veces, l.

as buenas ideas surgen

por casualidad. En mi caso
ocurri6 asi: gracias a una rara
combinaci6n de coincidencias, ingenuidad y felices errores, me vino la
inspiraci6n un viernes de abril de
1983 mientras, al volante del coche,
serpenteaba a la luz de 1\luna por
una carretera de montalia del norte
de California que atraviesa un bosque de secuoyas. Me di de bruces con
un proceso que permite fabricar un
numero ilimitado de copias de cualquier gen: la reacci6n en cadena de la
pclimerasa (RCP).
A partir de una sola molecula de
ADN, la RCP puede generar 100.000
millones de moleculas identicas en
una tarde. La reacci6n es muy sencilla, s610 necesita un tuba de ensayo,
algunos reactivos y una fuente de calor. La muestra de ADN que se desea
copiar no tiene forzosamente que ser
pura: basta incluso la infima parte de
una mezcla extraordinariamente
compleja de materiales biol6gicos. EI
ADN puede proceder de una muestra
de tejido de un hospital, de un cabello
humano, de una gota de sangre coa-

KARY B. MULLIS se autodefine

como "un generalista con prejuicios quimicos". Creador de la reaccion en cadena
de la polimerasa, ha inventado tam bien
un plastico que cambia de color tras la exposicion a la luz ultravioleta. Se doclOro
en bioquimica en 1972. Complet6 su formaci6n investigadora en la facultad de
medicina de la Universidad de Kansas y
en la Universidad de California en San
Francisco. Mullis ingreso despues en Iii
Cetus Corporation. donde descubrio la
reacci6n en cadena de la polimerasa. Posee en La Jolla su pro pia oficina asesora
en tecnica de la RCP y quimica de acidos
nucieicos.

gulada en la escena de un crimen, de

los tejidos de un ce,rebro momificado
o de un mamut lanudo muerto hace
40.000 alios y conservado en un glaciar.
Ha.f\ pasadoya
siete alios desde
aquella noche y la utilizaci6n de Ja
RCP se ha propagado a todas las ciencias biolOgicas. Asi 10 atestiguan los
mas de 1000 articulos publicados en
los que se describe su uso. Dado d
imp acto de la RCP en las investigaciones biol6gicas y su sencillez COIlceptual, el hecho de que a nadie se Ie
ocurriese
durante mas de quince
alios, a pesar de que todos los el~mentos necesarios se hallaban en circulaci6n, no deja de sorprender a mucha gente.
a reacci6n en cadena de la poliL
merasa simplifica la labor de los
bi610gos moleculares, pues con ella
obtienen la cuantia de ADN que deseen. Podriaparecer
que purificar
moleculas de ADN es tarea faci!. La
verdad es que en la practica cue~ta
conseguir una molecula bien definida
de ADN natural de cualquier organismo, si dejamos de lado los virus
mas simples.
La diflcultad reside en la propia r.aturaleza de la molecula. EI ADN eS
una deiicada cadena compuesta de
cuatro tipos de desoxinucle6tidos:
desoxiacienilato (A), desoxitimidilato
(T), desoxiguanilato (G) y desoxicitidilato (C). La secuencia de estas bases determina la informacion genetica. Los ADN monocatenarios son raros; normalmente. parejas de cadenas
con secuencias complementarias forman dobles helices donde las A de
una cadena se emparejan can las T
de la otra. y las G can las C [vease fa
figura 1]. En el interior de las celulas,
la helicl~ de ADN est a a su vez en '0llada y rodeada de diversas protein 15.

Cuando los bi610gos int,entan aislar

una cadena de ADN desnuda, esta es
tan larga y delgada que hasta los tratamientos mas suaves la rompen aleatoriamente en multiples pedazos. Por
ello, si se extrae ADN de 1000 celulas
identicas, habra 1000 copias de cualqui era de los genes de dicho ADN,
pero cad a copia se hallara en un fragmento de distinta longitud.
Durante alios este problema dificult6 el estudio de los genes. Hasta
que en los alios setenta se descubrieron las restrictasas, enzimas que cortan las cadenas de ADN por sitios especificos. Las restrictasas permiten
cortar el ADN en fragmentos menores, mas consistentes e identificables,
merced a 10 cual resulta mas facil ai~;lar los fragmentos que portan el gen
que nos interese.
A finales de los anos setenta, 105
bi610gos moleculares andaban muy
ocupados estudiando ADN ,can restrictasas y otras moIeculas: las sondas
de oligonucleotidos.
L1amase oligonucleotido una cadena breve de bases
nucleotidicas
especificamente
ordenadas. Bajo condiciones experimentales adecuadas, un oligonucieotido
se unira de manera especifica can una
secuencia de nucleotidos complementaria. Por tanto, los 0ligonucle6tidos
marcados
radiactivamente,
sintetizados en ellaboratorio,
sirven de sonda para determinar si una muestra de
ADN contiene una secuencia de nucleotidos especifica (gen). En 1979,
la empresa Cetus Corporation,
de
Emervville, California, me contrato
para sintetizar sondas de oligonucleotidos.
Hacia 1983, sin embargo, la sintcsis
de oligonucleotidos
como forma de
ganarse la vida empez6 a perder su
encanto, para mayor felicidad de
quienes nos dedicabamos a eso. Ellaborioso pero muy singular procedi-

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nucleotidos, al que nos habiamos comodamente amoldado, dejaba paso a

una menos encantadora
pero fiable
kcnica automatizada.
EI avance fue
considerable.
Gracias a est a pequefia revolucion
industrial, los quimicos de nucleotidos nos encontramos,
afortunadamente, con una gran cantidad de
tiempo libre. Las maquinas de laboratorio, que nosotros cargabamos y
vigilabamos, fabricaban mas nucleotidos casi de los que cabian en el
congelador, y, ciertamente,
mas de
cuantos
los biologos
mole cuI ares
-quienes parecian trabajar mas lenta
y cansinamente de 10 que habiamos
previstopodian usaren sus experimentos. Por tanto, en mi laboratorio
de la Cetus teniamos mucho tiempo
para pensar y lucubrar.
Y me encontre a mi mismo entregado a la especulacion sobre los oligonucleotidos:
Sabia que una tecnica que permitiese facilmente identificar el nucleotido presente en una~sicion
determinada de una molecula de AD N seria muy util, sobretodo
en los casos
de gr2n complejidad del ADN (como
en el ADN humano) y pequefia can-

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se podia utilizar \a enzima polimerasa de ADN en una variante del metodo de secuenciacion con didesoxidos.
y disefie un candido experimento para
someter esa idea a comprobacion.
Para entender que me rondaba por
la mente, conviene recordar ciertos
aspectos del ADN. Los extremos de
una cadena de ADN se denominan.
por convencion quimica. 3' y 5'. En
una doble helice de ADN.las cadenas
complementarias se dice que son antiparalelas, ya que el extremo 3' de
una de las cadenas se empareja con el
5' de la otra, y viceversa.
En 1955, Arthur Kornberg y sli
grupo, de la Universidad de Stanford ..
descubrieron la polimerasa de ADN.
Estas enzimas celulares desempefian
varias funciones, entre elias, la repa-,
racion y replicacion del ADN. Pue
den elongar un breve oligonucleotido
"cebador",
afiadiendo a su extrema
3' mas nucleotidos, pero solo si el cebador se hibrida. 0 une. a una cadena
complementaria.
que recibe entonces
el nombre de molde. La solucion donde se lleva a cabo la reaccion de be
contener tambien nucleotidos trifosfatados, que son los ladrillos de esta
construccion.

1. EL ADN consta de dos cadenas de nucle6tidos: desoxiadenilatos (A l,

desoxitimidilatos In, desoxiguaniiatos (Gl y desoxicitidilatos (Cl. La secllencia de nucle6tinos en una de las cadenas es complementaria de la olra.

ayamos ahora a la tecnica de seV

cuenciacion
con didesoxidos;
tambien lIamada de Sanger, en honor
de uno de sus inventores, Frederick
Sanger, del Laboratorio de Biologia
Molecular del Consejo de Investigaciones Medicas Britanico. Esta tecnica utiliza una polimerasa de ADN,
cadenas, moldes, cebadores, nucleotidos trifosfatados y didesoxidos trifosfatados especiales (ddNTP) para
determinar secuencias de ADN. Igual
que los nucleotidos normales, las polimerasas
pueden
incorporar
los
ddNTP en la nueva cadena que crece
a partir del cebador; sin embargo,
cuando esto ocurre, el ddNTP blo-

esto es. las A emparejan con las T, y las G con las C; esta complementariedad mantiene unidas ~.las dos cadenas. Cada cadena posee un extremQ
3' ,r otro 5'. Por esa orientacion opuesta se dice que son antiparalelas.

.quea el extrema 3'; no cabe anadir ya'

ffias bases. La tecnica de Sanger produce caderoas de longitud variable,
cuyos tamanos dependen del momento en que se incorpore el ddNTP. Ordenando estos fragmentos por tamanos, y sabiendo que ddNTP se ha incorporado, se determina la secuencia
de bases de una cadena molde. Por

ejemplo, si se ha incorporado en cierta posici6n didesoxiadenina (ddA), la

base complementaria
correspondiente en el molde sera una T; la adici6n
de una didesoxiguanina (ddG) implica la presencia de C en el molde.
En la versi6n modificada de esta
tecnica, yo pensaba utilizar s610 polimerasas, moldes, ddNTP y molecu-

las cebadoras; omitirfa, por tallO, los

nucle6tidos
trifosfatados
normaJ,es.
La elongaci6n de los cebadores 3Gl"
baria cuando se anadiese a la cadena
una base de un ddNTP. Si conociera
que ddNTP se habfa agregado al cebador, sabrfa tambien la identidad de
la base correspondiente
de la cadena
molde. Podrfa asf deducir la identidad

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64 CaPIAS

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2. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA, tecnica sencilla con

la que se puede copiar un fragmenw de ADN en ellaboratorio, empleando

reactivos asequ ibles. El numero de copias aumenta exponencialmente: en

unas pocas hOlas se pueden fabricar mas de 100.000 millones de elias.

Irrrenr\TclC~:>lIlleSIS

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nucleotidos, al que nos habiamos comodamente amoldado, dejaba paso a

una menos encantadora
pero fiable
tecIlica automatizada.
EI avance fue
considerable.
Gracias a esta pequefia revolucion
industrial, los quimicos de nuc\eotidos nos encontramos,
afortunadamente, con una gran cantidad de
tiempo libre. Las maquinas de laboratorio, que nosotros cargabamos y
vigilabamos, fabricaban mas nucleotidos casi de los que cabian en el
congelador, y, ciertamente,
mas de
cuantos
los biologos
moleculares
-quienes parecfan trabajar mas lenta
y cansinamente de 10 que habiamos
previsto- podian usar en sus experimentos. Por tanto, en mi lab oratorio
de la Cetus teniamos mucho tiempo
para pensar y lucubrar.
Y me encontre a mi mismo entregada a la especulacion sabre los oligonucleotidos:
Sabia que una tecnica que permitiese facilmente identificar el nucleotido presente en una~sicion
determinada de una molecula de AD N seria mllY util, sabre todo en los casas
de gr2H complejidad del ADN (como
en el ADN humano) y pequefia can-

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se podia utilizar \a enzima pOlimeraS3 de ADN en UIla variante del metodo de sccuenciacion con didesoxidos.
y disefie un candido experimento para
someter esa idea a comprobacion.
Para entender que me rondaba par
la mente, conviene recordar ciertos
aspectos del ADN. Los extremos de
una cadena de ADN se denominan.
por convencion quimica. 3' y 5'. En
una doble helice de ADN.las cadenas
complementarias se dice que son antiparalelas, ya que el extrema 3' de
una de las cadenas se empareja can el
5' de la otra, y viceversa.
En 1955, Arthur Kornberg y su
grupo, de la Universidad de StanJord ..
descubrieron la polimerasa de ADN.
Estas enzimas celulares desempefian
varias funciones, entre ellas, la repa-,
racion y replicacion del ADN. Pue
den elongar un breve oligonucleotido
"cebador",
afiadiendo a su extrema
3' mas nucle6tidos, pero solo si el cebador se hibrida. a une. a una cadena
complementaria.
que recibe entonces
elnombre de molde. La soluci6n donde se \leva a cabo la reacci6n debe
contener tambien nucle6tidos trifosfatados, que son los ladrillos de esta
construcci6n.

L EL ADN consta de dos cadenas de nucle6tidos: desoxiadenilatos (A),

desoxitimidilatos (n, desoxiguanilatos (G) y desoxicitidilatos (C). La secllencia de nucle6tinos en una de las cadenas es complementaria de la olra.

C! liucreulluu

que

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merasa sera complementario

can L
base que se aloja en la posici6n ell;"
rrespondiente de lacadena molde. P
ejemplo, si el nucleotido ~e la cac;lena
molde es una A, la polimerasa afiad::
una T; si es uha G, afiade una C. De
esta manera, la polimerasa elonga el
extrema 3' del cebador en direcci6n
al extrema 5' hasta el final de la cadena molde [vease fa figura 3]. En una
doble helice de ADN, cad a una de las
cadenas sirve de molde para la otra
durante la replicacion Y reparaci6n.
ayamos ahora a la tecnica de seV
cuenciacion
can didesoxidos,
tambien llamada de Sanger, en honor
de uno de sus inventores, Frederick
Sanger, del Laboratorio de Biologia
Molecular del Consejo de Investigaciones Medicas Britanico. Esta tecnica utiliza una polimerasa de ADN,
cadenas, moldes, cebadores, nucleotidos trifosfatados y didesoxidos trifosfatados especiales (ddNTP) para
determinar secuencias de ADN. Igual
que los nucle6tidos normales, las polimerasas
pueden
incorporar
los
ddNTP en la nueva cadena que crece
a partir del cebador; sin embargo,
cuando esto ocurre, el ddNTP blo-

esto es. las A emparejan con las T, y las G con la5 C; esta complementariedad mantiene unidas ~,las dos cactenas. Cada cadena posee un extremo
3' y otro 5'. Por esa orientaci6n opuesta se dice que son antiparalelas.

.quea el extrema 3'; no cabe anadir ya'

mas bases. La tecnica de Sanger produce cader;as de longitud variable.
cuyos tamanos depen&n del momento en que se incorpare el ddNTP. Ordenando estos fragmentos par tam anos. y sabiendo que ddNTP se ha incorporado, se determina la secuencia
de bases de una cadena molde. Par

ejemplo, si se ha incorporado en cierta posici6n didesoxiadenina (ddA), la

base complementaria
correspondiente en el molde sera una T; la adici6n
de una didesoxiguanina (ddG) implica la presencia de C en el molde.
En la versi6n modificada de esta
tecnica, yo pensaba utilizar s610 polimerasas, moldes, ddNTP y molecu-

las cebadoras; omitiria, por ta1to, los

nucle6tidos
trifosfatadbs
narmales.
La elongaci6n de los cebadores aca
baria cuando se anad'iese a la cadena
una base de un ddNTP. Si conociera
que ddNTP se habia agregado al cebador, sabria tambien la identidad de
la base correspondiente
de la cadena
molde. Podria asi deducir la identidad

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2. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA, tecnica senciJla con

la que se puede copiar un fragmento de ADN en ellaboratorio. empleando

reactivos asequibles. El numero de copias aumenta exponencialmente: en

Unas pocas hOlas se pueden fabricar mas de 100.000 millones de ellas.

de la base de una cadena molde advacente al sitio don de se uniese el cebador.

Endeesequemomenta
habia

no cai en la cuenta
poderosas razones
para que mi idea fracasase. EI problema era que los oligonucleotidos, a
veces, hibridan can otras secuencias
de ADN, que no son las que nos interesan. Estos inevitables emparejamientos habrian introducido bastante
ambigiiedad en mis resultados. Incluso con las manos mas diestras en el
arte de la hibridacion, es imposible
conseguir quese unan oligonucleotidos al ADN humano con suficiente
especificidad como para obtener un
resultado al men os minimamente significativo.
Por culpa de ese inconveniente, los
investigadores
han recurrido a procedimientos tortuosos para escrutar el
ADN humano. Par ejemplo, se emplean restrictasas para cortar la muestra de ADN en varios fragmentos,
que se separan par electrofaresis. Se
consigue con ello "purificar" en cierta
forma los fragmentos diana del resto
del ADN, antes de proceder a la hibridacion con la sonda de oligonucleotidos. Este procedimiento reduce
10 suficiente las hibridaciones erro~
neas como para obtener resultados
significativos,
aunque minimos. Se
trata, ademas, de un proceso bast ante
largo y no sirve para trabajar con
muestras de ADN degradado 0 desnaturalizado.
Otra tecnica onerosamente
larga
para el amilisis rutin aria del ADN se
vale de la clonacion. En un plasmido.
un pequeno anillo de ADN. podemos
clonar 0 copiar la secuencia de ADN
humano que nos importe. EI recurso
alas bacterias nos ofrece copias de dicho plasmido. y de la secuencia deseada. La informacion sobre Ia secuencia se puede obtener utilizando
las tecnicas de hibridacion con oligonucleotidosy de secuenciacion con didesoxidos. A comienzos de la decada
de los ochenta. la mayor parte de la
informacion
sobre
secuencias
de
ADN humano procedia de la clonacion y secuenciacion del ADN con
esta ultima tecnica.
En el protocolo de mi candido experimento, se daba por supuesto que
la utilizacion de oligonucleotidos para
detectar
secuencias
especificas de
ADN humano can una simple hibridaciun hacia innecesario recurrir a la
clonacion a a cualquier otra tecnica.
En ddensa de mi erroneo planteamiento, debo decir que uno de los
grupos de Cetus qU,e trabajaban en el
piso de abajo. dirigido por Henry A.
Erlich. intentaba otro metodo basado

en la hibridacion de un simple oligonucle6tido a un ADN humano diana.

Nadie se carcajeaba de Henry, y a todos nos pagaban regularmente.
De
hecho nos pagabanlo suficiente como
para que algur10 de nosotros pensasemos, quizas insolentemente,
que
estabamos poco menos que en la
frontera de la tecnologia del ADN.
Un viernes par la noche, a finales
de primavera, me dirigia a Mendocino Country con una amiga quimica.
Ella darmia. No iba casi nadie por la
autopista a aquellas horas. Me gustaba conducir de noche; los fines de
seman a salfa hacia el norte, ami cabana, sentado tranquilamente durante tres horas en mi coche, las manos
ocupadas, la mente libre. Esa noche,
concretamente,
pensaba en mi experimento de secuenciaci6n de ADN.
planes eran sencillos. ComenMiszaria
por separar un ADN diana en cadenas sencillas, calentandolo.
La hibridaria despues con un oligonucle6tido cuya secuencia fuese complementaria con algun fragmento de
una cadena. Colocaria porciones de
esta mezcla de ADN en cuatro tubas
distintos. Cada tuba contendria los
cuatro tipos de ddNTP, pero en cada
uno de ellos habria un ddNTP distinto
marcado con radiactividad. Anadiria,
a continuacion, polimerasa de ADN,
que elongaria en un solo ddNTP los
oligonucleotidos que hubiesen hibridado en cada tubo. Mediante electroforesis podria separar los oligonucleotidos result antes de los ddNTP que no
hubiesen
hibridado.
Identificando
que ddNTP marcado radiactivamente
se habia incorparado en el oligonucleotido, podria determinar la correspondiente base complementaria de la
cadena diana. Sin mas.
Cerca de Cloverdale,
don de se
abandona la autopista para tomar una
carretera queserpentea
costa arriba.
decidi que seria mejor si, en vez de un
solo oligonucleotido,
usaba dos. Los
dos cebadores rJdearian al par de bases que esperaba identificar. Utilizando oligonucle6tidos
de distinto tamano, podria distinguirlos. Si. ademas. cada oligonucleotido era especifico del ADN diana de una cadena.
obtendria informaci6n sabre las dos
cadenas complementarias.
El experimenta contaria de est a manera can un
control interno, sin que ello supusiese
ninguna molestia adicional [vease fa
jlgura 4].
Aunque en ese momenta no me di
cuenta, can los dos oligonucleotidos
en mi cabeza. con sus extremos 3'
apuntandose uno a otro. en cadenas
opuestas del gen diana. estaba a punta de descubrir la reaccion en cadena

de la polimerasa. De 10 que sf est\:i\~e'

a punto, no obstante, fge de salirrne !
de la carretera y despenanne.
La noche era humeda y se percibia
el alar de los castanos de indias florecidos. Las blancasinflorescencias
se
interponian
ante mi, deslumbradas
por los faros del coche. Iba yo pensando en los nuevos estanques que estaba construyendo en mi finca y lucubrando en los fallos posibles del experimento de secuenciaci6n.
e mi etapa postdoctoral en ellaboratorio de Wolfgang Sadee,
en la Universidad de California en
San Francisco, donde John Maybaum
utilizaba los nucle6tidos para ensayos
clinicos, recarde que mis muestras de
ADN podian contener trazas de nucle6tidos trifosfatados. Pense que la
interpretacion del gel se complicaria,
si los nucleotidos extraviados que fuesen con la muestra se incorporasen en
el extremo 3' del cebador, antes de la
prevista adici6n de los ddNTP marcados.
Se me ocurri6 destruir los nucleotidos trifosfato libres con fosfatasa alcalina. Esta enzima bacteriana eliminaria los grupos fosfato reactivos de
cualquier nucleotido trifosfatado, suprimiendo asi su reactividad frente a
la polimerasa. Ello me obligaria. sin
embargo, a eliminar la fosfatasa de la
rnuestra, so pen a de destruir tambien
la ddNTP, cuando los anadiese. Normalmente, las enzimas indeseables se
pueden inactivar calentandolas y alterando asi su configuracion funcional. Suponia, sin embargo, que la fosfatasa alcalina bacteriana podia volver a adoptar, par si sola. su configuracion original. Rechace, par tanto, la fosfatasa alcalina como solucion
al problema.
Pero andaba equivocado. Mas tarde supe que la fosfatasa alcalina puede desnaturalizarse irreversiblemente
por calor. siempre que no haya cine
en la solucion. Fue, sin embargo, un
error providencial: si hubiera sabido
mas. habria dejado de buscar opciones alternativas.
A cad a kil6metro. surgia otra posible solucion, que era inmediatamente rechazada. Cuando empece el descenso hacia el valle Anderson. me
vino una idea que apelaba a mi sentido de la estetica y la economia: utilizaria la misma enzima, la polimerasa
de ADN, dos veces, primero para eliminar los nucleotidos
trifosfatados
extranos de Ia muestra, y, luego. para
incorporar los ddNTP marcados.
Con suficientes nucleotidos en la
muestra para bloquear el experirnento. bastarfan tambien. pense. para
que la lJolimerasa de ADN actuase

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3'

3'

C
5'

3. POLIMERASA DE ADN. enzima que elonga una cadena corta de ADN, denominada oligonuc1e6tido cebador, si esta se une a una cadena "molde" Je ADN mas larga. La polimerasa Ileva a
cabo este proeeso ailadiendo los nucle6tidos complementarios al extremo 3' del cebador unido. Si se ,
incorpora un didesoxinucle6tido trifosfatado (ddNTPl, como la desoxiadenina (ddAJ, se interrumpe
la elongacion, ya que enel extremo 3' de la ddA no se puede acoplar ninglin otro nucle6tido.

sobre ellos. Sometiendo la muestra a

una serie de reacciones preliminares.
con cebadores de 0ligonucleO'tidos y
polimerasa. pero sin ddNTP. eliminaria facilinente los nucleO'tidos fibres
de la muestra. incorporfmdolos a los
propios 0ligonucleO'tidos en extensiO'n. Elevando entonces la temperatura, podria separar estos nuevos oligonucleO'tidos, mas largos. del ADN
diana. En realidad. los oligonucleO'tidos elongados permanecerian en la
muestra; pero. como habria muchos

mas cebadores origin ales sin elongar

que alargados, los ADN diana acabarlan par hibridarse con los cebadares originales, cuando se enfriase
la muestra. A continuaciO'n. afiadiria
ddNTP y mas polimerasa. para acometer el experimento de secuenciaciO'n.
Seguian acosandome algunas dudas. i,Entorpecerian Ios oligonucleO'tidos elongados por Ia reacciO'n preliminar las siguientes
reacciones?
i,Que ocurriria si fa eIongaciO'n fuese
de much as bases, y no de sO'10una 0

dos? i,Que pasaria si la elongaci6'~.

hubiese creado una secuencia que iqc1uyese un fragmento complementario a la otra molecula cebadora? Eso
causaria problemas ...
No. jTodo 10 contrario! De repente, me sacudiO' la evidencia: las cadenas del ADN diana y los oligonuc1e6tidos elongados tendrian la misma secuencia de bases. iEn efeeto, la
reacciO'n preliminai habria doblado el
numero de ADN dianas presentes en
la muestra!
De pronto, al menos para mi, la
fragancia de los castaiios de indias se
diluy6 exponencialmente.
n otras circunstancias no me hubiese dado euenta con tanta rapidez de la impartancia de esta duplicaci6n. La misma idea de repetir
un procedimiento una y otra vez me
habria pareCid<;>exasperante y monotona, Pero, habia pasado muchas
horas escribiendo programas 'de ordenador, y estaba familiarizado con
los bucles reiterativos -procedimientos en los que una operaci6n matematica se aplica repetidamente
a los
productos de Ias operaciones previas.
Esta experieneia me habia enseiiado
el poder de Ios procesos reiterativos
de crecimiento exponeneiai. EI proeedimiento de replicacion de ADN
que acababa de imaginar se ajustaba
a un proeeso de cse tipo.
Emocionado,
empece a calcular
poteneias de dos: dos, cuatro, ocho,
16, 32 ... Recordaba vagamente que
dos elevado a Ia decima potencia era
alrededor de 1000. y que. por tanto,
dos elevado a veinte se aproximaba al
mill6n. Pare el coche en un mirador
desde el que se divisaba el valle Anderson. Saque de la guantera Iapiz y
papel -necesitaba
comprobar
mis
calculos, Jennifer, mi adormilada pasajera, protesto debilmente par el retraso y la Iuz. Le grite que habia descubierto algo fantastico; ajena a mis
eavilaciones, se volvi6 adorm.ir. Confirme que dos a la veinte.'era en efecto
alrededor de un millon;'y segui adelante.
.
Aproximadamente
un kilO'metro
mas abajo. se me oeurri6 algo relacionado con los productos de la reaecion. Tras unas pocas rondas de elongar cebadores, disociarlos, rehibridar
nuevos cebadares y eiongarlos nuevamente, la longitud de las cadenas
del ADN que se acumula de manera
exponeneial quedaria fijada, ya que
sus extremos estarian perfectamente
definidos por Ios extremos 5' de los
cebadores. Pod ria replicar fragmentos mayores de la muestra original de
ADN si disefiaba cebadores que hibridasen en sitios mas alejados entre

Sl. Los fragmentos sedan siempre entidades discretas de una longitud especffica.
Pare de nuevo el coche y comence
a dibujar line as de moleculas de ADN
que hibridaban y se alargaban, y que,
una vez disociadas como producto del
primer cicIo, se convertian en moldes
de Ia reaccion siguiente...
Jennifer
protesto de nuevo por interrumpirle
el sueno. "No te 10 vas a creer", excIame. "Asombroso".
o quiso .desperta.rse. Segui
. Ia cabana Sin mas paradas.
N

hasta
En Ia
hondonada
del valle comienzan Ias
secuoyas y Ia tierra por antonomasia
delos zoquetes. Mi descubrimiento

me hizo sentir como si estuviera a

punto de quebrantar esa vieja tradicion del valle. Tarde en dormirme
aquella noche, con las bombas desoxirribonucIeares estallando en mi cabeza.'
Por la manana, me sentia todavia
tan cansado que imagine que a aIguien, en algun lugar, se Ie habria
ocurrido antes Ia misma idea. Miles
de investigadores habian, por diversas razones, utilizado la polimerasa
para alargar oligonucIeotidos;
seguramente alguno habria considerado Ia
posibilidad de una reaccion en cadena
de Ia polimerasa. Perosi hubiese funcionado, sin duda me habria enterado, ya que se utilizaria constantemen-

te para amplificar, 0 mulKplicar, [ragmentos de ADN.

S
De vuelta al Cetus, ellunes, pedi a
uno de los bibliotecarios,
George
McGregor, que me hiciera un vaciado
bibliografico
sobre polimerasas
de
ADN. No en contra nada de interes
sobre
multiplicacion
("amplificacion"). Durante Ias siguientes semanas explique mi idea a todo el que me
quiso escuchar.
Nadie habiaoido
nada sobre eso; ni esgrimian ninguna
razon de peso para que no funcionase. A pesar de ello, nadie se mostro
muy entusiasmado con la novedad.
La gente solia pensar que mis ideas
sobre ADN eran poco fiables,y a veces, despues de unos dias, yo tambien

PAR DE
BASES DIANA

tI

SEPARAR LAS CADENAS.

PEGAR LOS CEBADORES

3'

5'

ANADIR POLIMERASA
Y ddNTP MARCADOS

5'

3'

LA IDENTIDAD DE LOS ddNTP INCORPORADOS

REVELA LAS BASES DEL PAR DIANA

4. PARA DETER'\U:"iAR LA IDENTIDAD de un par de bases en un segmento de ADN, d autor confiaba ~n aplicar una yariante de una tecnica
de secuenciaci<in hasada en la utilizacion de didesoxinudeotidos. Se anadirian dos cebador~s alas cadenas opuestas del ADN. ~n sitios contiguos
al par de hases diana. Se agregarla luego a la mezcla polimerasa de ADN

y didesoxinucleOtidos trifosfatados (ddNTpl.

con 10que los respectiyos cebadores se elongarian solo en una base. La identidad de la base del ddNTp
incorporado revelaria la de la diana complementaria. La tecnica funciona
con un solo cebador; con dos se puede obteneruil control interno de los
resultados. Durante la planificaci6n del ensayo. cl autor descubri<i la Rep.

'\

;;.

ICconocfa sucinconsistencia. Pero esta

vez la cosa era muy distinta.
Hace afros, antes de que se pusiese
demoda
la biotecnologia,
nuestro
edificio de la empresa Cetus pertenecia' a la Shell Development Company. El espacio que ahara ocupa
nuestro labaratorio,
cuyas ventanas
traseras se asoman alas colinas de
Berkeley, habia visto nacer a la famosa 'Tira anti-insectos". No me pasaba inadvertido que la RCP podia,
algun dia, llegar tan lejos como su in-

vento hermano, esa pieza de pl<istic9

amarillo y caracteristico perfume.
Pasaron meses mientras preparaba
mi primer experimento para comprobar si la RCP funcionaba. Debia optimizar el ensayo y decidir que solucion tamponada usar, que con centraciones relativas y absolutas de los
reactivos habria que emplear, cuanto
calentar y enfriar las muestras, cuanto
tiempo dejarlas en incubacion, etc.
Algo me orientaron los primeros artfculos de Kornberg sobre la polime-

rasa de ADN. Para realizar el expe-=rimento, seleccione un fragmento dia('

na de 25 pares de bases, procedente
de un pl<ismido, y dos 0ligonude6tidos de 11 y 13 pares de bases como
cebadores.
Cuando estuvo to do listo, acometi
mi tipo favorito de experimento: el
que solo necesita un tubo deensayo
y en el que la respuesta es positiva 0
negativa. l.Multiplicaria la RCP la secuencia de AD N seleccionada? La
respuesta fue s1.

ELONGAR LOS CEBADORES PARA

FABRICAR COPIAS DE LAS CADENAS DIANA

SEPARAR CADENAS
Y PEGAR CEBADORES

91111111111111111111 I I I I1111 I II! 1111111111111 b

t~

CICLO

CICLO 2

f'
l

r
l

e--I-I-I 1-1-11-11-1-11-1-11-11-1
-11-1-11-11-1"'11-1-1
I-I I-I-II-Ia-9111111111

elill I I 1111111111III! II!! I1I1111111111

---------------------- J
~

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I-I I-I 1-1-1I-IJ-9111111111! III! II1II1I11 [[I I III I I IJ

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':111111111 nO]JTITD1TIII! 11111i i i! I

AD INFINITUM

5. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA. un proceso ciclico:

en cada cicio se dobla ei numero de ADN dianas. Las cadenas de cada ADN
diana bicatenario se separan con calor; a continuaci6n, se enfrian para

permitir que los cebadores se puedan unir a ellas. Luego, las polimerasas
de ADN elongan los cebadores, anadiendolesnucle6tidos. De esta manera,
se van produciendo duplicados de las cadenas de ADN diana originales.

Cuando. va a ultima hora de la tarde. me ma;chaba del laboratario. vi

que Albert Halluin. el experto en patentes de la Cetus. estaba aun en su
despacho. Le dije que habia inventado algo, y Ie hable de la RCP. Al
fue 'Ia primera persona, del casi centenar a quienes se 10 habia contado,
que dio credito a mi relata. Quiso ver
enseguida el autarradiograma
con los
resultados del experimento; aun estaba mojado.
L.os experimentos de un solotubo
de ensayo no suelen provocar muchas
emociones. En to do caso, Al no parecfa esceptico. Despues de todo, la
razon de ser de 10s expertos en patentes eran los inventos. Cuando. en su
despacho. Ie explicaba el proceso, 10
en contra coherente. Ahora. en el laboratorio. dejaba traslucir un punto
de excitacion. y sugirio que me concentrase en el experimento y escribiese un protocolo de patente. Al irse,
me felicito.
urante los meses siguientes continue estudiando v refinando la
RCP, con la avuda de Fred A. Faloona. un joven matem:itico que conoci
a traves de mi hija. Fred me ayudo en
el primer experimentode
la RCP,
realizando los ciclos de la mezcla de
AD N: er:r su primer experimento bioquimico. y 10 celebramos la noche del
exito con un as cervezas.
Con el paso de las seman as confirmamos que la RCP funcionaba con
fragmentos
cada vez mavores de
ADN plasmidico. Por ultimo. obtuvimos un ADN humano del laboratorio de Henrv Erlich. v demostramos
la multiplicad<)n de u~ fragmento de
un gen de copia tmica.
Se han superadoya las limitaciones
y fallos iniciales de la RCP. Son varios 1'osprotocolos. con ligeras variantes. actualmente en uso. Suelo aconsejar que las muestras de ADN se ciclen entre unos 98 C. justa antes del
punto de ebullicion. y 60 C. Estos ciclos pueden ser de uno 0 dos minutos.
Durante cada cicio. el mimero de moleculas de ADN diana se duplica. Los
cebadores constan de unas 20 0 30 bases de largo. Entre Ios refinamientos
principaies del proceso destacaria el
uso de una polimerasa de ADN especial. purificada de la bacteria Thermus aquatiClLS. que 'live en fuentes
termales. La poiimerasa que empleabamos en los primeros ensayos se destruia facilmente con el calor. y nos
veiamos obligados a anadir mas despues de cada~ cicio de Ja reaccion. La
polimerasa
deADN
de Thermus
aqumicus. sin embargo. es estable y
activa a temperaturas altas: solo hav
que anadirla' al principio de la reaecion. Esta po lime rasa termoestable se

6. MAQUINA donde se realiza la reacci6n en cadena de la polimerasa, en el momento en que se

introducen unas muestras de ADN.- Estos aparatos son imprescindibles en cualquier laboratorio.

produce ahora sin problemas por ingenieria genetica.

La amplificacion, virtualmente ilimitada, del ADN mediante la RCP
eta algo inaudito para ser aceptado de
buenas a primeras. Nadie estaba prepara do para un proceso que suministrase todo el ADN que uno pudiese
desear. A Fred y ami, la reaccion nos
parecfa poco menos que obvia. ya que
era nuestro juguete. La mayoria de la
gente, sin embargo. tardo algun tiempo en familiarizarse.
n la primavera de 1984, mientras
trabajaba en la patente. presentc
un poster que describia la RCP en la
reunion cientifica anual de la Cetus.
Estas conferencias tenian su encanto.
porque la empresa contaba con asesores cientificos de primera linea y ardia yo en ganas de hablarles de mi invento.
A nadie, sin embargo. pare cia interesarle mi poster. Mi ansiedad fue
en aumento. La gente Ie echaba un
vistazo y seguia p~aseando. Al fin. vi
que Joshua Lederberg, presidente de
la Universidad Rockefeller, se aproximaba. y 10 cace para que se fijara
en mis resultados. Josh observo el
poster con cierta detencion y, finalmente. volvio su imponente testa.
laureada con el Nobel. la cabeza que
en 1946 lIego a la conclusion de que
las bacterias podian tener "relaciones" sexuales. "i,Esto funciona'?" Le
parecio curioso.
Contento. Ie confirme que si. y
charlamos durante hast ante tiempo.
En un momenta dado. menciono que
un os 20 an os antes. despues de que
Kornberg hubiese descubierto la polimerasa de ADN. h abian considerado la posibilidad de emplear 1,1enzi-

ma para fabricar grandes cantidades

de ADN. Pero no acertaron a imaginarse como. Le recorde que en aquella epoca no era facil disponer de oligonucleotidos. y que apenas habia informacion sobre secuencias de ADN.
Y se volvio hacia mi poster con una
expresion
significativa.
Creo que
Josh, tras comprobar la increible simpleza de la RCP, fue quiza la primera
persona que penso 10 que se conyer
tiria en la reaccion inmediata de todos
los bi610gos moleculares e "ingenieros" del ADN: "i,Por que no se me
habria ocurrido?" Y nadie sabe la razon. Yo tampoco. Simplemente. me
encontre con ella una noche rezumada con la fragancia de Ios castall0S en
flor.
BIBLIOGRAFIA
COMPLEMENTARIA
SPECIFICSYNTHESISOF DNA IN VITRO VIA
A POLYMERASE-CATALYZED CHAIN
REACTION. Kary B. Mullis y Fred A.
Faloona en Methods In Enzvmology.
vol. 155, parte F, pags. 335-350; 1987.
AMPLIFICATION OF HUMAN MINISATELLITES BY THE POLYMER.O\SECHAIN REACTION: TOWARDS DNA FINGERPRINTING
OF SINGLE CELLS. Alec J. Jeffreys. Victoria Wilson. Rita Neumann y John
Keyte en Nucleic Acids Research. vol.
16, pags. 10.953-10.971: 1988.
DNA 'SEQUENCING'WITH THERMUS AQUATlCUS DNA POLYMERASEAND DIRECT
SEQUENCING OF POLYMERASE CHAIN
REACTION-AMPLIFIED DNA. M. A. Innis. K. B. Myambo, D. H .. Gelfand y
Marv Ann D. Brow en Proceedings of
the National Academv of Sciences. vol.
85, n.o 24. pags. 9.436-9,440:.diciembre
de 1988.
THE POLYMERASECHAIN REACTION. T. J.
White. Norman Arnheim v H. A. Erlich en Trends in Genelics. vol. 5. n.O
6. pags. 185-188: junio de 1989.

peR Primer Design

he objective of PCR is to amplify a specific DNA segment without any nonspecific byproducts. In principle, each physical and chemical component of PCR can be modified to
produce a potential increase in yield, specificity, or sensitivity. Yet the most critical parameter for successful PCR is optimal primer design. A poorly designed primer can result in little or no product, due to nonspecific amplification and/or primer-dimer formation leading
to reaction failure, even when all the other parameters are properly optimized. This chapter provides general guidelines for PCR primer design, tips for development of primer pairs
for more complex applications, and advice on the development of probes for real-time PCR.
We close with a discussion of computer programs available for PCR primer design.

Several parameters must be taken into account when designing primers for PCR. Each
parameter is discussed in detail below.

Primer length critically affects PCR success by influencing specificity, melting temperature,
and time of annealing. A primer length of 18-30 bases is optimal for most PCR applications.
Shorter primers could lead to nonspecific PCR amplification. Longer primers are more specific but have a higher probability of containing secondary structures such as hairpin loops.

r'. (>r .I've" " )

The speCificity of PCR strongly depends on the melting temperature (I;n) of the primers.
For most PCR applications, the optimum melting temperature of primers ranges from 55C
to 60C. In the absence of destabilizing agents, the
of a primer depends on its length,
sequence composition, and concentration. The impact of ionic strength is negligible
because the salt concentration does not vary significantly under differeru PCR conditions.
It is also important that all of the primers used in a reaction have similar melting temperatures. For most PCR applications. the primer pair Toc mismatch should not be more
than 2-3C. If the difference is greater. amplification will be less efficient or may not work.
TIll

at all because the primer with the higher Twill

misprime at alovver than optimal annealm
ing temperature,
and the primer with the lower T will only bind in low concentrations
at
a higher than optimal annealing temperature.
The most accurate T can be estimated by formulas based on the nearest-neighbor
the:-modynamic
theory. which takes into account thermodvnamic
analysis of the duplex melIing process.
L

I11

I11

The changes in enthalpy (~H) and entropy (~S) of duplex formation are calculated
from nearest-neighbor
thermodynamic
parameters, R is the molar gas constant, and C is the
molar concentration
of the oligonucleotide.
This analysis determines
the specific enthalpy
and entropy contribution
to the free energy of the duplex, made by each "nearest neighbor" in the sequence. The nearest neighbor starts at the 5' end, and the enthalpy and
entropy contributions
are additive. A second term is added to Equation 1 10 account empirically for the stabilizing effect of salt on the duplex:

Most primer design software uses either the Breslauer or SantaLucia

nearest-neighbor
parameter
set 10 estimate the Tm of oligonucleotide
duplexes
(Breslauer
et a!. 1986;
SantaLucia 1998, respectively).
A first-order approximation
for short sequences with 20 bases or less can be calculated
by the Wallace rule. The equation assumes a salt concentration
of 0.9 M, common for dotblot and hybridization
assays:

A general rule of thumb is to use a temperature

-5C lower than the primer melting
temperature.
Often, the annealing temperature
determined
this way will not be optimaL
and empirical experiments
will have to be performed to determine
the optimal temperature. This is most easily accomplished using a gradient thermal cycler. Alternatively.
more
accurate equations
can be used to calculate the Ta (optimum
annealing
temperature)
(Rychlik et a!. 1990).

where Tm of primer is the melting temperature

of the less stable primer-template
Tm of product is the melting temperature
of the PCR product, both calculated
above.

pair and
as shown

In addition to calculating the melting temperatures

of the primers, care must be taker w
ensure that the melting temperature
of the product is low enough to ensure complete melting at 92C. In generaL products benveen 100 and 600 bp are efficiently amplified in P,=R.
This parameter will help ensure a more efficient PCR but is not always necessary for 'Jcessful PCR The product
can be calculated using the formula
~1\

An important factor to consider when designing a primer is the presence of secondary

structures. A primer sequence with regions of self-homology
can snap back to form partially double-stranded
hairpin structures. Similarly, interprimer
homology can lead to the formation of primer-dimers.
Because high concentrations
of primers, relative to template, are
used in the PCR primers may anneal to each other much more readily than they anneal
to the template. The presence of 3' hairpins or 3' climers is especially detrimental to amplification, because these will lead to the nonspecific amplification of sharp background products. A simple way to avoid secondary structures is to select primers that are 50% G + C
and deficient in one of the four bases.

Primers with long runs of a single base or nucleotide repeats should generally
The effects of different types of repeats and runs are shown in Table 1.

be avoided.

Including a Gar C residue at the 3' end of primers increases the priming efficiency. The socalled "GC clamp" helps to ensure correct binding at the 3' end of the primer due to the
stronger hydrogen bonding of GC residues, thus providing enhanced specificity. Primers
that end with a thymidine residue tend to have reduced specificity.

For amplification of GC-rich DNA, primers with a higher Tm (preferably 75-80C) are recommended.
The strand separation temperature
for GC-rich DNA is significantly higher

Descri ption

a repeated sequence of 4 or more nucleotides,

which is repeated: (...AATCGA...AATCGA... )

a self-complementary sequence motif of 4 or

more nucleotides, (stem loop or hairpin motifs):
(...AATGGC....GCCATT... )
a sequence of 4 or more identical nucleotides:
(...AAAAA...)

Simple repeats can generate secondary binding

sites for primers. Stable hybridization to
secondary binding sites results in nonspecific
amplification. Repeats> 3-4.
Inverse repeats can cause inefficient priming
as they lead to formation of stable hairpins
in the binding region, or within the
amplicon.
Homopolymeric runs can be considered a
special case of direct repeats. These can
cause ambiguous binding of primers to their
target site ("slippage effect" I. Poly (A) and
poly (T) stretches should also be avoided as
these will "breathe" and open up stretches
of the primer-template complex.
Additionally, rUlls of 3 or more G residues
can cause problems due to intermolecular
stacking.

than for normal DNA. At lower temperatures,

the two strands of PCR amplicons have a
tendency to re-anneal faster and, as a result, compete with primer annealing.
Higher
annealing temperatures
during PCR favor primer annealing and therefore increase amplification efficiency.

Primer sequences should be searched using BLAST (http://www.ncbi.nlm

.nih.gov fBLAST /)
and checked for cross-homology with repetitive sequences or with other loci elsewhere in
the genome. Such homologies could lead to false priming and the production of nonspecific amplicons.

Multiplex PCR (MPCR) uses one template and several sets of primers for the simultaneous
amplification of multiple target sequences ina single PCR. It is an extremely useful technique that increases the throughput of PCR and allows more efficient use of each DNA
sample. A variant of MPCR is combinatorial PCR. Combinatorial PCR uses several templates
and several primer sets, all in the same reaction. The terms MPCR and combinatorial PCR
are often used synonymously.

MPCR requires that all the primer pairs in a reaction amplify their unique targets under a
defined set of reaction conditions. Most multiplex reactions are restricted to amplification
of five to ten targets. One reason for this is that a degree of flexibility is lost with each additional primer set included in the reaction. Increased numbers of primers also increase the
probability of primer-dimer
formation and nonspecific amplification. The development
of
an efficient MPCR requires strategic planning and often multiple attempts to optimize reaction conditions.
Ideally, all the primers in a multiplex reaction should amplify their individual target
sequences with equal efficiency. Most often it is difficult to predict the efficiency of a primer
pair, but oligonucleotides
with near-identical annealing temperatures work well under similar conditions.

When designing primers for use in MPCR, the general rules of primer design apply, but
additional considerations
must be taken into account. Generally, all the primers in a
multiplex reaction should be matched for TJ11' Care should be taken to avoid primers \\ith
complementary
3' nucleotides. Each primer pair should be tested separately to determine
optimal conditions. Once the panel of primer pairs is assembled, they need to be mixed
sequentially and optimized:
1. The length of individual
ly to result in formation

primers should be 18-24 bases. Longer primers are more Jikeof primer-dimers.

2. Annealing temperature
annealing temperature

and cycle number are critical to the success of MPCR. The

should be kept as high as possible. Identify the annealing rem-

:~!~each primer pair and use the !c'.Vest temperature

~ ~-~:.=-~~~,:r>"
use the minimum number of c\'cles,

in tbe multiplex

reac-

- ~~:" =-_:::- ~e templates are si~nu1taneous~ \~ amplified, the pool of enzyme and
~~_::: ~: .::' :~:a .\lPCR can be a limiting fcctc~ aEd more time is required for complete
.
: ,~: products, It is important tc' op:imize reagent concentrations
and exten~ c'ach reaction, Longer exte:1si.!:~ times are needed than in single-target

',e':::-: ~'=::=.: ::e;:gned to increase the sensiti\ity of PCR using a second PCR to amplify the
;,:-.:.::~=-::-::-:::>::~om a primary PCR. The second reaction uses primers placed internal to
:':le =-:-:- :=-_-=-:::
::3ir. These internal primers are referred to as "inner" or "nested" primers.
""':"1::::3_'-=--~':::C=:-,::-:
product from the first round acts as a template for the second round, sig:,'''' ~-=-_:--::::J-.lng sensitivity without impailli'1g specificity (Albert and Fenyo 1990).
Be,.:,':: ::::c::-:: ?(R uses two sets of primer pairs. a higher total number of cycles are possi:~:::C"C'::: ::::: ~::::-.:"hmentof reaction componems such as Taq DNA polymerase.
If a full
:::-.c::: ::=.=::= ~5i:::-~g
n\'o internal primers) cannot be performed, sensitivity and specificity
ca:: :,0 =::::--,e: ')\ designing a hemi-nested PCR using just one inner primer in conjunc:'..::_ T-'::: :::-e '~::-;e outer primers from the first reaction.
"",:"::0 ::~~-e<::~oblem with nested PCR is that it is prone to contamination.
Tubes from
:r:e
::=
::3'e IO be opened so that the primary product can be transferred
to a new
:~::c: . :r::: ":::::.2 reaction. It also involves rhe addirional cost of two rounds of PCR and
a:::'.:.:::~~ ::::--=-_::-:
5,'mhesis.

=: =~

""':":::::_::: ::.-e risk of contamination.

a single-rube approach, referred to as dropie. ::c -. _' .::.-e<'e::PCR, can be used. In this protocol. the inner primers are designed with
3 ,,~-- :::.::::..~
,,'''c~ melting temperature than the outer primer pair. Both primer pairs are
-.:::.=-~:-:.-: :c :_:e '::5: reaction. During the first round of PCR, the annealing
temperature
is
C1:::5o::::', '.:':: ~:,:\ rhe outer pair \\ill anneal and extend. During the second round of
~=...::::==:::. ::,e cnnealing temperature
is 100wred so that the inner pair can function.
,';'::::, _:- :::....:=-.e::.od is attractive from the conramination control perspective, it does not
. '.-~-::.:_ '_~e .::-. .:mages of the original nes,ed peR protocol.

L~ o'--e ~-e.::.e~:::
~:..;lesof PCR primer design can be applied to the design of primers of
=-_;C<:-:-:
c: _c:
.:: e ~':Jse multiple
primer pairs are used, the increased
probability
of
::::--=-:-'-:=-.-=--:::,~"c~cction
should be carefulh' co=:.sidered. When designing primers for sin:z:e-" ,- ::':':< :<~tit is importanr that tbe n:elting temperature
of the inner (nested)
~--'.'
- c'
'L:,~:ccntly lower than that of the oueer (first-round) primer pair. The easi","
: .::,-,:~',:::-,~
chis is 10 reduce the len~:h c: the nested primers as compared to outer
. ;,.::: :Oases\S, 25-28 basesl, Tie "'_o~ the outer primer pairs should be high
_" ,_.'
"-:: -::-.',je inner primers from a:::-,ne.:jfl~. ensuring that only the longer prod': :- -' -. -, ~-:::: ,:-c first, ~()und PCR. Ime:-::al ::-~in:ers should be used in excess (typical~
:. ::lpared to the cuter pri':ler' The use of shorter annealing and exten'--:: .' --: :-::.:,d PCR fa\'ors :'le .:nneaiir~:= 01 ,he shorter primers and production of

TIle major problem in RT-PCR is the presence of contaminating

genomic DNA (gDNA),
which can lead to false-positin:
signals, reduced specificity, or overestimation
of specific
RNA. To prevent any interference
oy gDNA in RT-PCR applications,
primers can be
designed to anneal to splice junctions.
unique to cDNA sequences, so that gDNA will nor
be amplified.
The eDNA-specific primers can be designed in three ways (as illustrated in Fig. 1):
1, Primers

spanning the exon-exon

junction. The primer is designed so that one-half of
its sequence will hybridize to the 3' end of one exon and the other half to the 5/ end
of the adjacent exon. This primer will anneal to mRNA, or to cDNA synthesized from
spliced mRNAs, but not to gDNA, thus eliminating
amplification
of contaminating
gDNA, Either the forward or the reverse primers can be designed to cross the exon
junction; the second primer can be designed to bind at a second exon junction, or at a
site completely within the exon.

2. Primers flanking the exon-exon

junction. RT-PCR primers can be designed to flank a
region that contains at least one intron. Products amplified from cDNA will be smaller
than those amplified from gDNA. This size difference can be used to detect the presence of contaminating
DNA.
3. Exon-primed
intron-crossing
primers. For selective amplification of the gDNA from a
mixture of cDNA and gDNA, primers should be designed to anneal across the
exon-intron
junctions. These primers are called exon-primed
intron-crossing
primers
(EPIC primers) (see, e,g., Bierne et a1, 2000). Because exon sequences are more highly conserved than intron sequences, EPIC primers can be used in phylogenetic
studies
to amplify homologous
intron regions.

In addition to the identification

of genes and prediction of the encoded proteins, the current effort in genomics includes studies on genome organization to examine the interposition of genes with structural and regulatory elements. Cross-species analysis, which forms
a major part of comparative genomics, is seen as an important method for the study of evolution, gene function, and human disease.
Cross-species analysis of microbial genomes, particularly bacteria, is beginning to identify genes conserved
among bacteria, and virulence genes associated with subspecies
(Fredricks and ReIman 1996). These advances have facilitated the development
of new,
broad-based methods for the detection and discrimination
of pathogenic microbes. Crossspecies PCR can be used to study evolutionarily
related species that share some common
genomic properties; the conserved regions can be used identify species at the genomic level.
The technique can also be used to amplify homologous genes in unsequenced
genomes.

Cross-species PCR primers are designed using multiple sequence alignment

and basic
primer design principles. The alignment
of sma]] numbers of large contiguous sequences
identifies conserved regions, which constitute potential cross-species primer-binding
sites.
Cross-species comparisons reqllire accurate alignment of a sma]] number of large CCllltigu-

1 Exon

---+
!

1 Exon

1 Intron

2 Exon

2 Intron

---+

FIGURE 1. cDNA/gDNA selective primer design. (A) Primer across exon-exon junction.
spanning exon-exon junction. (C) Exon -primed intron -crossing primers (EPIC primers).

(B)

Primer

ous sequences. Conserved regions are identified from the alignment as potential crossspecies primer-designing sites. Primers annealing to the conserved regions can be used to
amplify homologous loci in different species (see Fig. 2).
The following steps should be followed:
1. Align selected sequences using a multiple sequence alignment program such as Clustal
(available from: http://www.ebi.ac.uk/clustalw).
2. Evaluate conserved regions of the alignment. Derive a consensus primer sequence by
choosing the most commonly occurring nucleotide at each position of the conserwd
sequence.
3. The primer-binding site should lie entirely within the conserved region. For distantly
related species, when sequences are not completely conserved, the minority consensus
can also be used to design probes/primers. Degeneracy can be tolerated at the 5' end of
the primer, but mismatches at the 3' end reduce both annealing specificity and PCR
yield (Sommer and Tautz 1989).
4. Use general primer-design rules for PCR to avoid false priming and primer-dimer
mation in cross-species PCR.

for-

The introduction of real-time PCR has made it possible to quantif\ accurately the starting
amounts of nucleic acid during the PCR, without the need for post-PCR analvsis. In realtime PCR, a fluorescent reporter is used [0 monitor the PCR as it occurs (i.e., in reai time).

5' CTGCCATCAAGAGCC

3'

111111111111111

Minority

CYKSTTYCAGTYGGAGGAGAGACGGTAGTTCTCGGGRACGGKVKYCCTSTGGGGD
I' I I I 1 l
IIIII
I II I I I ~~~~ I ! I I I I ~~~~ I I I I I 1115~~1I ! I

11~~1

HUMTNFAA
RABTNF
RATTNF

ddo'

~k~~

5'
I I I I

GACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCA
GAACAAGGTC~"CCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCACCGGGAGACCCCC
GGAGAAAGTCAGCCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCTTGCCCTAAGGACACCCCT

FIGURE 2. Cross-species primer design in conserved region of multiple sequence alignment I"~
human tumor necrosis factor, rabbit tumor necrosis factor, and rat tumor necrosis facTOr gen,
sequence.

The fluorescence of the reporter molecule increases as products accumulate with each sue
cessive round of amplification.
The reporter
can be a nonspecific intercalating
double
stranded DNA-binding
dye or a sequence-specific
fluorescent-labeled
oligonucleotidt
probe. The oligonucleotide
probe is labeled with both a reporter fluorescent dye and i
quencher dye. While the probe is intact, the proximity of the quencher greatly reduces tht
fluorescence
emitted by the reporter dye by Forster resonance
energy transfer (FRET
through space. Adequate quenching is observed for probes with the reporter at the 5' ene
and the quencher at the 3' end. When a probe molecule is incorporated
into an amplicoD
quenching is disrupted and the probe fluoresces.
The ability to monitor the real-time progress of the PCR has completely revolutionized
the approach to PCR-based quantification
of DNA and RNA. It is now possible to quamif\
PCR products reliably by eliminating the variability associated with conventional
quantitative techniques. Because reporter fluorescence
is monitored
externally, the reaction tubes
do not need to be opened after the PCR is complete; this prevents aerosol contaminatio:'
by PCR products and reduces the number of false-positive results.

One popular real-time PCR probe strategy is the TaqMan assay (Applied Biosystems). TI1l'
assay uses a hydrolysis probe, which exploits the 5' exonuclease activity of Ta'i polymerasl'
to cleave a labeled hybridization
probe during the extension phase of PCR (Holland et c..
1991 ).

The flu orogenic 5' nuclease assay is a convenient,

self-contained
process. The pro>.
is designed to anneal to the target sequence
between the upstream and downstre,L'
primers. The probe is labeled with a reporter fluorochrome
(usually 6-carbo:\yflu('resce
[6-FAJ'v1]) at the 5' end and a quencher fluorochrome
(6-carboxy-tetramelh'.l-rhodami:
[TAMRA]) at the 3' end, or any T posiTion.

--

1 Exon

..... ~'.-.-.. '

1 Exon

--

1 Intron

2 Exon

2 Intron

1 Exon

--"

.....

FIGURE 1. cDNA/gDNA selective primer design. (A) Primer across exon-exon junction.
spanning exon-exon junction. (C) Exon-primed intron-crossing primers (EPIC primers).

(Bl

Primer

ous sequences. Conserved regions are identified from the alignment as potential crossspecies primer-designing sites. Primers annealing to the conserved regions can be used to
amplify homologous loci in different species (see Fig. 2).
The following steps should be followed:
1. Align selected sequences using a multiple sequence alignment program such as Clustal
(available from: http://www.ebi.ac.uk/clustalw).
2. Evaluate conserved regions of the alignment. Derive a consensus primer sequence by
choosing the most commonly occurring nucleotide at each position of the consen'ed
sequence.
3. The primer-binding site should lie entirely within the conserved region. For distantly
related species, when sequences are not completely conserved, the minority consensus
can also be used to design probes/primers. Degeneracy can be tolerated at the 5' end of
the primer, but mismatches at the 3' end reduce both annealing specificity and PCR
yield (Sommer and Tautz 1989).
4. Use general primer-design rules for PCR to avoid false priming and primer-dimer
mation in cross-species PCR.

for-

The introduction of real-time PCR has made it possible to quantify accurately the starting
amounts of nucleic acid. during the PCR, without the need. for post-PCR analvsis. In realtime PCR, a fluorescent reporter is used LO monitor the PCR as it occurs (i.e .. in reai time).

During the PCR aln;'~~fi..::at:'--'n,the ;'robe an:-:.e2.:5to its target on the template DNA. As
the primer is extended
c:he ne\yly s\T,:hes~zed D~,-\ strand approaches the site of robe
hybridization. On ani\'a~
cue -:0 its i=-:.triE:'~"::
=:' -:,~, 3' nuclease
activity, the pOly~rase
cleaves the prc'be, :-elea.:,~=-:.:::
tr,c re,~'onc=- flL<'r\'c:-:'':':'=~1einto the reaction buffer. When the
reporter molecule parts C:=-:,pcI~\' '.'.-ith 'he <:LeL::-:.e::-it starts to fluoresce, and synthesis of
the DNA stran.d cont:rE~e:, .In-:~, the ar1':"liL"::2:!":-:',,::.de is complete. Because the reponer
molecules are clea\'ed L::: I",-,tt.e pr-"bes G \.lr::-:.o: e'-eI'\' amplification cycle, the fluorescence
intensity of the oyera] ::"s:em ~ncrease, pre"',.'r-::c'Ec.}ly to the amount of DNA amplified,
The follm"ing issue-- sh'ul':: be considerec-: ',',he=-:.designing TaqMan probes:
1. The Y enc of the ;:: )ce ::-:'I'JStbe ;,rmec:eL-: a.:::a.~nstchain elongation during peR. To
block the 3'-end p::-:"spha-:e . ..::ord\'cepi:",- ~ _3 . Jideoxynucleosides,
inverse T, or the
quencher dye itself -ca::J.be :..:.sed.Labelin::: the 3 end with TAMRA or another quencher
can be achieyed by :":'SUl.g2. 3' amino IiEke::-, I-: is also possible to label the 3' end of
oligonucleotides
pos::::'''''Il.tJ:::.etically\ia at",-aDir.0 link. This method is available for all
dyes, except Cy3T.\':. Cy5T:\L Cy5.5T\L HE:\:. a.nd TIT.
2. The probe T::; shoLc
be IOC higher thar. tr-.e amplification
65-72C for optirna~ ~7-1 exonuclease
aeri\"it".

primer

Tm and within

3. Avoid incorporatior::. ,~f 3. G :-esidue at the 5 - enc of the probe; this will quench reporter
fluorescence e\'en 2...-'-:e:;:- cleayage.
4. Probe must not ha\'c

rrore

Gs than Cs.

5. Avoid runs of single :::::Lcle:n::ides.panicdarl~

G :-esidues.

6. AT-rich sequences
=-e-'.:J.L.ire
longer primer ar:.d ;,:-obe sequences to achieve the recommended T=o. ~ote t::'-_2.t,?roj,es more tha::::: -lC b;, long can exhibit inefficient quenching
and produce kw,er -:--:elJs.
7. Design the probe te ar.:.ueal as close as ;,oss'ble
least one base awa': ::.rc-m::,nn1er
3" end
.

to the primer without

overlapping

(at

i.

8. If a Taq~1.an probe is "=,e'..ng:

cesigned for alleEc c.:.scrimination, it is advisable to place the
mismatching nucle,:,:::i:: (:=-e polymorpr1ic site in the middle of the probe rather than
at the ends. These ;:-)'2-es s=-ould be as shon as ;,ossible to provide the greatest discrimination by the misr:=.atG.'l..

Amplicon size shouk r-=-=-gebe::ween 50 ani 15\~'Q;' and should not exceed 400 bp. Smaller
amplicons give more cC::::
..siste=-:t results because peR is more efficient and more tolerant of
reaction conditions.

TaqMan
TaqMan

I\tGB

:~ TET
, ~ TET

none
minor groove binder

----------.:::pa--

CIEf:CIA Y DESARROLLO

Dr. Mario Ramirez Lepe

Reacci6nen cadena-de
polimerasa

la

Una nueva epoca dorada en la biologia molecular

La reaccion en cadena de la polimerasa (RCP),

consiste en la sintesis enzimatica In vitro de millones de copias de un
segmento especifico de ADN. Esta ingeniosa y novedosa metodologia esta
causando una nueva revolucion en el analisis y manipulacion del material
genetico ..
Con frecuencia somos testigos del efeeto 'bola de nieve" que nuevas
tecnologias producen en el avanc"edel conocimiento cientifico.
Mas admirable es el surgimiento de algunas de ellas
en las que casi siempre se subestima su efeeto debido a su gran
simplicidad. En el area donde las esferas de conocimiento de la biologia y
la medicina se traslapan en el estudio de la celula, quiza la invenci6n de
105metodos de ADN recombinante, a principios del decenio de 105
setenta, sea el paradigma.1 Hoy vivimos una nueva epoca de oro en la
biomedicina, pues una vez mas ha surgido una poderosa herramienta de
investigacion. Sin duda, la invencion de la reaccion en cadena de la
polimerasa (RCP) marca un nuevo parteaguas en el estudio del material
genetico.

EJ termino "reacci6n en cadena de la polimerasa" (Rep) se aplica al

proceso bioquimico in vitro, mediante el cuallas cadenas individuales de
ADNblanco son duplicadas por la ADNpolimerasa en cad a uno de 10s
ciclos (generalmente entre 20 y 30) que integran la reacci6n, al final de
cada uno de ios cuales ias nuevas cadenas vuelven a ser duplicadas por
la misma enzima, lograndose una producci6n exponencial de millones de
capias del gen 0 segmento de ADNespedfico sometido aJ proceso (figura 1).
. 1general, ios componentes requeridos para una RCP son: ADN;iniciadores
,Jligonucle6tidos) espedficos que flanquean el gen 0 segmento que
actua como blanco para la amplificaci6n; mezcla de desoxinucle6tidos
(dNTP'S); soluci6n amortiguadora de reacci6n, y ADNpolimerasa.
Cada uno de ios ciclos de la reacci6n consta de tres pasos
determinados par temperaturas y tiempos especmcos, que son:
1) Desnaruralizaci6n (92-98 ec, 30 a 90 segundos), en el cual se
separan 0 desnaruralizan las dos cadenas complementarias del ADNblanco.

2) Alineamiento (50-60C, 30-60 seguncios), en el que se

realiza el apareamiento espedfico entre los iniciadores y las cadenas simples del
segmento de ADNblanca desnaturalizado.
3) Extensi6n (70-74
30-90 segundos), en el que la ADN
polimerasa extiende la 10ngitud de los iniciadores apareados al ADNblanco, d
ir polimerizando 10s desoxinucle6tidos libres, resultando en nuevas cadenas
complementarias alas dos cadenas sencUlas presentes al inicio de la reacci6n .
El ciclo siguiente se i!licia en el mismo tubo, con 10s mismos
componentes de la mezcla de reacci6n, pero contiene ahora el doble de cadenas
sencUlas de ADNblanco que el anterior y finaliza convirtiendo estas en cadenas
dobles.
Con la sucesi6n de ciclos se logra una simesis exponencial (zn)
del segmento de ADNblanco, cuyo tamaii.o se define desde 10sprimeros ciclos de
la reacci6n. La longirud del segmento amplificado par la RCP es el resultado (e
la suma de la 10ngitud de 10s dos iniciadores mas la disrancia del ADNblanco
t1anqueado por estos.

ec,

'>

notable praceso fue ideado en 1985 par Karry B. Mullis,: en ese

-~rl'ncesinvestigador en la campania Cetus, en Emerville, California,
;';. dos Unidos. Ese mismo ano, la RCP fue perteceionada por otras
::;'riadores delmismo grupo y se aplico exitosamente en el diagnostico
,'" ,) ,ie la anemia de celulas falciformes.J.5Desde entonces, el creci~:' . , .:e articulos que se basan en la RCP es mas que exponeneial cada
j;~',('~n mas aplicaeiones de esta metodologia en areas muy variadas de
:J homedicina.
Los primeras ensayos de la RCP se realizaron en forma
~1.lOual,unlizando para la amplificacion al fragmento Klenow de la ADN
:'\,ilmerasaI de la bacteria Escherichia coli,asi como varios banos de agua
~ata !asdiferentes temperaturas. Despues del paso de desnaruralizacion,
~n cada ciclo se requeria
Jc' ~3t una nueva cantidad
1 :::::;apara reemplazar a la
iOciuida inieialmente, dado
UUC eSta se inactivaba por la
~lt3 temperatura requerida
dutante el paso de desnarutali:aeion. Sin embargo, al
haeer esto tambien se
:nctementaba la concentfa -i6n del glicerol (conteniJl~na preparaeion comerc;al de la enzima) y este
tcrminabapar inhibir la actividadde la enzirnay lirnitar asi
la cficiencia de la reaceion.
Estas circunstaneias determinaronque10sprimeros ensayos
de Rep resultaran costosos,
wmpleios y poco efieientes.
Afortunadamente, el descubrimienro de una
ADN polirnerasa termoestable,
la ADN polirnerasaTaq, aislada
apartirde la bacteria Thermus
aquaticus, que habita en aguas
termales,y la introduceion de
los termocicladores automatizados, permitieron disr{ Ul: significativamente el
CC,lO, Y sirnplificar enormemente la tediosa tarea,
haciendo posible la populari:aci6n de esta metodologia.6
:'[C

el que se
imples del
Je la

ADN

blanco, al
s cadenas
, reaceion.
)S mismos
Ie cadenas
n cadenas
nc,. ,~11)
'5 eiclos de
5ultado de
DN blanco

FIgura 1. Amplificacion del

ADN

por la RCP. En esta figura se

eJemplifican /05 trespasos de cada
ciCIo de la RCP generandose,
dE oU'S de 25 a 30 eielos, entre
106, 107 copias del segmento de
ADN amplificado.

A siete anos de su creaeion, la amplificacion de segmentos de ADN

mediante la RCP se utiliza en muchos laboratorios y tiene multiples
aplicaciones en diferentes campos de la biomedicina, dentro de las
cuales podemos mencionar las siguiemes: en el campo del diagnostico
clinico esta metodologia es utilizada en la genetica medica para e!
diagnostico de enfermedades hereditarias y de algunas cromosomopatias
comunes; en el campo de la inmunologia se emplea para determinar
asociaciones entre el complejo mayor de histocompatibilidad (HLA) y la
predisposicion genetica para el desarrollo de enfermedades autoinmuneSj
en el campo de la oncologia para probar muraciones activadoras de
oncogenes 0 supresoras de' antioncongenes, para detectar arreglos
cromosomicos presentes en procesos neoplasicos, y para la deteccion de
virus y secuencias oncogenicas. En la microbiologia la
RCP se ha utilizado en el diagnostico rapido y preciso de infecciones producidas par barterias, hongos y virus, pa
cularmente aquellos microorganismos dificiles de detectar por analisis microbiologico
directo y cultivo, como es el
caso de las microbacterias. En
la medicina legalla RCP ha enriquecido enormemente el
analisis de las pruebas de
paternidad y la identificacion
de individuos a traves de la
tipificacion de regiones
cromosomicas con secuencias
de ADN altamente variables 0
polimorficas.
El proyecto del
genoma humano ha recurrido a
la RCP para identificar nuevos
genes, sus secuencias y r
eiones. La arqueologia ha encontrado una herramienta poderosa para el anaIisisgenetico
de muestras biologicasantiguas
como las provenientes de momias y fOslles.Y en proceso de
evolucion, su aplicacion a
estudios de secuencias conservadasha aceleradola reconstruccion de arboles filogeneticos y se ha convertido en un
instrumento mas accesiblepara
el _is
de especiesen via de
extincion,
En los campos
de la biologia molecular, la
ingenieria genetica y la

biotecnologia, la RCP se utili:a para la clonacion molecular de genes y su

secuenciacion nucleotida, para la mutagenesis dirigida a secuencias
genicas, para facilitar manipulaciones genic as encaminadas a la
produccion de proteinas recombinantes, y para el analisisy cuantificaci6n
de la expresion genica. Finalmente, los campos de la biotecnologia
animal y vegetal tambien han sido beneficiados con esta metodologia,
contribuyendo a aumentar eI arsenal de herramientas poderosas para el
mejoramiento de plantas y animales.

optimacion en el
laboratorio9.10

RCP: SU

Si se desea poner en marcha esta tecnologia,

Jeben adquirirse los materiales y equipos
enlistados en la tabla 1. Por 10 que respecta a
reactivos, estos deben ser de la mejor calidad
posible y aparecen aquellos requeridos en
la reaccion propiamente y en el analisis y
caracterizacion del producto de la reaccion
(tabla 2).
Aunque algunos de los
elementos citados (tablas 1y 2) son especificos
oara la RCP, la mayoria se encuentran
disponibles en cualquier laboratorio de biologia molecular, de manera que las adquisiciones no resultan muy costosas comparadas con
las enormes ventajas que ofrece la reaccion.
Los protocoloshan evolucionado desde Ia introduccion de la RCP a la fecha,
favoreciendose no solo el aumento
de la especificidady sensibilidadde
- la reacci6n, sino tambien la eficien.ia,el aumento en el tamafio de los
productos amplificados y eI
incremento en la versatilidad de
aplicacionesa nivel de diagnosticoy
de investigacion. Esto se ha logrado
a traves del control de parametros
criticos como tiempo, temperatura y
nlimero de ciclos de amplificacion.
A su vez, Ia estandarizacionde concentraciones de reactivos (oligonucleotidos,ionmagnesio, ADN plantilla y d>m's) permite Ia disminuci6n de la formacion de dimerosde
'1ligonucleotidos(apareamiento en.ie sus extremos, creando un ADN
blanco artificial que sera tambien
amplificado)y contribuye tambien a
la disminucion del indice de incorporacion erronea, aumentando por
consecuencia su fidelidad.Tambien
permite mejor control de falsos
positivos.

Acrualmente existen protocolos que facilitan eI montaje

de la RCP por primera vez en ellaboratorio. Por ejemplo, varias compafiias se anuncian en revistas especializadas ofreciendo estuches comerciales para el diagnostico de enfermedades geneticas 0 infecciosas, en las
que solo se necesita adicionar eI ADN blanco y la enzima a un tuba que
ya contiene los otros componentes de la mezcla de reaccion; ademas, el
mismo estuche incluye las especificaciones de tiempos, temperatura; y
numero de ciclos que deben utilizarse para programar eI termociclau0r
y llevar a cabo la amplificacion. No obstante, existen situaciones en las
que es necesario establecer todos los parametros de la reaccion, desde
el disefio de los oligonucleotidos hasta el
analisis del producto amplificado. Es comun
que en estos casos, al iniciar la estandarizacion
de la RCP, surjan dificultades tales como
obtener niveles no detectables de producto
amplificado, productos inespecificos, 0 'a
formacion de dimeros de oligonucleotidos
que compiten con el ADN blanco en la
amplificacion. En estas circunstancias es
necesario variar cada uno de los parametros
hasta obtener condiciones optimas para la
reaccion. Los parametros a estandarizar se
describen a continuacion:
.

Tabla 1. Equipo y material necesarlo para

la RCP y anallsis de producto amplificado

La secuencia de los oligonucleotidos

iniciadores es responsable de la amplificaci6n
especifica del fragmento deseado, y para su
disefio es indispensable conocer la secuencia
del ADN blanco. AI ser este
uno de los parametros mas importantes que determina la
especificidad de la RCP, su
eleccion y disefio (se disCI[e
posteriormente) debe ser muy
cuidadoso. Idealmente, en
cada 100 JlI de reacci6n, la
concentracion aceptable de
cada oligonucleotido oscila
entre 0.05 y 1.0 JlM. El uso de
concentraciones
mayores
favorece la amplificaci6n de
regiones inespecificas ' ia
formacion de dimeros .Ie
oligonucleotidos.

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Jtable de
do osciia
EI uso de
mayores
acion de
.cas y la
leros de

,:r es tan sensible que Ia amplificacion puede hacerse a partir de una

,;3 moleeula de ADN. Genes de una sola copia en el genoma pueden ser

.. ~::mcme amplificados. La concentracion de ADN bianco en Ia reaccion

de la fuente utilizada, e idealmente se requieren aproximada= .. :e .0' copias de ADN blanco, esto es, de 300 ng a 1 ~g de ADN
',::,'mlCO humano. En el caso de usarse genes clonados en plasmidos, de
:; 3 100 ng de su ADN son mas que suficientes. Altemativamente,
~~nndades menores de ADN pueden utilizarse en la amplificacion de
:(DCSque exisren en varias copias
cO ei .-\DN plantilla, 0 mayores candaJcs euando se utiliza el mismo
~1r JC oligonucleotidos para am:ar ':arios genes pertenecien3 .:na misma
familia. La
!::ura 2 ilustra el efecto de la
cc'ilcentracion de ADN blanco en
una reaccion de amplificacion
rarticular.

., <~

[' la, enzimas ADN polimerasas

!,'1Cnables
actualmente utili::das para la RCP, Ia ADN polimerasa
Taq es la mas usada por su facil
cstandarizacion y menor costo.
Esta enzima tiene actividad de ADN
ralimerasa, de exonucleasa 3' a 5'
(correctora de prueba) y de
cxonucleasa de 5' a 3'. 5u indice
J,. errnr de incorporacion es de 1
, +,. 10'4 bases y amplifica sin
JItlcultad segmentos de hasta

3000 pb.l2
La mavoria de los
protocolos reCOmiend~n el uso de
1 a 2.5 u de la enzima por cada
reacci6n de 100 ~l. Para establecer la cantidad minima de enzima
rcauenda para una amplificacion
l
:0", v generar cantidades optir:;l; del producto, deben realizar5e titulaciones en gamas que van
Je 0.5 a 5 u por reaccion. Esta
medida, ademas de ser economica, se utiliza para probar una
en:ima recien adquirida y disminure la amplificacion inespedfica
J lie evidencia
1a presencia de
',1. is al analizar el producto
,pllticado en un gel.

La concentracion de iones magnesio en Ia RCP es tambien determinante

en Ia especificidad de la reaccion. Concentraciones muy altas conducen
a una baja especificidad, mientras que ias concentraciones minimas
necesarias disminuyen ei indice de incorporaciones
erroneas de
nucleotidos, por 10 que se recomienda optimar ia concentracion de
Mgcl, en cada reaccion. Para una reaccion estandard se recomienda
utili~ar una concentracion
final entre 0.5 y 2.5 mM. 5i se disminuye demasiado la concentracion
de Mgcl" Ia actividad de la enzima
decae al grado de que aigunas veces la amplificacion
es nula.

_________________

----11

---

CiENCIA Y DESAR2CLL:

Al igual que el
Mgcl" las concentraciones minimas ~ecesarias de chm's disminuyen el indice de incorporaciones
erroneas de nueleotidos, mientras
que concentraciones muy altas disminuyen la especificidad de la reaccion, por 10 que la concentracion de dNTP'S tambien debe
optimarse (figura 4). Concentraciones entre 20 y 200 /-lm proparcionan resultados optimos, debiendose igualar la concentracion
de cada uno de los cuatro d\11"s
~n concentraciones equimolares.

Temperatura de
alineamiento9,10,13,14

Los oligonuele6tidos se aparean al

temperatura de alineamiento pc:
complementaridad al ADNblaner
EI alto grado de complemert:rida:
entre las bases nitrogenaclas l,e h
ohgonucle6tidos y del ADNblance
permite u tilizar altas temperatur~
de alinearniento, 10 que favorece h
especificidad de la reaccion. Kc
obstante, es importante notar qUt
no siempre es necesario un 100% &
complementariclad entre estos com,
ponentes. Por ejemplo, para denti,
Figura 4. Influencia del numero de cidos en Ia RCP. LoScarnies 1 a/4 muestran eI
ficar genes relacionados fanilia;
produeto amplificado de una RCP sometida a cftferentes clc/os de amplfflcacion: 18,
multigenicas), es suficiente disefu:
22, 26 Y 30 Cidos, respeetlvamente. En este caso, /a RCP con 22 cic/os lcarril2J
T eoricamente, en condiciones
un par de oligonucle6tidos que ~
resulto ser la mas eficiente. Se puede observar c/aramente que entre los delos del
optimas el nivel de amplificacion
apareen a regiones conservada'
26 al 30, no hay incremento propordonal del produeto amp/ificado, pero sf se
generan amplfflcaciones inespecificas IbarridoJ. Garril S, testigo negatiVo; 1l2,
del ADN en la RCP aumenta en
entre los diversos miembros de h
marcador de peso molecular.
familia; de esta manera se lograL '
forma exponencial con cada cielo;
amplificaci6n de varios genes a iJ
sin embargo en la practica, despues
de determinado numero de cielos,
vez, los cuales posteriormentt
pueden ser clonados individualmente para su caracterizaci6n. En este Oli'
la amplificacion se detiene gradualmente. Entra primero a una fase
la temperatura de alinearniento puede ser menor a la Tm calculadl dell:
lineal y luego a una estacionaria, a la que se denomina fase de "meseta",
ser estandarizada para permitir el alinearniento de los ohgonucle6tidos CDf
siendo esta debida al agotamiento de la actividad enzimatica y a la
las secuencias de los diferentes genes, mas no deben utilizarse tempera~
insuficiencia para llevar a cabo la extension del numero masivo de
de alinearniento demasiado bajas, pues ori"ainarian inespecilicidad en l
complejos ADN blanco-oligonueleotidos,
presentes en los cielos que
anteceden a este fenomeno.
amp lificacion.
Esto puede evitarse si se aumenta el tiempo de exteT1sion
Cuando la temperatura de alineamiento es muy baii
en los ultimos ciclos de la reaccion 0 la cantidad de la enzima, aunque
existe mayor probabilidad de que los oligonucle6tidos se apareen j
10 recomendable
es ajusrar el numero de cielos de tal manera que la
regiones no especificas del ADNblanco y pueden tambien ser extendido'
amplificacion se realice al obrenerse los niveles maximos de amplificatoda vez que la polimerasa Taq posee actividad aun a bajas temperar;
ras. Utilizando temperaturas de hibridaci6n entre 55 a 65C se [c Juee:
cion en una reaccion que presente comportamiento lineaL EI numero de
cielos promedio oscila entre 20 y 30, dependiendo de la cantidad de ADN
grandemente los sucesos de apareamiento inespedfico.
inicial. El efecto del numero de cielos en la RCPpuede apreciarse en la
Para calcular la temperatura optima de alineamien:
figura 4.
para un par de oligonucleotidos dado, pueden utilizarse varias formu!~
Las temperaturas de desnaturalizacion (92 a 98C) y
empmcas. Una es adicionando 2 C por cada A y T presentes en t
oligonucleotido, y 4 C par cada G y C, y restando 5 C del resultaJ
extension (70 a 74C) son generalmente estandares para todas las
reacciones, La temperatura que tiene el efecto mas critico en la
tal y como se muestra en la tabla 3.
CaIculos mas precisos pueden hacerse utilizando f6rrn~
especificidad es la de alineamiento, la cual esta determinada principalmente por la temperatura media de fusion (Tm) de los oligonueleotidos.
las mas complejas, aunque casi siempre la anterior es suficiente rr,
alcanzar buenos resultados.
Aspectos importantes sobre esta se discuten a continuaci6n.

Probabl,

lfuemin:
productl
dd fragr
de: agarr
duso m

de la r
troforcsi
ctidio. p

de: la ~
Paneric

vdanaI
lIletOOo
circuns
P\lCden

de poi
con en
ruidas

,.b Cl
hdad
llltdial

du,p
tiJlca.
Tabla 3.
Determinacion de Ja
temperatura de
alineamiento

de

.lOY"

aparean a k
nnienro POr
ADN blanco.
emenrar.dad
nadas de h
ADN blanco
emperaturas
: favorece k
acci6n. No
e notar que
un lOO%de
e ec-" com.
p,
nn
:os (tamilias
ente diseiiar
ddos que se
:onservadas
mbros de k
He logra!a
i genes a !a
eriormente
CI1
case
110..
Jebe
'le6tidos con
emperaturas
lcidad en !a
r

s muy baja
apareen a
extendidos,
te"""~ratu
.s
.cen

lineamiento
ias f6rmulas
entes en el
:1 resultado,
mdo f6wu
.ciente para

,t

Debidoa la alta sensibUidad de la RCP, los problemas de contaminaci6n

con ADN diferente al que se quiere analizar, y sobre todo con productos
J amplificaciones anteriares, pueden facUmente presentarse y ocasior r ::rios problemas si no se extreman las precauciones en el montaje
Je la reacci6n. La contaminaci6n por acidos nudeicos puede deberse a
donas de plasmidos con los que rutinariamente se trabaja en el
laboratorio, y estan presentes como contaminantes en cantidades
relativamente grandes (con respecto de las moleculas susrrato para la
Rep) en el equipo, materiales y reactivos. Otra fuente de contaminaci6n
en ellaboratorio es la acumulaci6n de productos de RCP producida par
amplificaciones repetidas de la misma secuencia blanco. Esta contamirlcion es nociva, y desafortunadamente es probable que ocurra por el
If. numero de moleculas que son producidas en una reacci6n esrandard.
Cada reacci6n de RCP puede contener hasta lOl2 copias de producto
amplificado,por 10 tanto, aun la mas pequefia gota de aerosol (lOO ~I)
podriacontener mas de lOS blancos potenciales. La tabla 4 enlista recomendacionesen el montaje de una reacci6n. Se deben incluir siempre testigos
negativosen cada amplificaci6n y debe contarse con un area especial, y
resttin"aidaUnicamente para el montaje de la RCP, separada de las areas
donde se extrae el ADN, de donde se preparan y dividen en alkuotas los
reactivosy de donde se manipulan los productos de la reacci6n. Ademas se
\ :te prevenir lapresencia de aerosoles e incluir tambien un testigo positivo,
pamcularmenre en el caso de reacciones con fines diagn6sticos.

Diseno de oligonucle6tidos: la clave del

exito
Ademas de su especificidad,otros requisitos que los oligonucleotidos deben
cumplir son: tener un tamai'lo que oscUeentre 20 y 30 nucle6tidos, un
contenido de G y C de aproxirnadamente 50%, una temperatura media de
fusion (nn) de 55 ee, que no sean complementarios entre si 0 consigo
mismos (para evitar la formaci6n de estructuras secundarias y de dimeros de
oligonucleotidos) y que el tamano del fragmento flanqueado par los
oligonucleotidosno exceda la capacidad de la polimerasa para la extensi6n
(idealmeme no mayor de 3 000 pb).9.11
Todos los parametros mencionados pueden calcularse y
analizarse manualmente 0 se puede recurrir a programas computacionales
tales como OliGO (National Bioscience, rne. Plymounth, MN, E. E. U. v.),
SQUIGGlES

0 C1RCl.ES.9

El proceso de sintesis puede llevarse a cabo de' manera

manual, pero en la actualidad existen varias compaflias que ofrecen sus
servicios comerciales en la preparaci6n de los oligonucle6tidos y orras que
venden equipos automatizados para la sintesis de estos. Dicha sintesis
consiste sirnplemente en la adicion sucesiva de mon6meros (nucleotidos)
activados a nucleotidos previamente fijados a una resina soporte.14

Los oligonucle6tidos son liberados de la resina, putificados

y recuperados por electroforesis preparativa en geles de poliacrilarnida 0
preferentemente mediante cromatograt!a liquida de alta presion. Algunas
modificacionesquimicas en el residuo 5'-OH del ultimo monomero incorporado, permiten la adici6n de grupos radiactivos 0 de biotina, de tal manera
Probablemente una de las caracteristicas que mas influy6 en la
que el oligonucle6tido queda preparado para participar directamente en
diseminaci6n de esta metodologia fue la facilidad para detectar el
procesos de identificacion de secuencias genicas.
producto amplificado. AI finalizar la reacci6n existen mUlones de copias
Si las condiciones de reacci6n son optimadas y los
del fragmento de interes, por 10 que es suficiente con colocar en un gel
oligonucle6tidos esran apropiadamente disefiados, estos se aparean a un
:e 19arosa una decirna parte (insolo sitio del ADN blanco y generan
duso menos) del volumen total
fragmentos amplificados de un tade la reacci6n, correr la elecmano unicoi en caso contrario, se
troforesis y tefur con bromuro de
obtienen fragmentos inespecificos
etidio,para poder verificar el exito
de varios tamaiios.
de la amplificaci6n (figura 5).
Los productos inPosteriormente. la caracterizacion
especificosamplificadosal inicio seryelanalisisfino se realiza siguiendo
vicin como plantlllas en el resto de
metodologias elegidas para cada
lareaccion, otiginandose una mezcla
,:ircunstancia particular, como
pb
de productos que puede enmascarar
~ueden ser: electroforesis en gel
fragmentos esperados en la RCP.
-<124
123
de poliacrilamida; digestiones
Los dimeros de
104
con enzimas de restriccion se-89
oligonudeotidos iniciadores son
80
glJidas por electroforesis en gel,
un artificio de la amplificacioni son
y la confirmacion de la idenfragmemos de doble cadena cuya
tidad del producto de RCP
longitud escasi igual a la suma de la
mediante hibridaci6n con sonlongitud de los dos oligonudas y por secuenciacion nudeocle6tidos, y se originan cuando
FIgura S. Ejemplo del analisis del producto amplificado. En ef diagn6stico de
tLlica, etcetera.
estos
se aparean por complefibrosis quistica, primero se analiza el exlto de la reaccl6n de amplificaci6n en
mentaridad
de secuencia en sus
un gel de agarosa al1.5% (panel AJ. Posteriormente, dichos productos se
separan en un gel de poliacrilamlda a18% (panel BJ,lograndose asi dlstlngulr una
extremos 3', y son extendidos por
sola banda en el adNamplificado de dos indivlduos sanos (carrifes 1 y 3) Y dos
la ADN polimerasa, sirviendo el probandas en el ADNamplificado de un portador heterocigoto. que dlfieren en su
ducto como plantiUa para su propia
!amalio por s6/0 tres nucleotldos. /of, corresponde al marcador de peso molecular.

---------_..":'p-----.......------C!E{:C!,~ '/ D:SAR,~C~L~

mplificaci6n. Estos se forman especialmente cuando no se pone atenci6n

a tales secuencias complementarias entre los extremos de los
oligonucle6tidos, y cuando se llevan a cabo muchos ciclos de amplifica
ci6n en una reacci6n que contenia muy pocas copias iniciales del ADN
bl
Si estos se forman desde ciclos tempranos, pueden llegar a ser el
prVuJcto predominante en la reacci6n. La forinaci6n de dimeros de
iniciadores se previene cortiendo unos cuantos pares de bases en
cualquier direcci6n las regiones de ADN blanco que se escogieron para
determinar la secuencia de los oligonucle6tidos y asi desfavorecer
regiones complementarias entre estos. Tambien se evitan aumentando
la temperatura de alineamiento 0 incrementando la concentraci6n del
ADN blanco para evitar excesos de oligonucle6tidos.11
o

----

nar la enzima a la reacci6n hasta despues de que se haya alcanzado la

temperatura de desnaturalizaci6n. A este procedimiento se Ie ha llamado
iniciaci6n de la RCP a alta temperatura (Hot.Stan PCR, en ingles) y ha
dado excelentes resultados.

'.

Progresos recientes en la RCP

Los problemas que se presentan con el uso del fragmento Klenow se
superaron al poco tiempo de surgida la RCP, con la introducci6n de la ADN
polimerasa termoestable Taq. 7
EI uso de esta enzima permiti6 el desarrollo del
termociclador automatizado, una maquina programable que permite
llevar a cabo la reacci6n en un solo tuba, en tiempos muy conos. Estas
modificaciones simplificaron la metodologia e incrementaron la
pecificidad de la reacci6n.

Entre las innovaciones enzimaticas recientes tendientes a aumentar aim

mas la fidelidad de la reacci6n, destaca la introducci6n de enzimas y
fragmenrosde ADN pohmerasa con menor indice de error de incorporaci6n;
por ejemplo, la ADN pohmerasa VThT, aislada de la bacteria Therrnococcus
Jjwralis, yelfragmentoStoffel(derivadode la ADN pohmerasaTaq), que poseen
!icesde error tan bajos como 1 x 10,7,12
Lasventajas logradas al utilizar las nuevas ADN pohmerasas
termoestables fueron el aumento de la fidelidad en la incorporaci6n de
nucle6tidos y el incremento en la longitud de los segmentos amplifica
dos. Mientras que en las primeras reacciones los productos no alcanzaban
longitudes mayores de 400 nucle6tidos, actualmente es posible amplifi.
car productos hasta de 10 000 nucle6tidos.12
Muchos desarrollos recientes en la RCP han aumentado su
efectividad y versatilidad, destacando los que se describen a continuaci6n:

Como se discuti6 anteriormente, uno de los problemas que pueden

presenrarse en la RCP es la amplificaci6n inespecifica, que ocurre por
lreamientos err6neos enrre los oligonucle6tidos y regiones del ADN
"derentes a la regi6n blanco, los cuales se generan a temperaturas bajas,
condici6n en la que la enzima presenta actividad. Esto generalmente
ocurre en el transcurso del montaje de la reacci6n, antes del primer paso
de desnaturalizaci6n. Para evitar este problema se recomienda adicio-

Una segunda sugerencia para evitar problemas de inespecificidad debi

da alas altas concentraciones de oligonucle6tidos que se requieren para
efectuar todos los ciclos de la RCP, consiste en montar la reacci6n con
cantidades mucho menores de oligonucle6tidos, y someterla a los
primeros 10 ciclos de amplificaci6n. Inmediatamente despues se adicio
na el resto de los oligonucle6tidos para continuar con los ciclos restantes
y terrninar la amplificaci6n. A esta alternativa se la ha denominado RCp
potenciadora, y con ella tambien se evita la formaci6n de dimeros de 105
oligonucle6tidos iniciadores, pues estos se uniran preferentemente al
producto de amplificaci6n creado en la primera parte de la reacci6n y,
posteriormente, cuando se agregue el resto de oligonucle6tidos, ya
habra muchas copias del ADN blanco que, al capturarlos, eviten problemas derivados de su abundancia.

Clonacion y determinacion de la secuencia nucleotidica del

produeto de la RCp15
La RCP tambien proporciona un metodo simple y rapido para el aish
miento y clonaci6n de fragmentos de ADN e incluso para su mutagenesis.
Estos fragmentos de ADN deben ser tratados con la enzima polinucle6tido
cinasa en presencia de ATP, para producir los extremos 5'fosfato reque
ridos para su clonaci6n en un vector adecuado, previamente digerido
con alguna enzima de restricci6n que genere extremos romos. Un
metodo mas practico es la utilizaci6n de oligonucle6tidos con sitios de
reconocimiento para enzimas de restricci6n en sus extremos 5',
Adicionalmente, la introducci6n de ligeros cambios en la secuencia de
los oligonucle6tidos induce mutaciones dirigidas en el ADN blanco.
La determinaci6n de la secuencia del ptoducto amplificacic
puede hacerse direeta 0 indirecramente. La ultima se tealiza a traves de la
clonacion del producto en un vector para secuenciacion (como los deriva
dos del fago M13). Para la determinacion de la secuencia, generalmente se
utiliza el metodo enzimatico de Sanger,16 que utiliza inhibidores
(desoxinucle6tidos)de la extension en la sintesisin vitrode nuevas cadenas
de ADN y un pequeno oligonucleotido especifico y complementario a un
extremo del fragmento de ADN cuya secuencia deseamos conocer. Dado el
indice de error de incorporacion de la pohmerasa Taq, se requiere verifica'
y comparar la secuencia de nucleotidos de varias clonas producidas en L
misma yen diferentes amplificaciones.
Para lograr la secuenciacion directa, se realiza una ampli
ficacion asimetrica utilizando un vasto exceso de uno de 10s dos
oligonucleotidos, usualmente en la gama de 50:1 a 100:1, cuya exten
sian en la RCP amplifica principalmente una de las cadenas blanco cuyas
copias son directamente sometidas al metodo Sanger (figura 6) para
determinar su secuencia nucleotida.

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FI;u. 6. Determinacion directa de la

secuEnciade un producto amplificado. EI
diagramai1ustra el metodo dlrecto en los
\iguientes pasos: A, ampllflcacion del ADNa
anailzarpor RCPy purificaclon del mismo.
I, sinces/sdel ADN,empleando el producto
amp/ificado, y purlflcando un ollgonucleotldo
especiflco para una de las dos cadenas, dNTP's
(uno de /os cuales esta marcado radlact/va
mente) y /a ADNpollmerasa. c, Inhlblcion de la
reaCCionde sintesis del ADNpor la ad/cion de la
mez de reaccion a cuatro tub os, cada uno
de Li cuales contlene un dlferente dNTPque
detiene la sintesis y genera fragmentos
marcadosde diferentes tamanos. D, en el
recuadro se observa la colecclon de cinco
fragmentos radlactivos generados en el tubo
Que contiene ddTTP.E, separacion de los
prOductos de la reaccion por electroforesis en
un gel de pollacrllamlda y autorradlografia. AI
leer las bandas de abajo hacia arriba se obtlene
/a secuencia nucleotidlca del fragmento
amc 'ic::do, i1ustrada en ellado derecho del
autuaaiograma.

na ampli.
; los dos
1C,
1 6)

,as
para

Una de las formas mas simples de detectar mutacione, es determi

nando, en forma directa, la presencia 0 ausencia de estas en una
re'ion particular del ADN. Un perfeccionamiento
que se ha hecho
1t: la RCP, consiste en incluir varios pares de oligonucleotidos
en

Figura 7. RCP multiplex para deteccion de

mutaciones en pacientes con distrofia muscular
ligada al x (DMLXl. Se observa la ampllficaclon
slmultanea de nueve exones del gen de la
dlstrofina, generandose nuevas bandas de tamalio
caracteristico lindicadas en pb a la izquierda de la
flguraJ.En ellndlviduo afectado I'J se observa la
ausencla de la banda de 388 pb debldo a que
presenta una delecion del exon 51 de su unica
copia del gen de la distrofina, que generaria dicha
banda. La madre portadora 10J presenta una
dlsmlnuclon en /a In tens/dad de esta banda 1388
pbJ corroborando su czracter de heterocigota para
la dele cion. N, indlvlduo femenino normal.

una misma reacci6n, para poderamplificar

simultaneamente
va
rias de las regiones de un gen que mas frecuentemente
estan
involucradas en mutaciones (figura 7). A esta estrategia se <Ie ha
Hamado RCPmUltiplex, tal y como fue descrita original mente por
Chamberlain y colaboradores en su analisis del gen de la distrofina,
del que se amplificaron nueve regiones.

\ ,_-" r,traregias utilizadas en biologia molecular para el analisis de la

:"." '1 Je genes, requieren de la sintesis de copias de ADN (ADNC) por la
0'_'::;" .,<riprasa inversa, a partir de ARNm,generalmente dificil de
nueva opcion, que esta utilizandose ampliamente, es la sintesis
. ~ ','\( I' su amplificacion mediante la RCP.La enzima ADN polimerasa Taq
, o:::r:~n rresenra actividad de retrorranscriptasa, de manera que si se utiliza
"':,\,c'morempladoen una reaccion RCPpodemos obtener como producto final
oX reJccion.-\DNC amplificado,
Para este proposita es preferible realizar en fonna secuencial
lJ ,inresisJe .-\DNC a partir de ARNmy suamplificacion en el mismo tubo de
n:leCIlin,empleando la polimerasa tenno,estable de la bacteria Thermus
tf~"1'1"'JT :'5 I '.DN polimerasa nh), dado el menor indice de incorporaciones
m,;nr.. .ore5ra enzima.

::~:~r
_:;.;

La causa mas comun de contaminacion son los productos amplificados

rrrmmente. Par fortuna, se dispone ahara de metodologias para la
lli.lCtll'acionde los ADN amplificados previamente. Una de estas utiliza
.je'<.lXiuridinatrifosfato
(dlITP)en vez de desoxitimidinatmosfato (dm), de
~ mane'] que la presencia de este nucleotido pennite la distincion entre los
prrJuctl de amplificaciones previas y el ADN de una nueva muesrra. Los
prlJuctos contaminantes son degradados par la enzima termosensible
unJilglicosilasa,que se anade durante el ensamblaje de la reaccion; la cual
C$ itl3ctivadaen el paso de desnaturalizacion del primer ciclo de la RCP,Esta
estl:llegianos permite amplificar unicamente el nuevo ADN blanco (figura 8).
Recientemente se describio un metoda alternativo de
l/\Jeril'acionde las moleculas contaminantes, basado en las propiedades
fofCJquimicas
del psoralen. Este compuesto es adicionado a la mezcla de
.rtJecion,y justa al concluir esta el tubo se expone a luz ultravioleta de onda
Ur5'"' I.: .uat fotaactiva el psoralen fonnando ciclobutano con los residuos
de ririnlldina en el ADN amplificado. Esto ultimo previene que el ADN
amplificadopueda participar en RCPsposteriores.

Amplificacion y confirmacion de IDS

productos de la reaccion en un solo paso
Recientemente se demostro que al incluir bromuro de etidio en la
reaccion, se puede determinar la presencia de las moleculas de AD;';
amplificadas mediante la irradiacion con luz ultravioleta. De esta
manera, se puede seguir la reaccion durante los diferentes ciclos,verificar su
exita e inclusive inferir el grado de amplificacion alcanzado.2c

Aunque no es propiamente una RCP,resulta ser una prometedora alternativa

para el diagnostico c1fnicov, en general, para la deteccion de muraciones
conocidas. Esta tecnica es catalizada por una ADN ligasa tennoesrable, en
lugarde la ADN polimerasa.Tambien difierede la RCPen que se emple~n dos
pares de sondas oligonucle6tidas (de 20 a 50 pb cada una) que se alfnean con
cada una de !ascadenas del ADN blanco, quedando susextremos yuxtapuesros,
en condiciones apropiadas para ser ligados covalentemente par la ADN
ligasa. En caso de presentarse un mal apareamiento en este punta,
debido a una mutacion en el ADN blanco, los extremos vuxtapuestas no
son ligados por la enzima y no se generan productos de ligacion. Esta
reaccion de ligacion se efecllia en un proceso dclico (25 a 30 ciclos) ,
semejante a la RCP,y comprende los siguientes pasos:
1) Desnaturalizacion del ADN (90 a 95 DC).
2) Alineamiento de !as sondas con el ADN blanco (50 a 65 DC).
3) Ligacion (60 a 70 DC) (figura 9).
Como resultado de esta reaccion se generan, 0 no, productos
ligados, dependiendo de la complementaridad perfecta 0 imperfecta entre
las sondas Vel ADN blanco en los sitios de la ligaci6n. La mas comun para la
identificacion de estos productos es marcar radiactivamente alguno de los
oligonucle6tidosy detectar el producta de la reaccion por autorradiograna,
tecnica que nos demuesrra la presencia 0 ausencia de la banda del tamano
esperado, detenninado par la suma total de la longitud de ambos
oligonucle6tidos.

perspectivas
FIgura 9. Reacci6n en cadena de la ligasa. Se
tsiluematizan los pasos Que constituyen cada
delo de '1 remion. En ei caso de un ADN
normal jnG; AJ. ei alineamiento perfecto de
, /as sonaasoligonUcleotidas especificas al ADN
C14nco.permite /levar a cabo la ligacion de los
!Jtremos yuxtapuestos de las sondas , y
~,.
, pues de varios ciclos produce fragmentos
: (amaliomayor Que el de las sondas
Qinales y se produce un aumento
ir;nenCial de los fragmentos ligados. Cuando
iF. atade un ADN mutado (panel BJ, no existe
.neamlento perfecto entre las sondas
!Sewfl'" v .,
~ ',' ,). = ADN blanco en el punto de
1.:;lon or;o Que no se /leva a cabo la
''''C'Or: y las
'" "
SOndasconservan sus tamalios
~1;lnaies.

de la RCP

Al poder de las metodologias aportadas por la tecnologia de

recombinacion de :icidos nucleicos, podemos ahara sumarle el de la RCP,
para asi conjuntar herramientas invaluables para la investigacion
biomedica. Sin duda que el conocirniento que contribuyen a generar
pennitici conocer y explicar mejor el funcionamiento de la celula, y por
ende, controlar mejor las causas que la trastornan.