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PRACTICA N 6.

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO MS CON DIFERENTES


CONCENTRACIONES DE REGULADORES DE CRECIMIENTO
I. OBJETIVOS:
1.1. Formula y prepara el medio de cultivo de Murashige y Skoog con
diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento.
1.2. Explica la importancia de los reguladores de crecimiento en el cultivo in
vitro.
1.3. Adquiere destreza en la preparacin de medios de cultivo.
1.4. Enfatizar en el proceso enseanza-aprendizaje valores de puntualidad,
responsabilidad, cooperacin y perseverancia.
II. MARCO TERICO:
El crecimiento de las plantas es un proceso dinmico, complejo y que esta
rigurosamente controlado, en el que las hormonas juegan un papel principal en
los procesos fisiolgicos.
En el cultivo in vitro, los reguladores de crecimiento, especialmente las auxinas
y citoquininas, juegan un papel muy importante en la extensin y/o la divisin
celular del explante.
Existe una gran cantidad de literatura sobre las concentraciones adecuadas de
los reguladores de crecimiento que pueden ser necesarias para iniciar el cultivo
de tejidos o de clulas de una determinada especie de planta. Sin embargo por
habituacin, cultivos in vitro que inicialmente necesitaban reguladores, para su
crecimiento y/o formacin de rganos, despus de algunos repicados necesitan
menores aportaciones de reguladores, o pueden prescindir por completo de
ellos.
Hormonas y reguladores de crecimiento:
Las hormonas son compuestos orgnicos sintetizados por las plantas, que
estimulan, inhiben o modifican de algn modo cualquier proceso fisiolgico,
actan generalmente en un lugar diferente a donde son producidas y se
encuentran presentes y activas en muy pequeas cantidades. Aparte de estos
productos naturales, se han desarrollado tambin otros de tipo sinttico, que
pueden tener una actividad similar a la de los primeros. Al conjunto de estos
productos sintticos, junto con las hormonas, se denomina reguladores de
crecimiento.

Para el cultivo in vitro los reguladores ms utilizados son los promotores del
crecimiento: auxinas, citoquininas y giberelinas.
Auxinas:
Las auxinas comprenden una gran familia de sustancias que tienen en comn
la capacidad de producir: elongacin celular o expansin de los tejidos y
formacin de races adventicias.
Existen varias sustancias auxinas llamadas naturales, siendo el cido indol
actico (AIA) el compuesto de mayor utilizacin.
Tambin se utiliza ampliamente un buen nmero de sustancias que provocan
un efecto fisiolgico similar y que se han producido sintticamente; son las
llamadas auxinas sintticas, entre las cuales el 2,4-D (cido 2,4diclorofenoxiactico), ANA (cido naftalenactico) y AIB (cido indol-3-butrico)
se encuentran ampliamente disponibles y se utilizan comnmente.
Citoquininas:
El nombre genrico de las citoquininas es empleado para aquellas sustancias
qumicas que pueden estimular principalmente la divisin celular. Casi todas
las citoquininas conocidas, tanto naturales como sintticas, son derivados de la
adenina, en los cuales el grupo amino lleva determinados sustituyentes en la
posicin 6.
Entre las citoquininas naturales, aisladas e identificadas, la ms ampliamente
distribuida es la zeatina, extrada del endospermo del maz, que adems de ser
la citoquinina natural ms potente est presente tanto en plantas superiores
como inferiores, pues tambin ha sido aislada de algas, hongos y bacterias.
Actualmente existen citoquininas sintticas como la kinetina (6-furfuril
adenina) y BAP (6-bencil-aminopurina).
Los niveles citoquinnicos son muy altos en frutos jvenes en desarrollo, en
semillas, embriones, hojas y predominantemente, en las races, que parecen
ser la fuente principal de citoquininas de las plantas, desde las cuales son
enviadas hacia los brotes.
Las citoquininas promueven la divisin celular, la formacin de vstagos
axilares y alargamiento de las hojas.
Giberelinas:
Son productos complejos del metabolismo del hongo Gibberella fujikuroi o de
plantas superiores, y que son capaces de intervenir en el crecimiento de
muchas plantas.

En la naturaleza existen muchas giberelinas, a las que se les designa como


giberelina GA1, GA2, GA3 y as sucesivamente, llegando ms all de la GA40.
La primera giberelina purificada y estructuralmente identificada fue el cido
giberlico (GA3)
Las giberelinas inducen la elongacin de los entrenudos, crecimiento de los
meristemos o yemas, germinacin de semillas.
III. MATERIALES:
3.1. Material de vidrio:
Baguetas.
Balones, 500 mL.
Frascos mbar para almacenar soluciones.
Frascos transparentes de cultivo.
Matraces, 100 y 250 mL.
Pipetas, 1, 5, 10 mL.
Probetas, 500 mL.
3.4. Reactivos:
Soluciones stock del medio MS.
Phytagel.
Reguladores de crecimiento: ANA, BAP y AG3
Sacarosa.
3.4. Otros:
Esptula.
Guantes de asbesto.
Ligas.
Micropipeta, 1000 L.
Papel aluminio.
Picetas.
3.5. Aparatos:
Balanza analtica.
Potencimetro.
Autoclave.
Microondas.

IV. METODOLOGA:
Preparar 2 L de medio de cultivo de Murashige y Skoog con diferentes
concentraciones de reguladores de crecimiento, como seala la Tabla N1.

Tabla N1: Tratamientos con diferentes concentraciones de factores de crecimiento.

V. PROCEDIMIENTO DETALLADO:
Cultivo in vitro de zanahorias a partir de callos :
PROCEDIMIENTO
La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, as como la higiene de las
manos.
El lugar de trabajo ser desinfectado con alcohol 70. Los participantes se
lavarn muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabn, antes de
pasarse alcohol 70. Cuidado! El alcohol es inflamable. Esterilizar el material
contaminado antes de descartarlo.

1. Esterilizacin de la superficie de la zanahoria.


- En un azulejo bien limpio, cortar con un cuchillo un pedazo de zanahoria de 3
a 6 cm, descartando ambas extremidades de la raz.
-Raspar para retirar la epidermis y marcar con algn corte la extremidad
inferior de la raz.

VI. RESULTADOS Y DISCUSIN:


Germino
X No germino
C Contaminado
ML Medio liquido
MANDARINA :
ANA(uM)/BAP(uM) 0

10

ML

10

ANTERAS :
ANA(uM)/BAP(uM) 0

10

10

ANA(uM)/BAP(uM) 0

10

10

ANA(uM)/BAP(uM) 0

10

ML

ZANAHORIAS :

DATILES :

VIII. CALCULOS:
Para las concentraciones de : 5/0 5/1 5/5 5/10
5/0 :
C1V1 = C2V2
1000 uM x V1 = 5uM x 125 ml
V1 = 0.625 ml
5/1 :
C1V1 = C2V2
1000 uM x V1 = 1uM x 125 ml
V1 = 0.125 ml

5/5 :
C1V1 = C2V2
1000 uM x V1 = 5uM x 125 ml
V1 = 0.625 ml
5/10 :
C1V1 = C2V2
1000 uM x V1 = 10uM x 125 ml
V1 = 1.25 ml
VII. CONCLUSIONES:

Para iniciar nuevos pices de ramas o brotes pueden ser:directamente


del explante o indirectamente del callo que se forma en la superficie
cortada del explante .

Para iniciar brotes adventicios es importante seleccionar bien el explante


y el rgimen de hormonas a que se sometan las plantas .

Las concentraciones elevadas de citoquininas estimulan la iniciacion de


yemas ramales .

IX. CUESTIONARIO:
Enumera las hormonas vegetales inhibidoras del crecimiento y
describe sus efectos en el cultivo in vitro.

FENOLICOS: Flavonoides (naringerina, quercetina) cidos Benzoicos


(cido glico, siqumico y cafeico), Cofactores de la oxidasa del AIA
(Ferlico y cumrico) o DIFENLICOS (cido clorogenico) .
Los derivados de las lactonas son cumarina, escopoletina, aesculina,
anemonina, juglona, umbeliferona
Se encuentran en todos los rganos de la planta: en tallos el inhibidor
Beta (ac. abscisico y otros inhibidores), en yemas el ABA y en frutos
cido cumrico, cafeico, etc. Se los puede encontrar como cidos libres
o como esteres glsidicos o glucsidos
Mecanismo de accin:

ABA: acta sobre la sntesis de enzimas y sobre la accin de las


giberelinas
Inhibidores: actan sobre las enzimas en forma directa, los fenoles
actan sobre la AIA oxidasa y por consecuencia en la concentracin de
AIA, las cumarinas actan sobre la oxidacin del AIA y los flavonoides
tamben sobre la AIA oxidasa y la produccin de ATP en las
mitocondrias.
Procesos que inhiben: germinacin de semillas o brotacin de yemas

Enumera las principales hormonas vegetales no clsicas

Poliaminas

Oxilipinas

Salicilatos

Oligosacarinas

Estrigolactona

Sistemina

Brasinesteroides

Cuales son los efectos de la interaccin auxina-citoquinina en la


induccin de proceso morfognico en cultivo de tejidos?

Las auxinas usadas junto con las citoquininas pueden estimular o


suprimir la embriogenesis in vitro .La adicin de auxinas tales como AIA
y 2,4 D al medio de cultivo en concentraciones elevadas ,suprimen
significativa o totalmente la embriogenesis mientras que los inhibidores
de sntesis de auxina (7 azi-indol y 5-HNB) estimulan este proceso al
igual que las altas concentraciones de citoquininas ,especialmente
cinetina y benzilaminopurina .Uno de los ejemplos ms claros de la
actividad de la citoquinina ocurre en la germinacin de grmenes.El

endospermo de los grmenes del monocotiledon ,tales como el maz


,contiene almacenes grandes del precursor zeatin ,cuando el ncleo del
maz germina, los movimientos del zeatin del endospermo a la raz se
inclinan donde se estimula mitosis vigorosa.

X. BIBLIOGRAFA:
AZCN-BIETO, J. y TALN, M. Fundamentos de Fisiologa vegetal. 2da
Edicin. Editorial McGraw-Hill. Espaa. 2008.
HURTADO, D., MERINO, M. Cultivo de tejidos vegetales. Editorial Trillas.
Mxico. 2000.
ROCA, W., MROGINSKI, L. Cultivo de tejidos en la agricultura.
Fundamentos y aplicaciones. Centro internacional de Agricultura Tropical
(CIAT). Colombia. 1993.

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