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MICROBIOLOGA
(2 INGENIERA AMBIENTAL)
NDICE
PRCTICA 1...4
1.1 ESTERILIZACIN (TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y PREPARACIN
DEL MATERIAL).
1.2 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES.
1.3 CULTIVO DE MICROORGANISMOS. TCNICAS DE SIEMBRA.
1.4 PRODUCCIN DE INDOL
1.5 TEST DE MOVILIDAD
1.6 FERMENTACIONES. PREPARACIN DE YOGUR.
1.7 CEPAS MICROBIANAS, MORFOLOGAS
1.8 DILUCIONES
SERIADAS.
RECUENTO
DE
POBLACIONES
MICROBIANAS.
PRCTICA 2.24
2.1 RECUENTO DE POBLACIONES MICROBIANAS.
2.2 PRUEBAS BIOQUMICAS.
2.3 REALIZACIN DE FROTIS Y TINCIN DE GRAM.
2.4 PRUEBA DE LA CITOCROMO C OXIDASA
2.5 ANLISIS MORFOLGICO.
2.6 MICROSCOPIO.
PRACTICA 3.37
3.1 COLUMNA DE WINOGRADSKY.
3.2 IDENTIFICACIN DE CEPAS BACTERIANAS.
3.3 OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS (LEVADURAS, MOHOS,
ALGAS Y PROTOZOOS).
PRCTICA 1
1.1
ESTERILIZACIN
1.2
2) Medios selectivos o inhibitorios: Son medios slidos que contienen adems de los
nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos
permitiendo el crecimiento de otros, por ej. agar cetrimide.
Estos medios tambin pueden contener indicadores para diferenciar los distintos tipos
de microorganismos que puedan crecer en l; tal medio sera selectivo y diferencial, por
ej. Mac Conkey, Baird Parker, EMB, etc.
3) Medios de enriquecimiento selectivo: Son medios lquidos que contienen inhibidores,
como tetrationato, sales biliares, concentraciones de cloruro de sodio mayores a la
fisiolgica, etc.
4) Otros: Dentro de los otros tipos de medios de cultivo podemos sealar:
a) medios de mantenimiento
b) medios para identificacin
c) medios para ensayo microbiolgico de vitaminas y aminocidos
d) medios para recuentos, etc.
En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar.
En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad deseada
del mismo y redisolverla en agua destilada. Antes de su esterilizacin, los medios
lquidos se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces); en ningn caso
la altura del lquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de este.
Una vez fundido, se distribuye en caliente en tubos o matraces (no en placas de Petri),
se tapa y se esteriliza.
Finalizada la esterilizacin en autoclave:
1. Los medios lquidos se dejaran enfriar a temperatura ambiente
2. Los medios slidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al
solidificarse, adopten la forma de agar inclinado (slant) si tal es su finalidad.
3. Las placas Petri pueden tambin ser preparadas ahora, vertiendo el medio aun
fundido y estril dentro de ellas en un ambiente asptico (p. Ej. En la
proximidad de la llama de un mechero Bunsen).
Material necesario
Esptulas para pesar
Papel de aluminio
Probetas de 500 ml
Medios de cultivo (Agar Nutritivo, Triptone Soya Agar TSA, Agar de Kliger KIA,
King B)
Agua destilada
2 balanzas
2 agitadores magnticos
Imanes
Botellas de 1 l
Tubos de 10 ml con sus tapones correspondientes
Gradillas para tubos de 10 ml
Placas de Petri
Cinta de autoclavar
Cada grupo tendr que preparar el medio de cultivo que se indica en la tabla 1.
As mismo cada grupo tendr que sembrar cada cepa problema que le corresponda
(segn se indica en las Tabla 1) en su placa de agar correspondiente y en los tubos KIA
(ver Tabla 2), por tanto cada grupo necesita 3 placas y 3 tubos KIA.
Tabla 1.
GRUPO
A
B
C
D
E
F
G
H
I
CEPA
1, 4, 6
2, 5, 7
1, 3, 6
2, 7, 4
3, 5, 8
3, 6, 8
2, 5, 7
1, 4, 8
1, 5, 6
MEDIO
AN
KIA
AN
TSA
AN
KING B
AN
KIA
AN
Tabla 2.
CEPA
1
2
3
4
5
6
7
8
MEDIO DE CULTIVO
Agar Nutritivo
Agar Nutritivo
Agar Nutritivo
Agar triptona soja (TSA)
Agar Nutritivo
Agar Nutritivo
King B
Agar Nutritivo
T DE CULTIVO (C)
30
37
30
37
37
37
30
37
AGAR NUTRITIVO
El agar se utiliza como agente gelidificante para dar solidez a los medios de cultivo. El
componente dominante en el agar bacteriolgico es un polisacrido, al que acompaan
algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2% en
agua licua hacia los 100 C y se gelifica alrededor de los 40 C, dependiendo de su
grado de pureza. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es
empleado como nutriente.
El agar nutritivo es una mezcla de agar bacteriolgico (15,0 gr/l agua destilada), mas
peptona de gelatina (5,0 gr/l) y extracto de carne (3,0 gr/l).
Mtodo de preparacin (hacer 250 ml de medio de cultivo)
1.
2.
3.
4.
MEDIO B DE KING
Es un medio para la identificacin de Pseudomonas, ya que favorece la produccin de
fluorescena. Esta compuesto por una mezcla de peptonas (20,0 gr/l), fosfato dipotsico
(1,5 gr/l), sulfato de magnesio (1,5 gr/l) y agar bacteriolgico (14,0 gr/l).
Mtodo de preparacin (hacer 250 ml de medio de cultivo)
1.
2.
3.
4.
5.
10
1.3
La toma del inculo de las muestras que hay que examinar es simple pero se requiere
prestar atencin en el proceso. Se recomienda colocar el mechero frente a la persona
que est trabajando y la preparacin o muestra que contiene los microorganismos, as
como el resto del material necesario. Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin
tropiezos.
Material necesario
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Mtodo de preparacin
1. Tomar el asa de siembra y flamear el filamento hasta que ste alcance un rojo
incandescente. Enfriar en la proximidad de la llama unos 10 segundos.
Si la muestras est en una placa de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesa de
trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos.
Llvela a la proximidad de la llama del mechero.
2. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, tome una pequea
porcin de una de las colonias mediante un ligero roce con el asa de siembra.
3. Transferir el inculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad
de la llama, etc.) o bien proceder a preparar un frotis para tincin.
11
inoculo haciendo estras en zigzag. Solo 2-3 veces seguidas, no vuelva atrs a la
primera zona de estra. Esta porcin de estra debe ocupar la mitad del resto de la
plaza que queda sin utilizar. Repetir la operacin por tercera vez. Esta debe ocupar
la porcin restante de la placa.
12
8. Incubar las placas y tubos durante un mnimo de 24 horas a la T que precise cada
cepa. Colocar las placas boca abajo dentro de la estufa para evitar la
condensacin que impedira la formacin de colonias aisladas.
9. Observar si hay crecimiento de colonias caractersticas en cada medio
de cultivo.
Mtodo
1. Inocular los tubos con caldo triptona con las cepas problema e incubar a la T
que precise cada cepa durante 24 horas.
2. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared
interior del tubo.
El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la
13
1.5.-TEST DE MOVILIDAD.
Hay bacterias que tienen la capacidad de moverse por la presencia de flagelos. Para
ello se realiza el test de la movilidad en medio semislido. La concentracin de agar en
el medio ha de ser suficientemente baja como para formar un gel suave que no impida la
movilidad de aquellas bacterias que la presenten. Para identificar la movilidad
bacteriana se le aade al medio una sal de tetrazolio (TTC) que ser reducida por el
metabolismo bacteriano transformndolo en formazn cuya coloracin es rojiza. De este
modo, las bacterias no mviles mostrarn coloracin rojiza tan slo a lo largo de la lnea
de inoculacin mientras que las bacterias mviles pueden desplazarse de la lnea de
inoculacin y por lo tanto el color rojo se ver en una mayor rea (ver dibujo 1 apartado
2.2).
Mtodo de preparacin
Aadir a cada uno de los tubos, aproximadamente 1 ml del medio correspondiente para
cada bacteria y 3 ml de una solucin con sal de tetrazolio (TTC) al 0,04 % (se os dar ya
preparado).
Una vez que el medio gelidifica, se har una siembra en profundidad (por picadura) de
cada una de las cepas bacterianas que cada grupo tiene asignadas. Los tubos se
colocarn en las estufas a sus temperaturas correspondientes durante 24 h. (determinar
la movilidad al da siguiente).
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CEPAS MICROBIANAS
Bacillus sp. Esporulado. Gram positivo y observar las endosporas, as como la
morfologa de bacterias bacilares. Fermentacin de la glucosa .Medio de cultivo
recomendado: Agar Nutritivo. T cultivo: 30 C
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MORFOLOGAS
18
19
1.8.
DILUCIONES
MICROBIANAS.
SERIADAS.
RECUENTO
DE
POBLACIONES
Diluciones seriadas
La carga microbiana de las muestras a analizar es muy variable. Antes de analizarla
microbiolgicamente debe diluirse para que el recuento pueda ejecutarse con una
razonable precisin. Las diluciones se preparan mezclando una parte de la muestra con
nueve partes del diluyente que habitualmente es una solucin salina estril. El factor de
dilucin para esa muestra es l/l0 o 10-1 y se calcula de la forma siguiente:
Factor de dilucin: volumen de la muestra / volumen de la muestra + volumen
del diluyente
Se pueden preparar diluciones adicionales segn se necesite. En la figura de abajo se
muestra la forma de hacerlo. La siembra en placa se refiere a la operacin de transferir e
incorporar la muestra que va a analizarse, o sus diluciones, a una placa de Petri con un
apropiado medio de agar. La siembra en superficie se hace dejando solidificar el
medio de agar e incorporando la muestra despus por extensin en la superficie.
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4. Placas con colonias esparcidas. Cuente una cadena de colonias que no estn
muy separadas como si fuese una sola colonia. Si las colonias pueden
distinguirse, no considere entonces que estn esparcidas para fines de
recuento. Si las cadenas de colonias se forman a partir de puntos distintos,
cuente cada colonia como si fuese una sola. Si la zona esparcida es superior
al 25% de la placa, anote que el resultado como colonias esparcidas y no
como un recuento cardinal.
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Material necesario
6 Tubos con 9 ml de solucin salina estril (SS)
Micropipetas estriles de 1 ml
Varillas de vidrio acodadas (esptula de Drigalski)
Mechero
Etanol de 96C
3 placas de agar de Levine (EMB)
Muestra problema (agua de la depuradora)
El agar de Levine (EMB) est compuesto por peptona (10,0 gr/l agua destilada), lactosa
(10,0 gr/l), fosfato dipotsico (2 gr/l), eosina (0,40 gr/l), azul de metileno (0,065 gr/l) y
agar (15 gr/l). Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de
enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la
diferenciacin de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a
colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto
brillo metlico, las fermentadoras.
Mtodo de preparacin
1. Tomar 1 ml de la muestra problema con una micropipeta estril y aadirlo a uno de
los tubos con 9 ml de solucin salina estril. Es muy importante que los volmenes
sean exactos.
2. Agitar el tubo para homogeneizar totalmente la suspensin. De esta forma hemos
conseguido diluir la muestra inicial 10 veces (dilucin 10-1).
3. Repetir la misma operacin a partir de esta primera dilucin para conseguir la
dilucin (10-2) y as sucesivamente hasta 6 diluciones.
4. Sembrar las 3 ltimas diluciones en placas de agar de levine (EMB) con 0.1 ml (100
l) de cada una de las tres ltimas diluciones realizadas. Este inculo debe
extenderse de forma homognea por toda la superficie de la placa para lo cual
utilizaremos la varilla de vidrio acodada, previamente esterilizada (impregnndola
de alcohol y pasndola por la llama del mechero).
5. Incubar las placas a 37 C durante 24 h.
6. Contar las colonias de las placas diferenciando los microorganismos fermentadores
y no fermentadores de lactosa. Calcular con estos datos el nmero de UFC/ml
iniciales.
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PRCTICA 2
2.1 RECUENTO DE POBLACIONES MICROBIANAS.
2.2 PRUEBAS BIOQUMICAS.
2.3 REALIZACIN DE FROTIS Y TINCIN DE GRAM.
2.4 PRUEBA DE LA CITOCROMO C OXIDASA
2.5 ANLISIS MORFOLGICO.
2.6 MICROSCOPIO.
Material necesario
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
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2 H2O + BURBUJAS DE O2
2 H2O2 CATALASA
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Tcnica
1. Coger tubos con KIA y realizar en cada uno de ellos una siembra en
superficie y en profundidad con cada una de las bacterias que cada grupo
tenga asignadas.
2. Colocar cada uno de los tubos en las estufas a sus temperaturas
correspondientes.
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POSITIVA
Aparicin de burbujas de O2
KIA
Fermentacin de glucosa
Fermentacin de lactosa
Produccin de gas
Produccin de SH2
Fondo amarillo
Superficie amarilla
Burbujas o ruptura del agar
Precipitado de color negro
King B
Pseudomonas fluorescens
Pigmento fluorescente
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Mechero.
Placas Petri con los cultivos de las muestras problema
Tubo con yogur
Asa de siembra.
Pinzas.
Portaobjetos.
Tcnica utilizada
1. Colocar una pequea gota de agua en un portaobjetos limpio.
2. Con el asa de siembra previamente flameada transferir una pequea cantidad del
cultivo bacteriano en medio slido a la gota (destapar la placa Petri en las cercanas
de la llama, sin dejar la tapa en la mesa y tomar una pequea muestra con el asa de
siembra). Remover la mezcla hasta formar una suspensin homognea y extenderla
para facilitar su secado.
3. Esperar hasta que la fina pelcula de lquido se evapore.
4. Fijacin de las bacterias al vidrio portaobjetos:
a. Por calor (bacterias procedentes de medio slido). Pasar tres veces el
portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el
portaobjetos entre los pases.
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TINCIN DE GRAM
Esta tincin fue desarrollada por Christian Gram en 1884 y es uno de los primeros pasos
que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. La tcnica es capaz de
diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas. El
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las
bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras
que las bacterias Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa
lipopolisacardica externa
La tincin de Gram requiere 4 soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal
violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las
clulas. Ej.: lugol. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico. Ej.: etanol. Algunos organismos
(Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (Gram negativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias Gram negativas, el alcohol es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a
la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de
retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas Gram
positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y
menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared
celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son todava
azules/violetas, pero las Gram negativas son incoloras.
4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer
colorante, por ejemplo safranina. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul o
violeta por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos
sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial del cristal
violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina.
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Material necesario
Tcnica:
1.
32
33
Tcnica:
1. Examinar al microscopio las preparaciones con tincin Gram. Dibujar la
morfologa de los distintos tipos bacterianos en estudio.
2. El yogur procede de la fermentacin de dos bacterias: Lactobacillus bulgaricus
(bacilo) y Streptococcus thermophilus (coco). Identificarlas.
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2.6. MICROSCOPIO
El microscopio compuesto dispone de dos o ms lentes de aumento. Un microscopio se
divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico.
Soporte: consta de:
Base, que normalmente alberga la fuente de alimentacin (lmpara
incandescente o halgena).
Brazo, soporta todo el sistema ptico, el cabezal portaoculares (mono o
binocular) y el revolver portaobjetivos. En el brazo se dispone tambin del mecanismo
de anclaje de la platina.
Platina, es la pieza donde se coloca la preparacin para su observacin. Presenta
un orificio central por donde pasa la luz.
Macromtrico y micromtrico, permiten enfocar la preparacin. El primero se
emplea para un enfoque rpido, mientras que el micromtrico permite afinar el enfoque.
Sistema ptico: Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes; los
oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. Un microscopio
convencional posee tres sistemas separados de lentes:
Condensador, colocado entre la fuente de luz y la preparacin. Concentra los
rayos de luz en un punto o foco, que, para una observacin ptima, debe hacerse
coincidir con el plano de la muestra. Incorpora tambin un diafragma tipo iris que
permite ajustar la cantidad de luz que llega a la preparacin y acta de un modo muy
eficaz sobre el contrastado de la preparacin.
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PRCTICA 3
3.1 COLUMNA DE WINOGRADSKY.
3.2 IDENTIFICACIN DE CEPAS BACTERIANAS.
3.3 OBSERVACIN
DE
MICROORGANISMOS
MOHOS, ALGAS Y PROTOZOOS).
(LEVADURAS,
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Material necesario
Recipiente alto de boca ancha, de paredes trasparentes, rectas y sin bordes (botellas
plsticas de 2 L o probeta de vidrio).
300 a 500 g de barro de un arroyo, lago, pantano o ro (sedimento superficial o
subsuperficial), junto con agua de la misma zona (1-2 L).
Fuente de S (yema de huevo), fuente de celulosa (papel de filtro, hierba).
Fuente de CaCO3 (cscara pulverizada de un huevo).
1 esptula.
Parafilm
Metodologa
1. Quitar las piedras, ramas o partculas grandes del barro.
2. Adicionar al barro la cscara de huevo machacada muy fina, el papel muy
cortado y la yema de huevo. Mezclar hasta homogenizar completamente. Poner
una parte de la celulosa en el fondo de la botella.
3. Colocar la mezcla en la botella hasta ocupar 1/3 del volumen total (ms o menos
unos 10 cm de capa). Compactar el barro a fin de eliminar las burbujas de aire.
4. Aadir el agua a la botella hasta llegar a una altura de aproximadamente de 3 a 5
cm debajo del borde. Tener cuidado de no resuspender la muestra compactada,
para ello inclinar la botella y resbalar el agua lentamente por las paredes.
5. Agitar la solucin con una varilla para eliminar burbujas de aire.
6. Registrar el aspecto final de la columna (color del sedimento y del lquido).
7. Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la botella con parafilm.
8. Incubar a temperatura ambiente (25 a 30C) cerca de una ventana para que
reciba iluminacin.
9. Examinar la columna peridicamente durante varias semanas anotando los
cambios de color y grosor de las diferentes capas.
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Cepa
Morfolo
ga
Gram
Catalasa
Ferment
glucosa
Ferment
lactosa
No
ferment.
azucares
Gas
SH2
Citocromo
C oxidasa
Movili
dad
Indol
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Fluores
cencia
Material necesario
1. Muestras de agua de arroyo, lago, pantano, ro (zona calmada), mar(1-2 L)
2. Placas de Petri con Rhizopus sp., Penicillium sp., Aspergillus sp. y
Saccharomices cerevisae.
3. Muestras de la cerveza elaborada
4. Preparaciones microscpicas de Toxoplasma gondii, Amoeba proteus,
Radiolarios,Foraminiferos, Trypanosoma gambiense, Dinobryon, Phytophthora
infestans y Nostoc.
5. Mallas de filtracin
6. Pinzas
7. Aguja enmangada
8. Cristal violeta
9. Lactofenol
10. Papel de filtro.
11. Frascos lavadores.
12. Cristalizadores y puentes de tincin.
13. Mechero alcohol.
14. Pipetas.
15. Portaobjetos y cubreobjetos.
16. Microscopio.
17. Aceite de inmersin.
18. Guas de identificacin de microorganismos acuticos.
Levaduras
1. Transfiera una porcin de la colonia de Saccharomices cerevisae a una gota de agua
sobre un porta.
2. Emulsione y extienda la mezcla. Fije al calor la extensin resultante.
3. Haga una tincin con cristal violeta durante 1 minuto. Lava la muestras con agua
destilada. Pon un cubre sobre la preparacin.
4. Examina las clulas a 1000x (aceite de inmersin). Dibuja la morfologa celular de
las levaduras.
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Mohos
1. Coloque una gota del colorante azul de lactofenol en un porta.
2. Extiende sobre el colorante un trozo de micelio (con ayuda de las pinzas y de la
aguja enmangada). Coloca el cubreobjetos despus procurando que no quede
ninguna burbuja de aire.
3. Observa la muestra al microscopio con diferentes aumentos y recorrindola en toda
su extensin. Dibuja lo que observas.
4. Repite estos pasos con Rhizopus sp., Penicillium sp. y Aspergillus sp.
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Metodologa
Observar las preparaciones al microscopio, dibujando la morfologa e indicando las
estructuras que se observen (p.e. ncleo).
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