Mestrado Int.

em Medicina

Bioqumica 2014/15

7 e 8 Aula Prtica Estudo do Metabolismo Eritrocitrio

NOTA

Na preparao da 7 aula prtica necessrio

que todos os alunos leiam os protocolos
correspondentes a essa aula e tambm 8
aula prtica.

Mestrado Int. em Medicina

Bioqumica 2014/15

7 e 8 Aula Prtica Estudo do Metabolismo Eritrocitrio

Introduo

Os eritrcitos so clulas anucleadas existentes na circulao sangunea cuja

principal funo no organismo o transporte de O2 e CO2 por ao da
hemoglobina. Esta funo requer energia sobre a forma de ATP, o qual no
eritrcito,

igualmente

necessrio

para

manuteno

da

forma,

deformabilidade, fosforilao de fosfolpidos e protenas de membrana e

transporte ativo de vrias molculas, entre outras funes. O substrato
primrio para o requerimento energtico dos eritrcitos a glicose. Ao entrar
na clula, esta fosforilada pela hexocinase a glicose-6-fosfato, a qual pode
ser metabolizada pela gliclise ou
pela

via

das

pentoses.

Pela

primeira via, cada molcula de

glicose convertida em duas
molculas de piruvato e neste
processo

so

molculas

de

geradas
ATP.

Por

duas
no

possurem mitocndrias, esta via

a nica fonte de produo de
ATP nos eritrcitos. O piruvato,
como produto final da gliclise,
pode ser depois metabolizado em
lactato pela fermentao lctica.
Figura 1 Esquema da gliclise e a sua relao com outras vias metablicas no eritrcito.

Palavras-chave:
Eritrcito; metabolismo; gliclise; fermentao lctica; glicose; lactato.

7 Aula Prtica - Estudo do Metabolismo Eritrocitrio I

Objetivo
1. Compreenso do modelo experimental utilizado.
2. Incubao e desproteinizao das amostras de sangue.
Material
Microcentrfuga
Tubos Eppendorf
Pipetas automticas e pontas
Vortex
Banho termostatizado (37C)

Solues
Soluo padro de glicose 100 mg/dL
Soluo de hidrxido de brio 0,3 N
Soluo de sulfato de zinco 0,3 N
cido perclrico (HClO4) 7,0%
Amostra biolgica
Sangue humano colhido da regio do sangradouro com anticoagulante
(dador em jejum).

Modelo Experimental
O modelo experimental que utilizar no estudo do metabolismo eritrocitrio
est representado na Figura 2. Uma amostra de sangue total separada em
trs alquotas. Duas destas so incubadas durante 60 min a temperaturas
diferentes (4C para a amostra t60 e 37C para a amostra t60). A terceira
amostra (t0) desproteinizada de imediato de acordo com o procedimento
experimental fornecido. Terminado o tempo de incubao, as amostras t60 e
t60 sero posteriormente desproteinizadas tal como efetuado para a amostra
t0.

Sangue Total

t0

Incube a 4C

Incube a 37C

durante 60 min.

durante 60 min.

t60

t60

Figura 2 Representao esquemtica do modelo experimental.

Procedimento experimental

Incubao das amostras de sangue

1. Coloque um tubo eppendorf de 1,5 mL com sangue (0,8 mL) a incubar
num banho de gua a 37C (amostra t60) e outro, no frigorfico a 4C
(amostra t60) durante 60 minutos.
2. Quando necessrio proceda desproteinizao de cada amostra de
sangue (t0, t60 e t60).

Obteno de desproteinizados para determinao da concentrao de

glicose
1. Rotule 3 tubos eppendorf de 2,0 mL com G0, branco e padro e
adicione os seguintes reagentes, pela ordem indicada:

G0

Branco

Padro

gua Destilada

900 L

1000 L

900 L

Sangue (t0)

100 L

___

___

Soluo Padro de Glicose

___

___

100 L

2. Agite os tubos no Vortex.

3. A cada tubo adicione pela ordem indicada:
500 L de soluo de hidrxido de brio 0,3 N
500 L de soluo de sulfato de zinco 0,3 N
4. Agite os tubos no Vortex e centrifugue a 11000 rpm durante 5 minutos
temperatura ambiente, de modo a obter um sobrenadante lmpido.
5. Remova cuidadosamente 400 L de cada sobrenadante para tubos
eppendorf de 1,5 mL devidamente identificados para armazenamento
(incluir turma e grupo das aulas prticas).
6. Guarde as amostras a 20C.
7. Terminada a incubao das amostras de sangue, t60 e t60, proceda sua
desproteinizao, tal como efetuado para a amostra t0 (repetindo os
passos 1 a 6, rotulando os tubos de amostra respetivamente com G60 e
G60 e sem efetuar o branco e padro de novo).

Obteno de desproteinizados para determinao da concentrao de

lactato
1. Pipete 500 L de sangue (t0) para um tubo eppendorf de 1,5 mL e rotule-o
com L0.
2. Adicione 500 L de cido perclrico 7% a este tubo.
3. Agite bem o tubo no Vortex e centrifugue a 11000 rpm durante 5 minutos
temperatura ambiente, de modo a obter um sobrenadante lmpido.
4. Retire 400 l de sobrenadante para um tubo eppendorf de 1,5 mL
devidamente identificado para armazenamento (incluir designao da
amostra, grupo e turma das Aulas Prticas).
5. Se no obtiver um sobrenadante lmpido, repita a centrifugao a 11000
rpm durante 2 minutos, temperatura ambiente.
6. Guarde as amostras a 20C.
7. Terminada a incubao das amostras, t60 e t60, proceda sua
desproteinizao, tal como efetuado para a amostra t0 (repetindo os
passos 1 a 6, rotulando os tubos de amostra respetivamente com L60 e
L60).

8 Aula Prtica Estudo do Metabolismo Eritrocitrio II

Objetivo
1. Aplicao do mtodo espetrofotomtrico para a quantificao de glicose e
lactato nos desproteinizados preparados na 7 Aula Prtica.

Determinao da Concentrao de Glicose no Sangue

Fundamento do mtodo
A determinao da concentrao de glicose no sangue baseia-se no mtodo
enzimtico de duas reaes acopladas (ver Figura 3). Primeiro, a glicose
existente na amostra oxidada pela ao da glicose oxidase (GOD),
formando-se cido glicnico e perxido de hidrognio. Este ltimo produto
reage posteriormente com a 4-aminoantipirina e com o cido hidroxibenzico
na presena de peroxidase (POD), dando origem quinoneimina, um produto
de cor vermelha.

Figura 3 Representao esquemtica do mtodo de determinao da

concentrao de glicose.

A absorvncia da quinoneimina, medida a 500 nm, proporcional

concentrao de glicose na amostra analisada.

Material
Espetrofotmetro
Tubos Eppendorf
Banho termostatizado (37C)
Cuvettes
Pipetas automticas e pontas
Vortex

Solues
Mistura de reao (mistura de tampo fosfato 100 mM, pH 7,5; cido 4hidroxibenzico 10 mM, 4-aminoantipirina 0,3 mM, glicose oxidase (GOD) 20
kU/L, peroxidase (POD) 3 kU/L).

Procedimento experimental
1. Prepare as seguintes solues em tubos eppendorf previamente rotulados
com branco, padro, G0, G60 e G60 adicionando os reagentes pela
ordem indicada:
Amostras
G0, G60, G60
___

Branco

Padro

Desproteinizado branco

100 L

___

Desproteinizado padro

___

100 L

___

___

100 L

1 mL

1 mL

1 mL

Desproteinizados
G0, G60, G60
Mistura de Reao

2. Agite os tubos por inverso.

3. Incube as solues durante 10 minutos num banho termostatizado a 37C,
evitando exposio direta luz.
4. Leia no espetrofotmetro as absorvncias do padro e amostras contra o
Branco ao comprimento de onda de 500 nm.
5. Calcule o valor de concentrao de glicose nas amostras de acordo com a
frmula: Glicosemg / dL

Absamostra
100
Abspadro

Determinao da Concentrao de Lactato no Sangue

Fundamento do mtodo
A determinao da concentrao de lactato baseia-se na reao enzimtica
catalisada pela lactato desidrogenase (LDH), descrita pela equao:
lactato desidrogenase
L-Lactato + NAD+
Piruvato + NADH + H+

A concentrao de lactato presente na amostra proporcional quantidade

de NAD+ que reduzido a NADH.

Material
Espetrofotmetro
Tubos Eppendorf
Pipetas automticas e pontas
Vortex
Cuvettes
Banho termostatizado (37C)

Solues
Tampo hidrazina 0,4 M - glicina 0,4M ; pH 9
NAD+ 30 mM
cido perclrico (HClO4) 7,0%
Lactato desidrogenase (LDH) 1000 UI/mL
Soluo padro de L-Lactato 1 mM

Procedimento experimental
1. Rotule os tubos eppendorf com branco, controlo do mtodo e
amostras L0, L60 e L60.
2. Prepare as solues de acordo com o quadro seguinte e seguindo a ordem
de adio.

Tampo hidrazina 0,4 M- glicina

0,4 M; pH 9,0
Desproteinizados (L0, L60, L60)
gua destilada
cido perclrico 7 %
Soluo padro de L-lactato
1 mM
+
NAD 30 mM

Branco

Controlo do
mtodo

Amostras
L0, L60, L60

1000 L

1000 L

1000 L

25 L
25 L

25 L

50 L
-

25 L

100 L

100 L

100 L

3. Agite os tubos no Vortex.

4. Leia a absorvncia do Controlo do mtodo e das amostras contra o
Branco ao comprimento de onda de 340 nm (Abs1), recuperando as
solues para os respetivos tubos eppendorf.
5. Adicione 10,8 L de LDH 1000 UI/mL a cada tubo. Homogeneize por
inverso.
6. Incube os tubos a 37C durante 30 minutos.
7. Leia a absorvncia do Controlo do mtodo e das amostras contra o
Branco ao comprimento de onda de 340 nm (Abs2).
8. Calcule a concentrao de lactato nos tubos de amostra e Controlo do
mtodo, aplicando as seguintes equaes (nas quais esto introduzidos
os fatores de converso respetivos):
Abs = Abs2 - Abs1
Controlo do mtodo

[Lactato] = 7,50 Abs

(mM)

Amostras

[Lactato] = 6,94 Abs

(mM)

Tratamento dos resultados

O tratamento dos resultados experimentais dever incluir os seguintes
passos:
1. Clculo dos valores de concentrao de glicose e lactato nas amostras de
sangue incubadas de acordo com o modelo experimental estudado.
2. Clculo das concentraes de glicose consumida e lactato produzido s
duas temperaturas de incubao utilizadas.
3. Determinao da razo molar entre o lactato produzido e a glicose
consumida apenas para a temperatura de 37C.