TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

INTRODUCCION:
La habilidad para detectar y aislar genes normales y mutados, su secuencia y la
expresin de sus productos proteicos ha tenido un importante impacto en la
biologa y la medicina. La tecnologa del DNA recombinante ha hecho posible
investigar ms a fondo la estructura y funcin de los genes, especialmente de los
genes eucariticos que eran inaccesibles por otros mtodos. Estas investigaciones
generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de los cuales tienen
profundas implicancias ticas.
La Tecnologa del DNA recombinante se origin en los comienzos de 1970 con el
descubrimiento de las endonucleasas de restriccin, enzimas capaces de realizar
el clivaje especfico del DNA en fragmentos determinados.
2. REVISIN DE LA ESTRUCTURA ADN / GEN:
El cido desoxirribonucleico (DNA) est formado por dos cadenas polinucletidicas
antiparalelas (5' fosfato > 3' hidroxilo, 3' hidroxilo > 5' fosfato) unidas por
puentes de hidrgeno entre los pares de bases (pb) complementarias dAMP dTMP y dCMP - dGMP. Los genes son hileras lineales de pares de bases de DNA
y son usualmente transcriptos en molculas de cido ribonucleico (RNA) de
cadena nica. El cromosoma es una hilera lineal (circular en bacteria) de genes y
el genoma es el complemento haploide de DNA en la clula.
Una clula bacteriana (por ejemplo Escherichia coli) contiene un cromosoma
(haploide) con 3 x 106 pb y cerca de 2.000 genes. Una clula humana contiene 46
cromosomas (diploide, 23 pares haploides) con cerca de 3 x 109 pb (tamao del
genoma haploide) y cerca de 50.000 genes. Debido al azar estadstico en la
secuencia de DNA, cada 44 (256) pb o 46 (4096) pb se incluirn en el promedio,
por ejemplo, las secuencias nicas que se encuentran a continuacin (o alguna
otra secuencia de 4 o 6 pb).
GATCGAATTC

CTAGCTTAAG

Por convencin, la cadena superior en una secuencia de DNA de doble cadena se lee 5'
fosfato a 3' hidroxilo y la cadena inferior se lee 3' hidroxilo a 5' fosfato. Las dos secuencias
de doble cadena ilustradas se denominan Palndromes ya que se leen exactamente igual en
ambas cadenas en la direccin 5' a 3'.

Figura 1: Secuencia de doble cadena denominada Palndrome.

3. CONSTRUCCIN Y CLONACIN DE MOLCULAS DE DNA

RECOMBINANTE:
3.1. ENZIMAS DE RESTRICCIN:
Las enzimas de restriccin son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma
especfica puentes fosfodister 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble
cadena de DNA.
Las enzimas de restriccin reciben su nombre de la bacteria de la que fueron
aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus
amyloliquefaciens. Las tres primeras letras en el nombre de la enzima,
corresponden la primera al gnero (E) y las otras dos a la especie (co). stas
pueden ir seguidas por la designacin de una cepa (R) y un nmero romano (I)
para indicar el orden del descubrimiento.
El tipo ms comn de enzimas de restriccin (tipo II) usado en la tecnologa del
DNA recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energa para el
clivaje del puente. Requiere en cambio iones Mg++ para la unin especfica al
DNA y posterior clivaje.
Otras enzimas de restriccin clivan palndromos de DNA de 4 o 6 pb.
Algunas otras enzimas de restriccin clivan una secuencia nica. Estas enzimas
que reconocen la misma secuencia se llaman ISOCHIZOMERS.
Las enzimas de restriccin de tipo OO son parte de un sistema de restriccin /
modificacin en la bacteria. La misma tiene un sistema de proteccin contra sus
propias enzimas de restriccin a travs de una enzima acompaante que metila
nucletidos de su ADN y los convierte en un sustrato inadecuado para ser digerido
en las secuencias de reconocimiento. Por esto es que las ADN metilasas de sitio
especfico y las enzimas de restriccin siempre estn por pares en una bacteria.