GUILHERMEFERREIRACAETANO

Biomembranadequitosanaalginatona
cicatrizaodelcerascutneasemratos

Dissertao apresentada ao Programa de

PsGraduao
Interunidades
em
Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT,
para obteno do Ttulo de Mestre em
Biotecnologia.

SoPaulo
2012

GUILHERMEFERREIRACAETANO

Biomembranadequitosanaalginatona
cicatrizaodelcerascutneasemratos

Dissertao apresentada ao Programa de

PsGraduao
Interunidades
em
Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT,
para obteno do Ttulo de Mestre em
Biotecnologia.

readeconcentrao:Biotecnologia

Orientador: Prof. Dr. Joo Tadeu Ribeiro

Paes
Coorientador: Prof. Dr. Marco Andrey
CiprianiFrade

Versooriginal

SoPaulo
2012

DADOS DE CATALOGAO NA PUBLICAO (CIP)

Servio de Biblioteca e Informao Biomdica do
Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo
reproduo total

Caetano, Guilherme Ferreira.

Biomembrana de quitosana-alginato na cicatrizao de lceras
cutneas em ratos / Guilherme Ferreira Caetano. -- So Paulo,
2012.
Orientador: Prof. Dr. Joo Tadeu Ribeiro Paes.
Dissertao (Mestrado) Universidade de So Paulo. Instituto de
Cincias Biomdicas. Programa de Ps-Graduao Interunidades em
Biotecnologia USP/IPT/Instituto Butantan. rea de concentrao:
Biotecnologia. Linha de pesquisa: Cicatrizao.
Verso do ttulo para o ingls: Chitosan-alginate biomembrane on
wound healing in rats.
1. Cicatrizao 2. Quitosana 3. Alginatos 4. Curativos biolgicos
I. Paes, Prof. Dr. Joo Tadeu Ribeiro II. Universidade de So Paulo.
Instituto de Cincias Biomdicas. Programa de Ps-Graduao
Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/Instituto Butantan III. Ttulo.

ICB/SBIB0119/2012

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
Programa de Ps-Graduao Interunidades em Biotecnologia
Universidade de So Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnolgicas
______________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a):

Guilherme Ferreira Caetano.

Ttulo da Dissertao:

Biomembrana de quitosana-alginato na cicatrizao de

lceras cutneas em ratos.

Orientador(a):

Prof. Dr. Joo Tadeu Ribeiro Paes.

A Comisso Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertao de Mestrado,

em sesso pblica realizada a ................./................./.................,
( ) Aprovado(a)

( ) Reprovado(a)

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: ................................................................................................

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: .................................................................................................

Presidente:

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: ................................................................................................

Dedico este trabalho aos meus

queridos pais Regiane e Reginaldo,
meusexemplosdevida.

Obrigado!

AGRADECIMENTOS

Primeiramente Deus, o grande Pai de todos, por ter me iluminado nesta minha
trajetriacheiadepedrasebarreiras,masquecomsuaabenoadasabedoriaguioumenos
momentosmaisdifceis.

AomeuorientadorProf.Dr.JooTadeuRibeiroPaespeloenormeincentivodadoao
meu trabalho. Todos sabamos que seria dificlimo no incio, porm com todo empenho e
dedicaoconseguimoschegaraofim.

Ao meu coorientadorMarco AndreyCiprianiFrade. Meus sinceros agradecimentos

porterabertoasportasdolaboratrioemeaceitadocomopartedogrupodeDermatologia
para o desenvolvimento do meu trabalho. Obrigado pela dedicao, pacincia apoio e
principalmentecredibilidade.

AosfuncionriosdoProgramadePsGraduaoemBiotecnologiaportodosuporte
eajudafornecidaaolongodomeutrabalho.

AosamigosdoLab.GenteCeldaUnespAssis,emespecialaoRodrigoKozmaeValter
Abrao. Obrigado pela confiana de ambos em meu trabalho e pelo suporte fornecido.
Estivemos no mesmo barco todo esse tempo e sabemos das dificuldades encontradas e o
quoimportantequandosabemosemquemprocurarajuda.

AtodososamigosdogrupodeDermatologiadaFMRPUSP,departamentodeClnica
Mdica. Gostaria de agradecer em especial ao Dr. Thiago Antnio Moretti de Andrade, ao
Dr.MrcioFronzaeMarcelNaniLeitepelosensinamentosecredibilidadeaolongodomeu
trabalho.Obrigadopeloesforoindividualdevocsemcadabatalhatravada.
camelandoqueseaprende;bolaprafrente.

tcnicaMariaAparecidaNunes,doLaboratriodeCulturaCelulardaDermatologia
daFMRPUSP.ObrigadoCicipelagrandeajudacomosexperimentosepelosensinamentos
transmitidos.

tcnica Paula Payo do Laboratrio de Nutrio da FMRPUSP. Obrigado pela

pacinciaeajudanasleiturasdasplaquinhasdeELISA.

AostcnicosKlberLoureiroeEdnaMoraesdaFORPUSP.Obrigadopelapacinciae
pelasperfeitssimaslminashistolgicasquevocsfizeram.

Aos funcionrios do Biotrio do Departamento de Clnica Mdica da FMRPUSP:

Adalberto,MaurcioeRoni,pelaajudanosexperimentosenocuidadocomosanimais.

CAPESpeloapoiofinanceiro.

minhaqueridaeamadafamlia:mameRegiane,papaiReginaldo,meulindoirmo
Marcelo (Tch), minha linda irm Ana Laura e aos meus tambm pais Mariano e Denise.
Muito Obrigado por toda dedicao emminhaeducao, em meu crescimentoe por todo
aprendizadodevida.Nadamaissouqueumespelhodetodosvocs.

minhanamoradaAnaBeatrizSantAnadoNascimentoporsempreestaraomeu
lado nos momentos fceis e difceis. Agradeo cada carinho, apoio e confiana que
contriburamefetivamenteemtodaminhatrajetria.

todos os meus amigos e familiares que de alguma forma contriburam para a

realizaodessetrabalhoequeporventuranotenhamsidomencionado,muitoobrigado!

RESUMO
CAETANO, G. F. Biomembrana de quitosanaalginato na cicatrizao de lceras cutneas
em ratos. 2012. 88 f. Dissertao (Mestrado em Biotecnologia) Instituto de Cincias
Biomdicas,UniversidadedeSoPaulo,SoPaulo,2012.
lcerascutneasnecessitamdeumlongotempodetratamento,resultandoemaltocusto
comcuidadosmdicos.Assim,abuscaporsubstnciasteraputicascicatrizantes,atxicas,
defcilacessoapopulaoebaixocustoganhouimportncianosltimosanos.Aquitosana
e o alginato so bem conhecidos por suas propriedades cicatrizantes. A quitosana,
polissacardeo catinico natural, renovvel, biodegradvel, biocompatvel, atxico, ativa
macrfagos funcionais e aumenta a fibroplasia na rea afetada. O alginato, polissacardeo
aninico, biocompatvel, hidroflico e biodegradvel, mantm a umidade no leito da leso,
promoveahemostasiaeformaodotecidodegranulao.Oobjetivodopresentetrabalho
foi avaliar a eficcia da biomembrana de quitosanaalginato na cicatrizao de lceras
cutneasemratos.Foramutilizados65ratosWistarmachos(200220g),anestesiadoscom
hidrato de cloral 4% (1.0 mL/100g do animal). Aps tricotomia da regio dorsal, duas
excisescirrgicasforamfeitascompunchhistolgico(1,5cmdedimetro)atingindotodas
as camadas da pele. Os animais foram divididos em grupos experimentais: BQA (n=25,
ambas as lceras de cada animal receberam a biomembrana de quitosanaalginato pr
hidratadacomsorofisiolgico0,9%)eSF(n=25,ambasaslcerasforamtratadassomente
comsorofisiolgico).Emseguida,todososanimaisreceberamcurativooclusivodegazee
esparadrapo. Todas as lceras foram hidratadas at o 7 dia e as biomembranas foram
removidassomentenodiadaeutansia.OgrupoGZ(n=15,ambasaslcerasforamtratadas
somentecomgaze,semhidrataoesemtrocasdirias)foiutilizadosomenteparaavaliara
reepitelizao. Aps 2, 7, 10, 14 e 21 dias do procedimento cirrgico cinco animais/grupo
foram eutanasiados e avaliouse a reepitelizao por meio do ndice de cicatrizao das
lceras.Umabipsiadelcera/cicatrizdecadaanimalfoicoletada,fixadaemformaldedo
3,7% tamponado, corada com hematoxilina e eosina e tricrmio de Gomori para
quantificao de infiltrado inflamatrio, fibroblastos, vasos sanguneos e colagnese por
meio do software ImageJ. A bipsia da outra lcera foi utilizada para a dosagem de
mieloperoxidase(MPO),paraavaliaroinfiltradoneutrofliconotecidolesado,edosagemde
hidroxiprolina (OHP) para avaliar a colagnese. BQA aumentou o recrutamento de clulas
inflamatriasparaalesoemrelaoSFjno2dia(p=0,0134).No7dia,houvereduo
das clulas inflamatrias no grupo BQA em relao ao 2 dia (p=0,0038), enquanto em SF
mantevese constante. Ambos os grupos apresentaram infiltrado neutroflico similar no 2
dia. No 7 dia, observouse importante reduo de MPO no BQA em relao ao 2 dia
(p=0,0326), e o SF apresentouse superior a BQA (p=0,0043). Assim, BQA parece ter
estimuladoafaseinflamatria,aumentandoorecrutamentocelularno2diaeregulandoo
estmulono7.BQAapresentoumaiorfibroplasiano7(p=0,0275)eno14dia(p=0,0086),
diferente do grupo SF, alm de maior colagnese no 21 dia (p=0,0219), pelo mtodo
histolgico. Em relao OHP, BQA apresentou maior colagnese em relao SF no 2
(p=0,0042) e 21 dias (p=0,0249), porm no 14 dia foi menor (P=0,0010). As lceras do
grupo BQA no 7 dia apresentaramse mais reepitelizado que as do SF (p=0,0006). Sendo
assim, a biomembrana de quitosanaalginato atuou ativamente na fase inflamatria e
estimulouacolagnese,acelerandoacicatrizaodaslcerasemratos.
Palavraschave:Cicatrizao.Quitosana.Curativosbiolgicos.

ABSTRACT
CAETANO, G. F. Chitosanalginate biomembrane on wound healing in rats. 2012. 88 p.
(Masters thesis in Biotechnology) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So
Paulo,SoPaulo,2012.
Skin wounds require a long treatment time, resulting in highcost medicalcare. Therefore,
the search for new natural therapeutic healing substances, nontoxic, easy access to
population and low cost has gained importance in recent years. Chitosan and alginate are
wellknown for healing properties. Chitosan, a natural cationic polymer, is biologically
renewable, biodegradable, biocompatible, nontoxic, and it can enhancing functions of
inflammatory cells, macrophages, and fibroblasts. Alginate, an anionic polymer, also
biocompatible, hydrophilic and biodegradable, is able to maintain a physiologically moist
microenvironment that promotes hemostasis and the formation of granulation tissue. The
purpose of this study was to evaluate the effectiveness of chitosanalginate biomembrane
onwoundhealinginrats.Atotalof65maleWistarrats(200220g)wereanaesthetizedby
4% chloral hydrate (1.0 mL/100g weight). After shaved the dorsal hair, two excisional
woundswereperformedbypunch(1.5cmdiameter)withdepthofalltheskinlayers.Rats
were divided in groups: BQA group (n=25, both wounds of each rat received chitosan
alginate biomembrane moistened with saline) and SF group (n=25, both wounds were
treatedonlywithsaline).Afterthis,thewoundsreceivedocclusivedressingwithgauzeand
tape.Allwoundsweremoisteneddailyuptothe7thdayandbiomembranewereremoved
onlyonthesacrificedday.GZgroup(n=15,bothwoundsweretreatedonlywithgauze,no
moistenedandnodailychanges)wasaddedtoevaluatethereepithelialization.On2,7,10,
14and21dayspostinjury,fiveratsofeachgroupwereeuthanizedandevaluatedthere
epithelializationbywoundhealingrate.Onebiopsyofwound/scarwasharvested,fixedon
3,7% formalin, and stained with hematoxylineosin and Gomoris trichrome for
quantification the inflammatory cells, fibroblasts, blood vessels and collagenesis by ImageJ
software. Other one was used for myeloperoxidase assay (MPO), to evaluate the
neutrophilic infiltrate on injured tissue, and by determining the levels of hydroxyproline
(OHP)toevaluatethecollagenesis.BQAincreasedtherecruitmentofinflammatorycellsto
wound, different from SF (p=0,0134) on 2nd day. On 7th day, BQA decreased inflammatory
infiltraterelationto2ndday(p=0,0038),whereasSFmaintainedthesameandsimilaramount
of inflammatory infiltrate than BQA, both decreasing during the followup (p>0,05).
RegardingtoMPO,bothgroupsshowedsimilarneutrophilicinfiltrateon2ndday.On7thday,
BQA showed an important MPO reduction relation to 2nd day (p=0,0326), whereas SF
showedhigherMPOthanBQA(p=0,0043).AllgroupsshowedlowlevelofMPOduringthe
followup (p>0,05). Thus, BQA stimulated the inflammatory phase of wound healing,
increasing inflammatory cells on 2nd day and modulating this stimulus on 7th day. BQA
increased the recruitment of fibroblasts to wound on 7th (p=0,0275) and 14th (p=0,0086)
days different from SF, in addition to collagenesis on 21st (p=0,0219). By OHP assay, BQA
showedhighercollagenesisthanSFon2nd(p=0,0042)and21stdays(p=0,0249),howeveron
14thdaySFshowedmorecollagenesisthanBQA(p=0,0010).BQAshowedmorepronounced
reepithelializationon7thdaythanSF(p=0,0006).Chitosanalginatebiomembraneregulated
theinflammatoryphaseandstimulatedthecollagenesis,acceleratingthewoundhealingon
rats.

Keywords:Woundhealing.Chitosan.Biologicaldressings.

LISTADEILUSTRAES

Figura1Produodasbiomembranasdequitosanaalginato..............................................44

Figura2Confecodeduaslcerascutneasnodorsodecadaanimal..............................45

Figura 3 Curativo oclusivo feito em cada animal aps receberem os respectivos

tratamentos.............................................................................................................................46

Figura4Suporteutilizadoparaaquisiodasimagens........................................................46

Figura5Bipsiadalcera/cicatrizdecadaanimalparaanlise...........................................47

Figura 6 Fotomicrografia da rea ulcerada de ambos os grupos ao longo do

seguimento..............................................................................................................................55

Figura 7 Quantificao do infiltrado inflamatrio (por histomorfometria) das lceras de

ambososgruposaolongodoseguimento..............................................................................55

Figura 8 Quantificao da mieloperoxidase nas lceras cutneas de ambos os grupos ao

longodoseguimento...............................................................................................................56

Figura 9 Angiognese nas lceras cutneas de ambos os grupos ao longo do

seguimento..............................................................................................................................57

Figura 10 Fibroplasia nas lceras cutneas de ambos os grupos ao longo do

seguimento..............................................................................................................................58
Figura 11 Fotomicrografia da rea ulcerada de ambos os grupos ao longo do
seguimento..............................................................................................................................60
Figura 12 Colagnese nas lceras cutneas de ambos os grupos ao longo do
seguimento..............................................................................................................................60

Figura 13 Colagnese nas lceras cutneas de ambos os grupos ao longo do

seguimento..............................................................................................................................61

Figura 14 Reepitelizao das lceras cutneas de ambos os grupos ao longo do

seguimento..............................................................................................................................63

Figura15Reepitelizaodaslcerascutneasdostrsgruposexperimentaisaolongodo
seguimento..............................................................................................................................64

LISTADESIGLAS
BQA

C3a

C5a

CD8

CD11b

CETEA

COBEA

EGF

EUA

FGF

FGF2

FMRP

GAGs

GPIb/IX/V

GZ

HE

ICU

IGF1

IL1

IL6

IL8

KGF

MCP1

Biomembranadequitosanaalginato
complementcomponent3a
complementcomponent5a
linfcitoT
macrfagos
ComissodeticaemExperimentaoAnimal
ColgioBrasileirodeExperimentaoAnimal
endothelialgrowthfactor
EstadosUnidosdaAmrica
fibroblastgrowthfator
fibroblastgrowthfactor2
FaculdadedeMedicinadeRibeiroPreto
glicosaminoglicanas
glycoproteinIb/IX/V
gaze
hematoxilinaeeosina
ndicedecicatrizaodaslceras
insulinlikegrowthfactor1
interleucina1
interleucine6
interleucina8
keratinocytegrowthfactor
monocytechemotacticprotein1


MEC

MIP1

MIP1

MMPs

MPO

NO

OMS

OHP

PEC

PDGF

PSGL1

ROS

SF

TGF

TGF

TIMPs

TNF

TG

UNICAMP

USP

UV

VEGF

matrizextracelular
macrophageinflammatoryprotein1
macrophageinflammatoryprotein1
matrizmetaloproteinases
mieloperoxidase
xidontrico
OrganizaoMundialdaSade
hidroxiprolina
polyelectrolytecomplex
plateletderivedgrowthfactor
Pselectinglycoproteinligand1
reactiveoxygenspecies
sorofisiolgico
transforminggrowthfactor
transforminggrowthfactor
TissueInhibitorsofMetalloproteinases
tumornecrosisfator
tricrmiodeGomori
UniversidadeEstadualdeCampinas
UniversidadedeSoPaulo
ultravioleta
VascularEndothelialGrowthFactor

SUMRIO

INTRODUO........................................................................................................

16

1.1

Morfofisiologiadapele........................................................................................

16

1.1.1

Epiderme...............................................................................................................

16

1.1.2

Derme...................................................................................................................

17

1.1.3

Hipoderme............................................................................................................

18

1.2

lcerascutneas..................................................................................................

18

1.2.1

lcerascutneasagudasecrnicas.....................................................................

19

1.3

Cicatrizao..........................................................................................................

21

1.3.1

Coagulao...........................................................................................................

22

1.3.2

Inflamao............................................................................................................

24

1.3.3

Formaotecidual................................................................................................

26

1.3.3.1

Fibroblastosesntesedecolgeno.......................................................................

27

1.3.3.2

Angiognese.........................................................................................................

28

1.3.3.3

Reepitelizao......................................................................................................

29

1.3.4

Remodelagemtecidual.........................................................................................

30

1.4

Tratamentodelceras........................................................................................

32

1.5

Biomembranadequitosanaalginato.................................................................

34

OBJETIVOS..........................................................................................................

40

2.1

Geral...................................................................................................................

40

2.2

Especficos..........................................................................................................

40

MATERIALEMTODOS......................................................................................

42

3.1

Animais...............................................................................................................

42

3.2

Confecodabiomembranadequitosanaalginato.........................................

42

3.3

Padronizaodosgrupos...................................................................................

44

3.4

Procedimentocirrgico:lcerascutneasdorsais...........................................

45

3.5

Coletadomaterialparaestudo........................................................................

46

3.6

AvaliaodondicedecicatrizaodaslceraspeloImageJ..........................

47

3.7

Estudohistolgico(histomorfometria)............................................................

48

3.7.1

Avaliao quantitativa por imagem quanto ao infiltrado inflamatrio,

angiogneseefibroplasia...................................................................................

48

3.7.2

Avaliaoquantitativaporimagemquantocolagnese................................

49

3.8

Dosagemdaenzimamieloperoxidase(MPO)....................................................

50

3.9

Dosagemdehidroxiprolina(OHP).....................................................................

51

3.10

Anlisedosresultados........................................................................................

52

RESULTADOS

54

4.1

Processoinflamatrio.......................................................................................

54

4.1.1

Avaliaodoinfiltradoinflamatriototal.........................................................

54

4.1.2

Dosagemdemieloperoxidase(MPO)................................................................

56

4.2

Avaliaodaangiognese................................................................................

57

4.3

Avaliaodafibroplasia...................................................................................

58

4.4

Avaliaodacolagnese..................................................................................

59

4.4.1

Avaliaohistolgicaporanlisedeimagem...................................................

59

4.4.2

Dosagemdehidroxiprolina(OHP).....................................................................

61

4.5

Avaliaodareepitelizaodaslceras(ICU).................................................

62

DISCUSSO........................................................................................................

CONCLUSES.....................................................................................................

REFERNCIAS.. ....................................................................................................................

66

74

76

1 Introduo .

Introduo|16

1.1 Morfofisiologiadapele

Apeleomaiorrgodocorpohumanoatingindoat10%damassacorporaltotal.
Em adultos, a rea total pode chegar de 1,5 a 2,0 m2 e pesar de 8 a 10 kg. importante
manter sua integridade fsica, pois ela atua como uma barreira mecanicamente flexvel,
atuandocomoaprimeiralinhadedefesacontrainfecodemicroorganismosetoxinasdo
meioexterno.Almdeserumrgosensorialespecializado,otecidocutneodesempenha
vriasfunescomoproteocontraraiosultravioleta(UV),prevenocontradesidratao,
termoregulao,absoro,vigilnciaimunolgica,cicatrizaoentreoutras(CLARK;GHOSH;
TONNESEN,2007;EHRENREICH;RUSZCZAK,2006;GLetal.,2011;JUNQUEIRA;CARNEIRO,
2004;THEORET,2009).
A pele consiste em duas camadas distintas: a epiderme, de origem ectodrmica,
composta por queratincitos, e a derme, de origem mesodrmica, uma poro conjuntiva
abaixo da epiderme formada por uma associao complexa de fibroblastos e matriz
extracelular (MEC), onde se encontram os apndices (pelos, glndulas sudorparas e
sebceas)eestruturascomovasossanguneosefibrasnervosas.Emcontinuidadedaderme
se situa a hipoderme, tambm de origem mesodrmica, uma frouxa conectiva camada de
tecidoadiposoque,emboranofaapartedapele,atuacomosuporteeuniodostecidose
rgos adjacentes (EHRENREICH; RUSZCZAK, 2006; GOSAIN; DIPIETRO, 2004; JUNQUEIRA;
CARNEIRO,2004).

1.1.1 Epiderme

a camada mais externa da pele composta por clulas epiteliais limitadas pelo
contatocomamembranabasal,estruturaqueseparaadermedaepiderme.constituda
por um epitlio estratificado queratinizado que funciona como uma barreira contra a
entradadeguaemicroorganismos(JUNQUEIRA;CARNEIRO,2004;PAUL;SHARMA,2004).
A epiderme composta por clulas especializadas como os queratincitos, clulas
responsveispelaproduodaqueratina,umaforteeestruturalprotena,osmelancitos,
clulasresponsveispelaproduodamelanina,pigmentodapelequeagecomoprotetor
natural contra os efeitos nocivos de raios UV, transferida progressivamente para os
queratincitos.HtambmasclulasdeLangerhansqueatuamnarespostaimunolgicae

Introduo|17

as clulas de Merkel que so mecanoreceptores (EHRENREICH; RUSZCZAK, 2006;

JUNQUEIRA;CARNEIRO,2004;WATT,1988).
A estratificao da epiderme contm cinco camadas: basal, espinhosa, granulosa,
lcidaecrnea.Acamadabasalamaisprofunda,localizadanajunodermoepidrmica.
tambm denominada camada germinativa, pois onde os queratincitos tm maior
potencialmitticoeauxiliadospelacamadaespinhosamantmumacontnuarenovaoda
epiderme. A camada granulosa responsvel pela sntese de lipdios armazenados em
corposlamelareseexcretadoscomafinalidadedeseremincorporadosnacamadacrnea,
tornando a pele impermevel a gua e impedindo a desidratao. A camada lcida
formada por clulas achatadas e est presente somente em regies do corpo onde a
epidermemaisespessa,comoaplantadospseapalmadamo.Acamadacrnea,amais
superficial, apresenta clulas mortas com citoplasma repleto de queratina (cornecitos)
(ELIAS; MENON, 1991; HOUBEN; DE PAEPE; ROGIERS, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004;
KIM;YUN;CHO,2011).
Nadiferenciaodaepiderme,osqueratincitosdeixamacamadabasalemovemse
em direo a superfcie pela camada espinhosa e granulosa em direo a camada crnea.
Neste processo conhecido como diferenciao terminal, os queratincitos perdem o
potencial mittico e sofrem modificaes morfolgicas e bioqumicas importantes e
transformamse em estruturas multilamelares de cornecitos anucleados envoltos por
matriz extracelular lipdica, formando uma poderosa barreira contra insultos do meio
externo(CANDI;SCHMIDT;MELINO,2005;ELIAS,2007;KIM;YUN;CHO,2011;REHDERetal.,
2004).

1.1.2 Derme

a parte mais espessa da pele, formada por um tecido conjuntivo composto por
colgeno,fibraselsticaseglicosaminoglicanas(GAGs),produzidosporfibroblastosdermais,
conferindo estrutura, apoio, consistncia fsica e elasticidade a pele. generosamente
vascularizada e inervada, totalmente invadidapor folculos pilosos e glndulas (sebceas e
sudorparas)queseestendemataepiderme.Adermetambmresponsvelpelanutrio
da epiderme por meio da difuso de pequenas molculas (EHRENREICH; RUSZCZAK, 2006;

Introduo|18

HUANG; REN; QIN, 1998; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; PAUL; SHARMA, 2004; THEORET,
2009).
A derme dividida em duas camadas, a papilar e a reticular. A camada papilar
constituda por um tecido conjuntivo frouxo (fibroblastos e delgadas fibras colgenas e
elsticas), apresentam salincias conhecidas como papilas drmicas, mantendo ntimo
contato com a epiderme. A camada reticular mais espessa e constituda por um tecido
conjuntivo denso (fibroblastos e espessos feixes de fibras colgenas e elsticas)
(EHRENREICH;RUSZCZAK,2006;GOSAIN;DIPIETRO,2004;JUNQUEIRA;CARNEIRO,2004;).
Os fibroblastos so clulas alongadas com formato fusiforme, responsveis pela
sntese da MEC (colgeno tipo I e tipo III, elastina, glicosaminoglicanas, fibronectinas),
contribuem para formao da membrana basal (laminina e colgeno tipo IV), fonte de
proteinasescomoasmatrizmetaloproteinases(MMPs),regulaodadiferenciaoepitelial,
secreo de fatores de crescimento, envolvimento na reparao tecidual, contrao na
cicatrizao,entreoutros(CHANGetal.,2002;GOSAIN;DIPIETRO,2004;PARSONAGEetal.,
2005; RODEMANN; MULLER, 1991; SIMIAN et al., 2001; TOMASEK et al., 2002; WISEMAN;
WERB,2002).

1.1.3 Hipoderme

A hipoderme ou tecido subcutneo a camada mais profunda da pele.

Essencialmente formada por tecido conjuntivo frouxo, composta por clulas que
armazenamgordura,bemvascularizadaeresponsvelbasicamentepeloisolamentotrmico
eabsorodechoquesmecnicos(JUNQUEIRA;CARNEIRO,2004;PAULESHARMA,2004).

1.2

lcerascutneas

lceras cutneas so definidas como um rompimento celular da continuidade

anatmicadapele(envolvendoepidermeederme)edesuafuncionalidade.Podemseruma
simpleslesonaintegridadedotecidocutneo(epidermeederme)oualcanarregiesmais
profundas (hipoderme, msculos e ossos), expondo as clulas e tecidos ao meio externo
(EHRENREICH;RUSZCZAK,2006;HENG,2011;ROBSON;STEED;FRANZ,2001;SCHMIDTetal.,

Introduo|19

2009).Podemsercaracterizadasporsuaprofundidade,taiscomo,espessuraparcial(derme
incompleta) ou lceras de espessura total (derme completa, podendo atingir o tecido
subcutneo)(MANDELBAUM;DISANTIS;MANDELBAUM,2003).
Aslcerasconstituemumdosprincipaisproblemasdesadepblica.Algumassode
difcil cicatrizao devido a diversos fatores intrnsecos e extrnsecos (FALANGA, 2005),
principalmente quando na fase crnica, agravando ainda mais a doena e diminuindo a
qualidadedevidadessaspessoas(GARYSIBBALD,WOO,2008).
As lceras de espessura parcial ocorrem aps procedimentos dermatolgicos
cirrgicoscomoadermoabrasoepeelingsqumicos,oucausadasportraumatismo.Neste
caso,areparaoaconteceapenaspormeiodareepitelizao,resultandoemumacicatriz
praticamente imperceptvel (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). As lceras
deespessuratotalnecessitam,almdareepitelizao,daformaoumtecidodegranulao
para restaurar o tecido perdido e a cicatriz formada tornase perceptvel e muitas vezes
pronunciada (FAZIO; ZITELLI; GOSLEN, 2000; MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM,
2003).

1.2.1 lcerascutneasagudasecrnicas

Otempoumimportantefatornamanutenodalesoeparaoprocessocicatricial.
Destemodo,aslceraspodemserclinicamentedivididasemlcerasagudasecrnicas.As
lcerasagudassodefinidasquandohumreparotecidualordenadoeoportuno,seguindo
o processo para a restaurao anatmica e funcional da pele. O tempo da cicatrizao
geralmente varia de 5 a 10 dias, podendo chegar at 30 dias (VELNAR; BAILEY; SMRKOLJ,
2009). So de origem traumtica ou devido a processos cirrgicos que, de modo geral,
envolveremoodeumtecidoconjuntivofrouxo,ondenohpresenadecontaminaes
e complicaes com o paciente (LAZARUS et al., 1994; ROBSON; STEED; FRANZ, 2001;
VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).
Embora o tempo no esteja claramente definido, lceras crnicas so aquelas cuja
cicatrizaonoocorreemumtempoesperadodeat6semanas(RONDNMARMetal.,
2009)oude8a12semanas,semqualquersinaldecicatrizao(WHITNEY,2005).Otempo
paraumalceracrnicareepitelizarcompletamentesignificantementemaiore,emalguns
casos,alceratemsuareaaumentada,principalmentedevidoaoambientealtamenterico

Introduo|20

emproteases,permanecememumestadoinflamatriopersistente.Destemodo,oreparo
tecidual incompleto, atrasado, no ordenado e resulta em uma pobre restaurao
anatmicaefuncional(MENKEetal.,2007;STOJADINOVICetal.,2008).
Aslcerascrnicassogeralmenteoriginadasporcomprometimentovascular,danos
repetitivos ao tecido e infeces, sendo as causas mais comuns as que incluem as lceras
venosas,arteriais,neuropticas,queimaduraselcerasporpresso(BELLO;PHILLIPS,2000;
KOMARCEVIC,2000;LAZARUSetal.,1994;MENKEetal.,2007;STOJADINOVICetal.,2008;
VANWIJCK,2001).
O estmulo inflamatrio persistente est relacionado s complicaes que incluem
hipxiatecidual,necrose,exsudatoseinfecesbacterianas.Ocontnuoestadoinflamatrio
da lcera cria inmeras respostas teciduais que associadas prejudicam a cicatrizao. Alta
atividade mittica e o delicado equilbrio entre citocinas prinflamatrias, quimiocinas,
proteaseseinibidoressoausentesnaslcerascrnicas.Osneutrfilosestopresentesem
todo processo e, consequentemente, h uma alta concentrao de enzimas degradativas
liberadas, como as matrizes metaloproteinases (MMPs), que quando no inibidas por
inibidoresnaturais(TIMPs),resultamemdegradaodaMEC,migraocelularprejudicada,
reduo de fibroblastos e da sntese de colgeno (LOBMANN et al., 2002; LOBMANN;
SCHULTZ;LEHNERT,2005;MAST;SCHULTZ,1996;MENKEetal.,2007;STOJADINOVICetal.,
2008;VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).
A complexidade do processo cicatricial relacionada patognese das lceras, sua
extenso,caractersticasfsicasefuncionaisdostecidosenvolvidos.Muitassoascondies
que tornam este processo de difcil resoluo, impedindo ou retardando uma completa
cicatrizao(BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,2006;KUMAR;ABBAS;FAUSTO,2005).
O aumento da expectativa de vida e o rpido incremento da populao idosa tm
sidoapontadoscomodeterminantessociaisdacrescenteprevalnciadecondiescrnicas
desade.Nestecontexto,aslcerascutneasassumemimportncia,vistoquepodemestar
relacionadas a doenas crnicodegenerativas associadas idade, alimentao, doenas
cardiovasculares, diabetes mellitus e artrite reumatide. Projees publicadas pela
Organizao Mundial de Sade (OMS) estimam que a populao idosa aumente cerca de
seteaoitovezesatoano2025(LIMAECOSTAetal.,2000).
Nos EUA, aproximadamente 600.000 pacientes tm lceras venosas, com custo
mdio de dez mil dlares por paciente, enquanto outros 1,4 milhes tm lceras por

Introduo|21

presso.Ocustototaldotratamentoparaestesdoisgrupostemsidoestimadoem8bilhes
de dlares anualmente (CLARK; GHOSH; TONNESEN, 2007). lceras que no cicatrizam,
principalmente em pacientes idosos, podem tornarse crnicas por anos e levar estes
pacientesabito(JAUL,2009;MENKEetal.,2007).
EstudosrealizadosnaUnioEuropiatmestimadoumaprevalnciaparalcerasde
p e perna de 1,48/1000 habitantes e com o avano da idade, estes nmeros aumentam
(36/1000habitantescommaisde65anosdeidade).Aprevalnciaanualdelcerasvenosas
de perna tem sido estimada em 1,69% para indivduos com 65 anos de idade ou mais
(HOWELLJONESetal.,2005).
Taisresultadosevidenciamadificuldadedadoenalceracutneaparaospacientes,
tendo em vista os aspectos socioeconmicos e psicolgicos. Um paciente com uma lcera
que no cicatriza tem diminuio da qualidade de vida devido ao desconforto, mau odor,
presenadesecreo,almdedanoimagemcorporal,aqualresultaemisolamentosocial
(JAUL,2009).Outrascomplicaesdelcerascrnicasincluemlimitaesfuncionais(como
dificuldade de locomoo), dor crnica, infeces (formao de abscessos, osteomielite e
mesmosepse)eamputao(MENKEetal.,2007).
Nosltimossculosenasdcadasrecentesinmerosavanostrouxerammudanas
significantes no conhecimento cientfico sobre o processo cicatricial, que influenciaram as
abordagensatualmenteaceitasnotratamentodelcerascutneas(SHAI;MAIBACH,2005).

1.3

Cicatrizao

A cicatrizao um processo biolgico complexo, multifatorial e contnuo, dividido

emcincofasesdistintasdidaticamente,pormsobrepostas:leso,coagulao,inflamao,
formaoeremodelagemteciduais.Emdiferentesregiesdeumamesmalcera,diferentes
fases da cicatrizao podem estar ocorrendo concomitantemente (BROUGHTON II; JANIS;
ATTINGER, 2006; CAMPOS; GROTH; BRANCO, 2008; MENKE et al., 2008; STRONCEK; BELL;
REICHERT,2009).
H participao de elementos celulares e/ou extracelulares especficos como
citocinasefatoresdecrescimento,queagemcomosubstnciassinalizadoras,supressorase
estimuladoras com funo de orquestrar e manter as funes biofisiolgicas de cada fase,

Introduo|22

ocorrendodeformasequencialemtodooprocesso,emumaintensidaderegulada(GOSAIN;
DIPIETRO,2004;MATHIEU;LINKE;WATTEL,2006;STOJADINOVICetal.,2008).
Aperdadaintegridadedapelepoderesultaremumgrandedesequilbriofisiolgico
quepodeocasionardesabilidadesignificanteaopacienteoumesmobito(CLARK;GHOSH;
TONNESEN, 2007). Quando uma leso ocorre com extravasamento de sangue, a resposta
imediataalcanarahemostasiatecidualecriarumsuporteparaoinfluxocelular.Oreparo
tecidual se inicia com a proliferao e crescimento de clulas da derme (fibroblastos e
clulasestromais)edaepiderme(queratincitos)(STOJADINOVICetal.,2008).

1.3.1 Coagulao

Imediatamente aps a leso, onde h o rompimento da soluo de continuidade

tecidual deuma regiovascularizada, ocorre oextravasamento de sangue que preenche a
realesadacomplasmaeelementoscelulares(plaquetas).Asplaquetas,juntamentecoma
fibrina,iniciamacoagulaosanguneaimediatamenteapsalesocomativaodacascata
da coagulao, aumentando a permeabilidade vascular e liberando protenas plasmticas
(fibrinognio e fibronectina), aminas vasoativas e outros mediadores (BEANESetal., 2003;
KARUKONDAetal.,2000).
O principal objetivo desta fase impedir a perda sangunea, proteger o sistema
vascularparamanterasfunesdosrgosvitais(BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,2006;
VELNAR; BAILEY; SMRKOLJ, 2009). Para isso, h formao de um cogulo plaquetrio que
servir tambm como uma matriz temporria para o recrutamento de clulas nas fases
seguintesdacicatrizao(ROBSON;STEED;FRANZ,2001;STOJADINOVICetal.,2008).
Devido ao mecanismo de reflexo neural, vasos lesados constringem rapidamente
devido contrao de clulas da musculatura lisa de arterolas de calibre at 0,5 cm de
dimetro. Entretanto, a constrio vascular pelo tono muscular liso somente acontece por
alguns segundos, pois a hipxia e acidez na parede da lcera causa passivo relaxamento
celular e o extravasamento sanguneo continua (LAWRENCE, 1998; STRECKERMCGRAW;
JONES; BAER, 2007; VELNAR; BAILEY; SMRKOLJ, 2009). Potentes vasoconstrictores como
tromboxano A2 e prostaglandinas2 so liberados para evitar a perda excessiva de sangue
(CAMPOS;GROTH;BRANCO,2008).

Introduo|23

O processo de hemostasia continua com ativao da cascata de coagulao

objetivando formar o cogulo sanguneo. As plaquetas e outros componentes do sangue
entram em contato com o colgeno (receptores glicoproticos especficos GPIb/IX/V) e
componentesdamatrizextracelulardotecidoaoredor.Essecontatodasplaquetasacionaa
liberaodefatoresdecoagulaoeaformaodocogulocompostodeplaquetas,fibrina
e fibronectina. Este tampo plaquetrio formado no apenas leva hemostasia, como
tambm desempenha funo de matriz provisria para a migrao celular (moncitos,
neutrfilos, fibroblastos e clulas endoteliais) no local da leso (BEANES et al., 2003;
BROUGHTON II; JANIS; ATTINGER, 2006; CAMPOS; GROTH; BRANCO, 2008; LAWRENCE,
1998;RUGGERI,2002;VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).
Aadesoeagregaoplaquetriafuncionamcomoativadoresdaliberaodefatores
decoagulao.Essesfatores,almdeacionarapolimerizaodafibrina,resultadodaao
de converso da trombina em fibrinognio no cogulo plaquetrio, so tambm
responsveispeladegranulaoeliberaodecitocinasprinflamatrias,almdediversos
fatoresdecrescimento,comofatordecrescimentoderivadodeplaquetas(PDGF),fatorde
transformao de crescimento beta 1 e alfa (TGF1 e TGF), fator de crescimento de
queratincitos (KGF2), fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento
endotelial (EGF) (BEANES et al., 2003; BROUGHTON II; JANIS; ATTINGER, 2006; CAMPOS;
GROTH;BRANCO,2008;LAWRENCE,1998;STANDEVEN;ARIENS;GRANT,2005).
Esses fatores atuam ativando e atraindo clulas inflamatrias, endoteliais e
fibroblastosparaareadaleso.Ocoguloformadoservecomoumreservatriodefatores
de crescimento que iro atrair quimiotaticamente clulas para a fase inflamatria. As
plaquetas tambm liberam aminas vasoativas, como a serotonina, estocadas em densos
corposplaquetriosquecausamvasodilataoeaumentodapermeabilidadevascularparao
influxocelularparaasfasessubsequentesdacicatrizao(CAMPOS;GROTH;BRANCO,2008;
LAWRENCE,1998;RICHARDSON,2004;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
Qualquerprocessoqueremovaotampodefibrinadalceralevainterrupoda
formaodamatriztemporriaeconsequentementeaumatrasonacicatrizao(BEANESet
al.,2003;FUKAIetal.,1991).

Introduo|24

1.3.2 Inflamao

Nafaseseguinte,inflamao,umarespostacelularehumoralacontececomobjetivo
de criar uma barreira imunolgica contra microrganismos invasores. A fase inflamatria
caracterizadapelossinaistpicosdoprocessoinflamatriolocalizado,comodor,rubor,calor
eedema,resultadodavasodilataoedapermeabilidadecapilaraumentada(BAUM;ARPEY,
2005;MONACO;LAWRENCE,2003).Asprincipaisclulasenvolvidassoosneutrfiloseos
macrfagos,comfunodedesbridamentoeprepararolocalafetadoparaocrescimentodo
novotecido(ABREU;MARQUES,2005).Arespostainflamatriainiciasenofinaldafasede
coagulao, onde fatores de crescimento e citocinas so liberados no local da lcera para
que neutrfilos sejam quimiotaticamente atrados para a leso (BROUGHTON II; JANIS;
ATTINGER,2006;HART,2002).
Alteraes na regulao de molculas de adeso dos leuccitos promovem o
processo de marginao na corrente sangunea. Neste processo, a aderncia s clulas
endoteliais fazse por meio do receptor dos leuccitos PSGL1 que se ligam a Pselectinas
expressasemplaquetaseclulasendoteliais.Comoessasligaessofracas,osleuccitos
rolamnasuperfciedoendotliopuxadospelofluxosanguneo.OfatorIVdeplaquetaseo
fator de ativao de plaquetas aumentam a expresso de CD8/CD11b, integrinas na
superfcie de neutrfilos que facilitam a transmigrao de leuccitos pelo endotlio, um
processo chamado diapedese (HART, 2002; HENG, 2011; MONACO; LAWRENCE, 2003;
YAGER;NWOMEH,1999).
Durante o rolamento, neutrfilos so ativados por interleucina8 (IL8) e protena
inflamatria de macrfagos (MIP1) liberados por clulas endoteliais. Receptores de
neutrfilos ligados a quimiocinas ativam integrinas 2, intensificando ainda mais a adeso
(SPRINGER,1994;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
Os neutrfilos, leuccitos mais comuns, so as menores clulas inflamatrias e a
primeira linha de defesa nesta fase. So importantes pela sua atividade microbicida,
principalmentepelaliberaodeenzimasproteolticastalcomoamieloperoxidase(SWAIN;
ROHN;QUINN,2002;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009),almdeespciesreativasderivadas
dooxignio(ROSs)exidontrico(NO)(BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,2006;FIERROet
al.,1996;FIERROetal.,1999).

Introduo|25

Osneutrfilos,aochegarlcerapormeiodoTGF,fatordenecrosetumoral(TNF),
interleucina (IL1), componentes complemento (C3a e C5a) e peptdeos produzidos pelas
prprias bactrias, iniciam a atividade de fagocitose de partculas estranhas e o
desbridamentodotecidolesadopormeiodeenzimasproteolticas(BROUGHTONII;JANIS;
ATTINGER, 2006; CAMPOS; GROTH; BRANCO, 2008; HENG, 2011; ROBSON; STEED; FRANZ,
2001;VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).Asespciesreativasdestroemagentesinfecciosos,
alm de possveis clulas hospedeiras, limpando a rea da lcera para impedir
contaminaes(GUO;DIPIETRO,2010;MARTIN;LEIBOVICH,2005).
Uma vez que os patgenos so removidos, a atividade neutroflica diminui
gradualmenteeosneutrfilosentramemprocessodeapoptose.Destemodo,aeliminao
neutroflica no cria danos ao tecido, evitando que a resposta inflamatria seja
potencializada (FRADE, 2003; HART, 2002; STRONCEK; BELL; REICHERT, 2009). Os corpos
apoptticos so fagocitados por macrfagos, dando seguimento fase inflamatria
(BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,2006;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
Os macrfagos chegam ao local da leso e continuam o processo de fagocitose.
Originalmente,moncitossorecrutadosdacorrentesanguneaeaochegarlcerasofrem
alteraes fenotpicas, diferenciando em macrfagos. So atrados por vrias quimiocinas,
como a protena1 quimiottica de moncito (MCP1), MIP1 e MIP1, fatores de
coagulao, componentes do sistema complemento, fibronectina, citocinas (PDGF, TGF,
fatorIVdeplaquetas),elastinaecolgenoprovenientesdaMECdestrudanaleso(FUKAIet
al.,1991;HART,2002;PIERCEetal.,1991;RAMASASTRY,2005;STRONCEK;BELL;REICHERT,
2009).
Em estudos onde os neutrfilos foram inibidos, observouse que o processo de
reparo no foi prejudicado. O mesmo no aconteceu quando os macrfagos foram
removidos,poishouvelimpezalimitadadotecidonecrticonolocaldaleso,resultandoem
processo de cicatrizao prolongado e demora da proliferao de fibroblastos com
subsequentefibrosedalcera.(BAUM;ARPEY,2005;DIEGELMANN;EVANS,2004;GURTNER
etal.,2008;LEIBOVICH;ROSS,1975;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
Almdefagocitarrestoscelulares,clulasapoptticaseneutrfilossenescentes,os
macrfagos tm papel crucial no processo de cicatrizao. Eles atuam como clulas
reguladorasepotentereservatriodefatoresdecrescimentotecidual(TGF,TGF,fatores
angiognicos, EGF e FGF) e citocinas prinflamatrias (TNF e IL1), alm de liberarem

Introduo|26

MMPs, colagenases e elastases para quebra do contedo extracelular remanescente

(BROUGHTON II; JANIS; ATTINGER, 2006; CAMPOS; GROTH; BRANCO, 2008; DIEGELMANN;
EVANS,2004;HENG,2011;MOSSER;EDWARDS,2008;RAMASASTRY,2005).
Os mastcitos auxiliam na resposta inflamatria liberando histamina e serotonina
para aumentar a permeabilidade dos vasos sanguneos e promover a migrao dos
macrfagos (BRADDING; WALLS; CHURCH, 1995; STRONCEK; BELL; REICHERT, 2009). Os
linfcitos atrados por IL1 so as ltimas clulas a participar da fase inflamatria, porm
seupapelaindanofoitotalmenteelucidado(BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,2006;GUO;
DIPIETRO,2010;HART,2002;).
Osmacrfagos,almdeauxiliaremnalimpezadalcera,atuamnatransioparaa
faseseguintedacicatrizao,poisestimulamaproliferaodequeratincitos,fibroblastose
oprocessodeangiognese,dandoinciodafasedeformaoproliferativa(GUO;DIPIETRO,
2010;MESZAROS;REICHNER;ALBINA,2000;MOSSER;EDWARDS,2008).

1.3.3 Formaotecidual

A fase de formao tecidual constituise no restabelecimento da integridade da

epiderme e da derme. caracterizada por uma intensa proliferao e migrao celular,
brotamento de capilares e sntese de uma nova MEC para preencher o tecido danificado
aps o desbridamento feito na fase inflamatria (GUO; DIPIETRO, 2010; STRONCEK; BELL;
REICHERT,2009;VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).Estafasecaracterizadapelaformao
do tecido de granulao, sntese de colgeno pelos fibroblastos, angiognese e
reepitelizao(BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,2006;CAMPOS;GROTH;BRANCO,2008).
Otecidodegranulaoassimchamadopeloaspectogranulargeradopeloscapilares
neoformados no local da leso, presena de clulas inflamatrias (principalmente
macrfagos),clulasendoteliais,fibroblastosemiofibroblastosemumamatrizfrouxamente
agregada, que precede o desenvolvimento do tecido cicatricial maduro (BAUM; ARPEY,
2005;BEANESetal.,2003;CLARK;GHOSH;TONNESEN,2007).

Introduo|27

1.3.3.1 Fibroblastosesntesedecolgeno

No momento da leso, fibroblastos do tecido circunjacente so estimulados

proliferao.Alcanadaahemostasiaelivredeinfeco,osfibroblastossoatradoslcera
pormeiodaaodeTGFePDGF,liberadosporclulasinflamatriaseplaquetas.Umavez
nolocaldaleso,osfibroblastoscontinuamaproliferaoesintetizamelementosdanova
matriz como, proteoglicanas, glicosaminoglicanas e colgeno, principais componentes da
MEC, que so depositados no local para substituir a matriz provisria inicial composta por
fibrina (CAMPOS; GROTH; BRANCO, 2008; GUO; DIPIETRO, 2010; RAMASASTRY, 2005;
VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).
Neste estgio da cicatrizao, h uma concentrao de fibroblastos no tecido de
granulao em desenvolvimento devido ao de FGF, TGF e PDGF. O FGF estimula a
proliferao celular. O TGF estimula a produo de colgeno (posterior sntese de
colgenotipoI)pelosfibroblastosetambmsuadiferenciaoemmiofibroblastos.OPDGF
estimula a proliferao e ativao dos fibroblastos. Os fibroblastos secretam FGF, TGF e
PDGF para a prpria manuteno, alm do fator de crescimento semelhante insulina 1
(IGF1)efatordecrescimentoparaqueratincitos(KGF)(BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,
2006;CAMPOS;GROTH;BRANCO,2008).
O colgeno a principal protena do tecido conjuntivo. Tem estrutura helicoidal
composta por glicina, prolina e hidroxiprolina. Diferenas em sua estrutura qumica
determinam seu papel biolgico. O tipo I a mais frequente forma encontrada, presente
principalmente em ossos e tendes. O tipo III mais fino, imaturo e desorganizado, est
presenteemvasossanguneos,fsciaenaderme,juntamentecomotipoI(ROBSON;STEED;
FRANZ,2001).
Emumtecidointacto,encontrase80%dotipoIe20%dotipoIII.Jemumtecidode
granulao, encontrase 40% do tipo III. Sintetizado pelos fibroblastos importante em
todasasfasesdacicatrizao,poisproporcionamintegridadeeforaparaostecidos,alm
de um importante papel no remodelamento tecidual (BAUM; ARPEY, 2005; CAMPOS;
GROTH;BRANCO,2008;ROBSON;STEED;FRANZ,2001;).
Amolculadehidroxiprolinatempapelmuitoimportantenocolgenoumavezque
proporcionaaconformaohelicoidalestvelprotena.Quandoausente,porexemplo,em
condies como falta de vitamina C, o colgeno tem sua estrutura alterada e pode sofrer

Introduo|28

desnaturao mais facilmente. O colgeno liberado no espao extracelular passa pela

clivagemdospeptdeosterminaisNeCeaenzimalisiloxidaseproporcionaaformaode
ligaes (crosslinks) mais estveis. Conforme o colgeno tornase maduro, mais ligaes
intra e intercelulares ocorrem nestas molculas. Esta etapa importante de crosslinking
proporciona, com o passar do tempo, fora e estabilidade ao colgeno (CORSETTI et al.,
2009;DIEGELMANN;EVANS,2004;DOUGHTY;SPARKSDeFRIESE,2012).
Norompimentodetecidos,ocolgenonecessriopararepararaperdaerestaurar
aestruturanormal.Seumexcessodecolgenofordepositadonolocaldaleso,aestrutura
anatmica normal da pele ser perdida e ocorrer fibrose. Por outro lado, se uma
quantidade insuficiente for depositada, a lcera, e consequentemente a cicatriz, sero
frgeis.Asnteseadequadadecolgenoumprocessofundamentalparaacicatrizaodas
lcerascutneas(CORSETTIetal.,2009;DIEGELMANN;EVANS,2004;MONACO;LAWRENCE,
2003).
Aps abundante sntese e deposio de MEC, os fibroblastos, por ao do TGF,
sofrem alteraes fenotpicas e transformamse em miofibroblastos. Neste estgio, eles
expressam largos filamentos de actina (assemelhamse musculatura lisa) abaixo da
membranaplasmtica.Ativamenteestendempseudpodesqueseprendemfirmementeno
colgenodaMECparafazerfortesmovimentosderetraocelular.Acontraodalcera
um evento importante para o processo de reparo na tentativa de aproximar as bordas da
leso. Por fim, o excesso de fibroblastos e miofibroblastos so eliminados por apoptose
(BAUM;ARPEY,2005;GOLDMAN,2004;RAMASASTRY,2005).

1.3.3.2 Angiognese

Clulas endoteliais residentes ao redor da lcera formam novos capilares quando

estes so destrudos. Degradam e invadem a matriz provisria da leso e se conectam a
outrasclulasquepormeiodebrotamentooriginamnovosvasos.Destemodo,conseguem
formar uma rede vascular mnima que permite a circulao sangunea e assim nutrir as
clulasquechegamaolocaldaleso(BARANOSKI;AYELLO,2004).
As clulas endoteliais tambm so responsveis pela liberao de fatores
angiognicos, VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), PDGF, TGF e TGF. Em
hipxia, molculas so secretadas por clulas parenquimatosas ao redor da leso para

Introduo|29

promoveraproliferaoecrescimentodeclulasendoteliais.Angiostatinaeesteridesso
fatores inibitrios que mantm um equilbrio adequado na proliferao de clulas
endoteliais,controlandoataxademitoseealiberaodosdemaisfatores.(FERRARA,2000;
OIKEetal.,2004;VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009;ZHANGetal.,1997).
Macrfagos, proliferao de fibroblastos e a vascularizao do tecido juntamente
commatrizdecolgeno,fibrinognio,fibronectinaecidohialurnicoconstituemotecido
de granulao agudo que substitui a matriz provisria de fibrina formada na fase
inflamatria. Com o acmulo de colgeno, h uma queda na concentrao de vasos
sanguneos e o tecido de granulao comea a maturar para a formao de uma cicatriz
(BAUM;ARPEY,2005;MOONetal.,2005,VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).
Assim, macrfagos, fibroblastos e vasos sanguneos so elementos importantes que
atuam de maneira interdependente no interior da leso durante o processo cicatricial. Os
macrfagos estimulam a fibroplasia e a angiognese por serem uma fonte contnua de
liberaodefatoresdecrescimento,enquantoosfibroblastosatuamnaconstruodanova
matriz extracelular, produzindo colgeno, glicosaminoglicanas e proteoglicanas, que dar
suporteparaachegadadeclulasdereparotecidual.Vasossanguneosneoformadostema
funodotransportedeoxignioenutrientesparaometabolismocelularacentuado.Assim,
o processo de granulao tecidual ocorre como consequncia direta da ativao dos
mecanismos de fibroplasia e angiognese (ARNOLD; WEST, 1991; CAMPOS; GROTH;
BRANCO,2008;GOSAIN;DIPIETRO,2004).

1.3.3.3 Reepitelizao

Areepitelizaooprocessoderestauraodaepidermepormeiodaproliferaoe
migrao de queratincitos da epiderme circunjacente. Iniciase logo aps o momento da
leso,migrandonosentidodasbordasparaocentroporintermdiodamatrizprovisriade
fibrinaefibronectina.Nomomentoqueasclulasepiteliaisencontramse,amigraocessa
einiciaseaformaodeumanovamembranabasal(LI;CHEN;KIRSNER,2007;MONACO;
LAWRENCE,2003).
Citocinas inflamatrias, como IL1 e TNF estimulam fibroblastos a sintetizar e
secretarKGF1,KGF2eIL6,osquaisestimulamaproliferao,diferenciaoemigraode

Introduo|30

queratincitos(BAUM;ARPEY,2005;BROUGHTONII;JANIS;ATTINGER,2006;STOJADINOVIC
etal.,2008;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
Amigraodosqueratincitoseacontraodalceraresultamnareepitelizaoda
rea lesada. O resultado final da fase proliferativa vitalmente importante para a
cicatrizao, pois estabelece o suporte necessrio para reconstruir o tecido danificado
(HARDING;PATEL,2002;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).

1.3.4 RemodelagemTecidual

A remodelagem tecidual se caracteriza pela reorganizao da matriz extracelular

ondeaarquiteturadapeleremodeladanatentativaderetornoestruturatecidualnormal
com degradao do colgeno imaturo e instvel e formao de um colgeno estvel e
organizado, por meio da ao das colagenases, metaloproteinases e fatores inibitrios
(CAMPOS;GROTH;BRANCO,2008;GOSAIN;DIPIETRO,2004).Nestafase,todososprocessos
ativados no incio da leso so cessados progressivamente e a populao celular (clulas
endoteliais, macrfagos e miofibroblastos) comea a sofrer apoptose, permanecendo
apenasgrandequantidadedecolgeno,elementosdamatrizepoucasclulas(GURTNERet
al.,2008).
Em lceras onde a membrana basal no afetada, pouca atividade de
remodelamento acontece devido ausncia de uma nova MEC sintetizada na fase de
proliferao. Deste modo, no h formao de cicatriz aps o reparo do tecido. Por outro
lado,emlesesondepelomenosadermesuperioratingida,hintensaformaodaMEC
e a fase de remodelamento envolve alinhamento e contrao das fibras para diminuir o
tamanhodalceraerestabeleceraforatecidual.Arecuperaodonovotecidoraramente
pode ser comparada a um tecido original, pois a nova estrutura menos organizada,
resultandonaformaodeumacicatriz(STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
O remodelamento de uma lcera aguda controlado por mecanismos regulatrios
quemanteroumcontnuoequilbriodelicadoentredegradaoesntesedecolgeno.As
MMPs, produzidas por neutrfilos, macrfagos e principalmente fibroblastos, so
responsveispeladegradaodocolgeno.OTGFpredominantementeomediadorda
maturao e remodelamento da lcera, inibindo a atividade das MMPs por meio da
expresso dos TIMPs, pausando a atividade de degradao para que a nova matriz de

Introduo|31

colgeno seja acumulada (GRINELL, 2003; LAWRENCE, DIEGELMANN, 1994; STOJADINOVIC

etal.,2008;VELNAR;BAILEY;SMRKOLJ,2009).
Neste processo de degradao, a matriz extracelular composta por fibronectina,
proteoglicanas e principalmente colgeno tipo III substituda pelo colgeno tipo I, um
colgenomaisgrosso,forteebemorganizado.Osmiofibroblastospermanecentesnotecido,
juntamente com as fibras de colgeno, tornamse orientados paralelamente ao leito da
leso,resultandoemumaaparnciaestriada,diferentedotecidoobservadonapeleintacta
(GURTNERetal.,2008;STOJADINOVICetal.,2008;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
O colgeno encontrado no tecido de granulao bioquimicamente diferente do
colgeno da pele intacta. O colgeno do tecido de granulao tem maior hidroxilao e
glicosilao dos resduos de lisina e este aumento da glicosilao est correlacionado com
fibrasmaisfinas.Ocolgenopresentenacicatriz(mesmoapsumanodematurao)nunca
ser organizado e forte como o colgeno encontrado na pele intacta. Em uma semana, a
lceratemcercade3%desuaforatensorafinal,emtrssemanascercade30%,eemtrs
mesesaproximadamente80%,sendoesteonvelmaisaltodeforatensoraqueumtecido
cicatrizado pode alcanar (BROUGHTON II; JANIS; ATTINGER, 2006; DIEGELMANN; EVANS,
2004;GURTNERetal.,2008;STOJADINOVICetal.,2008;STRONCEK;BELL;REICHERT,2009).
Osmacrfagoscomeamadesaparecerjuntocomaproliferaodefibroblastosea
reduo da angiognese, de forma que a densidade vascular da ferida volte ao normal. O
remodelamentotecidualcontinuapor1ou2anosoudependendodopacienteedotipoda
lcerapodepermanecernestafaseaindamaistempo.Estruturasdrmicas,comofolculos
pilosos, glndulas sebceas e sudorparas, que foram perdidas durante a leso no so
regeneradas. Acreditase que ao longo desse processo, a ferida ainda sofra outras
contraes fsicas pelo aparecimento de novos miofibroblastos (BAUM; ARPEY, 2005;
CAMPOS; GROTH; BRANCO, 2008; GOSAIN; DIPIETRO, 2004; STRONCEK; BELL; REICHERT,
2009).
Diantedosgrandesavanosnacompreensodosfenmenosenvolvidosnoprocesso
cicatricial,aincidnciadelcerascutneasdedifcilcicatrizaoaindasemantmelevada,
repercutindo em altos custos e consequncias sociais aos pacientes, tornando relevante o
estudo cientfico para melhor compreenso dos fatores envolvidos e novas possibilidades
teraputicas para o tratamento de lceras cutneas utilizando principalmente curativos
biolgicosatxicos(SEHNetal.,2009).

Introduo|32

1.4

Tratamentodelceras

Otratamentotpicodelcerasconsisteemrestauraroambientefisiolgiconoleito
da leso, visando manter uma umidade adequada, controle de temperatura, regulao de
pH, controle da carga bacteriana, remoo do tecido novivel (desbridamento), controle
doodor,minimizaodedoreproteodapelenaregioafetada.Estascondies,umavez
ajustadas, iro contribuir para o reparo e restaurao da funo tecidual. Nenhum
tratamento tpico ser eficaz se a condio patolgica do paciente no for corrigida
(ROLSTAD;BRYANT;NIX,2012).
Nosltimossculosenasdcadasrecentesinmerosavanostrouxerammudanas
significantes no conhecimento cientfico sobre o processo cicatricial, que influenciaram as
abordagensatualmenteaceitasnotratamentodelcerascutneas(SHAI;MAIBACH,2005).
A teraputica implica no apenas no conhecimento dos produtos (medicamentos,
curativos)utilizadosparapromoveracicatrizao,masprimeiramentenoentendimentoda
fisiopatologia do processo cicatricial, pois a cada estgio do processo de reparo, a lcera
requer condies diferentes para progredir. Nem todos os tratamentos e curativos so
indicadosouapropriadosparaseremusadoscontinuamenteatofechamentodalcera.A
maioria das lceras requer numerosas modificaes conforme suas caractersticas se
alteram ao longo do seguimento/tratamento. O tratamento deve ser reavaliado e
readequado baseado nas caractersticas da lcera e na resposta do paciente (ABREU;
MARQUES,2005;ROLSTAD;BRYANT;NIX,2012).
Muitos curativos naturais e sintticos, assim como mtodos baseados em
fototerapia (LEITE et al 2011, MINATEL et al 2009) tm sido alvos frequentes na busca de
estratgiaseficazesdaestimulaodoprocessocicatricial,destacandodezenasdecurativos
impregnados com diferentes substncias, desde vaselina a fatores de crescimento
geneticamente produzidos, disponveis comercialmente (BROUGHTON II; JANIS; ATTINGER,
2006).
Em 2003 uma pesquisa avaliou que o mercado americano de produtos para o
tratamentodelceras,incluindocurativosbiolgicosesintticos,foimaiorque1,7bilhes
de dlares e estimou um aumento significativo conforme a populao envelhece, pois se
tornam mais susceptveis s causas de lceras crnicas. A qualidade de vida desses
indivduos extremamente pobre, alm do constante gasto financeiro indireto na

Introduo|33

manutenodaleso,oquetornadifciloacessoaorealcustocomlcerascutneascom
curativosetratamentosexistentes(CLARK;GHOSH;TONNESEN,2007).
H vrias exigncias que necessitam ser cumpridas para a utilizao de um novo
curativo na cicatrizao de lceras. Dentre eles podese citar a capacidade de atuar como
barreiracontrapatgenosdomeioexterno,isolandoolocaldaleso,nosertxico,manter
oambientemido,promoveracicatrizao,eaomesmotempomanterumaboatrocade
gases.Devemsercapazestambmdeabsorveroexcessodeexsudato,noseaderiraoleito
daleso,fcilmanipulaoebaixocusto(WIEGAND;HIPLER,2010).
Curativosbiolgicos(biomateriais)produzidosabasedepolmeroscomoacelulose,
colgeno,alginatoequitosana,temacapacidadedeenvolvimentonaturalnotecidolesado,
assimcomonotecidoemformao,parapromoveracicatrizao.Almdisso,apresentam
propriedades antimicrobianas intrnsecas e distintas possibilidades de ligaes para
mediadores inflamatrios (citocinas, proteases e radicais livres), cujas concentraes so
elevadasemlcerascrnicasdedifcilcicatrizao(WIEGAND;HIPLER,2010).
Diversos curativos sintticos e biolgicos tm sido desenvolvidos e caracterizados
objetivandoproporcionarpropriedadesideaisparaotratamentodelceras.Osbiomateriais,
alm dessas propriedades, caracterizamse por terem origem de produtos renovveis e
biodegradveis (PAUL; SHARMA, 2004; WANG; KHOR; LIM, 2001; WANG et al., 2002;
WIEGAND;HIPLER,2010).Soempregadosnatentativadeestabelecerumsuportebiolgico
tridimensional saudvel, mimetizando uma matriz cutnea original que possibilite a
migrao, proliferao e uma organizao ideal das clulas no microambiente fisiolgico
cutneoalterado(GOMESetal.,2003;SILVA,2008).
Existe uma grande variedade de curativos em formas de gis, espumas e filmes de
diferentes biomateriais. Alguns tiveram bastante xito, mas ainda no representam um
curativo ideal. Neste sentido, intensas pesquisas visam aprimorar a confeco de um
curativo biolgico ideal para o tratamento de lceras e queimaduras. Uma biomembrana
com boas perspectivas de emprego so as formadas por associaes de polmeros de
quitosanacompolmerosdealginato(HEDLUND,2002;STASHAK;FARSTVEDT;OTHIC,2004;
WIEGAND;HIPLER,2010).

Introduo|34

1.5

Biomembranadequitosanaalginato

A quitosana um biopolmero que tem sido estudada recentemente quando

comparada a outros polmeros da literatura. Ao contrrio dos polmeros sintticos, a

quitosana tem uma superfcie hidroflica que permite a adeso e crescimento celular
(AZEVEDO et al., 2007; GEORGE; ABRAHAM, 2006; LI et al., 2009). um polissacardeo
atxicocompostoporcadeiasdeNacetilglicosaminaeDglicosamina,derivadodaquitina
por meio de desacetilao parcial, formando um polmero linear natural biodegradvel e
biocompatvel.Podeserfacilmenteencontradanoexoesqueletodeinsetos,nasconchasde
crustceos e na parede celular de fungos (DALLAN, 2005; KHAN; PEH, 2003; WIEGAND;
HIPLER,2010).
Depois da celulose, a quitosana o polissacardeo mais abundante encontrado na
natureza.Suabiocompatibilidadeediversasoutrascaractersticasfazemdestebiopolmero
umdosmaisinvestigadosnosmaisdiversoscamposdacincia(HEINetal.,2008).Aquitina
eaquitosanatemsidoamplamenteutilizadasnosmaisvariadoscamposdetrabalho,como
porexemplo,notratamentodegua,agricultura,cosmticos,processamentoalimentcioe
biomaterial em estudos farmacuticos e biotecnolgicos (AZEVEDO et al., 2007; GEORGE;
ABRAHAM, 2006). Os curativos base de quitosana podem ser manufaturados de vrias
formas,incluindofibras,membranas,esponjasegis(HEINetal.,2008;MALAFAYA;SILVA;
REIS, 2007; PAUL; SHARMA, 2004; SUZUKI; MIZUSHIMA, 1997; YUDANOVA; RESHETOV,
2006).
Este biopolmero contm muitas funes biolgicas. Como curativo podese citar
propriedades de acelerar o processo de cicatrizao de lceras cutneas ao ativar
macrfagosfuncionais,aumentaronmerodefibroblastosnareaafetada,adiferenciao
celular e a reepitelizao da pele (HEIN et al., 2008; PAUL; SHARMA, 2004; WANG; KHOR;
LIM,2001;).Destacasetambmaaoantimicrobiana,atuaonasjunesepiteliaisena
reorganizaodahistoarquiteturacelular(ALEMDAROGLUetal.,2006;CLASEN;WILHELMS;
KULICKE,2006;SUZUKI;MIZUSHIMA,1997;PAUL;SHARMA,2004).
Deacordocomestudosencontradosnaliteratura,percebesequeestebiopolmero
tornase vivel aplicao na cicatrizao de feridas de pele. Dentre suas diversas
caractersticas, destacamse a capacidade de ser absorvido pelo organismo, atividade

Introduo|35

fungicida, antibacteriana e antitumoral, sendo esta ltima devido propriedade de ativar

macrfagos(HEINetal.,2008;MALAFAYA;SILVA;REIS,2007;RODRIGUES,2008).
Por ser um material hemosttico, a quitosana auxilia no processo de coagulao
natural e sua despolimerizao libera, a partir de hidrlises, oligmeros de NacetilD
glicosamina,umaminoacarcomumaoorganismoqueentranaviametablicainatapara
serincorporadoemglicoprotenas,responsvelporumarpidaproliferaodefibroblastos
e uma deposio ordenada do colgeno (HEIN et al., 2008; PAUL; SHARMA, 2004;
RODRIGUES,2008).Osoligmerosoriundosdaquitosanaestimulamemodulamasntesedo
cido hialurnico natural, o qual tem papel importante na morfognese e inflamao,
promovendo maior motilidade celular, adeso e proliferao (MUZZARELLI, 2009; WANG;
KAO;HSIEH,2003).
Oalginatootermousadonormalmenteparasereferiraoniondocidoalgnico,
mas tambm pode se referir aos seus sais ou ao prprio cido. Ele um polissacardeo
naturalatxicoque,quimicamente,umcopolmerolinearformadoporblocosdegrupos
(1,4)Dmanuronato (M) e Lguluronato (G) que em presena de ctions multivalentes,
podem formar gis. A composio e extenso das sequncias de meros e a massa molar
determinamaspropriedadesfsicasdoalginato(GEORGE;ABRAHAM,2006;MCHUGH,2003;
PAUL;SHARMA,2004;STHERetal.,2008).
obtido a partir de diversos tipos de algas, destacandose principalmente algumas
espcies marinhas de algas marrons. O alginato usado como espessante na indstria de
alimentos em molhos, coberturas, maioneses e iogurtes. Tambm usado como
estabilizante, reduzindo a formao de cristais de gelo e a taxa de derretimento em
sorvetes.Almdisso,filmesdealginatodeclciotmsidousadosnapreservaodepeixes
congelados. Na indstria farmacutica, este composto tem sido usado na liberao
controlada de medicamentos e produtos qumicos devido a sua sensibilidade ao pH.
Microesferasdealginatorecobertascomquitosana(melhorpropriedademecnica)temsido
testadasnaliberaocontroladadevriosfrmacos(GEORGE;ABRAHAM,2006;MCHUGH,
2003;STHERetal.,2008).
Este biopolmero tem sido amplamente empregado no tratamento de lceras com
grandequantidadedeexsudato,poisatrocadeonsentreoclciodobiomaterialeosdio
dalceralevaformaodeumgelestvelatemperaturaambientequetemcapacidadede
absorver umidade e manter um microambiente mido apropriado, principalmente para a

Introduo|36

fasedegranulaotecidual(GEORGE;ABRAHAM,2006;PAUL;SHARMA,2004;SANKALIAet
al.,2007;WANGetal.,2002;WIEGAND;HIPLER,2010).
Apropriedadegelificanteresultadodasligaescooperativasdectionsdivalentes,
taiscomoomagnsio,brio,estrncioeclcio,comblocoshomopolimricosdopolmero.O
ction mais utilizado o clcio (Ca2+), ligando ionicamente nas cavidades eletronegativas,
formandoumgeltermoestvelresistente.Outroaspectopositivodousodoalginatosua
capacidadedeservircomobloqueadordasterminaesnervosasenoseaderiraoleitoda
leso, reduzindo possveis traumas na troca do curativo (DONG; WANG; DU, 2006; PAUL;
SHARMA,2004;RODRIGUES,2004;WANGetal.,2002).
Aquitosanaeoalginatosopolieletrlitosdecargasopostas,sendoqueaquitosana
pode apresentar carga lquida positiva e o alginato, carga lquida negativa quando em
soluo.Ocomplexopolieletroltico(PEC)dequitosanaalginatopossuimenortendnciaao
intumescimentoemrelaoaoalginatoemaiorresistnciasolubilizaoembaixosvalores
depH,quandocomparadoquitosana(HEINetal.,2008;;LIetal.,2009;RODRIGUES,2008;
STHERetal.,2008).
O comportamento do PEC de quitosanaalginato varia de acordo com o pH. Em pH
muitoalto,ainteraoentreoalginatoeaquitosanadesfavorecida,assimcomoempH
muitobaixovistoque,nestascondies,ocorreprepondernciadeionizaodoalginatoe
da quitosana isolados, respectivamente. Para promover a formao de um PEC estvel,
Crdenas et al. (2003) propem o ajuste do pH para 5,28, em um valor intermedirio aos
valoresdepKadaquitosana(6,3a7,0)(KARAKEILIetal.,2007)edoalginato(3,38paraos
gruposMe3,65paraosgruposG)(LIetal.,2009;STHERetal.,2008),garantindoquea
quitosanaestejapotencialmenteprotonadaeoalginato,desprotonado.
Aassociaodestespolmerosoriginacomplexospolieletrolticos(PECs)ligadospor
foras eletrostticas, pontes de hidrognio, foras de van der Waals e interaes
hidrofbicas. Essas associaes podem afetar as propriedades dos polmeros interligados,
taiscomoacondutividadeeltrica,permeabilidade,solubilidade,caractersticasmecnicas,
dentreoutras(LEEetal.,1999).
O complexo formado entre a quitosana e o alginato insolvel em gua e
consideradomaisefetivonocontroledaliberaodemateriaisincorporadosaele,quando
comparadoaospolmerosisolados.(YANG;KHOR;LIM,2000).Aassociaodoscompostos
levaaformaodeumhidrogel,queemcomparaocomospolmerosisolados,melhoraa

Introduo|37

fora estrutural e estabilidade mecnica, alm do promissor uso na engenharia tecidual

como scaffolds associados a clulas, fatores de crescimento e na liberao controlada de
frmacos(AZEVEDOetal.,2007;GEORGE;ABRAHAM,2006;LIetal.,2009;LIMetal.,2008).
A etapa de polimerizao ocorre devido natureza catinica da quitosana em
soluo, que permite a produo de complexos inicos com espcies aninicas, como o
alginato, sendo a rede polimrica caracterizada como um micro ambiente hidroflico com
alta quantidade de gua e alta densidade de cargas eltricas (ANAL; STEVENS, 2005;
GEORGE;ABRAHAM,2006;PAUL;SHARMA,2004).
Vrios trabalhos que utilizaram o complexo quitosanaalginato mostraram in vivo e
principalmenteinvitroaspropriedadesdebiodegradao,biocompatibilidade,ausnciade
imunogenicidade, adeso, crescimento e diferenciao celular com vrios tipos celulares
(LEUNGetal.,2010;LIetal.,2005;LI;ZHANG,2005;WANGetal.,2002).
Assim, o PEC de quitosanaalginato pode ser empregado para a confeco de
biomembranas com a finalidade de aplicao na terapia de leses, mostrandose flexveis,
finas, transparentes e to eficientes quanto os curativos convencionais (PAUL; SHARMA,
2004).biocompatvel,estveleapresentadegradaorelativamentelentanoorganismo.
Este complexo pode ser processado de diversas formas, existindo uma tendncia de
confeco de membranas (ou biofilmes) com diferentes quantidades de camadas, para
aplicao no tratamento de leses de pele de difcil cicatrizao, as quais apresentam um
grandedesafiodaatualidade(BUENO,2010;LIetal.,2009).
Pacientes com lceras crnicas necessitam de um longo tempo de tratamento,
resultandoemaltocustocomcuidadosmdicos.Umdosprincipaisdesafiosabuscapor
novassubstnciasteraputicas,visandoaneoformaotecidual,bemcomooentendimento
dosprocessoscelularesefisiolgicosenvolvidos,pormeiodautilizaodemedicamentosde
aotpicaousistmica(FONDERetal.,2008;SEHNetal.,2009).
Diante disso, a pesquisa por compostos naturais notxicos com propriedades
estimuladorasdareparaotecidualganhouimportncianosltimosanos,principalmente
em recursos para confeco de produtos cicatrizantes feitos a partir de matriaprima de
baixocusto,quepermitaumacessorpidoefcilpopulao(MANDELBAUM;DISANTIS;
MANDELBAUM,2003;SEHNetal.,2009).
A quitosana e o alginato, polissacardeos com grande disponibilidade comercial,
renovveis com propriedades intrnsecas de biocompatibilidade, biodegradabilidade e

Introduo|38

cicatrizantestornamsemateriaisideaisparaestudoseconfecodecurativosadequadoss
fasesdacicatrizao(KUCHARSKAetal.,2008;REDDYetal.,2008;RINAUDO,2008).
Desta forma, buscouse avaliar a eficcia e os possveis mecanismos de ao da
biomembranadequitosanaalginatonacicatrizaodelcerascutneasemratosWistar.

2 Objetivos .

Objetivos|40

2.1

Geral

Avaliar a eficcia da biomembrana de quitosanaalginato na cicatrizao de lceras

cutneasemratosWistar.

2.2

Especficos

Avaliar as alteraes histolgicas quanto ao infiltrado inflamatrio, vasos

sanguneosefibroplasiaemcorteshistolgicosdaslcerastradadascomBQAcoradoscom
hematoxilinaeeosina(HE);
Avaliaroinfiltradoneutroflicopormeiodadosagemdemieloperoxidase(MPO);
AvaliaracolagneseemcorteshistolgicoscoradoscomtricrmiodeGomori(TG);
Avaliaracolagnesepormeiodadosagemdehidroxiprolina(OHP)padronizao
domtodo;
Avaliar a reepitelizao por meio do clculo do ndice de cicatrizao das lceras
(ICU)emratostratadoscomabiomembranadequitosanaalginato.

3 Material e Mtodos

Material

e Mtodos|42

Osprotocolosenvolvendoousodeanimaisemexperimentaoforamrealizadosde
acordocomosPrincpiosticosnaExperimentaoAnimaladotadopeloColgioBrasileiro
de Experimentao Animal (COBEA). O projeto foi aprovado pela Comisso de tica em
ExperimentaoAnimal(CETEA),daFaculdadedeMedicinadeRibeiroPreto,Universidade
deSoPaulo(FMRPUSP),sobonmerodeprocesso085/2011(AnexoA).
Todo o estudo teve colaborao e orientao do Prof. Dr. Marco Andrey Cipriani
Frade do Departamento de Clnica Mdica, Diviso de Dermatologia da Faculdade de
Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo e do seu psdoutorando Thiago
AntnioMorettideAndrade.

3.1

Animais

Todos os animais envolvidos no projeto foram recebidos cinco dias antes do incio

dos experimentos para aclimatao, mantidos em gaiolas coletivas at o dia do

experimento.
Foram utilizados 65 ratos Wistar machos, com peso entre 180 e 220 g, obtidos do
BiotrioCentraldaFaculdadedeMedicinadeRibeiroPreto.Osanimaisforammantidosem
condiesdeisolamentodurantetodoexperimentoemgaiolasindividualizadas,comguae
rao ad libitum e ciclos alternados de luminosidade a cada 12 horas no Biotrio do
DepartamentodeClnicaMdicanoAnexoAdaFMRPUSP.

3.2

Confecodabiomembranadequitosanaalginato

EsteprocessoteveacolaboraodaProfa.Dra.ngelaMariaMoraesdaFaculdade
de Engenharia Qumica, Laboratrio de Desenvolvimento de Processos Biotecnolgicos da
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), onde foram produzidos os biomateriais
(BUENO,2010),gentilmentecedidosparaostestesinvivo.
Toda a preparao das biomembranas de quitosanaalginato foi baseada na
metodologia proposta por Yang, Khor e Lim (2000) e adaptada por Wang et al. (2002),
fundamentada na formao de coacervados. Todo o procedimento foi descrito
detalhadamente por Rodrigues (2008), contendo algumas modificaes feitas por Bueno

Material

e Mtodos|43

(2010)paraquehouvesseumaumentonaescaladoprocesso,almdefacilitaraproduo.
EstapreparaodobiomaterialfoifeitapeladoutorandaMScCeciliaZorziBueno.
Umvolumede180mLdeumasoluoalginato0,5%emguaMilliQfoicolocadoem
umreatordeaoinoxidvelencamisadocomdimetrointernode10cmealturade20cm.
Essesistemaconectadoaumbanhotermostticoparamantertodooprocessoconstante
a 25 C. Foram misturados 90 mL de acetona PA a 90 mL de soluo de quitosana 1% em
cido actico 2% (1:1) em vidro com tampa e agitados at que a mistura tenha ficado
totalmentehomognea.EssamisturafoicolocadaemumaseringadevidroBD50,acoplada
a uma bomba de infuso ST 670 T, para ser adicionada lentamente, em forma de
gotejamento, soluo de alginato 0,5% dentro do reator, a uma vazo de 160 mL/h,
enquantooreatormantidoaumaagitaode500rpm.
Aps o trmino do gotejamento da soluo polimrica de quitosana, a agitao foi
aumentadapara1000rpmdurante10minutos.Foiadicionado16,8mLdeNaOH1M,com
auxlio de uma pipeta graduada por toda a regio do reator e por mais 10 minutos foi
mantidoosistemaa1.000rpmparaqueopHsejaajustadoa5,28.Essafasedeextrema
importncia, j que neste pH a quitosana apresentase protonada e o alginato,
desprotonado.Paraconcluiraetapadereaodosreagentesjuntosoluopolimrica,3,6
ml de CaCl2 a 2% foi adicionado lentamente nas bordas do reator, com auxlio de
micropipeta,mantendoaagitaopormais10minutosparaqueocorraacomplexaodas
carboxilasremanescentescomosonsCa2+.
Aotrminodosltimos10minutos,aassociaopolimricaformadafoicolocadaem
umKitassatoedesaeradacomauxliodeumabombadevcuoporcercade90minutos.Em
seguida,amisturafoidivididaigualmenteem2placasdepoliestirenocircularde15cmde
dimetroelevadaaestufapor20horasa37Cemumpratogiratrio.
Apsisso,asmembranasforamcolocadasem150mLdeCaCl2gelado,a2%,por1
hora,paraumareticulaodascadeiasdealginatoqueaindaestiveremlivres.Paralavaras
membranasdobanhocomCaCl2,foramfeitas2imersesconsecutivasem200mLdegua
deionizadapor1horacadaimersoecadabiomembranaformada.Paraasecagemfinal,as
membranas foram deixadas em temperatura ambiente durante 24 horas, prensando as
bordas das membranas para evitar o encolhimento. Depois de secas, as bordas do
biomaterial foram cortadas para que fossem obtidas biomembranas circulares, lisas e
esticadas(Figura1).

Material

e Mtodos|44

Figura1Produodasbiomembranasdequitosanaalginato

(A)Sistemautilizadonapreparaodamisturapolimricaformadoradasbiomembranas.
(B)Biomembranadequitosanaalginatoutilizadacomotratamentodaslcerascutneas.
Fonte:Bueno(2010)

3.3

Padronizaodosgrupos

Adistinodosgruposfoiconformeotratamentoutilizadoemambasaslcerasde
cadaanimal:
BQA: 25 animais cujas lceras foram tratadas com a biomembrana de quitosana
alginato(BQA)previamentehidratadasemsorofisiolgico0,9%eacompanhadaspor2,7,
10,14e21dias(n=5animaisportempodetratamento);
SF:25animaiscujaslcerasforamtratadassomentecomsorofisiolgico0,9%(SF)e
acompanhadaspor2,7,10,14e21dias(n=5animaisportempodetratamento);
GZ: 15 animais cujas lceras foram somente recobertas com gaze e esparadrapo e
acompanhadaspor7,10e14dias(n=5animaisportempodetratamento).

Material

3.4

e Mtodos|45

Procedimentocirrgico:lcerascutneasdorsais

Os ratos foram pesados, anestesiados por via intraperitoneal com hidrato de cloral

4% na dose de 1.0 mL/100g de peso do animal. Posteriormente, os animais foram

tricotomizados, posicionados na mesa operatria em decbito ventral e aps assepsia do
dorsocomlcool70%,duasexcisescirrgicascircularesforamfeitascompunch1,5cmde
dimetrocomoanimalemdecbitolateral,atingindoaregiodermoepidrmica(Figura2).
A pele excisada para confeco das lceras nos animais foi acondicionada em cassete
histolgica e eppendorf para posteriores estudos histolgicos e bioqumicos
respectivamente,representandoamostrasdodiainicial(dia0,controlesemtratamento).

Figura2Confecodeduaslcerascutneasnodorsodecadaanimal

(A)Tricotomiadodorsodos.(B)Animalemdecbitoventralapsassepsiaparadeterminaodo
localparaconfecodaslceras.(C)Animalemdecbitolateralparaconfecodeduaslcerasna
regiodorsaldoratocompunchde1,5cmdedimetro.(D)lcerasconfeccionadaseamostrasdo
tecidocutneoexcisadosaseracondicionados.
Fonte:Caetano(2012)

Asbiomembranasdequitosanaalginato,previamentehidratadasemsorofisiolgico,
foram colocadas em ambas as lceras de cada animal do grupo BQA e somente retiradas
aps a eutansia. Aps a aplicao dos respectivos tratamentos, as lceras de todos os
animais receberam curativo oclusivo com gaze e esparadrapo. Os animais de ambos os
grupostiveramocurativooclusivotrocadosdiariamente,seguidosdehidrataodalcera
(grupo SF) e da biomembrana (BQA) at o 7o dia de seguimento (Figura 3). As lceras dos
animaisdogrupoGZnoforamhidratadaseoscurativosforamretiradossomentenodiada
aquisiodasimagens(dias7,10e14).
Apsacirurgia,foiaplicadoporviaintraperitonealdosenicadeDIPIRONA50mg/Kg
de peso diluda em salina. Aps receberem o tratamento, os animais foram colocados em
gaiolasindividualizadas,ondepermaneceramatodiadosacrifcio.

Material

e Mtodos|46

Figura3Curativooclusivofeitoemcadaanimalapsreceberemosrespectivos
tratamentos

(A)AmbasaslcerasdosanimaisdogrupoBQAreceberamabiomembranadequitosanaalginato
previamentehidratadascomsorofisiolgico0,9%.(B)Curativooclusivocomgazeeesparadrapo
feitoemtodososanimais.
Fonte:Caetano(2012)

3.5

Coletadomaterialparaestudo

Forameutanasiados5animaisporgrupoetempodeseguimento(n=10lceras),nos
dias 2, 7, 10, 14 e 21 com dose excessiva de anestsico (hidrato de cloral 4%). Ambas as
lceras de cada animal foram fotografadas separadamente pela cmera digital Sony DSC
W320,modobsico(semflash,semzoom,resoluode2MegaPixels).
Naaquisiodasimagens,foiutilizadoumaparatodemetalondeacmerafoifixada
numabasedealumniodistando30cmdeumarguaperpendicularlcera.Estarguafoi
utilizadaparaapadronizaodaunidadedereadasleses,emcentmetros(Figura4).

Figura4Suporteutilizadoparaaquisiodasimagens

(A) Suporte utilizado para padronizao da fotografia das lceras e tambm para aferio das
mesmas utilizando o clculo da rea das leses (em mm2). (B) Fotografia padronizada da lcera
esquerdadeumanimalutilizandoosuporte.
Fonte:Caetano(2012)

Material

e Mtodos|47

Em seguida, foram coletadas amostras das lceras/cicatrizes para estudos

histolgicos(n=5amostrasportempoeportratamento)dosanimaisdogrupoBQAeSFnos
dias2,7,14e21.Apeledorsalaoredordaslcerasfoirecortadaecomoauxliodopunch
histolgico de 1,5 cm de dimetro foi feita uma biopsia cilndrica da regio de cada
lcera/cicatrizdecadaanimal(Figura5).
Como demonstrado na figura 2D, uma das amostras de cada animal foi
acondicionadaemcasseteshistolgicas,fixadaemsoluodeformaldedo3,7%(v/v)efoi
seguido processamento habitual para estudo histolgico. A outra amostra foi colocada em
eppendorf e imediatamente congelada a 80C para posterior realizao de ensaios
bioqumicosparadosagemdehidroxiprolina(OHP)emieloperoxidase(MPO).

Figura5Bipsiadalcera/cicatrizdecadaanimalparaanlise

3.6

(A)Regiodorsalcontendoambasaslcerascutneas.(B)Fragmentodorsalrecortadocontendo
ambasaslceras.(C)Excisocirculardalcera/cicatrizaserfeitocompunchhistolgicode1,5cm
dedimetronosdias2,7,14e21nosgruposBQAeSFparaestudoshistolgicosebioqumicos.
Fonte:Caetano(2012)

AvaliaodondicedecicatrizaodaslceraspeloImageJ

Apartirdasfotografias,asreasdaslcerasforamcalculadaspelosoftwareImageJ
1.46 e em seguida foi calculado o ndice de cicatrizao das lceras (ICU) para anlise da
reepitelizao, cujo valor equivalente ao quociente entre a diferena das reas Inicial e
Final e a rea Inicial [ICU=(AiAf)/Ai]. Valores de ICU maiores que zero representam
diminuio da rea ulcerada, valores menores que zero representam aumento da rea e
valoresiguaisa1,0representamreepitelizaocompleta(CAETANOetal.,2009;MINATELet

Material

e Mtodos|48

al.,2009;ROBSONetal.,2000).Areainicialcorrespondeaodiadoprocedimentocirrgico
(dia0)eareafinalcorrespondeaodiadaeutansia(dias2,7,10,14ou21).

Formula(1)

(reainicialreafinal)
ICU=

reainicial

Estudohistolgico(histomorfometria)

3.7

As biopsias acondicionadas em cassetes histolgicas foram fixadas em soluo

tamponada de formaldedo 3,7% (v/v) (pH 7,4) durante 24 horas e posteriormente
processados em padro habitual para o estudo histolgico. Aps o processamento, os
fragmentos foram includos em parafina a 60C e os blocos foram seccionados em cortes
histolgicosde3,0meentocoradoscomhematoxilinaeeosinasimultaneamenteecomo
mesmo tempo para avaliao do infiltrado inflamatrio, nmero de fibroblastos e vasos
sanguneosnasamostrascoletadasdecadaanimalnosdiferentestemposetratamentos.As
lminas histolgicas para anlise da colagnese foram feitas do mesmo modo, porm
coradascomtricrmiodeGomori.

3.7.1 Avaliaoquantitativaporimagemquantoaoinfiltradoinflamatrio,angiognesee
fibroplasia

Asseceshistolgicascoradascomhematoxilinaeeosinadecadaanimaldogrupo
BQA e SF nos diferentes dias de seguimento (n=5 fragmentos por grupo e tempo) foram
visualizadasnomicroscpiopticoLEICADM4000BcomcmeraLEICADFC280utilizando
osoftwareLASLeicaApplicationSuiteparacapturadasimagens.

Material

e Mtodos|49

Para a quantificao do infiltrado inflamatrio e fibroplasia foram adquiridos 8

camposporlminasobaumentode400x,sendo4camposdeepidermeedermesuperiore
4 campos de derme inferior e hipoderme. Antes do processo de captura das imagens
propriamente dito, todas as imagens foram digitalizadas padronizandose a objetiva, a
intensidade da luz do microscpio e a altura do condensador (ANDRADE et al., 2011;
GONALVESetal.,2003).
Para a anlise quantitativa da angiognese foram capturadas imagens em srie no
sentido epidermedermehipoderme, em aumento de 100x para todos os cortes
histolgicos. Em seguida, essas imagens foram montadas em srie pelo Adobe Photoshop
CS5, de modo que a quantificao de vasos sanguneos fosse realizada por meio de uma
imagemquecorrespondiaatodaextensodotecidocutneo(epidermedermehipoderme).
Foi utilizado o Plugin Cell Counter do software ImageJ 1.46 para contagem de
clulas do infiltrado inflamatrio, fibroblastos e vasos sanguneos. A diferenciao de cada
clulafoifeitapeloobservadornaimagemdalmina.Osoftwarerealizaacontagemacada
cliquedoobservadorsobrecadaclula,sendoapresentadaacontagemtotalaofinaldecada
anlise.
Esse protocolo foi aplicado em 5 amostras diferentes (n=5) de cada tempo e
tratamento, sendo o resultado final a mdia do nmero de infiltrado inflamatrio,
fibroblastos e vasos sanguneos quantificados. A mdia final encontrada representa a
quantidadedestasclulasencontradasemcadaumadas5amostrasestudadas.

3.7.2Avaliaoquantitativaporimagemquantocolagnese

Para a quantificao histolgica da colagnese, foram capturados 6 campos em

aumento de 100x de cada lmina corada com tricrmio de Gomori, sendo 3 campos de
epidermeedermesuperiore3camposdedermeinferiorehipoderme.
Foi utilizado o Plugin Colour Deconvolution do software ImageJ 1.46 para
quantificaodaporcentagemdacorazul(colgeno)nareatotaldaimagem.EstePlugin
reconhece as cores da imagem e as decompe em trs cores: azul (colgeno), vermelho e
roxo. Em seguida, por meio da opo Threshold, toda rea da imagem a ser quantificada
(tomazul)foimarcadaemvermelhoepadronizouseasbarrasdetonsdeazulem0(tom

Material

e Mtodos|50

mximo)e115(tommnimo)paraquantificaraporcentagemdeazuldesejadaeigualpara
todasasimagensnareatotaldaimagem.
Esse protocolo foi tambm aplicado em 5 amostras diferentes (n=5) de cada
tratamentoedecadatempo,sendooresultadofinalamdiadapercentagemdereade
colgeno.Amdiafinalencontradarepresentouaquantidadedecolgenoemcadaumanas
5amostrasestudadas.

3.8

Dosagemdaenzimamieloperoxidase(MPO)

Adensidadedoinfiltradoneutrofliconalesodosanimaisfoiaferidapeladosagem
damieloperoxidase,enzimapredominanteemgrandequantidadenosneutrfilos(SOUZAet
al.,2001).Paratanto,asbipsias(n=5portempoeportratamento)dosanimaisdogrupo
BQAeSFforamacondicionadasemeppendorfsde2mLepermaneceramemfreezer80C
atodiadadosagem,comopreviamentedescrito.Retiradosdofreezeremantidosemgelo,
osfragmentosforampesadosembalanaanaltica.Colocouse300Ldetampo1(NaPO4
0,02M + NaCl 0,1M + Na2EDTA 0,015M, pH 4,7) nas amostras para serem totalmente
trituradas e homogeneizadas em POLYTRON PT 3100 a 13000 rpm. Aps este
procedimento, as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 3.000 rpm e o
sobrenadantedescartado.Opelletdecadaamostrafoiressuspendidoem1mLdesoluo
deliseNaCl2%,homogeneizadonovortexpor30segundosseguidodenovacentrifugao
por 15 minutos a 3.000 rpm. Descartado o sobrenadante, o pellet foi ressuspendido em
tampo 2 (NaPO4 contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamnio) e centrifugado
por20minutosa15.000rpm,obtendoumsobrenadantefinal.Emseguida,umvolumefinal
de50L(45LdeNaPO4+5Ldosobrenadantedasamostrasapsaltimacentrifugao)
foramcolocadasemumamicroplacade96poosparaoensaio.Foifeitaumacurvapadro
de neutrfilos obtidos da cavidade peritoneal 6 horas aps camundongos serem injetados
com carragenina. Em cada poo da placa foram adicionados 25 L de TMB (3, 3, 5, 5
tetramethylbenzidine)eemseguida100LdeH2O2.Amicroplacafoimantidaemestufaa
37C por 5 minutos. A seguir, a reao foi interrompida com cido sulfrico 4M e lida em
leitor de placas a 450 nm. Os resultados foram expressos em nmero de neutrfilos x
103/mgdetecido.

Material

3.9

e Mtodos|51

Dosagemdehidroxiprolina(OHP)

A anlise quantitativa da colagnese por mtodo bioqumico foi realizada por meio
dadosagemdehidroxiprolinanasbipsiascoletadasdosratos,mantidasemfreezer80C,
como previamente descrito, seguindo a metodologia proposta por Reddy e Enwemeka
(1996)eReddyetal.(2008)comalgumasmodificaes.
Paraarealizaodasdosagensdehidroxiprolina,asbipsiasforamdescongeladase
incubadas em estufa com circulao de ar temperaturade 60C em microtubos abertos,
overnight(15horasporamostra).Apsaincubao,asamostrasforampesadasembalana
analticaataobtenodepesoconstanteeentoforamtransferidasparatubosdeensaio
devidrocomtampa.
Volumesdecidoclordrico(HCl)6Nforamadicionados,utilizandoseaproporode
100 L de HCl por 1,0 mg de tecido seco. As amostras foram homogeneizadas, por 10
segundos,comohomogeneizadordetecidosPolytroneentosubmetidashidrlisecida,
queconsistiunaincubaodasamostrasemHCla130Cdurante4horas.
Aps o perodo de hidrlise e com as amostras temperatura ambiente, foram
transferidos500LdecadaamostraparaumtubodeensaiodevidroparaajustaropHpara
7,0 com hidrxido de sdio (NaOH) 2M. A partir deste hidrolisado, com pH neutro, foram
pipetados 10 L de cada amostra para uma microplaca de 96 poos. Foram preparadas
soluespadrodehidroxiprolinanasconcentraesde1,0;2,0;4,0;6,0;8,0;10;20;40;60;
80 e 100 g/mL, usandose o tampo citratoacetato pH 6,5 como veculo. Aps pipetar a
curva e as amostras na microplaca, foram adicionados 90 L de soluo de cloramina T
0,056M a cada poo e a microplaca foi incubada temperatura ambiente durante 25
minutos.Aofinaldaincubao,asamostrasoxidadasemcadapooforamentosubmetidas
adiode100LdoreagentedeEhrlichparaaformaodocromforo.Amicroplacafoi
novamenteincubadaa60Cdurante20minutos.
Aps a incubao, a microplaca foi homogeneizadas em um homogeneizador para
microplacasa20rpmdurante10minutos.Aleituradaabsorbnciafoirealizadaa550nm,a
uma temperatura ambiente. As leituras foram realizadas em perodos no superiores a 30
minutosapsofinaldaincubao.Otestefoirealizadoemduplicatatantoparaasamostras
quantoparaassoluespadrodehidroxiprolina.

Material

e Mtodos|52

Os valores das absorbncias foram plotados, determinandose a equao da reta e

comparando as absorbncias das concentraes conhecidas da curva padro de
hidroxiprolina com as absorbncias das amostras, determinandose as concentraes de
hidroxiprolina nas amostras, primeiramente por volume de HCl usado e finalmente por
miligramadetecidoseco.

3.10 Anlisedosresultados

ParaanlisedetodasasvariveisfoiutilizadootestetStudent(comparao2a2)
paracomparaoentreosgruposBQA,SFeGZemtodososdiasdeseguimento.
FoiutilizadoosoftwareGraphPadPrism5.0pararealizaodosgrficosedostestes
estatsticos.Osvaloresdep<0,05mostramevidnciasestatsticasdequehdiferenaentre
osdadosemquesto,comintervalodeconfianade95%.

4 Resultados .

Resultados|54

4.1

Processoinflamatrio

4.1.1Avaliaodoinfiltradoinflamatriototal

Comafinalidadedeavaliarqualitativamenteoprocessoinflamatrionaslcerasde
ambos os grupos experimentais, empregouse a colorao com hematoxilina e eosina. A
anlisehistolgicaqualitativadaslceras/cicatrizesevidenciounogrupoBQA,no2diade
seguimento,umdensoinfiltradoinflamatriocompostopredominantementedeneutrfilos
em todo corte histolgico, at mesmo em camadas mais inferiores. No 7 dia, ambos os
grupos apresentaram quantidades semelhantes de clulas inflamatrias (principalmente
macrfagos) associadas ao grande influxo de fibroblastos. A partir do 14 dia, ambos os
gruposapresentaramreduodoinfiltradoinflamatrio(Figura6).
A anlise quantitativa do infiltrado inflamatrio nas seces histolgicas,
empregandoseahistomorfometriamostrou,no2diadeseguimento,diferenaestatstica
quanto ao nmero de clulas inflamatrias entre os grupos, com maior celularidade no
grupoBQAemrelaoaoSF(p=0,0134).No7dia,ogrupoBQAapresentouumaimportante
reduodeclulasinflamatriasemrelaoao2dia(p=0,0038),enquantoquenogrupoSF
no foi observada reduo, mantendose com a mesma celularidade. No 14 dia houve
semelhana entre os grupos e reduo do infiltrado inflamatrio em relao ao 7 dia
(p<0,05)eassimpermaneceramatoltimodiadeseguimento(Figura7).

Resultados|55

Figura6Fotomicrografiadareaulceradadeambososgruposaolongodoseguimento

Destacaseoinfiltradoinflamatrio,vasossanguneosefibroblastosnosgrupostratadoscoma
biomembrana de quitosanaalginato hidratadas com soro fisiolgico (BQA) e somente com soro
fisiolgico(SF),por2,7,14e21dias.Coloraocomhematoxilinaeeosina.
Fonte:Caetano(2012)

Figura7Infiltradoinflamatriototalnaslcerascutneasdeambososgruposaolongodo
seguimento

p=0,0038

s
a
i
r

t
a
m
a
l
f
n
i
.
s
l

c
o
n
a
i
d

260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

p=0,0134
p=0,0347
p=0,0011

controle

dia 0

BQA

dia 2

SF

BQA

dia 7

SF

BQA

dia 14

SF

BQA

SF

dia 21

Quantificao das clulas inflamatrias totais (por histomorfometria) nas lceras cutneas
tratadas com biomembrana de quitosanaalginato hidratadas com soro fisiolgico (BQA) e
somentesorofisiolgico(SF),por2,7,14e21dias.
Fonte:Caetano(2012)

Resultados|56

4.1.2Dosagemdemieloperoxidase(MPO)

Comafinalidadedeavaliarbioquimicamenteaparticipaoneutroflicanoprocesso
inflamatrio, empregouse o mtodo de dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) nos
diferentesdiasdetratamentoentreosgrupos.Comoseverifica,nafigura8,no2diaambos
osgruposapresentaramaltasquantidadesdaenzimamieloperoxidase(p>0,05).No7dia,o
grupoBQAapresentouumareduoimportantedoinfiltradoneutroflicoemrelaoaoseu
2dia(p=0,0326)eumadosagemestatisticamenteinferioraogrupoSF(p=0,0043).No14e
21 dia, ambos os grupos apresentaramse semelhantes e com quantidades reduzidas de
MPOemrelaoaosdiasanteriores.

Neutrfilos x 10 3 /mg de tecido

Figura8Dosagemdamieloperoxidasenaslcerascutneasdeambososgruposaolongo
doseguimento

p=0,0043

6
p=0,0326

5
4
3
2
1
0

controle

dia 0

BQA

dia 2

SF

BQA

dia 7

SF

BQA

dia 14

SF

BQA

SF

dia 21

Quantificao da enzima mieloperoxidase (por dosagem bioqumica) nas lceras cutneas

tratadas com biomembrana de quitosanaalginato hidratadas com soro fisiolgico (BQA) e
somentecomsorofisiolgico(SF),por2,7,14e21dias.
Fonte:Caetano(2012)

Resultados|57

4.2

Avaliaodaangiognese
Pela anlise histolgica qualitativa das lceras/cicatrizes, podese observar

quantidade pronunciada de vasos sanguneos a partir do 7 dia em ambos os grupos

principalmentenotecidoemformaoprximoaoleitodalcera,caracterizandootecido
degranulao(Figura6).
Naanlisehistolgicaquantitativadaangiognese,foramfeitascontagensdevasos
sanguneos em seces histolgicas coradas com hematoxilina e eosina. No houve
diferenaestatsticaentreosgruposBQAeSFemtodoperododeseguimento.Noentanto,
observouse aumento importante da quantidade de vasos no 7 dia em ambos os grupos
(p<0,05),conformeapresentadonafigura9.

Figura9Angiognesenaslcerascutneasdeambososgruposaolongodoseguimento

p=0,0079

s
o
e
n

u
g
n
a
s
s
o
s
a
v
o
n
a
i
d

120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

p=0,0004

controle

dia 0

BQA

SF

dia 2

BQA

dia 7

SF

BQA

dia 14

SF

BQA

SF

dia 21

Quantificao dos vasos sanguneos (por histomorfometria) nas lceras cutneas tratadas com
biomembrana de quitosanaalginato hidratadas com soro fisiolgico (BQA) e somente soro
fisiolgico(SF),por2,7,14e21dias.
Fonte:Caetano(2012)

Resultados|58

4.3

Avaliaodafibroplasia

Pelaanlisehistolgicaqualitativa(coloraoHE)daslceras/cicatrizes,observouse
importanteestmulofibroplasiano7,14e21diasemambososgruposcomaltograude
diferenciao. No 21 dia, os fibroblastos, principalmente no grupo BQA, apresentaramse
mais organizados no novo tecido formado, dispostos paralelamente lcera, diferente do
grupoSF(Figura6).
Emrelaoanlisequantitativadafibroplasia,no2diadeseguimentoambos os
gruposapresentaramquantidadesreduzidasesemelhantesdefibroblasto.Apartirdo7dia,
ambos os grupos apresentaram importante proliferao de fibroblastos em relao ao 2
dia,demodoqueogrupoBQAapresentoumaioresquantidadesemrelaoaogrupoSFno
7(p=0,0275)e14dia(p=0,0086).No21dia,ogrupoBQAapresentoureduosignificativa
de fibroblastos em relao ao 14 (p=0,0319), enquanto o grupo SF permaneceu com
quantidadessemelhantesemtodoperodoapartirdo7dia(Figura10).

Figura10Fibroplasianaslcerascutneasdeambososgruposaolongodoseguimento

p=0,0319

s
o
t
s
a
l
b
o
r
b
i
f
o
n
a
i
d

200
180
160
140
120
100
80
50
40
30
20
10
0

p=0,0086

p=0,0275

controle

dia 0

BQA

SF

dia 2

BQA

SF

dia 7

BQA

dia 14

SF

BQA

SF

dia 21

Quantificao dos fibroblastos (por histomorfometria) das lceras cutneas tratadas com
biomembrana de quitosanaalginato hidratadas com soro fisiolgico (BQA) e somente soro
fisiolgico(SF),por2,7,14e21dias.
Fonte:Caetano(2012)

Resultados|59

4.4

Avaliaodacolagnese

4.4.1Avaliaohistolgicaporanlisedeimagem

Pela anlise histolgica qualitativa por meio da colorao de tricrmio de Gomori,

podese observar que no 2 dia ambos os grupos apresentaram pequena quantidade de
colgeno.Apartirdo7diadeseguimento,ambososgruposobtiveramvisvelcolagnese,
sendo maisevidenteapresena de fibras mais densas, organizadas e compactas no grupo
BQAemrelaoaogrupoSF(Figura11).
A quantificao da formao de colgeno, determinada pela porcentagem da rea
totalemazulnasseceshistolgicascoradascomtricrmiodeGomori,mostrouqueno2
dia ambos os grupos apresentaramse semelhantes e com baixa produo de colgeno. A
partir do 7 dia, foi observado grande quantidade de colgeno em ambos os grupos em
relao ao 2 dia, semelhantes entre si at o 14 dia. No 21 dia, foi observada maior
porcentagemdecolgenonogrupoBQAcomdiferenaestatsticaemrelaoaogrupoSF
(p=0,0219),conformeapresentadonafigura12.

Resultados|60

Figura11Fotomicrografiadareaulceradadeambososgruposaolongodoseguimento

Destacase a produo colagnica (colorao azul) nos grupos tratados com biomembrana de
quitosanaalginatohidratadascomsorofisiolgico(BQA)esomentecomsorofisiolgico(SF),por
2,7,14e21dias.ColoraocomtricrmiodeGomori.
Fonte:Caetano(2012)

Figura12Colagnesenaslcerascutneasdeambososgruposaolongodoseguimento

100

o
n
e
g

l
o
c
e
d
a
e
r

e
d
%

90
p=0,0219

80
70
60
50
40
30
20
10
0
Controle

dia 0

BQA

dia 2

SF

BQA

dia 7

SF

BQA

SF

dia 14

BQA

SF

dia 21

Quantificao do colgeno (por histomorfometria) nas lceras cutneas tratadas com

biomembranadequitosanaalginatohidratadascomsorofisiolgico(BQA)esomentecomsoro
fisiolgico(SF),durante2,7,14e21dias.
Fonte:Caetano(2012)

Resultados|61

4.4.2 Dosagemdehidroxiprolina(OHP)

Apsaobtenodopesosecodecadabipsia,asmesmasforamprocessadasparaa
anlise quantitativa da colagnese por meio da dosagem de hidroxiprolina. Ao final do
experimento,realizousealeituradeabsorbnciadasmicroplacasde96poos.Apartirdos
valoresdeabsorbnciaa550nmdasamostrascorrespondentescurvapadro,procedeu
seconstruodaequaodaretaeentoaosclculosdasconcentraesdesconhecidas
dehidroxiprolinaemmicrogramaspormiligramadetecidoseco.
Podese verificar na figura 13 que houve aumento progressivo da concentrao de
hidroxiprolinaduranteoseguimentodaslcerasemtodososgruposdetratamento.Ogrupo
BQAapresentoumaiorcolagneseemrelaoaoSFno2(p=0,0042)e21dia(p=0,0249).
Noentanto,no14diaogrupoSFapresentousesuperioraoBQA(p=0,0010).

Figura13Colagnesenaslcerascutneasdeambososgruposaolongodoseguimento

12
p=0,0010

p=0,0249

10
8
6
p=0,0042

4
2

o
d
i
c
e
t
e
d
g
m
/
P
H
O
e
d
g

controle

dia 0

BQA

dia 2

SF

BQA

SF

dia 7

BQA

dia 14

SF

BQA

SF

dia 21

Quantificao do colgeno (por dosagem bioqumica) nas lceras cutneas tratadas com
biomembranadequitosanaalginatohidratadascomsorofisiolgico(BQA)esomentecomsoro
fisiolgico(SF),por2,7,14e21dias.
Fonte:Caetano(2012)

Resultados|62

4.5

Avaliaodareepitelizaodaslceras(ICU)
Paraoestudodareepitelizaofoicalculadoondicedecicatrizaodaslceras(ICU)

considerandoareadalcera(calculadapelosoftwareImageJ)noincioenoltimodiade
acompanhamento.ComparandoareepitelizaodosgruposBQAeSF,no2diaambosos
grupos apresentaram semelhante reepitelizao. No 7 dia, as lceras do grupo BQA
apresentarammaiorgraudereepitelizaoemrelaoaogrupoSF(p=0,0006).Apartirdo
14 dia, a maioria das lceras de ambos os grupos j estavam totalmente cicatrizadas,
emboraasdogrupoBQAapresentassemmaiorqualidadedecicatrizefechamentoevidente
(Figura14).

Resultados|63

Figura14Reepitelizaodaslcerascutneasdeambososgruposaolongodoseguimento

B
1.0

p=0.0006

ICU

0.5

0.0
BQA

SF

dia 2

BQA

dia 7

SF

BQA

dia 14

SF

BQA

SF

dia 21

-0.5

(A) Seguimento clnico das lceras cutneas tratadas com biomembrana de quitosanaalginato
umidecidascomsorofisiolgico(BQA)esomentecomsorofisiolgico(SF),por2,7,14e21dias
deseguimento.(B)Quantificaodareepitelizao(pelondicedecicatrizaodaslceras).
Fonte:Caetano(2012)

Resultados|64

Considerandoogrupocompostoporlcerastratadassomentecomgaze,ausentede
hidrataoesemtrocadocurativo(GZ),no7e10diasogrupoBQAeSFapresentaram
reepitelizao mais evidente em relao GZ (p<0,0001). No 14 dia, o grupo GZ ainda
encontravaseemumestadoatrasadoemrelaoaogrupoBQA(p=0,0004)eSF(p=0,0013),
comoapresentadonafigura15.

Figura15Reepitelizaodaslcerascutneasdostrsgruposexperimentaisaolongodo
seguimento

p<0.0001

1.0

p=0.0004

p<0.0001

p=0.0013

p<0.0001

p=0.0006

p<0.0001

ICU

0.5

0.0
BQA

SF

dia 7

GZ

BQA

SF

dia 10

GZ

BQA

SF

GZ

dia 14

-0.5

Quantificao da reepitelizao (pelo ndice de cicatrizao das lceras) das lceras cutneas
tratadascombiomembranadequitosanaalginatohidratadascomsorofisiolgico(BQA),soro
fisiolgico(SF)esomentecomgaze(GZ),por7,10e14dias.
Fonte:Caetano(2012)

5 Discusso .

Discusso|66

lceras cutneas constituem um importante problema de sade pblica que afeta

milhes de indivduos em todo o mundo. A situao agravase quando estas lceras no
cicatrizamnaformaetempoesperados,levandosuacronicidade.Estimasequeemtorno
de seis milhes de pessoas ao redor do planeta sofram de desordens na cicatrizao de
lceras(RANZATO;MARTINOTTI;BURLANDO,2011).
Diante disso, temse desenvolvido diversos estudos visando busca por diferentes
alternativas no tratamento de lceras cutneas. H uma srie de trabalhos que reportam
propriedades cicatrizantes de produtos naturais (de origem animal ou vegetal). Muitos
dessesprodutosnaturais,oriundosdoconhecimentopopular,aindanoforamdevidamente
pesquisados, necessitando, assim, de estudos mais abrangentes e acurados (RANZATO;
MARTINOTTI;BURLANDO,2011;SCHULTZetal.,2011).Dentreessesprodutosdestacasea
associao da quitosana com o alginato, formando polmeros utilizados em forma de uma
biomembrana.
Apesar dos vrios relatos na literatura acerca das importantes propriedades
biolgicasdaquitosanaedoalginatoutilizadosdeformaisolada,hpoucosrelatossobrea
aoconjuntadocomplexopolieletrolticodequitosanaalginatonacicatrizaocutneaem
modelosinvivo(PEIetal.,2008;WANG;KHOR;LIM,2001).
Alguns trabalhos in vitro relatam a proliferao de diferentes tipos celulares e
superior deposio de MEC estimulados por complexos de quitosanaalginato,
demonstrandoacapacidadedeutilizaodestebiomaterialparaestimulaocelular.Qiet
al. (2011) observaram, comparando com pellets convencionais encontrados no mercado,
grande proliferao de clulastronco mesenquimais com alto grau de diferenciao em
condrcitosesntesedeMECutilizandoscaffoldsdequitosanaalginato.LieZhang(2005),
por sua vez, relataram superioridade proliferao de condrcitos e intensa deposio de
colgenotipoII.
Levando em considerao a importncia do potencial de estmulo proliferao
celulareproduodeMEC,abiocompatibilidadeeacaractersticaatxica,aquitosanaeo
alginato tornaramse foco de estudos visando uma possvel utilizao nas lceras de difcil
cicatrizao, buscando adotar um melhor mtodo de emprego (cremes, gis, cpsulas,
membrana).
Os polmeros de quitosana e de alginato podem ser processados por meio de
diferentesmetodologiaspararesultarnaproduofinaldeumabiomembrana.Destemodo,

Discusso|67

existem muitos trabalhos na literatura que abordam a obteno de PECs de quitosana

alginato de diferentes formas, diferentes caractersticas, com diferente viabilidade. Muitos
so os fatores que podem alterar a eficincia do composto final formado, tais como: a
velocidade de agitao na formao, dimetro do agitador, proporo da quitosana e do
alginatoutilizados,estabilidade,controledopHduranteenofinaldoprocesso,volumese
tipos de solventes utilizados, etc (OZTURK et al., 2006; PAUL; SHARMA, 2004; RINAUDO,
2008;SAETHERetal.,2008).
Neste estudo foi utilizada, em linhas gerais, a metodologia proposta por Bueno
(2010),ondeabiomembranadequitosanaalginatofoiprontamentecedidaparaostestesin
vivo. Levando em considerao o potencial de utilizao e a necessidade de evidncias
cientficasarespeitodosefeitosdoPECdequitosanaalginatoformado,opresenteestudo
avaliou a eficcia e mecanismos de ao da biomembrana ao longo do processo de
cicatrizaodelcerascutneasemmodeloinvivo.
O denso infiltrado inflamatrio observado no estudo histolgico (HE) do grupo de
animaistratadoscomabiomembranadequitosanaalginato(BQA)no2diadeseguimento
pareceuterfavorecidoodesbridamentodalceraaopotencializarafaseinflamatria,alm
depossivelmenteestimularaproduodecitocinasefatoresdecrescimentoqueinduziriam
asfasessubsequentesdoprocessocicatricial.
Pela dosagem de MPO, enzima produzida predominantemente por neutrfilos,
indicando o infiltrado neutroflico, podese observar que ambos os grupos apresentaram
altas e semelhantes quantidades no 2 dia (fase inflamatria), indicando que o maior
infiltrado inflamatrio total do grupo BQA possivelmente seja composto por maiores
quantidades de macrfagos e/ou linfcitos, diferente do grupo SF, uma vez que a
despolimerizao da quitosana estimula o recrutamento de macrfagos funcionais para o
localdaleso,oquepoderiaestarauxiliandoalceraaestaremumestadomaisavanado
doprocessocicatricial(PAUL;SHARMA,2004).
No 7 dia houve uma reduo importante do infiltrado inflamatrio total no grupo
BQA em relao ao 2 dia, assemelhandose s quantidades celularesdo grupo SF, que se
manteve semelhante ao 2 dia, de modo que o processo inflamatrio permanecesse
constantedesdeosdiasiniciais.HouvetambmreduodaMPOnogrupoBQAdo2parao
7 dia, indicando que BQA regulou a resposta inflamatria reduzindo principalmente os
neutrfilos. Entretanto,ogrupoSF noapresentouamesmaregulao,mantendosecom

Discusso|68

alta dosagem neutroflica no mesmo perodo, demonstrando intensa participao dos

neutrfilos no 7 dia, o que possivelmente explica a inferior atividade cicatrizante deste
grupo.
Arespostainflamatriaumpassoimportantenoprocessocicatricial,umavezque
preparaoambientedalceraparaoprocessodereparo.Entretanto,estafasenodeveser
muito intensa e persistente, pois uma resposta tecidual excessiva pode retardar a
cicatrizao, alm de favorecer o distrbio no equilbrio entre sntese e degradao de
colgeno (ARAJO et al., 2010). Observouse neste presente trabalho que a fase
inflamatriafoiestimulada,pormnopersistentedeacordocomasquantidadestotaisde
clulasiniciaisedosagemneutroflicadogrupoBQAemcomparaocomSF,oqueindica
tersidoimportanteinicialmenteenoprejudicialaolongodoseguimento.
Osneutrfilossomuitoimportantesnoprocessocicatricialporseremasprimeiras
clulasaresponderimediatamenteapsaformaodocogulo.Soasprimeirasaserem
recrutadasparaalesoporseremasclulasinflamatriasdemenortamanho.Noleitoda
lceraosneutrfilos,liberamenzimasproteolticas,talcomoMPO,paraadigestoderestos
celulares e contribuem para a morte de bactrias por meio de fagocitose, produo de
superxido ou perxido de hidrognio (espcies reativas derivadas do oxignio ROS) e
xidontrico(NO).Seadescontaminaodalceraforcompleta,osneutrfilosentramem
apoptosedentrode48horas.Noentanto,seoestmuloforpersistenteafunoneutroflica
seperpetuaproduzindodiversasenzimasproteolticas,oqueestimulaoestresseoxidativo,
prejudicando o processo cicatricial (DOUGHTY; SPARKSDeFRIESE, 2012; MONACO;
LAWRENCE, 2003; STRONCEK; BELL; REICHERT, 2009; FIERRO et al., 1996; FIERRO et al.,
1999).Nestesentido,abiomembranadequitosanaalginatosedestacaporestimulariguais
quantidades de neutrfilos no 2 dia, em comparao com o grupo SF, e diminuir
drasticamenteestaquantidadeno7dia,diferentedogrupoSFqueapresentouconstante
infiltradoneutroflicodo2parao7dia,oquepossivelmentecontribuiuparaacicatrizao
atrasadaedeficiente.
Embora as quantidades de clulas inflamatrias tenham sido semelhantes ao
decorrerdoseguimentoentreosgrupos,deacordocomaanlisehistolgica,notasequeos
tiposcelularespredominantesforamdiferentes.Comoesperado,observousetambmque
amaiorquantidadedeclulasinflamatriasemambososgruposfoiato7dia,reduzindo
apsestetempoaolongodoseguimento.

Discusso|69

Diegelmannetal.(1996)fizeramimplantesubcutneodeesponjadepolivinillcool
associadaaquitosana,polmeroestimuladorcelular,emratosedemonstraramacapacidade
deregulaodoprocessocicatricialcomparadoscomimplantessemquitosana.Osautores
observaram uma reduo celular significativa nos animais tratados com quitosana no 8 e
14 dia, enquanto os animais do grupo controle apresentavam elevadas quantidades de
macrfagos, leuccitos, vasos sanguneo e produo de colgeno. Os resultados deste
presente estudo condizem parcialmente com os citados acima, uma vez que no mesmo
perodo de anlise houve maior fibroplasia nos animais tratados com quitosanaalginato,
enquanto que reduziu as clulas inflamatrias. O aparecimento dos fibroblastos no
reportados por Diegelmann et al. (1996), porm quantificados neste estudo seriam os
responsveispormaiorcolagneseobservadanoperodo.
A reduo do infiltrado inflamatrio em ambos os grupos foi acompanhada por
proliferao e migrao de grandes quantidades de fibroblastos, principalmente no grupo
BQAno7e14dia,sendoesseseventosimportantesparaasfasesdeformaoteciduale
posteriorremodelamentodonovocolgenosintetizado.
Kosakaetal.(1996)tambmutilizaramimplantedequitosanaemcesparaanlise
do estimulo celular originado pela quitosana por meio de quimiluminescncia. Relataram
que uma grande quantidade de macrfagos permaneceu por mais tempo no tecido dos
animais que receberam quitosana, sugerindo um potente papel imunoprotetor destas
clulas, modulando a migrao, atividade e subsequentes processos de fibroplasia e
reepitelizao,oquepossivelmentepoderiaestarocorrendonoprocessodecicatrizaodos
animais que receberam a biomembrana de quitosanaalginato, de acordo com o estmulo
celularobservadoemtodoprocesso,resultandonaaceleradaeeficazcicatrizaoobservada
nestepresenteestudo.
A importncia da angiognese est relacionada com a intensa necessidade de
nutrienteseoxignioparaolocalespecificamenteduranteafaseinflamatria,momentoem
queasclulasestoemaltogastoenergticodevidosintensasmitoseseativaocelular
para o desbridamento tecidual (BATES; JONES, 2003). Como esperado, o aumento da
angiognese aconteceu aps os primeiros dias, de modo que no 7 dia houve maior
quantidadeemambososgruposmesmonohavendodiferenaestatsticaentreeles.Daiet
al.(2009)relatarampormeiodemtodohistolgicomenorpresenadevasossanguneos
em animais tratados com um curativo poroso (em forma de esponja) de quitosana e

Discusso|70

alginato, observando que os animais tratados somente com gaze encontravamse em um

estadodegranulaoatrasadaecompresenapronunciadadevasossanguneos.Ambosos
trabalhos utilizaram apenas o mtodo histolgico para avaliao da angiognese, sendo
necessriooempregodeoutrosmtodosparaaveriguaroestmuloaesteevento,umavez
que a quitosana possivelmente tem a capacidade de aumentar o aparecimento de novos
vasossanguneos,pormeiodecitocinas(MUZZARELLI,2009).
Neste sentido, Dash et al. (2011) demonstraram que a quitosana tem papel
importante na liberao de fator de crescimento para fibroblasto2 (FGF2) que, alm da
fibroplasia,estimulaaangiogneseativandoclulasendoteliais.Haoetal.(2007)eSunetal.
(2010)demonstraramaumentodaangiogneseemanimaistratadoscomaplicaodeVEGF,
sendoesteumpossvelfatordecrescimentotambmestimuladopelaquitosanaemleses
de pele para o brotamento rpidos de novos vasos sanguneos. Neste presente estudo,
corroborando com Dai et al. (2009), a angiognese no foi pronunciada de acordo com o
mtodoempregadoparaanlise.Entretanto,houveestmuloeregulaoemtodasasfases
doprocessocicatricialcomnfasenoremodelamentodonovocolgenoproduzido.
Ocolgenooprincipalcomponenteestruturaldotecidodegranulao,fortalecea
MECe,finalmente,irreporamatrizprovisriadefibrina.Oaminocidoprolinaumaparte
integraldafibradecolgenoeahidroxiprolinausadacomoummarcadorbioqumicopara
o colgeno tecidual, assim como um indicativo positivo da progresso da cicatrizao
(KOKANE et al., 2009; NAYAK et al., 2011). A presena de fibras de colgeno mais
organizadas e maduras observadas no grupo BQA somada ao aumento do contedo de
hidroxiprolina, sugere a efetividade do complexo polieletroltico utilizado na proliferao
fibroblstica e sntese de MEC durante a cicatrizao, propriedades estas semelhantes s
observadasporDaietal.(2009)eArajoetal.(2010).
Acolagnese,pormeiodadosagemOHPmostrousesuperiornoincioenofinaldo
processo no grupo BQA, com predominncia de fibroblastos. Entretanto, observou uma
grandecolagneseno14diadeseguimentonogrupoSF,quandoaslcerasjencontravam
praticamente reepitelizadas. A partir do 14 dia, perodo de reduo da fibroplasia, houve
um intenso aparecimento de colgeno no grupo BQA. Estes resultados sugerem estmulos
em tempos diferentes para a produo predominante de colgeno, sendo necessrios
estudosmaisaprofundadossobreostiposdecolgenosformadosemambososgrupos,uma
vez que a qualidade parece ter sido melhor no grupo BQA. Assim, o aparecimento de um

Discusso|71

colgenomaisdensoefibrasmaisorganizadasnogrupoBQA,comoobservadonomtodo
histolgico,sugerepapelimportantedobiomaterialnoleitodalesoemtodasasfasesda
cicatrizao,corroborandocomaliteratura.
DeacordocomotrabalhodeWangetal.(2002),ocomplexodequitosanaalginato
parece facilitar o remodelamento do tecido cicatrizado, aumentando a taxa de sntese e
compactao do novo colgeno formado, bem como o aparecimento de fibroblastos
maduros,comoobservadono21diadeseguimentonogrupoBQAdestepresentetrabalho.
Alm da biomembrana de quitosanaalginato estimular a fase de proliferao e
remodelamento teciduais e a ativao da fase inflamatria, certamente atuaram
intensamente na produo de citocinas e fatores de crescimento, evidentemente
favorecendoasfasessubsequentesdacicatrizaocomotambmpropostoporImamuraet
al.(2005)eAndradeetal.(2011).NessesentidoKhanePeh(2003)sugeremqueautilizao
daquitosanaparaotratamentodelcerascutneasinfluenciabeneficamentetodasasfases
da cicatrizao. A rpida proliferao dos fibroblastos (fibroplasia) estaria envolvida com a
liberao de IL8 pelo prprio fibroblasto induzida pela quitosana. Este efeito somado a
sntesedecolgenoecontraodalceramoduladapelaquitosana,resultouemumrpido
fechamentodaleso.
H relatos na literatura a respeito do processo cicatricial ser beneficiado pela
umidade do leito da lcera. Nesse sentido, biomateriais que aumentam a humidade da
lcerafavorecemtambmporestemotivoacicatrizaomaiseficaz,comoporexemplo,a
biomembrana de ltex da seringueira Hevea brasiliensis (FRADE et al., 2011; FRADE et al.,
2012,ANDRADEetal.,2011).Diantedisso,objetivousenopresentetrabalhoadicionarum
grupo de estudo que recebeu somente o curativo com gaze e esparadrapo nas lceras
cutneas (grupo GZ) e assim permaneceu durante todo seguimento para avaliao da
reepitelizaoecompararcomosgruposdoestudo.
Wang et al. (2002) relataram a propriedade cicatrizante de uma biomembrana de
quitosanaalginatoutilizadacomotratamentodelcerasdorsaisemratos,comparandocom
ratos ulcerados sem o tratamento (somente gaze) e ratos ulcerados tratados com um
curativo convencional j utilizado comercialmente (Opsite). Todos receberam curativo
secundrioabasedegaze.Areepitelizaodaslcerastratadascomabiomembranafoide
aproximadamente 60% no 7 dia, corroborando com os resultados encontrados neste

Discusso|72

presentetrabalho,ondeapresentouumareepitelizaodeaproximadamente70%emigual
perododeanlise,equiparandosecomocurativocomercial.
AssimcomotambmobservadoporWangetal.(2002)eDaietal.(2009)emlceras
tratadas somente com gaze, a aderncia das fibras da mesma no tecido em formao
prejudicava as trocas dos curativos, resultando em danos secundrios lcera e perda de
tecido, fato que no presenciado em lceras tratadas com biomembrana ou biofilme,
isolando totalmente a lcera do curativo secundrio, no necessitando trocar
constantemente.
A umidade no leito da lcera facilita o desbridamento autoltico, ou seja, a
degradao natural do tecido desvitalizado por meio de ao enzimtica, e a mobilidade
celular.propostoqueahidrataodalceraestimuleaformaodotecidodegranulao
para posterior reepitelizao, alm de atrair fibroblastos e estimular a sntese e
remodelamentodocolgeno.Almdisso,evitaadesidrataotecidualdiminuindopossveis
traumatismosduranteatrocadiriadoscurativos(KUMARetal.,2008;NARDIetal.,2004).
A ocluso das leses com gaze e esparadrapo sem trocas dirias apresentouse
prejudicialquandocomparadoscomosgruposBQAeSF.Aausnciadeumidificaosomada
com a utilizao de um curativo no ativo que se adere com o tecido em formao
atrapalhou o processo cicatricial, observando lceras em grau atrasado quanto
reepitelizaono14dia,diferentedogrupoBQAeSF.Issoevidenciaaimportanteatividade
cicatrizante da biomembrana de quitosanaalginato hidratada com soro fisiolgico 0,9%
frenteaosdemaistratamentosestudados.

6 Concluses .

Concluses|74

Os achados deste trabalho indicam que a utilizao do PEC de quitosanaalginato

desempenha um papel importante no recrutamento e organizao celular, corroborando,
assim,osresultadosreportadosporoutrosautores;

A biomembrana de quitosanaalginato parece regular as fases da cicatrizao,

principalmente a proliferao e recrutamento de neutrfilos, fibroblastos, sntese e
remodelamentodocolgeno;

A regulao dos componentes da cicatrizao proporcionada pelos polissacardeos

naturais, somada proteo no aderente ao ambiente ulcerado pela biomembrana,
acelerouacicatrizaodelcerasagudasemratos.

Referncias .

Referncias|76

REFERNCIAS

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