressores
de tumor durante a progresso tumoral.
Alm de intermediar a interrupo do ciclo celular, o p53 necessrio para a
apoptose induzida por dano no DNA. O dano no reparado de DNA induz a
apoptose de clulas mamferas uma resposta vantajosa para o organismo j
que elimina clulas com mutaes prejudiciais. Assim, clulas sem p53 no
sofrem apoptose em resposta a agentes que danificam o DNA, incluindo
radiao e drogas usadas na quimioterapia. Esta falha em sofrer apoptose
contribui para a resistncia de tumores quimioterapia. Alm disso, a perda
de p53 interfere tambm com a apoptose induzida por outros estmulos, como
privao de um factor de crescimento ou de oxignio.
iv) Reparao do DNA
O DNA, assim como qualquer outra molcula pode sofrer uma variedade de
reaces qumicas. Mas, como o DNA sofre uma cpia permanente, mudanas na
sua estrutura tm consequncias muito profundas. As mutaes podem ser
resultado de incorporao incorrecta de bases durante a replicao de DNA. Estas
mutaes podem bloquear a transcrio ou a replicao o que pode culminar em
consequncias insuportveis do ponto de vista celular. Para manter a sua correcta
funo os genes desenvolveram mecanismos de reparao de DNA.
Mecanismos de reparao
de DNA

Reverso directa da reaco


qumica

Remoo das bases alteradas


seguida de substituio com
DNA recm-sintetizado

(1) Reverso directa da leso no DNA


So poucos os tipos de leses no DNA que podem ser reparados atravs da
reverso directa. Exemplos: dmeros de timina que resultam da exposio luz
UV e resduos de guanina alquilados que foram modificados pela adio de
grupos metila ou etila.
A luz UV uma grande fonte de dano ao DNA. No caso da timina a luz UV
provoca a formao de dmeros de timina que so unidas por um anel de
ciclobutano.
A formao dos dmeros distorce a estrutura da cadeia de DNA e bloqueia a
transcrio ou a replicao aps o local da leso. Um mecanismo de reparao
da leso a reverso directa da leso, por um processo de fotorreativao,
uma vez que a energia da luz visvel usada para quebrar a estrutura do anel
de ciclobutano.
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As bases pirimidicas iniciais permanecem no DNA, restitudas ao seu estado
normal.

(2) Remoo das bases alteradas seguida de substituio com DNA recmsintetizado
(a) Exciso de base
Apenas uma base reconhecida e a
DNA glicosilase elimina a ligao entre a
base azotada e a desoxirribose. No
existindo base azotada, a AP
endonuclease corta a cadeia de DNA. A
desoxirribose removida por uma
enzima e o intervalo existente
preenchido pela DNA polimerase e
posteriormente celado pela ligase.

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(b) Exciso de nucleotdeo


Neste tipo de reparao as bases lesadas (dmeros de timina por exemplo)
so removidas como parte de um oligonucleotdeo contendo a leso. O
DNA lesado identificado e clivado em ambas as posies. A aco de uma
helicase remove o oligonucleotdeo que contm a leso, sendo a falha
resultante preenchida pela DNA polimerase e selada pela ligase.

(c) Reparao por recombinao homloga


A reparao de quebras de dupla cadeia baseada no modelo de Holliday.
Segundo este modelo a recombinao iniciada pela introduo de cortes
em posies idnticas nas duas molculas de DNA. As fitas cortadas
sofriam um desenrolamento e cada uma dela juntava-se a outra molcula
de DNA por pareamento de bases complementares como a fita no
cortada. A ligao das fitas gera uma juno de Holliday devido s fitas
entrecruzadas. Aps a formao da juno pode haver um corte e
rejuno das fitas entrecruzadas, gerando-se molculas recombinantes.
(numa modificao deste modelo apenas uma das molculas parentais
sofre corte).

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j)

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Cancro circuito celular

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k) Cancro colorectal

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Aula 20
20) Morte celular
a) Tipos de morte celular
i) Apoptose: tipo de auto-destruio celular que ocorre de forma ordenada e
necessita de energia para a sua execuo, est relacionada com a manuteno da
homeostase e regulao fisiolgica do tamanho dos tecidos
ii) Necrose: processo patolgico e desordenado causado por factores que levam
leso celular irreversvel e consequente morte celular

iii) Autofagia
Degradao lisossomal de protenas e organelos
Condensao parcial da cromatina
Vacuolizao massiva do citoplasma
Doenas associadas:
o Neurodegenerativas
o Neuromusculares
o Cancro

b) Apoptose
Foi descrita em 1972. Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1701.html
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i)

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Papis
Desenvolvimento embrionrio
O ser humano, no incio do seu desenvolvimento embrionrio tem os dedos
das mos juntos. necessrio ocorrer a apoptose nesses locais para ocorrer
um correcto desenvolvimento.

Homeostase tecidular (intestino, pelo, sangue)


Remoo de clulas indesejveis (infectadas por vrus, do S. I., com mutaes
no DNA)
ii) Doenas
(1) Por elevada taxa de apoptose
Neurodegenerao (Alzheimer, Parkinson)
Isqumia
Trauma
Ataque cardaco
Infeces bacterianas e virais
Rejeio de enxertos
(2) Por baixa taxa de apoptose
Tumores
Doenas auto-imunes
Infeces persistentes
iii) Morfologia
Durante a apoptose, o DNA
cromossmico

normalmente
fragmentado em resultado do corte
da ligao entre nucleossomas. A
cromatina condensa e o ncleo
divide-se em pequenas pores.
Finalmente, a clula encolhe e acaba
estilhaada
em
fragmentos
rodeados de membrana, chamados de
corpos apoptticos.

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iv) Bioqumica
As clulas e os fragmentos apoptticos so eficientemente reconhecidos e
fagocitados tanto pelos macrfagos como pelas clulas vizinhas, sendo as clulas
que morreram por apoptose rapidamente removidas dos tecidos. Contudo, as
clulas que morrem por leso incham e sofrem lise, libertando o contedo no
espao extracelular, causando inflamao.
A remoo das clulas apoptticas medida por sinais eat me na superfcie da
clula. Estes sinais incluem a fosfatidilserina (normalmente na parte interior da
membrana), sendo esta expressa durante a apoptose na superfcie da clula,
sendo reconhecida por receptores expressos pelas clulas fagocticas

v) Famlias
(1) Caspases
Caspases: cistena, cido asprtico, protases
So, por excelncia, as protenas iniciadoras (caspases 2, 8, 9 e 10) e
executoras (caspases 3, 6 e 7) da morte celular programada, mediando os
eventos apoptticos de cerca de 100 protenas diferentes. Uma delas um
inibidor, a DNase, que quando activado responsvel pela fragmentao do
DNA. Alm disso, as caspases quebram a
lmina nuclear (fragmentao do ncleo) e
as protenas do citosqueleto, levando
disrupo do citosqueleto, formao de
bolhas de membrana e fragmentao da
clula.
Todas as caspases so sintetizadas como
inactivas, podendo apenas ser activas por
clivagem protelitica, catalizada por outras
caspases. Da, a activao de uma caspases
iniciadora leva a reaces em cadeia,
culminando nas caspases executoras e na
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morte celular. Logo, central a regulao das caspases para a sobrevivncia


celular.
Por exemplo, a Apaf-1 liga-se s caspases e promove a sua activao. Nos
mamferos, a principal caspase iniciadora (caspase-9) activada por ligao
Apaf-1 num complexo a que se chama apoptossoma. A formao deste
complexo requer tambm citocromo C, que libertado da mitocndria para
estimular e activar a apoptose. Uma vez activado o complexo, a caspase 9
activa outras caspases efectoras, como a caspase 3 e 7, resultando
eventualmente na morte celular.

(2) Bcl-2
Bcl-2: Clulas B, Linfoma
Primeiramente, o gene bcl-2 foi identificado como um oncogene que
contribua para o desenvolvimento de linfomas das clulas B.
Nos mamferos, so codificadas
cerca
de
20
protenas
relacionadas com a Bcl-2
(protena), sendo divididas em
trs grupos. Alguns membros
da famlia Bcl-2 funcionam
169

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como inibidores da apoptose e morte celular programada. Outras, induzem a


apoptose por activao das caspases. H dois grupos de protenas proapoptticas que diferem em funo e na estrutura. As protenas antiapoptticas partilham 4 regies homlogas, chamadas de domnios BH (Bcl-2
Homology). Um dos grupos pro-apoptticos tem apenas uma regio
homloga enquanto o segundo tem trs regies homlogas.
O destino da clula determinado pela balano da actividade proapopttica e anti-apopttica das protenas da famlia Bcl-2, que actuam
como reguladoras de
outras. Os membros
da multi domain
proapopttica,
como a Bax e Bak,
so efectores que
induzem
directamente
a
apoptose. Eles so
inibidos
por
protenas da famlia
anti-apopttica,
como a Bcl-2. Os
membros da BH3only family so
membros da cascata de apoptose, sendo regulados por sinais que induzem a
morte celular (como DNA danificado) ou a sobrevivncia celular (factores de
crecimento). Quando activada, a BH3-only family liga-se a membros da
famlia anti-apopttica, levando activao de protenas pro-apoptticas
e colocando o balano a favor da activao das caspases, levando morte
celular.
vi) Vias de sinalizao
As vias de sinalizao so variadas, sendo destacadas a via mitocndrial e a via dos
receptores de morte.
(1) Via mitocondrial
Nos mamferos, os membros da famlia Bcl-2 actuam na mitocndria,
desempenhando um papel importante no controlo da morte celular
programada. Quando a Bax e a Bak so activadas, formam oligmeros na
membrana exterior da mitocndria. A formao de oligmeros de Bax e Bak
levam libertao de citocromo C do espao intermembranar da mitocndria,
quer pela formao de poros quer pela interaco com outras protenas da
membrana exterior. A libertao de citocromo C inicia a activao das
caspases.

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A actividade das caspases tambm


regulada por uma famlia de protenas
chamadas IAP (Inibitor of Apoptosis).
Os membros desta famlia interagem
directamente com as caspases e
suprimem a apoptose quer por inibio
da actividade da caspases quer por
levando ubiquitinao das caspases e
degradao no proteossoma. A
permeabilizao
da
membrana
mitocndrial pela Bax ou Bak resulta
no s na libertao de citocromo C
mas tambm de outras substncias que
promovem a apoptose, tal como a
Smac/Diablo e a Omi/Htr2).

(2) Via dos receptores de morte


Os receptores de morte
conseguem
activar
directamente uma caspase
iniciadora. TNF e os membros
da restante famlia tm trs
cadeias polipeptdicas iguais, e
a sua ligao induz a
trimerizao dos receptores. A
poro citoplasmtica dos
receptores liga-se a molculas
adaptadoras que conseguem
ligar-se
a
uma
caspase
iniciadora (caspase 8). Isto leva
activao da caspase 8 e
subsequente activao de
outras caspases.

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vii) Regulao
Um importante papel da apoptose a eliminao de clulas danificadas. Devido ao
facto de poder gerar cancro, o dano no DNA um dos principais interruptores para
a morte celular programada.
(1) P53
Nos mamferos, a via maioritria que leva
prolongao do ciclo celular em resposta a danos
no DNA mediada pela factor de transcrio p53.
As quinases ATM e CHK so activadas por erros
no DNA, fosforilando e activando a p53. Quando
h aumento de p53, so transcritos genes-alvo da
p53, tal como o inibidor de Cdk (p21) que inibe
complexos Cdk1/ciclina e Cdk2/ciclina, parando a
progresso no ciclo. Contudo, a activao da p53
pode tambm levar apoptose. A induo da
apoptose por p53 resulta, pelo menos em parte,
na activao da transcrio de genes que
codificam BH3-only proapoptotic Bcl-2 family
members, tal como a PUMA e a Noxa.

(2) Cinase PI3

Uma das vias de sinalizao responsvel pela promoo da sobrevivncia da


clula iniciada pela PI 3-kinase, que activada por protein-tyrosine kinases
ou por protenas G ligadas a receptores. A PI-3 kinase fosforila a membrana
fosfolipdica PIP2 para formar PIP3 que activa a protein-serina/threonino
kinase (Akt) que fosforila algumas protenas que regulam a apoptose. Uma
delas a Bad (membro da famlia pro-apopttica BH3-only).

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